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Laboratorio di Chimica Biologica


Corso di Studio in Scienze Biologiche (Laurea triennale)
Facolt di Scienze MFN Universit degli Studi di Genova
Anno Accademico 2006-2007









Sperimentazione e redazione a cura di:
Prof. Alessandro Morelli
Prof.ssa Isabella Panfoli
Dott.ssa Silvia Ravera
Dott.ssa. Daniela Calzia
CHIMICA
BIOLOGICA


ESPERIENZE DI LABORATORIO

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INTRODUZIONE

In questo laboratorio lo studente potr eseguire alcuni semplici esperimenti:
Determinazione dello spettro dassorbimento del coenzima piridinico NADH (forma ridotta) e NAD
+

(forma ossidata).
Misura dellattivit enzimatica a substrato soprasaturante dellenzima Glucosio-6-fosfato deidrogenasi
(Glucose-6-phosphate: NADP oxidoreductase; G6PD; 1.1.1.49), presente nel lievito (Saccharomyces
cerevisiae).
Determinazione del flusso glicolitico (consumo di glucosio e formazione di etanolo) nel lievito
Saccharomyces cerevisiae.
Determinazione della costante di Michaelis-Menten (per il substrato glucosio-6.fosfato) dellenzima
Glucosio-6-P deidrogenasi, utilizzando il metodo di linearizzazione grafica di Lineweaver-Burk.
Analisi qualitativa e quantitativa, con tecniche cromatografiche ed enzimatiche, di un campione
contenente concentrazioni incognite di ATP, ADP ed AMP.

Il metabolismo cellulare ha caratteristiche universali. Per esempio la glicolisi anaerobica, che possibile
osservare nel materiale biologico consegnato allo studente, avviene praticamente in tutte le specie.
Lesperienze di questo laboratorio vengono condotte con cellule di lievito (le stesse usate per scopi
alimentari, dal corredo genetico triploide) che presentano un accentuato metabolismo anaerobico. Sono
inoltre cellule particolarmente semplici, pur essendo eucariote a tutti gli effetti (sono infatti dotate di nucleo,
di reticolo endoplasmatico, di mitocondri).
Lo studente potr verificare che:
1) il glucosio assunto generalmente degradato in percentuale elevata ad etanolo ed anidride carbonica,
grazie alla glicolisi anaerobica;
2) il glucosio pu anche essere metabolizzato in forma aerobica (glicolisi + ciclo di Krebs- associato alla
fosforilazione ossidativa), ma questo avviene in misura ridotta nel tipo di lievito da noi utilizzato.
Losservazione e la misura del flusso metabolico della glicolisi anaerobica non rappresenta, ovviamente,
lunica finalit di questo laboratorio. Lo studente chiamato a prendere confidenza con manipolazioni
biochimiche semplici per realizzare alcune esperienze analitiche di tipo qualitativo e quantitativo,
nellambito delle microquantit dei composti analizzati, utilizzando anche enzimi purificati, reperibili in
commercio, per lesecuzione di reazioni in vitro.


Strumentazione

Le osservazioni biochimiche richiedono spesso lutilizzo dello spettrofotometro. Qui ne vengono
richiamati i principali aspetti applicativi.
Questo strumento pu essere pi o meno complesso, ma essenzialmente costituito da: una sorgente di luce
(lampada), che nel nostro caso emette luce nel visibile e nellultravioletto (UV), un filtro, una cuvetta, e un
rivelatore fotosensibile per analizzare la luce trasmessa (assorbanza).
La legge fisica che governa lassorbimento della luce, quella di Lambert-Beer, ed espressa con la
seguente equazione:

A =

M
M s ( Legge di Lambert-Beer)
ove:
A = assorbanza, o densit ottica (OD); indica la quantit di luce assorbita dal campione ad una
particolare lunghezza donda. Durante questo corso si utilizzeranno coenzimi piridinici, che
presentano nella forma ridotta un incremento massimo a 340 nm. Tali coenzimi sono largamente
utilizzati nelle determinazioni biochimiche quantitative.
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M
= coefficiente di estinzione molare, riferito ad una certa lunghezza donda , che corrisponde
allassorbanza di una soluzione 1 Molare della sostanza, se il cammino ottico attraversato 1 cm
(questo coefficiente espresso in M
-1
x cm
-1
).
M = molarit della soluzione, ovvero concentrazione di un composto espressa in: moli / litro.
s = spessore, indica il cammino ottico percorso dalla radiazione monocromatica attraverso la soluzione;
in genere 1 cm.


Avvertenza: si tenga presente che la lettura allo spettrofotometro attendibile per valori di Assorbanza
(o Densit ottica, OD) al di sotto di 1,2 OD . Ovvero lo strumento non in grado di misurare campioni
troppo concentrati. I campioni che presentano una OD al di sopra di tale valore richiedono unopportuna
diluizione.


Per il prelievo di liquidi vengono utilizzate pipette pneumatiche a gradazione variabile che prevedono
limpiego di puntali monouso.


Preparazione delle soluzioni
Le concentrazioni sono, di norma, espresse in Molarit (M, ovvero il numero di moli di un determinato
composto presenti in 1 litro di soluzione). Per preparare una soluzione con molarit M, occorrer pesare la
quantit in grammi (gr) data dalla formula seguente


gr = PM M V, dove
PM = peso molecolare (per esempio per il glucosio 180 Da)
M = molarit della soluzione
V = volume finale espresso in litri

Occorre inizialmente preparare una soluzione a concentrazione 1 M di glucosio: volume richiesto 10 ml
(0,01 litri). Si utilizza Glucosio monoidrato in cristalli (PM = 180 + 18 (per la molecola dH
2
O di
cristallizzazione) = 198). Quindi:
gr = 198 1 0,010 = 1,98

Questi 1,98 gr sono pesati direttamente in una provetta graduata da 10 ml (le provette coniche di materiale
plastico e monouso a disposizione dello studente presentano contrassegni in corrispondenza dei volumi: 0,5 -
1,0-2,5-5-10 ml); al glucosio si aggiungono circa 2 ml di H
2
O deionizzata, agitando immediatamente la
soluzione. Poi si porta a volume (si aggiunge H
2
O sino a 10 ml) e si agita nuovamente per rendere la
soluzione omogenea. Si contrassegni la provetta con la scritta Glucosio 1 M, utilizzando lapposito
pennarello.
Nel laboratorio biochimico si utilizzano frequentemente le soluzioni:
M (molare, cio 1 mole a litro, quindi 1 mmole in 1 ml)
mM (millimolare, cio 1 millimole a litro, quindi 1 mole in 1 ml)
M (micromolare, cio 1 micromole a litro, quindi 1 nmole in 1 ml)............ e sottomultipli.









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1Giorno
DETERMINAZIONE DELLO SPETTRO DASSORBIMENTO DEL
COENZIMA PIRIDINICO NADH (forma ridotta) NAD
+
(forma ossidata).

Questo ciclo di esperienze prevede un ampio impiego dei coenzimi piridinici (NAD
+
e NADP
+
), i quali
presentano un particolare spettro di assorbimento in forma ossidata (identico per NAD
+
e NADP
+
) che
differisce dallo spettro di assorbimento delle forme ridotte (NADH e NADPH). Infatti entrambi i coenzimi
sono caratterizzati, nella forma ridotta, da una banda di assorbimento con massimo a 340 nm, che assente
nelle forme ossidate (v. Fig. 1). Quindi, se nella cuvetta dello spettrofotometro NAD
+
o NADP
+
partecipano
a reazioni nelle quali sono trasformati in NADH o NADPH si osserver un incremento di densit ottica a
340 nm. Viceversa, se il NADH od il NADPH sono ossidati a NAD
+
o NADP
+
, si osserver un decremento
della densit ottica.






