Nome: Amalia

Cognome: Montini

Titolo: Esperienza di laboratorio I: Cromatografia su strato sottile

Cenni teorici

La cromatografia un metodo chimico-fisico per separare specifiche sostanze al fine di risolvere la

miscela. Questa tecnica si basa sulla diversa distribuzione di composti in due fasi immiscibili:

-una fase stazionaria (solida o liquida)

-fase mobile (liquida o gassosa)

La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica
tra le due fasi (coefficiente di ripartizione Kd=Cs/Cm). In particolare, nella cromatografia su strato
sottile, la fase stazionaria forma uno strato sottile (circa 1 mm) su piastre di vetro, plastica o di
metallo. La fase mobile passa attraverso quella stazionaria per capillarit in senso verticale. Gli
analiti si separeranno in maniera differente a seconda della capacit che ogni molecola o ione
possiede nel distribuirsi fra le due differenti fasi cromatografiche, instaurando dei legami chimici
deboli: prevalentemente legami dipolo-dipolo- e legami idrogeno. La polarit fondamentale per la
scelta delleluente poich da essa che dipende lentit del trascinamento delle sostanze lungo la
lastrina in una TLC. Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in
grado di interagire con i gruppi polari della silice: dunque quanti pi polari sono i composti, tanto
pi verranno trattenuti dalla fase stazionaria.

I diversi componenti della miscela si localizzeranno in punti diversi della lastra, dopo aver fermato
la corsa cromatografica. La posizione degli analiti sul cromatogramma viene definita dal valore:
Rf= (Retardation factor) che rappresenta il rapporto tra distanza di migrazione dallanalita e quella
del fronte della fase mobile, a partire dal punto di deposizione del campione. Se l'analita interagisce
nella medesima maniera con entrambe le fasi, si ritrover ripartitita in entrambe (in questo caso la
miscela non risolta) ed otteremo un valore di Rf vicino ad 1. Eventualmente, la risoluzione di
componenti non separabili con una sola corsa si pu ottenere con la cromatografia bidimensionale:
la lastra ruotata di 90 gradi e si procede con unaltra separazione, con una fase mobile differente. I
metodi di rielazione dipendono delle caratteristiche dellanalita (metodi diretti) o di suoi derivati
(metodi indiretti): -Colorimetrici -Fluorimetrici -Rivelazione con luce UV -Autoradiografici
(radioattivit). Pu essere utilizzata a scopi quantitativi mediante lanalisi densitometrica del
cromatogramma. La cromatografia su strato sottile pu risultare estremamente utile, oltre che per
definire il numero e l'identit di sostanze presenti in un campione, per permetterci di capire il potere
eluotropico di un solvente in modo tale che possa eluire efficientemente molecole nella
cromatografia su colonna: questo, infatti, lobiettivo di codesta esperienza di laboratorio

Fase stazionaria:

La fase stazionaria, rappresentata da gel di silice, forma uno strato sottile su un supporto di
alluminio: inoltre sono stati aggiunti come supporto di caricamento collant, solventi e fluoresceinato
di sodio. Il fluoresceinato di sodio un composto non visibile alla luce del sole; solo quando
irradiato assorbe energia emessa sotto forma di fluorescenza di colore verde: grazie alla presenza di
doppi legami sono favorite le transizioni elettroniche con sigma pi piccolo (poich i sistemi sono
coniugati avr una emissione intensa). Se sulla lastrina sono presenti dei composti in grado di
assorbire la radiazione UV, ma non di riemettere luce per fluorescenza, in corrispondenza delle
macchie dei composti compare una colorazione viola.

Preparazione della lastrina

Con lutilizzo di un taglierino, si ritagliano da un foglio per TLC delle strisce rettangolari di
alluminio ricavando 5 lastrine che ci permettano una buona migrazione (che dipende anche
dallaltezza della lastrina).

