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TECNICHE ANALITICHE

PER IL FINGERPRINTING
METABOLOMICO

METABOLOMICA
La metabolomica la pi giovane delle omics technologies, e gode di
crescente popolarit. E una tecnologia funzionale finalizzata ad identificare,
quantificare e caratterizzare simultaneamente centinaia/migliaia (circa

3000) metaboliti di basso peso molecolare (oligopeptidi, AA, zuccheri, acidi


organici, acidi biliari, acidi grassi semplici, lipidi, steroidi, vitamine...) presenti
in un sistema biologico e dipendenti dal contesto, variando in base a stimoli

fisiologici, allo sviluppo e allo stato patologico di una cellula, tessuto, organo o
dell intero organismo. Essa capace di generare una foto istantanea dello
stato metabolico del sistema biologico in esame.

Metabolomica

A differenza della genomica, infatti, che valuta ci che potrebbe succedere ma non
necessariamente successo, la metabolomica (dal greco metabol, che significa
cambiamento) fotografa quello che effettivamente si verificato.

METABOLOMICA

Prima pubblicazione Lipidomica


Prima pubblicazione Metabolomica

METABOLOMICA

LINUS PAULING 1970

OLIVER S.G. 1998

METABOLOMICS SOCIETY 2004

METABOLOMICA

METABOLOMICA

10

METABOLOMICA
Quale piattaforma analitica bisogna impiegare?

Dovrebbe essere rapida, riproducibile, con facile preparazione del campione.

Scale da - a + + + per i maggiori svantaggi principali vantaggi


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METABOLOMICA

12

METABOLOMICA

13

TECNICHE ANALITICHE
PER IL FINGERPRINTING METABOLOMICO

Parte I: Principi di base della


CROMATOGRAFIA

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Cromatografia

Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di


separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il
riconoscimento.
Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari
componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e laltra
chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase
fissa.
Le tecniche sono molto utilizzate in campo archeometrico, essendo
particolarmente utili nellanalisi di miscele complesse come sono la maggior
parte dei campioni di natura organica

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Nascita della cromatografia


Inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari,
inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett.

Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di


foglie verdi in etere di petrolio, lo deposit in testa ad una colonna di vetro
impaccata con carbonato di calcio ed elu, (cio vers in continuo) con
solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in bande colorate, in
particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla
Tswett chiam questa tecnica
cromatografia dal greco scrittura
del colore

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Cenni preliminari
Le tecniche cromatografiche sono sempre distruttive (anche se in senso
strettamente analitico possono in alcuni casi essere non distruttive), in quanto

operano esclusivamente su campioni in soluzione o in fase vapore: i


materiali oggetto di analisi vanno quindi disciolti in un opportuno solvente.

Non possibile lanalisi senza prelievo di campione n tanto meno lanalisi


in situ (tranne con strumenti miniaturizzati).

bene precisare che il consumo di campione minimo. Sono sufficienti da 1


ml a 1 l di soluzione, corrispondenti a pochi mg di campione solido
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Basi del procedimento cromatografico


il campione introdotto nella fase mobile, che pu essere un gas, un liquido o un fluido
supercritico
la fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che
immiscibile nelleluente

la fase stazionaria (liquida o solida) si trova allinterno di una colonna oppure


supportata su una superficie piana
la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da

separare si distribuiscano tra le due fasi


i componenti pi affini alla fase stazionaria passeranno pi tempo in questa fase,
quindi si sposteranno pi lentamente attraverso il sistema
i componenti pi affini alla fase mobile si sposteranno invece pi velocemente
la separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione
caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione Kd=Cs/Cm)

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Visualizzazione della separazione


Ponendo alluscita della colonna un
rivelatore che misuri la concentrazione
del soluto nelleluito (cio la fase mobile
che esce dalla colonna) e riportando il
segnale in funzione del tempo si pu
ottenere un cromatogramma
La posizione dei picchi sullasse dei
tempi, o tempo di ritenzione, serve per
identificare i componenti del campione
Larea

sottesa

dai

picchi

proporzionale alla quantit di ogni


singolo

componente

pu

utilizzata a scopo quantitativo

essere
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PICCO CROMATOGRAFICO
Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di
concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana.