(densit O.D.
ottica- = NAD e NADP
unit arbitrarie) (forme ossidate)

= NADH e NADPH
(forme ridotte)

Massimo di assorbimento di
NADH e NADPH





260 340 nm (lunghezza donda )


Figura 1 : Spettri di assorbimento dei coenzimi piridinici

Il coefficiente di estinzione molare (

M
) dei coenzimi piridinici ridotti 6220 M
-1
cm
-1
ad una lunghezza
donda di 340 nm.

Una soluzione 1 M dei coenzimi piridinici illeggibile, perch lassorbanza supera di molto il limite di 1.2
OD, imposto dallattendibilit dello strumento. Per anche una soluzione 1 millimolare di NADH (o
NADPH) ancora troppo concentrata, poich presenta unOD pari a 6,220; pertanto si utilizzeranno
soluzioni ancora pi diluite. Infatti diluendo questultima ancora per 6,22 volte (ovvero se ad 1 ml di
soluzione 1 mM sono aggiunti 5,2 ml di H
2
O) si otterr unassorbanza di 1 O.D, valore ormai leggibile allo
strumento.
Per conoscere la concentrazione (in moli/ml, quindi la millimolarit) di una soluzione a concentrazione
incognita presente nella cuvetta dello spettrofotometro sufficiente dividere l OD per 6,22 (se lo spessore
di soluzione attraversato dal raggio di luce monocromatico 1 cm. (Nei laboratori quasi sempre utilizzato
tale spessore).
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Parte pratica:
Allo studente verr fornita una soluzione di NADH ad una concentrazione incognita. Di norma si risale ad
essa effettuando la misura della OD allo spettrofotometro, ad opportuna diluizione (se necessaria),
direttamente a lunghezza donda a 340 nm.
Per acquisire confidenza con questo tipo di determinazione quantitativa, inizialmente lo studente ricava
sperimentalmente lintero Spettro di Assorbimento, effettuando pi misure dellOD a varie lunghezze donda
da 240 nm a 420 nm .
In particolare si determiner lOD diunaliquota della soluzione a 240, 260, 280, 300, (lunghezze donda
dellultravioletto) 320, 330, 340, 360, 380, 400, 420 nm (lunghezze donda del visibile); al termine delle
letture si aggiungeranno ..l di perossido di idrogeno (acqua ossigenata) che determiner lossidazione del
NADH a NAD
+
. Dopo alcuni minuti si dovranno effettuare nuovamente le misure alle stesse lunghezze
donda.
I dati cos ottenuti dovranno essere riportati in un grafico (su carta millimetrata), in cui in ordinate sar
indicata lassorbanza, espressa in OD, e in ascissa la lunghezza donda, espressa in nm.
Questa esperienza permetter allo studente di verificare nella pratica che solo le forme ridotte dei coenzimi
piridinici assorbono a 340 nm. E si osserver la persistenza dellassorbimento a 260 nm che dovuto
alladenina, che non subisce modifiche nel corso dellossidazione da parte dell H
2
O
2
.

Per calcolare la Concentrazione Molare di NADH presente nella cuvetta, baster applicare la Legge di
Lambert-Beer; perci visto che: A =

M
M s, per risalire allincognita M sar sufficiente estrapolare
M da tale equazione e sostituire ad A lOD letta allo spettrofotometro, a

M
il valore del coefficiente di
estinzione molare del NADH a 340 nm, ed a s il valore del cammino ottico.










DETERMINAZIONE DELLATTIVITA DELLENZIMA G6PD PRESENTE
IN DIVERSI PREPARATI BIOLOGICI


Attivit di un enzima
Vengono qui si seguito riportati alcune propriet fondamentali dellEnzimologia; si rimanda ai libri di testo
di Biochimica per una esauriente trattazione.
In una cellula sono presenti migliaia di proteine enzimatiche, che sono distinte macromolecole proteiche
(enzimi) in grado (ciascuno) di catalizzare una specifica reazione chimica. Per la determinazione di una
specifica attivit enzimatica in un lisato cellulare, che teoricamente ne contiene migliaia, si colloca una
piccola aliquota del lisato stesso in una soluzione che contiene quantit soprasaturanti dei substrati
dellenzima che si vuole analizzare. In tali condizioni potr essere operativo solo lenzima che trova i(l)
propri(o) substrati(o), e taceranno gli altri enzimi, che al contrario ne sono privi.
Si otterr la cos detta velocit massima V
max
. Occorre far riferimento alle seguente equazione:

V
max
= k
3
[ E ]

V
max
= velocit massima, in moli/minuto secondo in 1 ml di soluzione.
k
3
= numero di turnover, cio le moli di substrato elaborate da una mole di enzima in 1 secondo
che coincide, ovviamente, con le moli di substrato elaborate da 1 mole di enzima in secondo.
[ E ] = concentrazione dellenzima, in moli/ml .
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E possibile determinare lattivit di un enzima in un preparato biologico con tecniche di vario tipo. Per tale
misura necessario che il preparato sia nativo, ovvero non deve aver subito processi denaturanti, in modo
da mantenere il pi possibile intatte le funzioni delle varie proteine in essi contenute tra cui, ovviamente, le
proteine dotate di attivit enzimatica.
Per misurare la concentrazione di qualsiasi componente endocellulare occorre rompere la membrana (e la
parte dove presente), in modo che le cellule riversino il loro contenuto nella soluzione. Tale processo viene
denominato omogenizzazione, e sar affrontato in forme pi esaurienti nel Laboratorio di Fisiologia
Generale. In questa sede verr semplicemente preparato:
1) un lisato di lievito mediante rottura meccanica della parete cellulare. Si tenga presente che le cellule
di lievito presentano una ottima resistenza: infatti possiedono una parete, oltre alla classica membrana
citoplasmatica. Quindi la cellula circondata da due barriere: la membrana plasmatica, pi interna,
che contiene il citosol, ed una parete, pi esterna. Tale parete particolarmente resistente, presentando
una struttura portante a base di chitina. In pratica sufficiente lagitazione meccanica delle cellule con
palline di vetro per avere un buon grado di rottura delle stesse. Lavvenuta lisi cellulare verificabile
direttamente al microscopio ottico.
2) un omogenato di epatociti bovini
3) un omogenato di tessuto muscolare murino


Lenzima Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) largamente distribuito in tutte le cellule ( il primo
enzima dello Shunt dei pentosi-fosfato che, tra laltro, garantisce alla cellula la sintesi degli zuccheri a 5
atomi di carbonio, che entrano nella composizione degli acidi nucleici).
Per quanto riguarda lattivit G6PD non esistono problemi di equilibrio chimico, per riprodurre la reazione
in vitro (schematizzata a pag 6). Infatti sufficiente che lenzima si trovi in presenza dei due substrati (G6P
e NADP - questo ultimo definito comunemente coenzima) e la reazione procede perch caratterizzata da un
G largamente negativo.






