GAS CROMATOGRAFIA

Tecniche cromatografiche: principi generali

• Fase stazionaria (FS):

La fase stazionaria o fissa, può essere un solido o un
liquido opportunamente supportato su di un solido o
deposito sulle pareti della colonna.

• Fase mobile (FM):

La fase mobile è un liquido o un gas che scorre sulla fase
fissa; provoca la migrazione del/degli analiti nella direzione
del suo scorrimento.
 GAS CROMATOGRAFIA
Fase mobile gassosa
Fase stazionaria

SOLIDA LIQUIDA

Cromatografia Cromatografia
Gas-SOLIDO Gas-LIQUIDO
(silice , allumina o carbone) (liquido non volatile legato
covalentemente)

CROMATOGRAFIA DI
CROMATOGRAFIA DI
ADSORBIMENTO
Adatta alla separazione gas pemanenti o RIPARTIZIONE
idrocarburi a basso p eb.
La cromatografia gas-liquido è molto più utilizzata di quella gas-solido,
che presenta l’inconveniente di un forte e permanente adsorbimento
degli analiti con conseguente scodamento dei picchi.
Nella cromatografia gas-liquido la fase stazionaria liquida è supportata
su di un supporto solido inerte. Il meccanismo di separazione degli
analiti si basa sulla ripartizione fra fase mobile gassosa e fase
stazionaria liquida, opportunamente supportata.

Tecnica idonea all’analisi di composti

VOLATILI (solidi o liquidi con tensione di vapore elevata)

TERMOSTABILI
DOTATI DI BASSO PESO MOLECOLARE (PM< 400)
 GAS CROMATOGRAFIA
Principi generali

Fase stazionaria : solido o liquido

Fase mobile: gas inerte ( che fluisce in modo continuo

attraverso fase stazionaria contenuta in una colonna
cromatografica (elio, azoto, argon)

 Bassa densità
 Puro e privo di acqua (può saturare la fase fissa)
 GAS CROMATOGRAFIA
Principi generali
Fase stazionaria : solido o liquido

Fase mobile: gas inerte ( che fluisce in modo continuo

attraverso fase stazionaria contenuta in una colonna
cromatografica (elio, azoto, argon)

Il campione da analizzare (che deve essere termostabile e

volatile) è introdotto allo stato di vapore nella corrente di gas
inierte; gli analiti si distribuiscono tra FS e FM in funzione
della diversa forza con cui la fase stazionaria li trattiene

Un importante elemento che influisce sulla separazione

cromatografica è la temperatura di esercizio
 GAS CROMATOGRAFO-componenti
1.sistema di erogazione del gas di trasporto con regolazione e
misura della pressione e della portata

2.iniettore con possibilità di controllo della temperatura

3.colonna cromatografica con collegamenti all’iniettore e al

rivelatore

4.forno per il controllo della temperatura (possibilità di effettuare

un’analisi in isoterma o in gradiente di temperatura)
5.rivelatore (ad es. a conducibilità termica o a ionizzazione di
fiamma -FID)

6.sistemi adatti all’elaborazione dei dati (amplificatore, registratore,

integratore, etc…)
Schema di un gas-cromatografo
1) sistema di erogazione del gas di trasporto: bombola che
contiene il gas che costituirà la fase mobile (carrier)..

Prima che il carrier venga introdotto nella colonna é

necessario eliminare le tracce di ossigeno e di anidride
carbonica; è inoltre necessario anidrificare il carrier, in quanto
la presenza di acqua determinerebbe, nel caso di una
gascromatografia di adsorbimento, una disattivazione dei siti
attivi della fase stazionaria. A tale scopo si utilizzano apposite
trappole
3) colonna cromatografica: contenente la fase stazionaria ed è posta
all'interno di una camera opportunamente termostata - 4) forno - allo scopo
di tenere in fase gassosa i vari costituenti della miscela da separare.