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PICCO CROMATOGRAFICO
Da un punto di vista matematico una curva gaussiana viene descritta dal punto di massimo e dalla
distanza tra i punti di flesso (tale distanza diviso 2 la deviazione std. ()
Altezza del picco: distanza tra il punto massimo
e la tangente alla linea di base
Larghezza della base del picco (W): lunghezza
del segmento interpolato allintersezione fra le

tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base


(Wb = 4 )
Larghezza a met altezza: larghezza misurata a
met altezza del picco (WH = 2.354)
Distanza fra i punti di flesso: segmento
interpolato

fra

due

punti

di

flesso

(corrsipondente al 60.7% altezza picco) (Wi = 2 )


Area

totale

sottesa:

proporzionale

alla

concentrazione

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PICCO CROMATOGRAFICO

tR
tM

Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita
dallinizio alluscita della colonna.
Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non trattenuto e che
passa attraverso la colonna alla stessa velocit con cui fluisce la fase mobile lungo la
colonna.

Analogamente si definiscono i corrispondenti:


Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario ad eluire lanalita
dallinizio alluscita della colonna.
Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non trattenuto
(corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).
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Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocit di
migrazione dellanalita lungo la colonna il fattore di capacit, k.

k' A

n totale di moli di A nella fase stazionaria K A VS

n totale di moli di A nella fase mobile


VM

Si dimostra che k pu essere ricavato dai parametri del cromatogramma:

k' A

tR tM
tM

Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k.


La selettivit quantifica lentit della separazione fra due specie: riguarda la capacit di un
sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed dipendente dalla
distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B> (tR)A.

k'B ( tR )B tM

k' A ( tR )A tM

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CALCOLO DEL FATTORE DI CAPACIT


k (fattore di capacit) = (tR - tM ) / tM

k = 1,7

k = 3,5

Tr = 5.5

Tr = 9.0

k = 5,2

Tr = 12.5

tempo morto

10

12

14
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RISOLUZIONE DEI PICCHI


La risoluzione dei picchi lentit della
separazione tra due picchi. E calcolata
come la differenza tra i tempi di ritenzione
di due picchi divisa per lampiezza media
dei due picchi alla linea di base.
Per due picchi ideali:

(t R 2 t R1 )
RS
2( 2 1 )
TR= Tempo di ritenzione

WA= larghezza alla base del picco= 4


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RISOLUZIONE DEI PICCHI

o, per due picchi reali:

2( t R 2 t R1 )
RS
( a b)

Per picchi asimmetrici, non ideali, lequazione deve essere modificata


sostituendo la larghezza alla base del picco con la lunghezza delle semibasi
che si affiancano.
26

Risoluzione dei picchi

separazione del 98% con


sovrapposizione 3%

separazione del 99,7%


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DIPENDENZA DELLA RISOLUZIONE DEI


PICCHI
Efficienza.

Capacit della colonna di formare picchi distanziati influenzando di

conseguenza la larghezza del picco. Maggiore lefficienza pi stretti risultano i picchi


e perci migliore la risoluzione.
Selettivit. Esprime la capacit della colonna di mantenere compatta la banda di

eluizione di una sostanza lungo tutto il percorso della fase mobile. Maggiore la
differenza tra i coefficienti di distribuzione degli analiti tra le due fasi, maggiore la
selettivit. Un aumento di selettivit, aumenta la risoluzione.

tr(A)

tr(B)

WA

WB

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DIPENDENZA DELLA RISOLUZIONE DEI


PICCHI
Scarsa selettivit ed efficienza

Aumento di selettivit

Aumento di efficienza

Aumento di efficienza ma non di selettivit

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Asimmetria dei picchi


I picchi cromatografici, in realt, hanno raramente la forma simmetrica della curva gaussiana.
Le deformazioni che spesso si osservano sono di due tipi:
Tailing: il tracciato sale bruscamente e

raggiunge

rapidamente il punto massimo, da cui scende verso la


linea di base in modo pi lento;
As >1

As <1
Fronting:quando il tracciato sale lentamente

fino al punto di massimo e scende rapidamente


verso la linea di base;
Lasimmetria dei picchi viene espressa dal fattore o rapporto di asimmetria

AS = b/a

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ASIMMETRIA DEI PICCHI


Le cause di fronting e tailing possono essere ricondotte ad uno di questi
fattori:
Introduzione del campione lenta o comunque scorretta.
2 mg

Adsorbimento irreversibile della sostanza nella fase stazionaria


Sovraccarico.
Ridotta solubilit del campione nella fase mobile.