Parte pratica:
Preparazione dellestratto nativo (lisato cellulare)
In una provetta conica di plastica da 10 ml si aggiungono:

Lievito fresco........................................................ 0,8 gr.
H
2
O distillata........................................................ 0,8 ml
Sferette di vetro.................................................... q.b. a 2,5 ml

Si agita la provetta con Vortex per 10 min.
Per verificare il grado di lisi cellulare si pu prelevare unaliquota del lisato (p.e. 20 l), diluita 50 volte con
acqua deionizzata. Si deposita una goccia di campione su vetrino e si applica il vetrino coprioggetto:
losservazione viene effettuata al microscopio ottico, con obiettivo ad immersione, a 1000 ingrandimenti.
Pu essere considerata soddisfacente una lisi dell80 %.
Definizione di unit enzimatica
Si definisce unit di enzima quella quantit di enzima che (ad una temperatura prefissata,
nel nostro caso, per semplicit, la temperatura ambiente) elabora 1 mole di substrato in un
minuto primo.
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Per calcolare quante unit dellenzima G6PD sono presenti in 1 ml del ns. lisato cellulare o negli
omogenati, si immette una piccola aliquota del campione in una cuvetta da spettrofotometro, in presenza dei
rispettivi substrati e si registra (nel tempo) lincremento di densit ottica a 340 nm., dovuta al NADPH che si
forma nel corso della reazione. La concentrazione di tale enzima nel lisato di lievito alquanto elevata per
cui occorre effettuare una diluizione di 1.000 volte.




Dosaggio della G6PD:
La reazione enzimatica che viene messa in condizione di avvenire (grazie al piccola aliquota di lisato
introdotta nella cuvetta) quella che porta allincontro di Glucosio-6-P con NADP
+
.
Si realizza cos lossidazione del Glucosio-6-P ad acido 6-fosfo-gluconico ( in sostanza il gruppo aldeidico
in posizione 1 del glucosio-6-P che viene ossidato a gruppo acido), ad opera del NADP
+
che si riduce a
NADPH (producendo 1 equivalente di protoni, che genera acidit).

Inizialmente (nel caso del saggio sul lievito) si diluisce il lisato 1000 volte. Per farlo consigliamo di eseguire
la diluizione portando unaliquota iniziale di..ml di lisato ad un volume finale di 10 ml. Per poi
realizzare il dosaggio, si aggiungono in cuvetta le soluzioni indicate di seguito:
Si sottolinea che per una corretta riuscita dellesperienza il lisato va aggiunto per ultimo, subito prima di
eseguire la misurazione.


NADP
+
NADPH + H
+

G6PD
Glucosio 6-P ac.6-P-gluconico






Sostanze M iniziale M finale Lievito lisato Epatociti Muscolo
TRIS-HCl pH=8 1M 85 mM
MgCl
2
0.5 M 7 mM
Glucosio-6-P 0.1 M 1 mM
NADP 10 mM 1 mM
Campione 0.2 ml (Dx1000) 0.05 ml 0.05 ml
H
2
0
Volume finale 1 ml 1 ml 1ml


Si agita la soluzione e si esegue una lettura ogni minuto. Non occorre una preventiva lettura, prima
dellaggiunta del lisato cellulare, perch questa una misura cinetica, e quindi saranno misurate delle
variazioni di OD, per una reazione che, teoricamente, si svolge a velocit costante. L OD aumenter per il
NADPH che via-via si forma. Si registra la lettura dellOD ogni minuto, e si calcola immediatamente la
differenza. Si osserver che la O.D. aumenta costantemente. Con unosservazione complessiva di 10 minuti,
si pu eseguire una corretta determinazione dellattivit enzimatica. Se nellarco dei 10 minuti la differenza
(al minuto) si mantenuta allincirca costante, si pu dividere il O.D. complessivo per 10 (tempo in
minuti complessivo dellosservazione) e si avr il O.D. riferito al minuto primo. Dividendo tale valore
per 6,220 (lassorbimento di 1 mole/ml) si otterranno le unit di enzima presenti in cuvetta, ovvero
le moli prodotte, nella cuvetta, in 1 minuto. E conveniente esprimere tale unit in concentrazione
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dellenzima, ovvero in unit internazionali/ml (IU/ml). Essendo 1 ml il volume della cuvetta, le
IU calcolate totali coincidono con le IU/ml..
Per sapere quante unit internazionali di G6PD sono presenti in 1 ml di lisato cellulare bisogna applicare il
metodo delle diluizioni scalari. Questo metodo tiene conto delle diluizioni effettuate in ogni singolo
passaggio durante lesecuzione dellesperimento. Questo significa, in generale, che il valore dellassorbanza
dopo essere stato diviso per il valore del coefficiente di estinzione molare, deve essere moltiplicato per il
rapporto tra il volume totale e il volume del campione per ogni passaggio.
Dividendo il O.D./min (dovuto alla riduzione del coenzima piridinico NADP) per 6,220, si ottengono
le moli/ml min, ovvero le Unit internazionali (UI) di enzima presenti in cuvetta, quindi presenti in 1
ml. Occorre domandarsi quale diluizione ha subito laliquota del campione immesso in cuvetta:
corrisponder al Volume Finale diviso il Volume Iniziale, ovvero 1000 / 200 (se sono stati usati 200 l).
Moltiplicando le UI/ml (in cuvetta) per 1000/200 si otterranno le unit presenti nella soluzione diluita 1000x
del lisato dalla quale provengono i 200 l. Se si moltiplica ancora per 1000 si otterrano le unit/ml nel
lisato iniziale. Moltiplicando ancora per 2 (perch le cellule sono state diluite 2 volte durante la preparazione
del lisato) si otterranno la UI/ml di lievito. Quindi alla fine dei calcoli (schematizzati di seguito) si otterranno
le UI presenti in 1 ml di cellule pure.



















In definitiva:

IU/ml (in cuvetta) 5 1.000 2 = Unit Internazionali / ml di cellule
















OD
x
6,220
1.000

200
10000
x
10

x 2 = .. UI/ml
mM del NADPH
presenti in
cuvetta
=
IU presenti in
cuvetta
Diluizione
subita dai 200
l di estratto
trasferiti in
cuvetta
Diluizione
iniziale subita
dal lisato
Diluizione
delle
cellule di
lievito
9


2 Giorno
FERMENTAZIONE ALCOLICA IN CELLULE DI LIEVITO


Generalit e finalit dellesperimento
Questa esperienza permette allo studente di osservare landamento di un intero processo metabolico. In
particolare, si studier il consumo di glucosio da parte del lievito (S. cerevisiae), con la conseguente
produzione di CO
2
ed etanolo, ad opera dei 12 enzimi in successione che rendono operativo lintero
processo della glicolisi anaerobica che, nel lievito, nota come fermentazione alcolica. ( Si ricorda che la
glicolisi, nella generalit delle altre cellule, porta invece alla formazione di lattato). Lo studente potr
osservare la presenza della CO
2
sottoforma di effervescenza, mentre il glucosio e letanolo saranno
determinati quantitativamente mediante saggi enzimatici.
Durante questa esperienza sar anche possibile verificare la stechiometria della glicolisi:

CH
2
OH

H C O H CH
3

H 12 reazioni
C OH H C 2 CH
2
OH + 2 CO
2

enzimatiche
OH C C OH etanolo

H OH

-D-glucosio


Ovvero per 1 mole di glucosio scomparso si formano, in teoria, 2 moli di etanolo e 2 moli di anidride
carbonica.
Questo si verificherebbe, nel lievito, se fosse operativa unicamente la sopra-schematizzata fermentazione
alcolica. Nella realt esistono molti altri metabolismi, di entit di gran lunga minore. Per esempio operativo
lo Shunt dei pentoso-fosfati (il cui primo enzima la Glucosio-6-fosfato deidrogenasi-G6PD, che stato
dosato durante la prima esperienza). Tale Shunt preleva un intermedio della glicolisi, e quindi contribuisce
ad abbassare la resa in etanolo. Anche il glicerolo-3-P (un intermedio della glicolisi) viene prelevato nella
cellula per la fornitura del glicerolo durante la sintesi dei trigliceridi, infatti nel lievito per ogni mole di
glucosio metabolizzato, circa 0,3 moli sono dirottate verso glicerolo.
Esistono quindi una serie di prelievi di intermedi della glicolisi allinterno della cellula, che ne modificano
la resa, infatti le moli di etanolo formate, per ogni mole di glucosio consumato, oscillano tra le 1,2 e le 1,4
soltanto (anzich le 2 stechiometriche).
Letanolo, che manca ancora allappello perci, rispecchia probabilmente la avvenuta conversione di
intermedi della glicolisi in: 1) prodotti di biosintesi (p. es. lipidi e/o amminoacidi); 2) prodotti di
degradazione completa (CO
2
ed H
2
O) per un modesto contributo dei processi che avvengono in aerobiosi
(ciclo di Krebs e fosforilazione ossidativa), oltre, naturalmente, alla formazione dei prodotti
precedentemente citati (glicerolo e metaboliti dello Shunt).


Parte pratica:
Lesperimento prevede di incubare il lievito con unopportuna soluzione contenente vari metaboliti,
compreso il glucosio, per osservare la formazione di etanolo e CO
2
, nellarco di trenta minuti (con prelievi
ogni 10 minuti): appena aggiunto il glucosio si effettuer subito il prelievo di unaliquota (tempo 0) per le
analisi successive, mentre il resto della soluzione verr incubato a 37C. Dall incubazione si preleveranno
10
quindi altre aliquote, ai tempi 10 20 - 30 minuti. Perci, alla fine, si disporr di 4 campioni (tempi 0
- 10 - 20 - 30 min), nei quali sar possibile determinare il glucosio (che progressivamente diminuisce) e
letanolo (che progressivamente aumenta) perch prodotto dalle cellule stesse.
Bisogna per sottolineare che il campione incubato come tale non idoneo alla misura della concentrazione
dei metaboliti, perci occorrer provocarne la denaturazione, cio eliminare le proteine in esso contenute,
comprendenti tutto il patrimonio enzimatico, per arrestare tutti i processi biochimici cellulari. Per questo
scopo solitamente si utilizza lacido perclorico.

Perci, prima di iniziare con lincubazione, si contrassegnano 4 provette Eppendorf con la scritta 0, 10, 20,
30 e in ciascuna si trasferiscono 0,1 ml di acido perclorico (PCA) 5 M.

Si allestisce quindi lincubazione. Si pesano in una provetta conica di plastica 0,5 grammi di lievito fresco,
al quale vengono successivamente aggiunti gli altri componenti, secondo lo schema sottostante:

ATTENZIONE: fondamentale aggiungere il glucosio per ultimo, e solo quando si pronti ad effettuare il
prelievo denominato tempo zero, altrimenti il lievito comincer a metabolizzare il glucosio e non si
riuscirebbe a fotografare correttamente il tempo zero (massima concentrazione di glucosio, minima
concentrazione di etanolo).

mM ml
(millimolarit finale)
Lievito 0,5 gr 0,5
H
2
O - -----
KCl 100 mM 24 -----
NH
4
+
CH
3
COO
-
100 mM 20 -----
glucosio 1 M 100 ----- aggiunto per ultimo
NaH
2
PO
4
100mM

(opzionale)

2 ------
___________________________
Totale 10,000

Alcuni gruppi di lavoro possono incubare il lievito con aggiunta di Na fosfato 2mM finale, questo aumenter
del doppio la resa della glicolisi.
La provetta conica presenta un anello in rilievo in corrispondenza del volume max = 10 ml. E utile
verificare nel suo complesso la correttezza dei volumi aggiunti. Infatti sufficiente verificare che, alla fine,
il volume corrisponda a 10 ml.
Si chiude quindi la provetta con tappo di plastica e la si capovolge pi volte per rendere la sospensione
omogenea. Si preleva quindi 1 ml della soluzione incubazione ormai pronta, trasferendo tale aliquota
nella provetta Eppendorf, contenente lacido perclorico, contrassegnata con Tempo = 0. Tappare e agitare
immediatamente tale provetta del tempo 0 con energia, per disperdere bene i componenti della sospensione.
La provetta conica incubazione, con i restanti 9 ml va subito incubata in bagno termostatato a 37C. Si
prenda nota del tempo di incubazione, per effettuare i 3 prelievi ai tempi programmati (10, 20, 30 min).
Terminata lincubazione, ed effettuati i restanti tre prelievi 10, 20, 30 min, si disporr dei quattro prelievi
acidificati con acido perclorico e si proceder al loro processamento in parallelo.
I campioni sono centrifugati a 5000 giri al minuto per 10 minuti. Si presti attenzione ad equilibrare il rotore
disponendo i campioni in modo tale che il baricentro coincida con lasse di rotazione del rotore stesso.

OCCORRE CONTRASSEGNARE I CAMPIONI PER EVITARE SCAMBI DI PROVETTE TRA I GRUPPI DI LAVORO!

Questa operazione indispensabile per separare le proteine, ormai denaturate, dal resto della soluzione che
conterr anche il glucosio e letanolo. Le proteine precipiteranno sul fondo formando il pellet, mentre il resto
della soluzione former il sovranatante. Dopo aver recuperato i campioni occorrer verificare la presenza del
pellet; se dovesse esistere ancora torbidit occorre ricentrifugare.
Si prelevano 0,8 ml di sopranatante da ogni provetta e si trasferiscono in altre 4 provette Eppendorf
opportunamente contrassegnate.
11
A queste aliquote si aggiunge carbonato di potassio (K
2
CO
3
) 2 M che forma, insieme al PCA, il sale
insolubile KClO
4
, allontanando cos lo ione perclorico e riportando il pH alla neutralit. Dovrebbero essere
sufficienti 95 l.

ATTENZIONE: appena si aggiunger il carbonato di potassio si former allinterno della eppendorf della
CO
2
, per questo consigliabile mantenere le provette aperte fino a che leffervescenza non sar finita,
altrimenti la pressione esercitata dal contenitore lo far scoppiare.

Occorre, poi, verificare che il pH sia effettivamente neutro trasferendo 1-2 l della soluzione appena
neutralizzata su cartina universale indicatrice di pH. Se il pH risultasse ancora acido si deve aggiungere
ancora una piccola quantit (2 l) di K
2
CO
3
2 M fino a pH neutro (in genere occorrono al massimo circa
100 l totali di K
2
CO
3
2 M).
Si centrifuga nuovamente per allontanare il sale, anche se questo sedimenterebbe da solo, grazie alla forza di
gravit.
I campioni sono quindi pronti per lanalisi dei metaboliti in esso contenuti.

Data lelevata concentrazione dei metaboliti presenti negli estratti (come si potr constatare a consuntivo)
opportuno effettuare le diluizioni 20 X con acqua degli stessi. A tal fine si depositano in 4 provette
Eppendorf . ml H
2
O, e si aggiungono ml dei rispettivi estratti, sapendo che il volume finale
di 1 ml. Ricordarsi, come al solito, di agitare i campioni. Tali campioni diluiti 20 X sono utilizzati per
lanalisi di Glucosio ed Etanolo.