A poco meno di 1 cm dalla base si traccia con la matita una linea orizzontale
e si segnano tre punti: due corrispondenti alle singole miscele ed uno centrale
al mix, per verificare sulla linea retta se si sono separate correttamente). In
questa esperienza sono stati utilizzati come composti da separare p-
nitrofenolo e acetanilide. Sono stati annotati ,sopra i punti, i nomi delle sostanze da eluire e sulla
sommit della lastrina la composizione della miscela eluente che verr utilizzata. Si Immerge la
punta di un capillare nella soluzione, mettendo a contatto la punta del capillare con il punto segnato
sulla lastrina corrispondente al composto di riferimento, lasciando depositare il contenuto del
capillare sulla silice. E necessario asciugare il solvente, soffiando leggermente sulla superficie
della lastrina, in quanto le macchie potrebbero propagarsi.

Preparazione della camera di eluizione.

La camera cromatografica costituita da un recipiente, generalmente di vetro, dotato di un tappo a
tenuta; inoltre importanti garantirsi che, prima del suo utilizzo, sia asciutta. Per una corsa ottimale,
si utilizzano 10 mL di eluente con lausilio di un cilindro graduato. I solventi pi comuni possono
essere ordinati rispetto alla loro polarit in modo seguente: esano < diclorometano < dietiletere <
etil acetato < etanolo.

Il primo approccio provato di:

100% di esano
In seguito sono stati variati i rapporti tra i componenti (polare e apolare) al fine di ottimizzare la
separazione, utilizzando un rapporto esano-acetato di etile di:
9:1
7:3
1:1

In base alle proporzioni tra i solventi, vengono utilizzate diverse

concentrazioni e poi versate nella camera cromatografica. Chiudere col tappo
,assicurandoci che il solvente non evapori, e agitare in modo da mescolare la
soluzione. Si asciughi l'interno del barattolo col phon.

Eluizione

Nella fase di eluizione, dopo essersi assicurati che il solvente non sia
evaporato, si immerge la lastrina nella soluzione eluente e si chiude il
contenitore. Si lascia che il solvente salga per capillarit a circa 1 cm
dall'estremit superiore della lastrina che verr quindi estratta. Il livello raggiunto dall'eluente
segnato a matita;dopodich bisogna asciugare rapidamente la superficie con un phon.

Visualizzazione

La lastrina illuminata con la lampada a raggi Ultra Violetti motivo per cui risulter illuminarsi di
verde grazie alla presenza dellindicatore di fluorescenza

Determinazione del rapporto di eluizione:

Dopo aver evidenziato le bande ,ricavare il rapporto di eluizione delle sostanze di riferimento per
ogni miscela eluente. Tale valore si ottiene dividendo la distanza percorsa dallanalita per la
distanza percorsa dal fronte del solvente. Il primo valore si misura dal punto in cui il soluto stato
applicato fino alla porzione centrale della macchia pi densa; la distanza percorsa dal solvente si
calcola dal punto di applicazione fino al fronte di migrazione del solvente (questa operazione deve
essere effettuata appena la lastrina stata rimossa dalla camera cromatografica perch il solvente
potrebbe risultare non visibile a causa dell evaporazione).

Analisi dei risultati:

Dati i due composti, p-nitrofenolo e acetanilide, abbiamo effettuato una separazione cromatografica
utilizzando esano e acetato di etile a differenti concentrazioni come solventi.
Nella prima prova, la fase mobile rappresentata al 100% dallesano: come possibile osservare,
lesano da solo non riesce a smuovere le due sostanze in quanto troppo poco polare.
Nella seconda prova, con un rapporto esano/acetato di etile 9:1 le due sostanze hanno migrato poco,
infatti le bande nel mix si compenetrano.
Nella terza prova, aumentando il quantitativo di acetato di etile in un rapporto 7:3, si avverte una
maggiore migrazione delle due sostanze e per questo si scelto di utilizzare, nella quarta prova, un
rapporto 1:1 delle sostanze per permettere che le due bande migrino oltre met lastrina. Dai risultati
emerso che in questa ultima scelta il mix si separato bene e le singole miscele hanno migrato