Esistono due tipi di colonne:

1. impaccate
2. capillari
le differenze fra le due sono riportate nella seguente tabella:
impaccate capillari
0,5-10 m Lunghezza 5-100 m

2-4 mm Diametro interno 0,1-1 mm

10 g/picco Capacità di carico  50 ng/picco

20-60 ml/min Portata del gas 0,5-15 ml/min

5000/m Piatti teorici 150000/m

WCOT wall coated open tubular

Maggiore efficienza

SCOT Support coated open tubular

Maggiore capacità di carico

PLOT (Porous Layer Open Tubular) strato poroso polimerico o inorganico

(adsorbimento) la fase stazionaria è rappresentata dalle pareti interne del capillare
Cromatografia Gas-liquido
Le FS liquide più usate sono a base di polimetilsilossani diversamente
sostituiti con gruppi a diversa polarità (es: fenile, cianopropile,
trifluoropropile, dimetile). Trovano ampio impiego anche FS a base di
glicole polietilenico, utilizzate soprattutto per la separazione di composti
polari.

FS a base di polimetilsilossani
la polarità dei gruppi modula la
polarità della FS.
 Come scegliere il tipo di colonna da utilizzare in
cromatografia Gas-liquido?

La polarità della FS è la La polarità della FS

proprietà più importante da determina la capacità di
considerare nella scelta separare due o più
della colonna composti

INOLTRE

E’ sempre necessario ricordare il principio:

“IL SIMILE SCIOGLIE IL SIMILE”

Idonea a separare
FS APOLARE composti APOLARI

Idonea a separare
FS POLARE
composti POLARI
composti APOLARI La separazione si basa essenzialmente
Es idrocarburi sulla loro volatilità (p.eb)

Interagiscono con FS polari o di

composti POLARI o media polarità mediante interazioni
POLARIZZABILI dipolo-dipolo

Le molecole si muovono con velocità

diversa in funzione dell’entità delle loro
interazioni con la FS

p
o
l
a
r
i
t
à
Colonna media polarità OV5
che separa sulla base sul
peso molecolare e forma

N-alcani
Carbowax
Altri fattori da considerare nella scelta della colonna:

1)Diametro interno ID: influenza efficienza e capacità di carico della

colonna.
Colonne di piccolo diametro (0,2-0,25 mm) presentano, rispetto a colonne
con id superiore (0,5 mm), maggiore efficienza e minore capacità di carico

2) Spessore della FS: aumentando lo spessore della FS in genere si

ottiene un allargamento del picco (< efficienza) e un aumento del tempo di
ritenzione. Inoltre aumentando lo spessore si osserva generalmente un
aumento della capacità della colonna e una diminuzione della
temperatura massima compatibile con la FS (è necessario lavorare a
temperature di esercizio più basse per evitare fenomeni di degradazione-
esaurimento della colonna)
FS sottili (0,1-0,25 mm): idonee all’analisi di composti aventi alto p.eb. in
miscele non complesse
FS più spesse (1-5 mm): idonee all’analisi di composti apolare volatili,
anche in miscele complesse
 Temperatura di esercizio

Temperatura della colonna: variabile molto critica in gas-cromatografia

per ottenere analisi riproducibili

Deve essere accuratamente definita e controllata!

La temperatura ottimale dipende dal p.eb del campione:

Una temperatura leggermente superiore al p.eb. consente l’eluizione
dell’analita in tempi compresi fra 2 e 50 min.
Abbassando la temperatura aumenta la permanenza del campione in
colonna con conseguente aumento dei tr e miglioramento della risoluzione.

Modalità di esecuzione dell’analisi:

Isoterma
In gradiente di temperatura (idonea all’analisi di analiti con p.eb molto
diversi): la temperatura cresce nel tempo in modo lineare o a gradini.
 SISTEMI DI INIEZIONE

Tramite l'iniettore (2) si introduce la miscela da analizzare in colonna.

Il campione può essere iniettato in fase gassosa, se la miscela è un
gas, oppure solubilizzato in un opportuno solvente volatile se la
miscela da analizzare è liquida o solida.