A) Determinazione enzimatica del glucosio
Per catalizzare le reazioni sotto specificate si utilizzano enzimi purificati, reperibili in commercio. Si
ricostruiscono in vitro (nella cuvetta dello spettrofotometro) due reazioni che portano alla formazione di
NADPH:

ATP ADP NADP+ NADPH + H
+

HK G6PD
Glucosio Glucosio 6-P 6-P-gluconato
Mg
2+


LATP aggiunto in eccesso rispetto al glucosio. Il
glucosio presente (introdotto col campione) former
una quantit stechiometrica di glucosio 6-P in
presenza dellenzima purificato esocinasi (HK). Se in
cuvetta si aggiunge anche un eccesso di NADP e
lenzima glucosio 6-P deidrogenasi purificata
(G6PD) si ottiene la formazione stechiometrica di
NADPH, il quale, a differenza del NADP, assorbe
luce a 340 nm con un coefficiente di estinzione
molare = 6.220 M
-1
x cm
-1
. Le micromoli di NADPH
formate corrispondono alle micromoli di glucosio
presenti nellaliquota di estratto introdotto in cuvetta.
N.B.: in realt con questo sistema viene determinato
anche il glucosio 6-P endocellulare, che per
generalmente presente in quantit trascurabile.
Il dosaggio effettuato a pH = 8. Si ricordino le
propriet degli agenti tamponanti, per esempio lacido
acetico esprime azione tamponante in un ambito di pH Fig 2: Propriet di sostanze tampone
12

che corrisponde al valore del rispettivo pK
a
1, ad esempio per lacido acetico il pK
a
4,8.
Si tenga presente lutile quadro riassuntivo riprodotto dal Catalogo SIGMA (Fig. 2 - pag. 10) dal quale si
deduce che il TRIS (pK
a
= 8,1) un tampone idoneo TRIZMA = TRIS).

In pratica, nella cuvetta dello spettrofotometro si mescoleranno, sino al volume finale di 1 ml:

mM
f
ml
Tampone TRIS-HCl 1,0 M pH 8,0 .......................................... 50 ---------
Estratto diluito x 20 (che contiene il glucosio da determinare) 0.020
ATP 50 mM ......................................................................... . 2.5 --------
NADP 10 mM ......................................................................... 0.2 --------
MgCl
2
0,5 M (indispensabile) .......................................... 5 --------
H
2
O ................................................................................................ 0,847
Volume finale (in cuvetta) ....... 0,997

(NB: per calcolare i volumi a partire dalle due molarit considerare il volume finale uguale a 1ml)

Si agitano per bene le cuvette e si misura lestinzione contro aria.
Si aggiungono poi : 2 l di HK a 2 mg/ml (cio 4 g) e In realt si aggiungono 3 l della
2 l di G6PD a 1 mg /ml (cio 2 g) miscela: HK/G6PD.
(con laggiunta degli enzimi il volume finale totale 1,00 ml).

Si agitano nuovamente le cuvette (importante), che vengono collocate nello spettrofotometro. Si osserva
un rapido aumento nella densit ottica: si legge il valore finale e costante nel tempo, dal quale andr sottratta
la lettura eseguita prima dellaggiunta degli enzimi.

Occorre registrare le O.D. del tempo zero (per ciascuno dei quattro campioni) e le rispettive O.D. dopo
laggiunta degli enzimi. La differenza ( O.D.) proporzionale alla quantit di glucosio presente (si pu
immediatamente constatare che le prove 10, 20, e 30 minuti contengono meno glucosio del tempo 0).
Il campione t =0 dovrebbe avere un O.D.=
----------
; mentre la prova 10 minuti dovrebbe avere OD =
---
---
La prova 20 minuti un OD =
--------
e quella a 30 minuti un OD= -------. I valori di OD sono
proporzionali al glucosio presente. Tali OD devono decrescere, con il decorrere dellincubazione, a
conferma del fatto che il glucosio viene progressivamente consumato.
Dal OD si pu risalire alla concentrazione del glucosio, applicando il metodo delle diluizioni scalari (v.
pag.7). La concentrazione del glucosio al t = 0 dovrebbe corrispondere al glucosio teorico: la
concentrazione teorica iniziale del glucosio 100 mM (glucosio aggiunto). Occorre anche tener conto del
glucosio endogeno, che dovrebbe essere dellordine del 10 mM. In definitiva, il glucosio iniziale pu
oscillare tra i 105 ed i 120 mM. Questa unutile verifica interna. E accettabile uno scarto del 10%.
La concentrazione di glucosio dovrebbe scendere (nella prova 30 minuti) a 55 mM circa, con un
consumo, quindi, di circa 60 mM.
Se le cellule di lievito sono state incubate con Na Fosfato si dovrebbe osservare un forte aumento del
metabolismo, dellordine del 100 %.


B) Determinazione enzimatica delletanolo
La concentrazione di etanolo presente nei vari estratti perclorici determinabile mediante lutilizzo della
reazione catalizzata dallenzima alcool deidrogenasi (ADH). Occorre tener presente che lequilibrio della
reazione catalizzata dallenzima ADH spostato verso la formazione delletanolo, e non viceversa. Si pu
ovviare al problema sottraendo lacetaldeide mano a mano che si forma. Infatti, perch letanolo presente nel
campione da analizzare sia completamente rimosso e ossidato ad acetaldeide, occorre far avvenire la
reazione in un tampone a base di semicarbazide (idrazin-carbossiammide), che forma il semicarbazone con
13
il gruppo carbonilico dellacetaldeide. Ovviamente la reazione in questo verso pi lenta. Da acetaldeide
ad etanolo invece, la reazione decorre spontaneamente.

La reazione che avverr in cuvetta la seguente:


NAD
+
NADH + H
+


ADH
etanolo acetaldeide G = + 5.400 cal/mole

Nella cuvetta dello spettrofotometro si mescolano, sino al volume finale di 1 ml:

mM f ml
TRIS-HCl-1M pH=8.............................................................. 50 ---------
Semicarbazide 100 mM.......................................................... 6.2 ---------
NAD
+
50 mM ....................................................................... 2.00 ---------
Campione (estratto perclorico neutralizzato diluito 20 X) .. 0.020
H
2
O .................................................................................... ---------
Tot. 0,998

(NB: per calcolare i volumi a partire dalle due molarit considerare il volume finale uguale a 1ml)

Si aggiungono 2 l di ADH (5 mg/ml) , cio 25 g.
Si colloca la cuvetta nello spettrofotometro e si osserva laumento di densit ottica. Si legge il valore finale,
dal quale andr sottratta la lettura eseguita prima dellaggiunta dellenzima.
Dai OD ottenuti si risale, con il metodo delle diluizioni scalari (v. pag. 7), alle concentrazioni dei rispettivi
composti presenti nellincubazione originale delle cellule di lievito.
Il campione t = 0 dovrebbe contenere circa 12 mM etanolo (endogeno), che dovrebbe salire a 55 mM nel
campione 10, a 73 mM nel campione 20 e a 85 mM nel campione 30.

