INTRODUZIONE AI METODI

CROMATOGRAFICI

La cromatografia comprende un variegato ed importante gruppo di metodi che permettono la

separazione, l’identificazione e la determinazione quantitativa dei componenti di miscele anche
molto complesse.

La cromatografia nasce come tecnica separativa di miscele omogenee, tecnica affine all’estrazione
con solvente (l’estrazione si basa sulla diversa affinità che hanno i componenti di una miscela nei
confronti di due liquidi immiscibili).

Se la cromatografia viene utilizzata esclusivamente come tecnica separativa si parla di cromatografia

preparativa, si utilizzano quantità macroscopiche di campione per isolare e purificare una quantità
significativa del componente di una miscela, è molto utilizzata nell’industria farmaceutica e in campo
biochimico.
Se la cromatografia viene utilizzata come tecnica analitica qualitativa e quantitativa si parla di
cromatografia analitica, si utilizzano quantità microscopiche di campione.

La cromatografia si basa sulla diversa affinità che hanno i componenti in una miscela omogenea nei
confronti di due fasi separate e distinte.

Un sistema cromatografico è sempre costituito da due fasi:

-fase stazionaria (o fase fissa) che può essere solida o liquida.
-fase mobile (o eluente) che può essere un liquido (cromatografia in fase liquida) o un gas
(cromatografia in fase gassosa) o un fluido supercritico (cromatografia supercritica).

La fase stazionaria è immobilizzata ed opportunamente supportata e su di essa scorre in modo

continuo la fase mobile, che contiene la miscela da separare.
Maggiore è l’affinità di una sostanza presente nella miscela per la fase stazionaria e maggiore è il
tempo che la sostanza trascorre in essa.

Sostanze diverse hanno diversa affinità con la fase stazionaria e quindi vengono separate poiché
trascorrono in essa tempi diversi.

La cromatografia nasce dall’esperimento fondamentale del chimico russo Tsweet. Egli separò nel
1906 un estratto in etere di petrolio (miscela di idrocarburi saturi con 5/6 atomi di carbonio) di
clorofille, mediante una colonna di vetro riempita di carbonato di calcio. La miscela posta in testa
alla colonna venne separata facendo percolare continuamente l’etere di petrolio. Il termine
“cromatografia” deriva dal greco, dalle parole “colore” e “scrittura” e significa “tracciato colorato”.
 Esempio di colonna cromatografica preparativa

a) Esempio di colonna cromatografica analitica b) Registrazione del relativo cromatogramma

Le numerose tecniche cromatografiche possono essere classificate secondo diversi criteri, in base alla
modalità di esecuzione si distinguono in tecniche planari e tecniche in colonna.
Ad eccezione della cromatografia su carta e della cromatografia su strato sottile (TLC), che
costituiscono le tecniche planari, tutte le tecniche cromatografiche, strumentali e non, vengono
condotte con l’utilizzo di una colonna. L’analisi cromatografica strumentale consiste nella
registrazione di un cromatogramma (tracciato che indica la quantità di sostanza che arriva al rivelatore
in funzione del tempo).
 PROCESSO DINAMICO DI DISTRIBUZIONE
In ogni istante della separazione cromatografica, ogni sostanza presente nella miscela è coinvolta in
un processo dinamico di trasferimento tra le due fasi, dalla mobile alla stazionaria e viceversa.

fase mobile fase fissa

↓ vd
Cm Cs
vi

vd è direttamente proporzionale a Cm
vi è direttamente proporzionale a Cs
all’equilibrio vd=vi

Se si suppone il raggiungimento di una condizione di equilibrio dinamico di distribuzione della

sostanza nelle due fasi (equilibrio sperimentalmente in realtà non raggiungibile a causa del
trascinamento continuo della fase mobile), la sua affinità nei confronti della fase stazionaria viene
valutata quantitativamente mediante la costante di distribuzione Kc (costante termodinamica).

Indicando con C la concentrazione molare della sostanza nelle due fasi all’equilibrio (le due velocità
di trasferimento da una fase all’altra diventano uguali), la condizione di equilibrio viene espressa:

Kc = Cs/Cm
Kc dipende da:
natura chimica della sostanza
coppia di fasi
temperatura
Sostanze diverse avendo Kc differenti vengono trattenute in colonna per tempi diversi.

TEMPO DI RITENZIONE (tr)

Tempo che la sostanza trascorre in colonna, ovvero intervallo di tempo che intercorre tra l’arrivo
della sostanza al rivelatore e il suo ingresso in colonna.

Se una sostanza non ha affinità per la fase stazionaria (Kc=0 poiché Cs=0) non viene trattenuta da
essa e quindi attraversa la colonna con la stessa velocità della fase mobile, il suo tempo di ritenzione
viene definito tempo morto (tm), detto anche tempo della fase mobile.

In un esperimento cromatografico il tempo trascorso nella fase mobile (tempo morto) è uguale per
tutte le sostanze. Ciò che varia per sostanze diverse è il tempo trascorso nella fase stazionaria, tale
tempo viene definito tempo di ritenzione corretto (t’r).

tr = tm+t’r
tempo di ritenzione=tempo morto+tempo ritenzione corretto

tempo trascorso in colonna=tempo trascorso nella fase mobile (uguale per tutte le sostanze)+tempo
trascorso nella fase stazionaria (diverso per sostanze diverse)

Per calcolare il tempo di ritenzione corretto t’r = tr-tm

La velocità lineare media di una sostanza attraverso una colonna di lunghezza L si calcola
ῡ = L/tr

La velocità lineare della fase mobile o di una sostanza non trattenuta attraverso una colonna di
lunghezza L si calcola
u = L/tm