2 g

31

Asimmetria dei picchi

Se lisoterma della sostanza convessa (Languir), in


pratica Kd diminuisce allaumentare della concentrazione.

Ci si verifica quando la fase stazionaria si satura e la


sostanza tende a scappare con la fase mobile

Partendo da una distribuzione gaussiana la


variazione di Kd far si che la zona pi concentrata
della banda corra di pi delle altre.

La banda finale in

uscita si presenta con un

fronte netto con una lunga coda (tailing).


32

Asimmetria dei picchi

Se lisoterma della sostanza concava (anti Languir), in


pratica Kd aumenta allaumentare della concentrazione.

Ci si verifica quando la fase mobile si satura e la


sostanza non riesce a essere correttamente distaccata
via dalla fase stazionaria.

Partendo da una distribuzione gaussiana la


variazione di Kd far si che la zona meno

concentrata della banda corra di pi delle


altre.

La banda finale in uscita si presenta


con un progressivo aumento della
concentrazione (fronting)
33

Numero di piatti teorici

Il numero dei piatti teorici di una colonna cromatografica ricavabile da

N = 16 (tR/wb)2
mentre facendo riferimento al tempo di ritenzione corretto, si definisce il numero dei
piatti effettivi

Neff = 16 (tR/wb)2

E importante precisare che N non un parametro caratteristico per una data colonna,
poich dipende anche dalla sostanza eluita. Ci significa che una stessa colonna
attraversata da due sostanze mostra due diversi valori di piatti teorici.

Il concetto di piatto teorico stato preso a prestito dalla teoria della colonna di
distillazione. Si pu immaginare che una colonna cromatografica, come una di
distillazione, sia suddivisa appunto in tante zone in cui si instaura lequilibrio di

ripartizione dellanalita tra fase stazionaria e fase mobile.


34

Numero di piatti teorici

La sostanza si sposta verso la fine della colonna attraverso la fase mobile che, in
equilibrio su un piatto, si passa al piatto successivo.

importante sottolineare che, a differenza della colonna di distillazione, i piatti

non esistono realmente allinterno della colonna ma sono solo un modello per
facilitare la comprensione del processo che avviene.

Se si aumenta N, diminuisce il numero dei piatti teorici su cui si distribuisce


ogni sostanza poich aumentano gli equilibri a cui essa sottoposta; a parit di
lunghezza, pertanto, si accorcia il tratto di colonna su cui si distribuisce ogni
sostanza.
35

Numero di piatti teorici

Aumentando i piatti

Aumentano gli equilibri

pi compatta viaggia la
sostanza

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Numero di piatti teorici

Lefficienza di una colonna aumenta con il numero dei piatti: tanto maggiore N, tanto pi
compatta la banda in uscita e quindi tanto pi stretto il picco sul cromatogramma.

Aumentando
i piatti

i picchi
sono pi
stretti

si hanno
migliori
separazioni

Il modo pi semplice per aumentare il numero dei piatti consiste nellaumentare la lunghezza
della colonna ma ci comporta un notevole aumento dei tempi di ritenzione.

In alternativa si deve trovare un modo di diminuire le dimensioni di un singolo piatto. A parit di


lunghezza una colonna sar pi efficiente quando viene minimizzata laltezza equivalente al
piatto teorico
H = L/N
dove L la lunghezza della colonna. Ancora pi adatta la formula
Heff = L/Neff

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Una colonna tanto pi efficiente (nei confronti di una determinata specie chimica), e
fornisce quindi picchi tanto pi stretti, quanto minore il valore di H.

Il parametro H indipendente dalla lunghezza della colonna e quindi pi adatto di N


per confrontare le prestazioni di colonne diverse verso una stessa sostanza.

Il numero di piatti teorici, e quindi la loro altezza, pu essere calcolato esaminando un


picco cromatografico dopo leluizione.