Calcoli stechiometrici
E possibile risalire alla concentrazione del glucosio e delletanolo nella sospensione del lievito. Si parte
dalle concentrazioni dei rispettivi metaboliti rilevate nella cuvetta dello spettrofotometro, e si risale alla
concentrazione nellincubazione mediante il metodo delle diluizioni scalari, gi applicato durante il
dosaggio della G6PD. In pratica occorre tener conto delle diluizioni successive che hanno subito i prelievi
dellincubazione.
Metodo delle diluizioni scalari
Le considerazioni che seguono si riferiscono al glucosio, ma sono riferibili, ovviamente, anche agli altri
metaboliti.
Dividendo il O.D. dovuto alla ossidazione (o riduzione) del coenzima piridinicio NADPH per 6,220,
si ottengono le moli/ml, ovvero la mM in vaschetta. Ricordiamo che il glucosio, reagendo, produce una
stechiometrica quantit di NADPH.
Occorre domandarsi quale diluizione ha subito laliquota del campione immesso in cuvetta: corrisponder al
Volume Finale diviso il Volume Iniziale, ovvero 1000 / 20 (se sono stati usati 20 l di campione che sono
stati immessi, e quindi diluiti, in cuvetta).
Moltiplicando tale mM (in cuvetta) per 1000/20 si otterr la millimolarit della soluzione dalla quale
provengono i 20 l di campione, ovvero lestratto neutralizzato con K
2
CO
3
.
Si procede ora a ritroso per tener conto delle diluizioni successive.
Occorre moltiplicare per 20 se sono state effettuate diluizioni 20 X di tali estratti.
Gli estratti neutralizzati hanno subito a loro volta una certa diluizione: 800 l di sopranatante acido stato
diluito con 95 l di K
2
CO
3
. Pertanto la diluizione subita corrisponde a 895 / 800, e moltiplicando per tale
14
rapporto si otterr la concentrazione del glucosio (sempre in mM) nella soluzione di provenienza,
cio nel sopranatante acido.
Infine, tale sopranatante acido deriva da una diluizione con acido perclorico della sospensione iniziale
(incubazione): sono stati prelevati 1000 l, che sono stati diluiti con 100 l di acido perclorico. Quindi 1000
l sono stati portati a 1100 l. Moltiplicando per 1100 / 1000 si otterr la mM del glucosio nellincubazione
originale.
Ricapitolando:








Quindi il O.D, moltiplicato per tutti i fattori sopra riportati, fornisce la mM di glucosio nella incubazione
originale (quella con il lievito vivo, dalla quale sono state prelevate le aliquote!), ovviamente riferita al un
tempo particolare di una dato prelievo. F indica il coefficiente che deriva dalla riunione di tutti i fattori
costanti, che risulta uguale a 197,94. Quindi:

>>>>>>> O.D. x F = mM glucosio o etanolo [F = 197,84 ] <<<<<<

La determinazione del glucosio al tempo = 0 fornisce una utile verifica delle procedure sin qui seguite: il
valore teorico atteso 100 mM glucosio iniziale (in realt la millimolarit dovrebbe essere leggermente
superiore, perch esiste del glucosio endogeno 10 mM).
Visto che il NADH (prodotto per ossidazione delletanolo - v. reazione a pag. 7) ha lo stesso coefficiente di
estinzione del NADPH, tale formula utilizzabile anche per ricavare la millimolarit delletanolo, che con la
sua ossidazione genera acetaldeide, riducendo contemporaneamente il NAD a NADH.
Si tenga presente che queste metodologie presentano un margine di errore dellordine del 2 5 %.

Una volta calcolate le concentrazioni di glucosio e di etanolo ai vari prelievi, eseguire un grafico in cui
sullasse delle ordinate sar riportata la concentrazione (mM), e sullasse delle ascisse il tempo (min), come
riportato in Fig3, pag 14).

Commenti alle osservazioni sperimentali
In definitiva, il processo metabolico in esame illustrato della seguente forma schematica:

5 enzimi 7 enzimi
1 Glucosio 2 Triosi-P 2 etanolo + 2 CO
2



Per verificare il bilancio di massa occorre tener presente la stechiometria dellintero processo:
OD
x
6.220
1.000

20

20
895
x
800

1100
=
1000

mM

mM del
NADPH
in
vaschetta


Diluizione
subita dai
20 l di
estratto 20x
trasfe- riti
in va-
schetta

Diluizione
20x dell
estratto
neutraliz-
zato

Diluizione
subita
dallestratto
acido per
aggiunta di
K
2
CO
3



Diluizione subita
dallaliquota di
incubazione inizia-
le per aggiunta di
HClO
4
.


millimolarit
del glucosio
nellincubazione

15
1 mole di glucosio genera 2 moli di etanolo. Quindi su 60 mM glucosio consumato si
dovrebbe ottenere (con 100 % di fermentazione alcolica) una produzione 120 mM di etanolo.
Invece lo studente otterr un valore ~73 mM etanolo, ovvero solo il 60 % del teorico.
Quindi ~ 40% del glucosio scomparso non ha formato etanolo. Ci del tutto plausibile. Infatti possono
esistere altre vie metaboliche che utilizzano il glucosio. Per esempio parte del glucosio consumato (~ 15 %)
produce glicerolo. Variando opportunamente le condizioni di incubazione (p.e. innalzando il pH) si pu
addirittura verificare che la formazione di glicerolo prevale sulla formazione di etanolo. Inoltre esiste una
quota modesta del glucosio utilizzato (1-5 %) che metabolizzato via Shunt dei Pentosi.
I valori sopra riportati sono solo indicativi e non fanno testo. I 12 passaggi enzimatici della
fermentazione alcolica sono influenzati da diversi fattori. Per esempio:
- stato di conservazione del campione
- pH,
- la freschezza delle cellule di lievito, ecc.



















16

3 Giorno
CINETICA ENZIMATICA: DETERMINAZIONE DELLA COSTANTE DI
MICHAELIS -MENTEN


Introduzione
Sul significato dei parametri cinetici di un enzima, occorre che lo studente richiami alcuni concetti-base
dellenzimologia (v. libri di teso di Biochimica).
Ricordiamo brevemente che, per una reazione catalizzata da un enzima, vale la relazione:


V
max
v = velocit

della reazione
v = V
max
= velocit massima della reazione ( a
K
M
substrato soprasaturante)
1 + [ S ] = concentrazione del substrato
[ S ] K
M
= costante di Michaelis-Menten

Per una reazione a cinetica normale, in un grafico con v (velocit della reazione) in funzione di [S], si
ottiene uniperbole.
Per verificare la legge di MIchaelis-Menten si pu utilizzare il metodo della linearizzazione grafica di
Lineweaver-Burk: in pratica si riporta su grafico 1/v in funzione di 1/[S]. Tali reciproci di v ed [ S ]
scaturiscono dalla relazione sopra citata espressa in forma inversa:

1 1 K
M
1
= +
v V
max
V
max
[ S ]

I punti ottenuti dalle misure eseguite allo spettrofotometro sono riportati sul grafico dei doppi reciproci. Se
giacciono su di una retta, significa che lenzima ha cinetica normale, ovvero iperbolica.