CROMATOGRAMMA
E’ il tracciato che indica la quantità di sostanza misurata dal rivelatore in funzione del tempo. La
misura del tempo di ritenzione della sostanza permette l’analisi qualitativa, la misura dell’area del
picco permette l’analisi quantitativa.
In condizioni ideali ogni sostanza dà origine ad un picco simmetrico con un andamento gaussiano. Il
parametro che indica il grado di dispersione intorno al valore centrale è la deviazione standard σ
(semidistanza tra i due punti di flesso).
In condizioni reali i picchi possono essere asimmetrici con una coda anteriore o posteriore. A parità
di quantità di sostanza (o area del picco) i primi sono alti e stretti mentre gli ultimi sono bassi e larghi
e ciò come conseguenza dell’inevitabile diffusione longitudinale della sostanza sotto il gradiente di
concentrazione.
 VOLUME DI RITENZIONE Vr
Anziché valutare il tempo di ritenzione è possibile considerare il volume di ritenzione Vr, ovvero il
volume di eluente necessario per far uscire una sostanza dalla colonna, tale grandezza è direttamente
proporzionale al tr se il flusso della fase mobile è costante.
Vr = F.tr
Volume di ritenzione=flusso fase mobile.tempo di ritenzione
Il flusso della fase mobile indica il volume di eluente che passa nella colonna nell’unità di tempo
attraverso una sezione perpendicolare allo scorrimento.
Vr = Vm + V’r
Vr= volume di eluente necessario per far uscire una sostanza dalla colonna
Vm=volume morto detto anche volume della fase mobile, ovvero volume di colonna non occupato
dalla fase stazionaria e quindi disponibile per la fase mobile
V’r= surplus di eluente necessario per far uscire la sostanza

EQUAZIONE FONDAMENTALE
CROMATOGRAFIA
Vr = Vm + V’r
V’r varia per le diverse sostanze, per la stessa sostanza è direttamente proporzionale alla costante di
distribuzione Kc (dipende dall’affinità della sostanza per la fase stazionaria) ed è direttamente
proporzionale al volume di fase stazionaria Vs.

V’r=Kc.Vs=(Cs/Cm).Vs Vr = Vm + Kc.Vs equazione fondamentale della

cromatografia

Per determinare sperimentalmente Kc di una sostanza dall’equazione fondamentale è necessario

determinare sperimentalmente Vr Vm (facilmente determinabili) Vs (difficilmente misurabile
sperimentalmente). Per valutare il grado di affinità di una sostanza per la fase stazionaria è stato
introdotto un altro parametro che si chiama fattore di ritenzione K, facilmente calcolabile dal
cromatogramma.

FATTORE DI RITENZIONE (K)

Rapporto tra le moli (anziché tra le concentrazioni) di sostanza presenti nelle due fasi all’equilibrio.

K = ns/nm
ns= moli di sostanza nella fase stazionaria all’equilibrio
nm=moli di sostanza nella fase mobile all’equilibrio.

K=ns/nm=(Cs.Vs)/(Cm.Vm)=Kc.(Vs/Vm)

K = Kc.(Vs/Vm)
K dipende da Kc (quindi dalla natura della sostanza, dalla coppia di fasi e dalla temperatura) ma anche
dal rapporto tra i volumi delle fasi del sistema cromatografico e quindi dalle dimensioni, forma,
granulometria e grado di impaccamento delle particelle della fase stazionaria. Non dipende dalla
lunghezza della colonna e dal flusso dell’eluente.
Dall’equazione fondamentale della cromatografia si ricava l’equazione per il calcolo sperimentale di
K di una sostanza in un determinato sistema cromatografico.

Dalla relazione precedente Kc=K.(Vm/Vs)

sostituendo nell’equazione fondamentale Vr=Vm+(Kc.Vs)
Vr=Vm+(K.Vm)
K=(Vr-Vm)/Vm=V’r/Vm
se il flusso F è costante K=(F.t’r)/(F.tm)

K = t’r/tm
K indica il rapporto tra il tempo trascorso dalla sostanza nella fase stazionaria ed il tempo trascorso
nella fase mobile, ovvero indica quanto una sostanza viene ritardata dalla fase stazionaria. E’ specifica
per ogni sostanza in un determinato sistema cromatografico e in genere assume valori che vanno da
1 a 10.
K=1 l’affinità per la fase stazionaria è uguale a quella per la fase mobile
K=10 l’affinità per la fase stazionaria è dieci volte superiore a quella per la fase mobile
K=0 nessuna affinità per la fase stazionaria.

PARAMETRI PER VALUTARE LE PRESTAZIONI

DI UN SISTEMA CROMATOGRAFICO
A COLONNA
RISOLUZIONE
Capacità di un sistema cromatografico di separare due picchi consecutivi. La risoluzione è
tanto migliore quanto maggiore è la distanza fra i picchi e quanto minore è la larghezza dei due
picchi. La risoluzione si valuta quantitativamente dal cromatogramma mediante il calcolo di Rs

Rs = (tr2-tr1) / (Wb1+Wb2)/2 = 2Δtr / (Wb1+Wb2)

Rs = risoluzione fra due picchi consecutivi
Rs = distanza fra due picchi/semisomma delle larghezze alla base dei picchi

Wb = larghezza alla base del picco (viene ottenuto tracciando le tangenti al

punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base)

Wb = 4.σ
Rs = 1,5 risoluzione completa
Una risoluzione superiore a 1,5 è inutile poiché aumentano i tempi di ritenzione e quindi il tempo di
lavoro.
La risoluzione di due picchi consecutivi dipende dalla selettività
e dall’efficienza.

SELETTIVITA’
Capacità di distanziare due picchi consecutivi ovvero capacità di eluire sostanze diverse in
tempi diversi.
E’ riferita ad una coppia di sostanze in una determinata colonna.
Sostanze diverse rispetto ad una determinata coppia di fasi hanno Kc K tr’ diversi. La selettività
dipende dalla coppia di sostanze, dalla coppia di fasi e dalla temperatura. E’ indipendente
dalle caratteristiche strutturali della colonna.
Per valutare matematicamente la selettività della colonna si calcola il fattore di selettività α.