Come si pu osservare Neff = 16 (tR/wb


dallequazione, il numero di
piatti della colonna
Esce prima ma
diverso
per
ciascun ha la stessa
componente del campione.
ampiezza
di

)2

Esce dopo ma ha la
stessa ampiezza di base:
maggior efficienza della
colonna
nei
suoi
confronti

base:
minor
efficienza della
colonna nei suoi
confronti

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TECNICHE ANALITICHE
PER I FINGERPRINTING METABOLOMICO

Parte II: Equazione di Van deemter

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Eq. van deemter

40

Eq. van deemter

Abbiamo visto che per efficienza di una colonna si intende la sua capacit di
mantenere compatti i picchi lungo il percorso e quindi alluscita.
Tale grandezza, in omaggio al parallelismo con una colonna di distillazione
(fatto da Martin e Synge nel 1941), viene

evidenziata con l altezza

equivalente al piatto teorico (Height Equivalent to a Theoretical Plate)


abbreviata con H.

41

Eq. van deemter

Se si fanno pi misure sperimentali di H a differenti valori della velocit della fase


mobile, si trova che landamento di H molto complesso

La spiegazione di tale andamento non pu essere ricercata semplicemente nelle Kd


(o nelle k) poich esse non variano.
42

Eq. van deemter


Lattenzione stata allora posta sui fenomeni che rallentano il
raggiungimento dellequilibrio e quindi il non rispetto totale delle Kd.
E stata cos formulata, da Giddings, la teoria del non-equilibrio; a lui si
deve

appunto

lindividuazione

dei

fenomeni

che

ostacolano

linstaurarsi degli equilibri tra le due fasi nel sistema cromatografico.


Sulle basi di tale teoria stata sviluppata, da Van Deemter e collaboratori,
lequazione che correla H con la velocit lineare della fase mobile (u):

H= A + B/u + Cu

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Eq. van deemter


I fenomeni che rallentano il raggiungimento dellequilibrio sono tre:
percorsi multipli (eddy o multipath diffusion)
diffusione molecolare longitudinale
resistenza al trasferimento di massa
Tutti e tre causano un allargamento della banda e quindi perdita di
efficienza della colonna verso una data sostanza

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Percorsi multipli
Le inevitabili differenze di dimensioni delle

particelle solide che costituiscono la fase


stazionaria (o il supporto che la sostiene) fanno

procedere le molecole della sostanza in analisi


secondo strade diverse.
Nel loro moto casuale, alcune molecole
arriveranno prima, altre dopo, con il risultato
globale di far allargare la banda in uscita dalla
colonna
45

Percorsi multipli

46

Percorsi multipli

Due sono le soluzioni teoricamente possibili:

utilizzare particelle molto piccole, in modo che i vari cammini risultino


poco differenti

utilizzare particelle con granulometria costante

In realt nessuna delle due completamente applicabile.

Un abbassamento eccessivo delle dimensioni dei granuli della fase stazionaria


causerebbe problemi di intasamento della colonna e blocco della fase mobile

mentre , di fatto, impossibile ottenere granuli con dimensioni costanti.


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Percorsi multipli
La soluzione migliore quella di usare granuli quanto pi omogenei
possibili e dimensioni non tali da causare problemi allapparecchiatutra

cromatografica

Rispettando queste caratteristiche si pu avere la relativa certezza che le


particelle utilizzeranno quasi lo stesso tempo per uscire e si minimizza il
naturale allargamento della banda.

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Percorsi multipli

La diffusione multivorticosa costante. Indipendentemente dalla velocit con cui la fase


mobile trasporta le molecole della sostanza attraverso la fase stazionaria, la loro differenziazione
avverr sempre con la stessa distribuzione.

Nell equazione di Van Deemter


il parametro che rappresenta
questo fenomeno indicato con

H= A + B/u + Cu

A. Il suo contributo ad H,
costante al variare del flusso
(u), sar raffigurato con una

retta parallela alle x.


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Percorsi multipli
Il valore del parametro A pu essere espresso come:

A = 2dp
una costante associata alla granulometria (diametro delle particelle e
loro distribuzione granulometrica) e allimpaccamento della colonna
dp il diametro medio delle particelle di riempimento.