Esecuzione delle misure
Queste osservazioni vengono eseguite sullenzima G6PD in quanto un enzima assai diffuso nelle cellule
sia di organismi superiori che in batteri.
La misura effettuata usando lenzima puro, ma si potrebbe anche eseguire direttamente su un lisato di
lievito1:2, diluito ancora x 1.000.
Si preparano 6 cuvette nelle quali lunica variabile la concentrazione del substrato (glucosio-6-P). Le
quantit sono riportate in l. I volumi dell H
2
O sono calcolati in modo da portare il volume finale a 1 ml.

mM (finali) di G6P 0,05 0,07 0,1 0,2 0,4 1

l da aggiungere in cuvetta

Glucosio-6-fosfato 10 mM 5 7 10 20 40 100
TRIS-HCl 1 M pH 8 85 85 85 85 85 85
MgCl
2
0,5 M 14 14 14 14 14 14
NADP 10 mM 100 100 100 100 100 100
Lisato 1.000x 200 200 200 200 200 200
H
2
O 596 594 591 581 561 501


17
Le reazioni partono per aggiunta di lisato (che contiene anche lenzima G6PD che si vuol
determinare. Occorre registrare sul protocollo le letture (in aumento a 340 nm) calcolando la differenza di
minuto in minuto. Mediare opportunamente in un intervallo di almeno 4 minuti. A tempi pi lunghi si pu
osservare un decremento della velocit di reazione per calo del substrato o inibizione da prodotti. In teoria
potrebbe rendersi necessaria la estrapolazione dei valori della velocit al tempo iniziale.
Preparare una tabella per ottenere i valori da riportare nel grafico dei doppi reciproci :

mM (finali) di G6P 0,05 0,07 0,1 0,2 0,4 1




v (OD x 1000/min)* 5,33 5,670 8,02 11 12,41 13,58

v (nmoli/min) 0,857 0,911 1,290 1,767 1,996 2,183




* E pi pratico fare i calcoli con OD moltiplicato x 1000 [p. es. 0,1 OD vengono regi-
strati come 100 punti. Dalla divisione di tali punti per 6,22 si ottengono le
nmoli/min (nano moli/minuto) prodotte per ml di soluzione anzich le moli/ prodotte al minuto per
ml di soluzione].
Si dimensiona opportunamente un grafico con 1/ v in ordinate ed 1/ mM in ascisse. Si riportano i valori di
1/v in ordinate in funzione dei valori di 1/mM di G6P in ascisse. Si traccia la retta che meglio interpola i
punti). Si ha unintercetta sullasse delle ordinate: questa corrisponde ad 1/V
Max.
E plausibile un valore di
0,4 min/nmoli. Quindi linverso dovrebbe corrispondere ad una V
Max
= 2,5 nmoli/min (0,0025
moli/min.ml) che, moltiplicato per 5 x 1000 x 2, fornisce un valore di 25 moli/min.ml di lievito, ovvero
25 UI/ml di lievito. E utile confrontare questo valore con quello ottenuto con una sola misura, a saturazione
sia di G6P che di NADP (v. pag. 13). Il valore dello stesso ordine di grandezza. Non deve essere
necessariamente coincidente in quanto si tratta di preparazioni diverse.
Per il calcolo della K
M
, che lobiettivo di questo
esperimento, si misura lintercetta sullasse delle ascisse,
che corrisponde a 1 / K
M
( plausibile un valore di
9,75 mM
-1
). K
M
risulta, quindi uguale allinverso di 9,75.
In definitiva K
M
= 0,102 mM.
E noto che la K
M
espressione della costante di
dissociazione del complesso enzima substrato. In questo
esperimento stata misurata la K
M
dellenzima G6PD
per il substrato G6P, in condizioni di saturazione di
NADP. E degno di nota che questa informazione
importante sulle propriet di una proteina enzimatica sia
stata ottenuta con il preparato grezzo, contenente
migliaia di altre attivit enzimatiche. Trattasi quindi di
una misura sperimentale facilmente accessible.
Si pu osservare che il valore di K
M
relativamente
elevato, rispetto alle K
M
di altri enzimi.
Se si considera che la concentrazione endocellulare del suo
substrato, il G6P, intorno a 25, si comprende che lenzima poco operativo nelle condizioni
endocellulari.
In conclusione il livello modesto dello Shunt dei pentosi fofato in linea sia con laccertata bassa attivit
endocelluare dellenzima G6PD, che con la sua modesta affinit per il substrato.

1/mM 20 14,28 10 5 2,5 1
1/v 1,166 1,097 0,775 0,565 0,501 0,458
18

4 Giorno
ANALISI DEL CAMPIONE CONTENENTE ATP;ADP;AMP

Ogni studente ricever un campione a concentrazione incognita di ATP, ADP ed AMP e dovr accertare la
presenza di tali nucleotidi, mediante analisi qualitativa con TLC. Il campione pu contenere da uno a tre di
tali nucleotidi. Potr poi essere condotta unanalisi su base quantitativa utilizzando dosaggi enzimatici.
Lanalisi dellATP utilizza lo stesso sistema utilizzato per il dosaggio del glucosio, solo che in questo caso il
glucosio in eccesso.
ADP ed AMP sono determinati contemporaneamente in una singola cuvetta. Si utilizzano gli enzimi
Piruvato Cinasi (PK) e Lattico deidrogenasi (LDH), per la determinazione dellADP. Si passa poi alla
determinazione dellAMP per aggiunta di miocinasi (MK). Nella cuvetta avvengono le seguenti reazioni:

ADP ATP NADH NAD
+
PK LDH
Fosfoenol piruvato Piruvato Lattato

Si opera in eccesso di fosfoenol piruvato (PEP), con una quota adeguata di NADH, che fornisca 0,8 1,0
O.D. a 340 nm. Si legge lO.D. iniziale; si aggiungono quindi i due enzimi PK ed LDH ; il NADH che
scompare corrisponde stechiometricamente allADP presente.
In 2 min si registra il O.D.; quindi si aggiunge nella medesima cuvetta poco ATP e lenzima miocinasi
(MK). Se presente AMP si registrer un ulteriore decremento dellassorbimento a 340 nm. Infatti lAMP
reagisce con lATP secondo la reazione:

MK
AMP + ATP 2 ADP

LADP cos formato verr nuovamente registrato dallo spettrofotometro, perch sono ancora operative le
reazioni prima riportate, essendo ancora presenti i reattivi e gli enzimi che consentono di determinare
lADP. Quindi avremo un ulteriore decremento, se nel campione incognito presente anche lAMP.
Si tenga presente per i calcoli la stechiometria: lADP formato per azione della miocinasi risulter doppio
rispetto allAMP presente; quindi il valore registrato dallo strumento andr opportunamente diviso per sue
per risalire alla effettiva concentrazione di AMP.

Analisi qualitativa dei nucleotidi purinici mediante cromatografia su strato sottile (TLC)
Si utilizzano lastre di polietilene (materiale inerte) portanti un sottile strato (0,1 mm) di Poli Etilen Immino
cellulosa (PEI) impregnato di indicatore di fluorescenza. Si traccia con una matita a 2 cm dal bordo una
linea di partenza. In essa si depositano da 2 a 6 l di soluzione, contenenti almeno 2 nanomoli, meglio 10,
del nucleotide standard o della soluzione da analizzare
Lo studente riceve una soluzione standard che contiene i tre nucleotidi ATP, ADP, AMP, che 5 mM in
ciascuno dei tre. Depositandone 2 l, si depositano in pratica 10 nmoli di ciascun nucleotide. Vengono
depositati anche 2 l di campione da analizzare. Dopo aver asciugato le macchie (con lausilio di una
corrente di aria tiepida) nella vasca da TLC viene collocata la lastrina che alla base risulter immersa nel
solvente con la seguente composizione:
NaCl 1M a pH 7.2
Il solvente sale per capillarit e la cromatografia procede sino a 4-5 cm dal bordo superiore. Si asporta a
questo punto la lastra dalla vasca cromatografica e la si asciuga. Quindi la lastra viene irradiata con una
lampada UV che rivela la presenza dei nucleotidi fluorescenti. Con una matita si tracciano i contorni delle
macchie. Per semplificare la procedura di standarizzazione viene applicata una sola macchia contenente tutti
e tre i nucleotidi che si desidera analizzare:
19
lATP si sposta di meno (R
f
= 0,2); lADP corre di pi (R
f
= 0,43) e lAMP corre ancor di pi (R
f
= 0,6) (v. Fig. 4) Ovvero, pi il nucleotide fosforilato, minore il suo spostamento perch il supporto di
natura basica tratterr maggiormente i composti pi acidi, cio maggiormente fosforilati.
Per maggior chiarezza qui riportato uno schema di deposizione dei campioni sulla lastra di PEI per
TLC.