α = Kc2/Kc1= K2/K1= t’r2 / t’r1

α deve essere sempre >1

Una elevata selettività non garantisce una buona risoluzione poiché essa dipende anche dalla
larghezza dei picchi, ovvero dipende anche dall’efficienza.
 EFFICIENZA
Capacità di eluire una sostanza con un picco stretto, ovvero capacità di eluire tutte le molecole
della stessa sostanza nello stesso tempo.
E’ riferita ad una sostanza e dipende dalle caratteristiche strutturali della colonna.
Il parametro più semplice per esprimere l’efficienza è la larghezza alla base del picco Wb, che tende
però ad aumentare con il tempo di ritenzione, quindi si è stabilito di calcolare il numero di
piatti teorici N

N = (tr/σ)2 poiché Wb = 4.σ sostituendo nella relazione precedente σ = Wb/4

N = 16(tr/Wb)2
In analogia con la distillazione, N (adimensionato) indica il numero degli equilibri tra le due fasi
che la sostanza instaura durante l’attraversamento della colonna. L’efficienza aumenta con
l’aumentare di N. Aumentando la lunghezza della colonna aumenta N, ma aumenta anche il tempo
di lavoro.

E’ possibile calcolare N anche facendo riferimento alla larghezza del picco a metà altezza Wh
Wh=1,177Wb N=5,545(tr/Wh)2

Per confrontare l’efficienza di colonne di diversa lunghezza si misura l’efficienza utilizzando H

altezza equivalente di un piatto teorico (H.E.T.P.)

H=L/N L=lunghezza colonna

H indica il tratto di colonna in cui si instaura un equilibrio, l’efficienza aumenta con il diminuire di
H.

Per una data colonna H dipende dalla velocità lineare della fase mobile u.
H = f(u)
La relazione che esprime tale funzione è detta equazione di Van Deemter.

EQUAZIONE DI VAN DEEMTER

L’equazione permette di determinare la velocità ottimale della fase mobile durante l’eluizione,
ovvero la velocità che minimizza il valore di H (migliora l’efficienza).

L’equazione è la somma di tre funzioni, una costante, una di proporzionalità diretta ed una di
proporzionalità inversa.

H = A + B/u + C.u
H = altezza equivalente di un piatto teorico
U = velocità lineare della fase mobile
A B C sono parametri che dipendono dalle caratteristiche della colonna

Hmin = A+2√(B.C)
uot = √(B/C)

L’equazione è la somma di tre funzioni perché sono tre i fattori che causano l’allargamento di
un picco e quindi il peggioramento dell’efficienza.
Ogni sostanza deve essere introdotta in colonna in banda stretta e ciò sperimentalmente si ottiene
introducendo velocemente una piccola quantità di campione.
Anche se tutte le molecole di una sostanza vengono introdotte in colonna nello stesso
momento, durante l’eluizione si verificano tre fenomeni che determinano l’allargamento del
picco.
PERCORSI MULTIPLI
Le molecole della sostanza possono compiere in colonna percorsi di diversa lunghezza
che le trattengono in colonna per tempi diversi. Questo fenomeno è correlato al primo
termine dell’equazione (A), è un parametro costante (retta parallela all’asse delle x), è
indipendente dalla velocità della fase mobile, dipende invece dalla granulometria della fase
stazionaria. Per minimizzare il valore di A (migliorare l’efficienza) le particelle della fase
stazionaria devono essere sferiche e di diametro piccolo ed uniforme.
DIFFUSIONE LONGITUDIALE SOTTO IL GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE
Maggiore è il tempo di permanenza della sostanza in colonna e maggiore è la diffusione che
avviene in tutte le direzioni, la diffusione longitudinale determina allargamento del picco.
Questo fenomeno è correlato al secondo termine dell’equazione (B/u). B/u diminuisce con
l’aumentare della velocità della fase mobile, poiché diminuisce il tempo di diffusione.
La diffusione diminuisce con l’aumentare delle dimensioni delle molecole della sostanza e con
l’aumentare della viscosità dell’eluente poiché aumenta l’attrito con il fluido in cui avviene la
diffusione.
La diffusione in un gas è più veloce della diffusione in un liquido (più viscoso), per questo
motivo la velocità lineare ottimale in gascromatografia è più elevata rispetto alla cromatografia
in fase liquida.

RESISTENZA AL TRASFERIMENTO DI MASSA DA UNA FASE ALL’ALTRA

In conseguenza del trascinamento da parte della fase mobile, la sostanza incontra difficoltà
nell’instaurare un equilibrio tra le due fasi. Tale fenomeno è associato al terzo termine (C.u).
Per minimizzare C.u è necessaria una velocità della fase mobile bassa in modo che la sostanza
abbia il tempo di instaurare un equilibrio nei diversi tratti della colonna prima di essere trascinata
dall’eluente. Con il diminuire del diametro della colonna l’efficienza migliora poiché diminuisce
la distanza attraverso la quale la sostanza deve diffondere per raggiungere la fase stazionaria.
Con il diminuire dello spessore della fase stazionaria l’efficienza migliora perché la sostanza impiega
meno tempo per diffondere dalla parte più profonda della fase stazionaria alla fase mobile.

CAPACITA’
Quantità massima di miscela che la fase stazionaria può trattare senza compromettere la qualità della
separazione. In genere si misura in mg di campione per un g di fase stazionaria. Questo parametro è
particolarmente significativo in cromatografia preparativa.
 ASIMMETRIA PICCHI
Una buona separazione deve fornire picchi simmetrici, alcuni picchi possono presentare asimmetrie,
ovvero deformazioni di fronting (frontale, deformazione anteriore) o tailing (di coda, deformazione
posteriore).
Sono molteplici i fattori che determinano deformazioni dei picchi:
-introduzione scorretta del campione (l’introduzione deve essere veloce e con piccole quantità di
campione per garantire una banda iniziale stretta)
-saturazione dei siti attivi della fase stazionaria, ovvero superamento della capacità della fase
stazionaria (la sostanza non deve essere troppo concentrata nel campione) ecc.

L’asimmetria di un picco può essere quantificata calcolando il fattore di asimmetria B/A

Per calcolare la risoluzione di due picchi asimmetrici al denominatore si pone la somma delle
semibasi che si affacciano.
Rs = (tr2-tr1) / (B1+A2)

TEMPI DI LAVORO
Per ottimizzare il tempo di lavoro è possibile effettuare, durante l’eluizione, una variazione
programmata di una variabile che influisce sulla risoluzione, in modo da garantire inizialmente una
buona risoluzione e successivamente una riduzione dei tempi di lavoro.