Come gi anticipato qualitativamente, si vede anche dalla relazione che per


minimizzare il suo valore occorre ridurre il diametro delle particelle della fase
stazionaria e la loro distribuzione granulometrica, oltre a migliorare
limpaccamento. Attualmente il termine A incide molto poco sul valore di H.
50

Diffusione molecolare longitudinale


Le molecole della sostanza diffondono sia nella fase mobile sia in quella

stazionaria.

Tendono

cio

a passare spontaneamente da zone

concentrazione pi alta a quelle a concentrazione pi bassa secondo una


direzione longitudinale, quella appunto di avanzamento della fase mobile.

In realt pi marcata la retrodiffusione rispetto alla diffusione nella


direzione di avanzamento della fase mobile.
51

DIFFUSIONE MOLECOLARE LONGITUDINALE


Il fenomeno tanto pi favorito quanto meno viscosa la fase e per questo
stesso motivo pi accentuato nella fase mobile che in quella stazionaria.
Anche il tempo di permanenza importante: pi a lungo la sostanza rimane
nella colonna e pi tempo ha a disposizione per diffondere.
Per minimizzare questo fenomeno occorrono flussi elevati (ma non troppo
perch si possono verificare problemi per la pressione) e fluidi viscosi; anche
le basse temperature aiutano poich aumentano la viscosit delle fasi.

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Diffusione molecolare longitudinale


Nell equazione di Van Deemter il parametro che rappresenta questo fenomeno
indicato con B. Il suo contributo ad H, inversamente proporzionale al
variare del flusso (u), raffigurato con un ramo di iperbole. Come si vede dal
grafico il suo contributo allaltezza del piatto teorico cala prima velocemente e

poi in maniera pi blanda con il crescere del flusso

H= A + B/u + Cu

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Diffusione molecolare longitudinale


Il parametro B viene espresso come

B = 2gDM
g il fattore di tortuosit, che dipende dallimpaccamento della colonna (vale a
dire dalla geometria degli spazi disponibili per la fase mobile)
DM il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile, un parametro che
riassume tutte le caratteristiche che influenzano la sua resistenza alla diffusione:
densit e viscosit.
Poich valori alti di entrambe portano a piccoli coefficienti di diffusione, si spiega

perch tale fenomeno sia pi accentuato con un gas che con un liquido.

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Diffusione molecolare longitudinale


Piccolo velo di

Per ridurre il valore di g occorre usare particelle

fase mobile

di dimensioni uniformi (ma non necessariamente

Grosse zone di

piccole); in questo modo, infatti, limpaccamento

fase mobile

risulta pi compatto e si riducono gli spazi in cui


la fase mobile pu consentire il fenomeno della
diffusione longitudinale.

Al contrario, dimensioni diverse delle particelle lasciano disponibili


larghe zone alla fase mobile con la possibilit di dar luogo a
consistenti diffusioni.
La variabile u, che compare al denominatore, suggerisce,

come gi detto, di

aumentare il flusso per minimizzare il contributo del termine al valore complessivo di


H.
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Resistenza al trasferimento di massa


Il terzo parametro da cui dipende lefficienza di una colonna associato alla
resistenza al trasferimento di massa: un equilibrio ha bisogno di tempo per
instaurarsi

Il suo contributo al valore complessivo di H il pi importante di tutti gli


altri.
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Resistenza al trasferimento di massa


Su di esso incidono tutte quelle variabili che influenzano il passaggio di una
sostanza da una fase allaltra e in particolare:
solubilit della sostanza nelle due fasi
temperatura
viscosit, densit
quantit del liquido di ripartizione
estensione

delle

superfici

attraverso

cui

lequilibrazione pu avvenire
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Resistenza al trasferimento di massa

Per esempio, in gascromatografia, sar molto pi semplice il passaggio nella fase


gassosa che in quella liquida, che pi densa e viscosa.

Poich quella gassosa va costantemente avanti, con il tempo lo sbilanciamento diviene


pi marcato e si avr un progressivo allargamento della banda

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Resistenza al trasferimento di massa

Nell equazione di Van Deemter il parametro che rappresenta questo fenomeno indicato
con C. Il suo contributo ad H, direttamente proporzionale al variare del flusso (u),
raffigurato con una retta.