Per effettuare l’iniezione si utilizzano siringhe

di volume variabile (5, 10, 50, 100 l).
Nel sistema di iniezione è presente una
camera di evaporazione mantenuta ad una
temperatura sufficientemente alta da
consentire l’immediata evaporazione del
campione; il campione vaporizzato viene
quindi trascinato in colonna dal gas di
trasporto.
NB: la temperatura del sistema di iniezione è
di solito mantenuta a circa 50°C al di sopra
del punto di ebollizione del componente meno
volatile del campione da analizzare.
 Iniezioni in COLONNE CAPILLARI

Modalità di iniezione

1) Iniezione frazionata (split)/non frazionata (splitless)

2) Iniezione in colonna (on-column injection) a freddo

3) Iniezione tramite iniettore PTV

 Iniezioni in COLONNE CAPILLARI

Iniezione frazionata (split)/non frazionata (splitless)

L’iniezione non viene effettuata direttamente in colonna, ma in un liner di vetro

o quarzo riscaldato.

Modalità split
Il campione viene suddiviso in due porzioni
diseguali, la più piccola delle quali va in
colonna e la più grande viene eliminata
all’esterno con il flusso di gas di trasporto
tramite una valvola split. I rapporti di
frazionamento (definiti rapporti di splittaggio)
variano da 10:1 a 100:1.
Utilizzato per campioni concentrati
 Iniezioni in COLONNE CAPILLARI

Iniezione frazionata (split)/non frazionata (splitless)

L’iniezione non viene effettuata direttamente in colonna, ma in un liner di vetro

o quarzo riscaldato.

Modalità splitless
Tutto il campione è introdotto in colonna e la
valvola di spurgo dell’iniettore rimane
chiusa, dopo l’iniezione, per 0,5-1 minuti.
Utilizzato per campioni più diluiti.
Iniezione in colonna (on-column injection) a freddo

L’iniettore viene opportunamente raffreddato in modo da permettere

introduzione del campione liquido direttamente in colonna. L’aumento
programmato della temperatura della colonna determina l’evaporazione
progressiva dei componenti della miscela da separare.

Iniettore PTV

Il sistema di iniezione è sottoposto ad un aumento programmato di

temperatura: inizialmente la temperatura è più bassa della temperatura di
ebollizione di tutti i componenti della miscela; la temperatura viene
successivamente aumentata in modo progressivo, così da vaporizzare
ogni componente della miscela alla sua “temperatura ideale”.
Riassumendo…cosa influenza la
separazione in GC

 Tipo e flusso del gas

 Temperatura della colonna
 Lunghezza della colonna
 Spessore di liquido della FS
 Diametro interno della colonna
 RIVELATORI

Alla fine della colonna viene posto un rivelatore (5) in grado di evidenziare
le varie sostanze che fuoriescono in tempi diversi emettendo un segnale
con una intensità proporzionale alla loro concentrazione; il segnale viene
registrato da uno strumento che darà così luogo al gas-cromatogramma.

NB Rivelatori: hanno il compito di trasformare in impulso elettrico il

passaggio di ciascun componente della miscela gassosa cromatografata

I rivelatori più diffusi sono:

- rivelatori a ionizzazione di fiamma
- rivelatori a cattura di elettroni Spettrometro di massa
- rivelatori a conducibilità termica
 - rivelatori a rivelatori a ionizzazione di fiamma
- rivelatori a cattura di elettroni
- rivelatori a conducibilità termica

Rivelatori di tipo differenziale: sono strutturati in maniera tale

che quando vengono attraversati dal gas di trasporto puro non
danno alcun tipo di risposta, mentre, quando sono attraversati
da un componente che fuoriesce dalla colonna cromatografica
danno una risposta direttamente proporzionale alla quantità di
quel componente. Non appena il componente è passato, il
rivelatore torna a dare una risposta nulla perchè attraversato di
nuovo soltanto dal carrier.
 Rivelatori a ionizzazione di fiamma FID

Si basa sulla
ionizzazione di vari
componenti organici
prodotta mediante
combustione in una
fiamma alimentata da
aria e H2.