In gascromatografia (GC) si può effettuare una variazione della temperatura, in cromatografia liquida
ad elevate prestazioni (HPLC) una variazione della polarità (composizione) dell’eluente, in
cromatografia con fluido supercritico (SFC) una variazione di pressione.
 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE
CROMATOGRAFICHE IN BASE AL MECCANISMO DI
INTERAZIONE DELLE SOSTANZE CON LA FASE
STAZIONARIA

CROMATOGRAFIA D’ADSORBIMENTO
La fase stazionaria è solida, gel di silice SiO2 o allumina Al2O3 (fasi stazionarie polari),
granulare e sferica, in modo da aumentare la superficie adsorbente. La fase mobile può essere
liquida (cromatografia liquido-solido LSC) o gassosa (cromatografia gas-solido GSC).
L’adsorbimento è un’interazione fra le molecole di una sostanza liquida o gassosa ed i siti
attivi presenti sulla superficie di una fase solida. L’interazione è dovuta all’instaurarsi di
forze intermolecolari tra la fase stazionaria e le molecole dei composti presenti nella miscela da
separare (legami ad idrogeno, interazioni dipolo-dipolo, dipolo-dipolo indotto).
L’intensità dell’adsorbimento aumenta con:
-polarità e massa molare sostanza adsorbita
-diminuzione temperatura
-aumento pressione se la sostanza adsorbita è un gas

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE
La fase stazionaria è liquida, opportunamente stesa in strato sottile su un supporto granulare
solido inerte. La fase mobile può essere liquida (cromatografia liquido-liquido LLC) o
gassosa (cromatografia gas-liquido GLC). Le fasi stazionaria e mobile devono essere immiscibili.
Se la fase stazionaria è un liquido polare e quella mobile è un liquido apolare si parla di cromatografia
di ripartizione in fase normale o diretta (NP), se la polarità è invertita si parla di cromatografia di
ripartizione in fase inversa (RP).
 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
La fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, ovvero una matrice polimerica
avente in superficie siti attivi ionici, che scambiano reversibilmente i propri controioni con gli
ioni presenti nella fase mobile (una soluzione acquosa tampone). Le resine sono simili a quelle
utilizzate per la demineralizzazione e l’addolcimento dell’acqua.
-Resine a scambio cationico: i siti attivi hanno carica negativa e scambiano i controioni H+ (resina
in forma acida) oppure Na+ (resina in forma sodica) con cationi presenti nella miscela (per
esempio cationi metallici, amminoacidi ecc). I siti attivi a scambio cationico possono essere forti
come il gruppo solfonico –SO3- o deboli come il gruppo carbossilico -COO-
-Resine a scambio anionico: i siti attivi hanno carica positiva e scambiano i controioni OH- (resina
in forma basica) oppure Cl- (resina in forma clorurata) con anioni presenti nella miscela. I siti
attivi a scambio cationico possono essere forti come il gruppo ammonico quaternario –NR3+ o
deboli come il gruppo amminico secondario o terziario –NH2R+ –NHR2+

Tra le applicazioni della tecnica: addolcimento o deionizzazione acqua, rimozione impurezze ioniche
da composti organici, analisi amminoacidi (mediante variazione del pH dell’eluente gli AA vengono
eluiti secondo il loro punto isoelettrico, ovvero secondo il valore di pH in cui l’AA è in forma
dipolare, cioè privo di carica netta).

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE

La fase stazionaria è costituita da un solido poroso e permette la separazione delle sostanze in
base alle dimensioni molecolari (separazione di sostanze con masse molecolari molto diverse).
Sostanze le cui molecole hanno dimensioni inferiori ai pori delle particelle della fase
stazionaria possono penetrare in essa, dando tempi di ritenzione maggiori rispetto a sostanze con
dimensioni molecolari superiori ai pori, che vengono trattenute poco tempo in colonna.
Utilizzata in biochimica per la purificazione delle macromolecole.
 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
Utilizzata in campo biochimico, è la tecnica cromatografica più selettiva poiché si basa
sull’interazione specifica e reversibile tra un tipo di molecola ed una seconda molecola immobilizzata
sulla fase stazionaria (anticorpo-antigene, enzima-substrato, recettore-ormone). Per esempio uno
specifico anticorpo immobilizzato lega solo la specifica proteina presente in una miscela di proteine,
dopo aver lavato tutte le proteine estranee dalla colonna la proteina viene staccata dal sito attivo
variando il pH dell’elunte.

CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE

CROMATOGRAFICHE IN BASE ALLA MODALITA’
DI ESECUZIONE
CROMATOGRAFIA PLANARE
-Cromatografia su carta (PC)
-Cromatografia su strato sottile (TLC)
CROMATOGRAFIA IN COLONNA
-Gascromatografia (GC)
-Cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC)
-Cromatografia con liquido supercritico (SFC)
 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE
CROMATOGRAFICHE LIQUIDE IN BASE ALLA
POLARITA’ DELLE FASI
CROMATOGRAFIA IN FASE NORMALE O DIRETTA (NP): se la fase stazionaria è solida (quindi
polare) o è un liquido polare mentre la fase mobile è un liquido apolare.
CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA (RP): se la fase stazionaria è un liquido apolare mentre la
fase mobile è un liquido polare.

TLC (cromatografia su strato sottile)

La TLC può essere ascendente (la fase mobile liquida sale per capillarità nella fase fissa) o
discendente (la fase mobile liquida scorre per gravità).

La fase stazionaria viene immobilizzata in strato sottile su una superficie inerte (supporto di
plastica, vetro o alluminio). Sulla parte inferiore della lastrina si traccia con una matita la linea di
partenza su cui si semina la miscela da separare. La lastrina viene poi immersa nella fase mobile
contenuta in una camera cromatografica preventivamente saturata con la fase mobile.
Conclusa l’eluizione, con una matita si traccia la linea del fronte del solvente.
In TLC in fase diretta (normale), la fase stazionaria è gel di silice o allumina, mentre l’eluente è una
miscela di solventi apolari (cromatografia di adsorbimento).
In TLC in fase inversa la fase stazionaria è liquida, lo strato solido viene imbevuto con la fase
stazionaria liquida e la fase mobile è polare (cromatografia di ripartizione).
Da un punto di vista teorico la TLC può essere usata per l’analisi qualitativa confrontando la corsa di
una sostanza presente nella miscela con quella di una sostanza pura seminata contemporaneamente
alla miscela sulla linea di semina.
L’analisi quantitativa può essere svolta grattando la macchia di un componente della miscela,
solubilizzandola e sottoponendola ad analisi spettrofotometriche. Per l’individuazione di sostanze
non colorate si possono utilizzare fasi stazionarie mescolate con una sostanza fluorescente. Dopo
l’eluizione, utilizzando una lampada UV è possibile individuare le macchie nelle zone non colorate
della lastrina. La TLC viene oggi utilizzata come tecnica esplorativa per determinare la miglior
composizione dell’eluente da utilizzare in HPLC.