Come si vede dal grafico il suo contributo allaltezza del piatto teorico cresce
costantemente con il flusso della fase mobile: pi veloce la fase mobile e minore il
tempo che le fasi hanno per equilibrarsi e pi sfasate saranno con conseguente
allargamento della banda.

59

Resistenza al trasferimento di massa

Il valore complessivo del termine C fornito dallequazione:

C= CS + CM

Cs il contributo relativo alla fase stazionaria

CM quello relativo alla fase mobile.

E ovvio che lo stato fisico delle fasi fa s che i due contributi non siano
uguali.

Tutte le variabili indicate prima trovano rispondenza in parametri ben precisi


legati alla natura delle fasi e a come una colonna stata costruita.
60

Resistenza al trasferimento di massa


Il parametro CS viene espresso dalla relazione

CS = q k df2/ (1+k)2 DS
q una costante legata alla disomogenit della fase stazionaria*
k il fattore di ritenzione*
df lo spessore massimo della fase stazionaria*
DS il coefficiente di diffusione nella fase stazionaria
Tra i tre coefficienti costruttivi*, quello su cui pi semplice operare per

abbassare CS , ridurre lo spessore della fase stazionaria (df).

61

Resistenza al trasferimento di massa


Il parametro CM viene espresso dalla relazione

CM = w dp2/ DM
w una costante che dipende dallimpaccamento*
dp il diametro medio delle particelle della fase solida*

DM il coefficiente di diffusione nella fase mobile


Tra i due coefficienti costruttivi*, quello su cui pi semplice operare per
abbassare CM , ridurre il diametro medio delle particelle della fase solida (dp).
Non conviene invece aumentare DM poich esso favorirebbe il termine B
62

equazione di Van Deemter

Lequazione di Van Deemter deriva dalla somma dei tre componenti visti prima e
si vede come ci sia una zona di flussi pi convenienti

Il valore del flusso viene scelto


per minimizzare H
per avere tempi di analisi non troppo lunghi

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TECNICHE ANALITICHE
PER I FINGERPRINTING METABOLOMICO

Parte III: Tecniche Cromatografiche

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INTERAZIONI FRA SOLUTI E FASI


Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e
stazionaria) sono deboli: se cos non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase
stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le
seguenti interazioni:

legami a idrogeno
interazioni dipolo-dipolo
interazioni dipolo-dipolo indotto
forze di Van der Waals
formazione di composti di interazione
attrazione coulombiana
interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarit delle due
fasi. Spesso possono essere presenti pi tipi di interazione nello stesso processo
cromatografico

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MECCANISMI DI SEPARAZIONE

In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi


di separazione impiegati in cromatografia in:

adsorbimento
ripartizione
scambio ionico
esclusione
affinit
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ADSORBIMENTO
La fase stazionaria un solido in polvere steso su un supporto; sulla superficie dei
granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le
molecole della miscela da separare. Si parla quindi di cromatografia di
adsorbimento, che pu essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della
fase mobile

La cromatografia di adsorbimento
utilizzata per separare sostanze neutre
polari o non polari, di natura organica
o inorganica

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RIPARTIZIONE
La fase stazionaria un liquido che impregna un solido granulare inerte o ad esso
chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase

stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili.


Durante leluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo
la diversa solubilit di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che

pu essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile


La cromatografia di ripartizione chiamata in
fase normale se la fase stazionaria pi polare

della fase mobile, mentre chiamata fase


inversa se la fase stazionaria meno polare
della fase mobile. Si tratta della tecnica pi

comunemente impiegata per la separazione di


sostanze organiche

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SCAMBIO IONICO
La fase stazionaria costituita da un polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o
ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello
stesso segno. Il meccanismo di separazione basato sulla competizione per i siti di
scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla
di cromatografia di scambio ionico (IEC)

La cromatografia a
scambio ionico
impiegata per la
separazione di
sostanze ioniche o
ionizzabili

69

ESCLUSIONE DIMENSIONALE
La fase stazionaria un solido poroso o un gel.