Fig. 4 - Cromatografia su strato sottile dei nucleotidi adenilici


Fronte di avanzamento
del solvente



AMP
direzione di migrazione
del solvente
Campione 1 = ATP, AMP
ADP Campione 2 = ADP, AMP
Campione 3 = ATP, ADP

ATP


deposizione dei campioni
1 2 3
Standard Campioni incogniti



Esecuzione dellanalisi
Lo studente ricever 0,2 ml di soluzione in una provetta tipo Eppendorf, contenente da 0,5 a 5 moli Totali
di ogni singolo nucleotide (ATP, ADP, AMP). Possono essere presenti tutti e tre, in quantit diverse, oppure
anche soltanto uno o due dei tre. Si proceder allanalisi qualitativa, depositando 2 l del campione
incognito su lastrina da TLC (PEI cellulosa), accanto alla miscela standard. Per irradiazione con raggi UV si
potranno rilevare le macchie dei composti presenti.
Si passa quindi allanalisi quantitativa. A tal fine occorre diluire il campione iniziale da 0,2 ml portando il
volume ad 1 ml con H
2
O (dopo il modesto prelievo per lanalisi qualitativa). In pratica si aggiungono
0,800 ml di acqua con la pipetta pneumatica da 1 ml e si agita. A questo punto ogni nucleotide
contenuto, se presente, in una concentrazione compresa tra 0,5 e 5 moli per ml (cio 0,5 5,0 mM).

Analisi dellATP
Si predispone la cuvetta come precedentemente specificato per lanalisi del glucosio e si aggiungono 20 l
della soluzione diluita a concentrazione incognita di ATP (al posto di 0,020 ml di estratto perclorico diluito
20x). Si immette anche il glucosio in eccesso. In definitiva le condizioni di dosaggio sono le seguenti:
ml
Tampone TRIS-HCl 1,0 M pH 8,0 ................................................. 0,050
Campione (che contiene lATP da determinare) ....... 0,020
Glucosio 0,1 M ................................................................................. 0,050
NADP 10 mM ............................................................................... 0,020
MgCl
2
0,5 M (indispensabile) ..................................................... 0,010
H
2
O ................................................................................................ 0,847

Volume finale (in cuvetta) ....... 0,997
20


Lo studente pu verificare teoricamente che il O.D. potr variare da 0,062 (per 0,5 moli consegnate) a
0,622 (per 5 moli consegnate). Il O.D. registrato, diviso per 6,220, fornir le moli presenti in cuvetta.
Moltiplicando per 50 (valore che considera la diluizione subita dal campione in cuvetta) si otterranno le
moli totali, che lo studente ha ricevuto con la Eppendorf.
Questo il valore da riportare nella relazione, per il singolo nucleotide ATP, indicando ovviamente zero se
eventualmente assente (si tenga presente che possibile riscontrare tracce anche in caso di assenza, in
quanto i componenti che ha ricevuto lo studente non sono puri al 100 % ). La eventuale assenza di
nucleotidi ricever conferma dallanalisi qualitativa TLC.


Analisi dellADP
In una cuvetta da spettrofotometro si aggiungono i
seguenti volumi :
TRIS 1,0 M - pH 8,0 ................... 0,050 ml
Campione .................................... 0,030 ml
NADH 5 mM .............................. 0,030 ml
PEP 0,1 M .................................... 0,010 ml
MgCl
2
0,5 M ............................... 0,010 ml
H
2
O .............................................. 0,866 ml
Tot. 0,996 ml
Si agita e si registra lO.D. iniziale a 340 nm;
quindi si aggiungono 2 l di Piruvato cinasi e 2 l
di LDH. Dopo circa 2 minuti si legge allo
spettrofotometro lO.D. finale. Il O.D. (in
decremento) corrisponde allADP presente nel
campione. La quantit precisa verr ricavata con un
calcolo identico a quello utilizzato per ricavare
lATP.




Analisi dellAMP
Nella stessa cuvetta, dopo aver eseguito la determinazione dellADP, si aggiungono 4 l di ATP 50 mM
(0,2 moli totali), si agita e si attende circa 2 minuti per dar modo alle eventuali impurezze di ADP
contenute nellATP aggiunto di reagire con la PK etc. Si legge nuovamente lO.D. iniziale e si aggiungono
2 l di Miocinasi. Dopo 2 minuti si pu leggere il valore di O.D. Il O.D. (in decremento) corrisponde al
doppio dellAMP presente.
Se lOD scende al di sotto di 0,18 occorre fare attenzione : il NADH aggiunto risulta insufficiente e di
fatto stato quasi tutto ossidato a NAD. In tal caso occorre ripetere le misure per ADP ed AMP, utilizzando
solo 10 l del campione (ricordandosi poi di moltiplicare per 100 anzich per 50). LAMP potrebbe infatti
richiedere un O.D. maggiore di quello disponibile, anche perch ossida - con la catena di reazioni
realizzata in cuvetta - una quantit doppia di NADH rispetto a quello ossidato dallADP. Infatti, con 5
moli (quantit massima) di AMP il O.D. teorico con 20 l di campione sarebbe 1,244. In presenza
eventuale di altre 5 moli di ADP (la quantit massima), il O.D. teorico con 20 l sarebbe 1,244 + 0,622
(max per ADP)= 1,866; ben superiore ai teorici (O.D. = 0,933, disponibili con 0,030 ml di NADH 5 mM).

Il O.D. dovuto allADP ed il O.D. dovuto allAMP (questultimo devessere opportunamente
diviso per due ) debbono essere divisi per 6,22 e moltiplicati per 50 per avere la concentrazione espressa in
millimolarit (mM) del campione, che corrisponde alle moli / ml, ovvero alle umoli totali ricevute dallo
studente. Si moltiplicher invece per 100 se in cuvetta sono stati trasferiti 10 l di campione.

21
N.B. Ciascuno gruppo di lavoro tenuto a redigere
la relazione con lanalisi dei dati ottenuti, da consegnare
una settimana dopo la conclusione del laboratorio.
Nella relazione non devono essere descritte la procedure
eseguite, ma riportate soltanto le letture eseguite allo
strumento, con le osservazioni essenziali circa i processi
osservati. Occorre altres allegare i grafici ottenuti con
le misure cinetiche, con le relative elaborazioni
numeriche.
Ogni studente consegner, alla fine del turno, la scheda
che gli verr consegnata dal docente (che pu anche
ritagliare dalla presente pagina), dove indicher il
numero del campione incognito ricevuto, ed i risultati
ottenuti (espressi in moli totali) mediante lanalisi
cromatografica ed enzimatica del campione a
concentrazioni incognite di nucleotidi adenilici.
Nella relazione non dovranno comparire i dati relativi
alla prova incognita.











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LABORATORIO DI BIOLOGIA SPERIMENTALE II
settore : Chimica Biologica

RISULTATI DELL ANALISI DEI NUCLEOTIDI ADENILICI :

Nome e Cognome : .................................................................................

n del campione : ........ ........................


ATP ADP AMP


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moli ...................... ............................ .............................



Data ................................. Firma .........................................................