PARAMETRI PER VALUTARE LE PRESTAZIONE DELLA TLC

SELETTIVITA’: capacità di distanziare due macchie consecutive.
Sostanze diverse avendo diversa affinità per la fase stazionaria, percorrono spazi diversi che
vengono valutati con il fattore di ritenzione (Rf).

Rf = d/del
Rf = distanza percorsa dalla macchia/distanza percorsa dall’eluente

EFFICIENZA: capacità di mantenere la macchia compatta. Maggiore è il tempo di permanenza della

sostanza e maggiore è la grandezza della macchia.
Anche in TLC l’efficienza si misura con N.

N=16(d/W)2

d=distanza centro della macchia dalla linea di semina

 W=diametro della macchia nella direzione dell’eluizione

RISOLUZIONE: capacità di separare due macchie consecutive.

Rs=d/(Wa+Wb)/2
Rs = distanza macchie/semisomma diametri macchie

Esercizio

Una miscela di 5 sostanze è stata separata con una TLC portando la corsa del solvente a 15cm dalla

linea di semina su una lastrina di 5x20cm. Supponendo di aver depositato una macchia di diametro

2 mm, sapendo che la corsa dei componenti è stata 10.2 cm per A, 8.3 cm per B, 5.1 cm per C, 4.7

cm per D e 3.2 cm per E e che le macchie hanno rispettivamente un diametro di 6 mm, 5mm, 4 mm,

4mm, 3 mm. Disegnare il cromatogramma, calcolare gli Rf e gli Rs valutando la qualità della

risoluzione.

Rf1=10.2/15=0.68 Rf2=8.3/15=0.55 Rf3=5.1/15=0.34 Rf4=4.7/15=0.31 Rf5=3.2/15=0.21

Rs1=2x1.9/(5+6)=0.345=3.45 Rs2=2x3.2/(5+4)=0.711=7.11 Rs3=2x0.4/(4+4)=0.1=1
Rs4=2x1.5/(3+4)=0.428=4.28

PRINCIPALI FASI STAZIONARIE SOLIDE (TLC GC HPLC)

GEL DI SILICE (polare): solido granulare sferico che si prepara trattando il silicato di sodio con
acido solforico
Na4SiO4+2H2SO42Na2SO4+H4SiO4
l’acido silicico tende a polimerizzare eliminando molecole di acqua (policondensazione) formando
granuli porosi sulla cui superficie sono presenti i siti attivi polari Si-OH

Questi siti attivi si legano facilmente alle molecole di acqua (umidità dell’aria). Il gel di silice deve
essere essiccato in stufa prima dell’utilizzo in modo da liberare i siti attivi e aumentare la forza
adsorbente.

ALLUMINA (polare): si ottiene trattando chimicamente idrossidi di alluminio. Si possono ottenere

allumine acide, basiche o neutre a seconda dei siti attivi. Anche l’allumina adsorbe facilmente l’acqua
per cui va essiccata in stufa.
 CELLULOSA (polare): polimero del glucosio, i gruppi OH superficiali si legano all’umidità dell’aria
e quindi la TLC su cellulosa (che ha sostituito la cromatografia su carta) è una cromatografia di
ripartizione.

PRINCIPALI FASI STAZIONARIE LIQUIDE

CHIMICAMENTE LEGATE (TLC GC HPLC)
Se il supporto solido inerte viene semplicemente impregnato del liquido che costituisce la fase
stazionaria, si verifica nel tempo una sua continua rimozione da parte della fase mobile.
La cromatografia in fase inversa si è sviluppata grazie alla possibilità di legare
chimicamente fasi stazionarie liquide apolari (catene idrocarburiche) ad un supporto inerte
costituito da gel di silice.
La fase stazionaria liquida viene legata mediante silanizzazione (sililazione) che è un
processo di derivatizzazione che permette di introdurre un gruppo –SiR3 (R3 catene
idrocarburiche) in una molecola in cui è presente un gruppo OH. I gruppi ossidrilici superficiali del
gel di silice reagiscono con il dimetilalchilclorosilano introducendo così catene idrocarburiche da 8
a 18 atomi di carbonio sulla superficie del supporto inerte.

FASE MOBILE LIQUIDA (TLC HPLC)

Costituita da una o più solventi diversi aventi diverso grado di polarità. Per facilitare la scelta della
più opportuna fase mobile esistono delle serie eluotrope in cui diversi solventi sono ordinati secondo
polarità crescente.
 CRITERI GENERALI PER LA SCELTA DELLE PIU’
OPPORTUNE FASI MOBILE E FISSA
-le due fasi non devono interagire, devono essere immiscibili, ovvero devono avere diversa polarità.
-i componenti della miscela devono interagire con entrambe le fasi, ma con intensità diversa,
ogni sostanza deve avere un’affinità per la fase stazionaria non troppo bassa e non troppo elevata.
- la miscela da separare deve essere solubile nella fase mobile.

La cromatografia d’adsorbimento (in fase normale) viene preferita per separare composti che
appartengono a classi diverse, l’ordine di eluizione avviene secondo polarità crescente.
La cromatografia di ripartizione (in fase inversa) si utilizza per separare composti appartenenti
alla stessa classe, sfruttando le piccole differenze di polarità si sostanze appartenenti ad una
serie omologa. In tal caso l’ordine di eluizione avviene secondo polarità decrescente.