Le molecole dellanalita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le


loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le
molecole pi grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in
tempi brevi

Si parla di cromatografia di esclusione


dimensionale (SEC)
oGel permeazione per la separazione di
sostanze insolubili in acqua
oGel filtrazione per la separazione di
sostanze solubili in acqua
La tecnica impiegata per la
separazione di molecole di grandi
dimensioni

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AFFINIT

In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche,


in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga
cos leluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di
cromatografia di affinit (AFC)

La cromatografia di affinit
impiegata nella separazione di
molecole

di

interesse

prevalentemente biochimico
71

Cromatografia

72

Separazione di amminoacidi
Separazione per scambio cationico di amminoacidi provenienti da
residui di materiale proteico rinvenuto allinterno di vasi ceramici.
Il profilo degli amminoacidi consente di risalire alla natura degli
dei leganti proteici utilizzati negliaffreschi.

D: acido aspartico; N: asparagina; T:


treonina; S: serina;
E: acido
glutamico; Q: glutamina; A: alanina; V:
valina

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Cromatografia su strato sottile


Su strato sottile si possono eseguire cromatografie di
ripartizione, di adsorbimento, a esclusione e la cromatografia
liquida ad alta risoluzione.
La tecnica semplice, veloce e permette l'analisi di pi
campioni contemporaneamente.
Pu essere impiegata sia a scopi analitici che preparativi.
basata su un principio analogo alla cromatografia su
colonna (a parit di fase stazionaria il comportamento delle
sostanze analogo).

90

TLC
La fase stazionaria deposta come film sottile su una lastrina di vario

materiale (vetro, plastica, metallo, cartoncino, ).


La lastrina viene disposta verticalmente in un recipiente chiuso
ermeticamente detto camera di eluizione (becker coperto, barattolo,),
contenente delleluente che bagna solo la parte inferiore della lastrina (al
di sotto della linea di deposizione).
La fase mobile si muove dal basso verso lalto per capillarit.
Quando l'eluente raggiunge quasi la cima della lastrina, la si rimuove dalla
camera di eluizione e la si sviluppa per evidenziare delle macchie.
La TLC molto utile per seguire landamento di una reazione, per saggiare
la purezza di un composto e per identificare un prodotto noto in una
miscela.
In TLC gli analiti si associa il fattore di ritenzione Rf data da:

Rf =

spostamento della sostanza


spostamento del fronte del solvente

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Preparazione dello strato sottile


A una lastrina d vetro, di plastica o di metallo viene applicata una sospensione
densa della fase stazionaria, normalmente in acqua, e la si stende sotto forma
di uno strato sottile e uniforme per mezzo di una spatola, partendo da un lato
della lastra e muovendosi verso il lato opposto.
Lo spessore dello strato dipende dal tipo di separazione cromatografica
desiderata. Nel caso di separazioni analitiche lo spessore dell'ordine di 0,25
mm, mentre per quelle preparative pu arrivare anche a 5 mm.

Nella cromatografia d'adsorbimento, alla sospensione viene aggiunto un


agente legante, come il solfato di calcio, che facilita l'adesione dell'adsorbente
alla lastra. In generale la lastra viene essiccata per far aderire perfettamente la
fase stazionaria al supporto. Nel caso di adsorbenti, l'essiccamento condotto
in una stufa a 100-120C. Ci serve anche a ottenere l'attivazione
dell'adsorbente.
oggi commercialmente disponibile una vasta gamma di piastre gi pronte.

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Punto di allpicazione del campione

Fronte del solvente

Sostanze separate

Sviluppo

Il campione viene applicato alla lastra mediante una micropipetta o una


siringa sotto forma di macchia, a circa 2,0 cm dal bordo. Il solvente viene
rimosso con un leggero riscaldamento o con un asciugacapelli.
La separazione avviene in un recipiente di vetro che contiene sul fondo circa
1,5 cm di solvente di sviluppo.
Il solvente va lasciato equilibrare per almeno un'ora chiudendo il recipiente
con un coperchio, in modo di assicurare che l'atmosfera al suo interno
diventi satura del vapore del solvente (equilibramento), per evitare una
corsa irregolare del solvente e quindi una cattiva separazione.
Una volta avvenuto l'equilibramento, si toglie il coperchio e si posiziona
verticalmente la lastra nel recipiente facendo in modo che peschi nel
solvente.
Si ripone quindi il coperchio e la separazione avviene man mano che il
solvente corre lungo la lastra.
Lo sviluppo viene arrestato quando il fronte del solvente ha raggiunto circa i
due terzi della lunghezza della lastrina: normalmente occorrono pochi
minuti.
94

Rivelazione dei componenti

In alcuni casi di analiti colorati non necessaria alcuna operazione.