GASCROMATOGRAFIA GC
Tecnica analitica strumentale su colonna, la fase mobile (carrier, gas di trasporto) è costituita
da un gas inerte che può essere azoto, idrogeno, argon o elio. La miscela campione è
costituita da un miscuglio gassoso o da un miscuglio di liquidi vaporizzabili o da solidi
solubilizzati e poi vaporizzati. La fase stazionaria può essere solida (GSC, con scarse applicazioni) o
liquida (GLC, molto utilizzata). I limiti della GC sono due, non sono analizzabili sostanze non
vaporizzabili e sostanze termolabili. In GC si utilizzano due tipologie di colonne:

-COLONNE IMPACCATE: lunghezza 1-6 m con diametri 0.75-4mm, sono di acciaio e sono
avvolte a spirale. Sono le colonne tradizionali completamente riempite di fase stazionaria
granulare. Il gas di trasporto attraversa la colonna passando negli interstizi tra le particelle della
fase stazionaria. Sono colonne poco permeabili al gas di trasporto e che quindi offrono molta
resistenza.

-COLONNE CAPILLARI (tubolari aperte): sono d’acciaio, hanno una lunghezza di 15-
100m, diametri che variano da 0.1-0.75mm. La fase stazionaria riveste in strato sottile le pareti
interne della colonna, è presente un lume centrale che viene attraversato dal gas di trasporto, quindi
offrono meno resistenza rispetto alle colonne impaccate e possono essere molto lunghe.
 a) Colonna impaccata b) Colonna capillare

PARAMETRI PER VALUTARE LE PRESTAZIONI DI UN SISTEMA

GASCROMATOGRAFICO
SELETTIVITA’: capacità di distanziare due picchi consecutivi. Si valuta con il fattore di separazione
α=Kc2/Kc1=K2/K1=t’r2/t’r1. In GC la selettività dipende dalla natura delle sostanze da separare,
dalla natura della fase stazionaria (la fase mobile è un gas inerte) e dalla temperatura. La
variabile operativa temperatura riveste un ruolo fondamentale. L’aumento di temperatura
determina un aumento della tensione di vapore delle sostanze da separare, che quindi
tendono ad interagire meno con la fase stazionaria determinando una diminuzione della
selettività. La temperatura non può essere troppo bassa poiché aumentano i tempi di lavoro con
conseguente allargamento dei picchi (minore efficienza). La temperatura va quindi stabilita facendo
un compromesso fra due i due fattori contrastanti. La temperatura di esercizio deve essere
comunque simile alla temperatura media di ebollizione delle sostanze da separare. Se le
sostanze da separare hanno temperature di ebollizione simili si effettua una separazione
isoterma. Se le temperature di ebollizione delle sostanze da separare sono diverse si effettua
una separazione a temperatura programmata, in genere la separazione inizia a temperatura
costante, successivamente l’operatore programma un aumento della temperatura graduale in modo
da facilitare l’uscita delle ultime sostanze.
EFFICIENZA: capacità di eluire una sostanza con un picco stretto. Si misura con N=16.(tr/Wb)2. Le
colonne capillari sono decisamente più efficienti rispetto a quelle impaccate per diversi motivi. A
parità di lunghezza una colonna capillare ha già di per sé un’efficienza migliore rispetto a
quella impaccata e ciò perché non si verifica un allargamento di banda dovuto ai percorsi
multipli, inoltre poiché lo strato di fase stazionaria è molto sottile, il trasferimento di massa
da una fase all’altra è rapido. Per migliorare l’efficienza di una colonna capillare (aumentare
N) è possibile allungare molto la colonna. Non è possibile invece avere colonne impaccate
troppo lunghe poiché offrono una resistenza al flusso del gas di trasporto molto elevata. Con
una colonna capillare inoltre è possibile ridurre i tempi di lavoro, anche se sono lunghe,
aumentando la velocità della fase mobile e ciò perché l’efficienza diminuisce poco. Per una
colonna impaccata invece un aumento della velocità del gas di trasporto fa diminuire molto
l’efficienza. Equazione di Van Deemter per una colonna impaccata e capillare.

Per migliorare l’efficienza per una colonna impaccata è possibile migliorare la granulometria della
fase stazionaria.

RISOLUZIONE: capacità di separare due picchi consecutivi. Dipende sia dall’efficienza che
dalla selettività e si valuta con Rs=tr2-tr1/(Wb1+Wb2)/2
Le colonne capillari forniscono migliore risoluzione.

CAPACITA’: le colonne capillari, a causa della minore quantità di fase fissa, hanno capacità inferiore
rispetto a quelle impaccate.

SIMMETRIA DEI PICCHI: per avere un picchi simmetrici è necessario introdurre il campione
in piccole quantità e in banda stretta.

SCHEMA A BLOCCHI GASCROMATOGRAFO

Il gas di trasporto è commercializzato in bombole di acciaio sotto pressione, prima dell’ingresso in
colonna attraversa dei setacci molecolari per la rimozione delle impurezze e dell’umidità (andrebbe
ad occupare i siti attivi per esempio del gel di silice).
Il campione viene introdotto, attraverso un setto di gomma, con una microsiringa, nell’iniettore
riscaldato in testa alla colonna, dove viene vaporizzato istantaneamente e portato in colonna dal
gas di trasporto.
Con colonne impaccate si introducono quantità di campione liquido dell’ordine dei microlitri.

Con colonne capillari si introducono quantità di campione liquido dell’ordine dei nanolitri, è quindi
necessaria una valvola di campionamento (splitter) che manda in colonna una frazione del
campione, spurgando il resto.

Campioni gassosi si possono introdurre con siringhe più capienti oppure, per migliorare la
riproducibilità si utilizzano dispositivi a valvola.

Se il sistema di iniezione è poco riproducibile si può usare uno standard interno per effettuare
l’analisi quantitativa.

Le fasi stazionarie più usate sono quelle liquide chimicamente legate ad un supporto inerte.

Il rivelatore può essere universale o selettivo (se selettivo è sensibile solo a determinate sostanze)
inoltre può essere distruttivo o non distruttivo.
Tra i rivelatori più usati c’è quello a ionizzazione a fiamma (FID) che è universale e distruttivo.
Quando il gas di trasporto arriva al FID viene ionizzato creando una corrente di fondo, quando al
rivelatore arriva anche una sostanza si ionizza e la conducibilità aumenta.