Spruzzando sulla lastra acido solforico al 50% o acido solforico al 25% in
etanolo, si ottiene la carbonizzazione della maggior parte dei composti che,
pertanto, saranno visibili come macchie marroni.
L'esame della lastra sotto luce ultravioletta mostrer la posizione di
sostanze che assorbono nell'ultravioletto o di composti fluorescenti. Molti
adsorbenti commerciali usati per la cromatografia su strato sottile
contengono un colorante fluorescente, cos che, all'esame in luce
ultravioletta, i composti separati appaiono come macchie blu, verdi o nere
su uno sfondo fluorescente.
Se si sottopone invece la lastra a vapori di iodio si mettono in evidenza i
composti insaturi.
Spruzzando infine la lastra con reattivi specifici si otterr la colorazione di
determinati composti: ad esempio, con la ninidrina gli aminoacidi si
colorano in violetto.
95

TLC bidimensionale
Il materiale da cromatografare posto su un angolo della lastra come singola
macchia e successivamente viene sviluppato in una direzione e dopo
essiccamento sviluppata con un altro eluente in una direzione perpendicolare
alla prima.
direzione di flusso del primo
solvente

separazione se
viene usato solo
il secondo
solvente

direzione di
flusso del
secondo
solvente
separazione se
viene usato solo
il primo solvente

separazione se
entrambi i
solventi vengono
utilizzati

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Cromatografia su carta

Le fibre di cellulosa della carta fungono da matrice di supporto per la fase


stazionaria.
La fase stazionaria pu essere acqua, o un materiale apolare (ad esempio la
paraffina liquida) oppure particelle impregnate di un adsorbente solido.
Esistono in commercio carte dotate di diverse caratteristiche.
Sia per il metodo ascendente (simile al TLC) sia per quello discendente il
solvente posto sul fondo di un recipiente chiuso per permettere la
saturazione della camera con i suoi vapori.
Nella tecnica discendente, il lato della carta lungo il quale deposto il
campione invece immerso in una vaschetta alla sommit del recipiente
mentre il resto della carta lasciato pendere verticalmente. Il solvente si
muove verso il basso a causa della forza di gravit. Questa tecnica, rispetto a
quella ascendente, presenta il vantaggio che la velocit di flusso del solvente
maggiore.
Anche nella cromatografia su carta si pu usare la tecnica bidimensionale,
analogamente a quanto stato descritto per la TLC.
97

TECNICHE ANALITICHE
PER I FINGERPRINTING METABOLOMICO

Parte IV: UHPLC

98

HPLC

99

HPLC
Mobile Phases

Flow Rate
Composition

Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
100

Fasi Mobili

101

Pompa HPLC a pistoni reciprocanti

102

INIETTORE A LOOP

103

Trapping mode

Load-trapping injection mode was performed using a 10-port switching valve connected
to a Loading Pump (L.P.), a micro-pump (.P.), a trap column and a separation column.
In the Load-Inject position, the sample is introduced onto the loading column using the
L.P. for 5 min and then transferred to the separation column using the .P. (Eluting
mode position).

104

Esempio
Carboidrati:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Fructose
Glucose
Saccharose
Palatinose
Trehalulose
isomaltose

Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)


70/30 Acetonitrile/Water

mAU

1 mL/min Detect=Refractive Index


time
105

HPLC
Injector

Separation in based upon differential


migration between the stationary and
mobile phases.
Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica

Mixer

Mobile Phase - carries the sample


through the stationary phase as it
moves through the column.

Pumps

Column

Detector

Solvents

Waste

106

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

107

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

108

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

109

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

110

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

111

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

112

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

113

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

114

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

115

HPLC
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

116