Il miglior rivelatore è lo spettrometro di massa, anch’esso universale e distruttivo. Per ogni

sostanza che arriva al rivelatore viene registrato lo spettro di massa che permette l’analisi
qualitativa e quantitativa.
L’analisi quantitativa si basa sulla misura dell’area del picco. Si possono usare diversi metodi:
taratura diretta con un singolo standard, retta di taratura con più miscele standard, metodo
dell’aggiunta e normalizzazione interna.

METODO DELLA NORMALIZZAZIONE INTERNA

Si usa solo se tutti i componenti della miscela sono presenti nel cromatogramma con picchi distinti.
La composizione % in massa di ogni singolo componente coincide con l’area relativa percentuale se
il rivelatore ha la stessa sensibilità per tutti i componenti.
-Il rivelatore ha la stessa sensibilità per tutti i componenti.
Miscela campione di 3 componenti A B C
Stot=SA+SB+SC
%A=(SA/Stot).100 %B=(SB/Stot).100 %C=(SC/Stot).100
-Il rivelatore non ha la stessa sensibilità per tutti i componenti.
Prima di procedere alla normalizzazione interna si effettua una correzione delle aree mediante un
fattore di correzione f che viene determinato dal cromatogramma di una miscela standard. Le aree
corrette sono direttamente proporzionali alle concentrazioni dei componenti e quindi si può procedere
con la normalizzazione interna.
Miscela campione di 3 componenti A B C
Scor=area del picco corretta
C=concentrazione componente nel campione
SAcor/CA=SBcor/CB=SCcor/CC
SAcor=SA./fA
SBcor=SB.fB
SCcor=SC.fC
Miscela standard con concentrazione dei tre componenti C’A C’B C’C
C’=concentrazione dei componenti nello standard
S’=area picco di un componente standard
Si attribuisce ad uno dei componenti fattore di correzione 1
fA=1
S’A.1/C’A=S’B.fB/C’B=S’C.fC/C’C
fB=(S’A/C’A).(C’B/S’B) fC=(S’A/C’A).(C’C/S’C)
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA
PRESTAZIONE (HPLC)
E’ la versione strumentale della cromatografia liquida in colonna a pressione ordinaria.
E’ una tecnica versatile, veloce e relativamente poco costosa che permette la separazione, l’analisi
quali-quantitativa dei componenti di una matrice.
Può essere utilizzata per matrici di natura molto differente poiché possono essere utilizzate
colonne che sfruttano modalità diverse d’interazione con la fase stazionaria (adsorbimento,
ripartizione, scambio ionico, esclusione, affinità).
In HPLC le separazioni vengono condotte a temperature costanti, ma ordinarie, quindi la
tecnica non presenta i limiti della GC (non analizzabili sostanze non volatili o termolabili).
Si utilizzano colonne di acciaio con lunghezze che variano da 3 a 25cm con diametro tra 4 e 10
mm.
La fase stazionaria è granulare con particelle molto più piccole rispetto alla cromatografia su
colonna a pressione ordinaria, la fase stazionaria è molto impaccata e offre elevata resistenza al
flusso della fase mobile.
La fase mobile viene quindi pompata ad elevata pressione con una velocità costante, garantendo
tempi di lavoro ridotti.
L’HPLC può essere condotta utilizzando una miscela di più solventi con composizione costante
(HPLC isocratica) oppure variando gradualmente la composizione in modo da garantire una buona
risoluzione e brevi tempi di lavoro (HPLC in gradiente di concentrazione).
Per quanto riguarda la cromatografia di adsorbimento e di ripartizione le tecniche vengono
classificate in NP-HPLC (in fase normale) e RP-HPLC (in fase inversa).
NP-HPLC: la fase stazionaria è un solido polare o più convenientemente un liquido polare legato,
mentre la fase mobile è apolare (es. n-esano miscelato con quantità variabili di un solvente più polare
come un alcol). Le sostanze vengono eluite secondo polarità crescente.
RP-HPLC: la fase stazionaria è un liquido apolare chimicamente legato mentre la fase mobile è polare
(es. acqua miscelata con quantità crescenti di un solvente meno polare come metanolo o acetonitrile).
La sostanze vengono eluite secondo polarità decrescente.

PARAMETRI PER VALUTARE LE PRESTAZIONE DELL’HPLC

SELETTIVITA’: può essere migliorata non solo con la scelta della opportuna fase
stazionaria ma anche della fase mobile. Diversamente da ciò che si verifica in GC, in
HPLC si utilizza una temperatura di esercizio simile alla temperatura ambientale o di poco
superiore, tale parametro deve essere mantenuto costante per garantire la riproducibilità
dell’analisi, infatti un suo aumento fa diminuire i tempi di ritenzione, riduce la viscosità della
fase mobile, consentendo flussi più veloci.

EFFICIENZA: non è possibile utilizzare in HPLC colonne capillari aperte (spessore fase
stazionaria e diametro fase mobile piccoli) che in GC garantiscono una buona efficienza, in
conseguenza di un aumento della velocità di diffusione delle sostanze tra il canale e la fase
stazionaria (veloce trasferimento tra le due fasi che garantisce un rapido equilibrio). Infatti nei
liquidi la diffusione delle sostanze è enormemente più lenta che nei gas, di conseguenza in
cromatografia liquida il diametro del canale di eluente in un eventuale colonna capillare aperta
sarebbe troppo grande per essere attraversato in breve tempo dalle molecola delle sostanze, in
HPLC si utilizzano solo colonne impaccate di piccolo diametro e con particelle di fase
stazionaria di piccole dimensioni.

L’efficienza di una colonna impaccata aumenta al diminuire delle dimensioni delle particelle
di fase stazionaria, che garantiscono un flusso più uniforme attraverso la colonna
riducendo i percorsi multipli (diminuzione termine A eq. Van Deemter) e garantendo
distanze minori che le sostanze devono percorrere per trasferirsi da una fase all’altra
(diminuzione termine C eq. Van Deemter). Con particelle di fase stazionaria piccole, non solo
diminuisce l’altezza del piatto e aumenta la velocità ottimale, ma è possibile superare tale
velocità (riducendo i tempi di lavoro) senza peggiorare l’efficienza. Lo svantaggio delle
particelle di fase fissa piccole è la resistenza al flusso dell’eluente che richiede pressioni di
esercizio elevate.
Per migliorare l’efficienza i solventi che si utilizzano come fase mobile in HPLC sono liquidi a bassa
viscosità.

RISOLUZIONE: la risoluzione viene ottimizzata scegliendo la più opportuna composizione della

fase mobile e con una eluizione in gradiente di concentrazione.

PRINCIPALI COMPONENTI DELLO STRUMENTO

COLONNE: sono costose, hanno un tempo di vita di 500-2000 iniezioni, vengono
facilmente degradate da impurezze presenti nel campione o nell’eluente che possono legarsi
irreversibilmente ai siti adsorbenti, l’ingresso della colonna viene quindi protetto da una corta
precolonna, detta di guardia, contenente la stessa fase stazionaria della colonna principale, che
viene periodicamente sostituita.
La fase stazionaria più semplice è costituita da particelle sferiche microporose di silice, utilizzata per
la cromatografia d’adsorbimento (in fase normale).
Più frequentemente si realizza la cromatografia di ripartizione su fase stazionaria legata alla
superficie della silice, che a seconda della polarità può essere in fase normale (con l’aumentare
della polarità della fase mobile aumenta la forza eluente) o in fase inversa (con la diminuzione
della polarità della fase mobile aumenta la forza eluente).

POMPA: deve garantire un flusso costante e riproducibile. Si utilizzano pompe reciprocanti a due
pistoni. I due pistoni alternano fasi di ricarica e scarico in modo alternato. Si utilizzano solventi ad
elevata purezza specifici per HPLC abbastanza costosi, che vengono degasati poiché l’aria crea
problemi alla pompa e alla colonna.

SISTEMA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE: il campione è introdotto in testa alla colonna allo
stato liquido o in soluzione, mediante una siringa in un capillare scollegato dalla colonna. La
valvola d’iniezione monta loop (circuito ad anello) intercambiabili, ciascuno dei quali contiene un
volume prefissato di campione. Successivamente il capillare viene attraversato dall’eluente e
collegato alla colonna garantendo un ingresso riproducibile del campione.
RIVELATORI: i più utilizzati sono; spettrofotometro UV-vis a schiera di diodi, spettrometro di
massa, conduttimetro ecc. Le analisi sono effettuate con gli stessi criteri della GC.

CROMATOGRAFIA A FLUIDO
SUPERCRITICO (SFC)
La SFC è un ibrido tra la GC e l’HPLC.
Una sostanza a pressione e temperatura superiori ai valori critici viene detta fluido supercritico.
A determinate condizioni di temperatura e pressione l'attrazione tra le particelle di un gas diventa
sufficientemente forte da tenerle unite nella fase liquida, il gas subisce, cioè, un processo di
liquefazione. Ciò può avvenire aumentando la pressione (che provoca un avvicinamento delle
particelle di gas) o diminuendo la temperatura (le particelle si muovono meno rapidamente e sono
maggiormente soggette alle forze di attrazione).
Per ogni gas esiste una temperatura critica al di sopra della quale, per quanto si aumenti la pressione,
è impossibile liquefare il gas. La pressione richiesta per fare liquefare un gas alla temperatura critica
è detta pressione critica, che è la pressione al di sopra della quale, per quanto si diminuisca la
temperatura, è impossibile liquefare il gas. Al di sopra della temperatura critica un aeriforme è un
gas, al di sotto è un vapore.
Come fluidi supercritici si utilizzano sostanze con bassa massa molecolare aventi una temperatura
critica prossima a quella ambiente ed una pressione critica non troppo elevata.
Per esempio l’anidride carbonica è una sostanza che si presta ad essere utilizzata come fluido
supercritico poiché ha una temperatura critica prossima alla temperatura ambientale (Tc=31°C
Pc=73atm), non è tossica, non è infiammabile, è poco inquinante e poco costosa.

Un fluido supercritico ha proprietà intermedie tra quelle di un liquido e quelle di un gas, infatti le
particelle per effetto della pressione sono vicine tra loro in modo del tutto analogo a quanto avviene
in un liquido, mentre per effetto della temperatura elevata possiedono un’energia cinetica tale da
vincere le forze di attrazione, come avviene in un gas.
Un fluido supercritico conserva del gas la capacità di diffusione e la bassa viscosità, che permettono
una facile penetrazione all’interno delle matrici, mentre del liquido conserva la capacità solvatante,
che è direttamente legata alla sua elevata densità. Il processo di solvatazione di una sostanza in un
fluido supercritico somiglia alla volatilizzazione, ma ad una temperatura molto più bassa. Queste
proprietà rendono i fluidi supercritici capaci di estrarre sostanze da matrici in tempi brevissimi e con
rese elevate (esempio l'estrazione della caffeina dai chicchi di caffè attraverso l'anidride carbonica
allo stato supercritico).
I fluidi supercritici vengono impiegati come fasi mobili in SFC, per l’analisi di sostanze termolabili
e ad elevata massa molare, quindi non volatili, non analizzabili in GC, come ad esempio polimeri e
macromolecole biologiche.
L'apparecchiatura per la SFC è simile a quella per HPLC e possono essere impiegati sia i rivelatori
tipici della GC che dell'HPLC. Possono essere impiegate sia colonne capillari che impaccate.
L’eluente più comunemente usato in SFC è la CO2 e le condizioni operative sono analoghe a quelle
dell’HPLC con due varianti: serve un forno per termostatare la colonna e un riduttore di pressione al
termine della colonna, in modo che il fluido supercritico torni ad essere un gas prima di raggiungere
il rivelatore. Un aumento di pressione provoca un aumento di densità e di conseguenza un aumento
del potere solvatante del fluido nei confronti di sostanze ad elevata massa molare. In questo caso si
può fare un gradiente di pressione al posto di quello di temperatura, all’aumentare della pressione
diminuisce il tempo di ritenzione.