La risposta del rivelatore FID è proporzionale al numero di atomi di carbonio presenti

nella sostanza. La sensibilità è legata al peso molecolare della sostanza organica
eluita.
•Il FID è un rivelatore assai poco selettivo ( rivela tutte le sostanze in grado di
generare specie cariche) ma presenta una sensibilità molto elevata, essendo in
grado di rilevare sostanze presenti i quantità comprese tra 10-5 g e 10-11 g.
•Il FID è selettivo per le sostanze organiche e non risente della presenza dell’acqua
perciò è molto utile per l’analisi di componenti in tracce in campioni a base acquosa.
Rivelatori a cattura di elettroni

In questi rivelatori sono presenti due elettrodi e una sorgente di raggi b; viene
misurata la conducibilità del gas fra due elettrodi.

Quando il carrier attraversa i due elettrodi

viene ionizzato da un sistema a bassa
radioattività (raggi b) secondo il seguente
processo:

la formazione di questi ioni e dei rispettivi

elettroni dà luogo alla cosiddetta corrente di
fondo che nel cromatogramma rappresenta
la linea di base.
 Quando la sostanza A attraversa il rivelatore interagisce con le particelle
presenti secondo le seguenti reazioni:

La sostanza A “cattura” gli elettroni

formando specie anioniche che
neutralizzano le cariche positive

Diminuzione della corrente fra i due elettrodi che si traduce nella

comparsa di un picco nel gas-cromatogramma.

NB Il processo di cattura degli elettroni è legato alla

affinità per gli elettroni che possono avere gli
atomi/gruppi funzionali presenti nella molecola A: Rivelatore
questo tipo di rivelatore è particolarmente adatto
selettivo
all’analisi di alogenoderivati, nitroderivati, composti
organometallici, ecc.
 Rivelatore a conducibilità termica Rivelatore non
distruttivo
Si basa sulle variazioni di conducibilità
termica che subisce il gas di trasporto
quando con esso vengono eluiti gli analiti.
E’ costituito da due o più resistenze
collegate e scaldate mediante corrente
elettrica; una (o più) si trova “immersa” nel
gas di trasporto prima del suo passaggio
nella camera di iniezione del campione,
l’altra (o le altre) all’uscita della colonna.
 Quando esce solo gas dalla colonna il
sistema è bilanciato e non si rivela alcun
segnale.
 Quando il gas esce insieme ad altri
componenti si ha una variazione di
conducibilità termica del gas stesso, il
sistema non è più bilanciato e viene
rivelato un segnale che si tradurrà poi in
un picco sul gas-cromatogramma.
 Quando si esegue l’analisi, vanno sempre indicati:

•I gas che vengono utilizzati, ovvero il carrier, l’ausiliario ed,

eventualmente, i gas di alimentazione del FID e di tutti va specificata
la pressione alla quale vengono fatti fluire attraverso la colonna.

•Il tipo di colonna utilizzata.

•La temperatura alla quale si esegue l’analisi e, nel caso l’analisi sia
in gradiente di temperatura, la temperatura iniziale, la velocità di
riscaldamento e la temperatura finale che viene raggiunta.

•La temperatura dell’iniettore.

•La temperatura del detector.

In tutto il mondo l’analisi di solventi residui negli intermedi di processo,
negli eccipienti e nelle formulazioni dei prodotti medicinali rappresenta
un importante strumento di salvaguardia a garanzia della sicurezza dei
prodotti farmaceutici

USP raggruppa i solventi residui in tre classi:

i solventi residui di Classe uno sono caratterizzati da livelli inaccettabili

di tossicità ed è necessario evitarne l’uso nella produzione dei prodotti
medicinali
i solventi residui di Classe due presentano una tossicità meno grave,
tuttavia il loro uso deve essere limitato per prevenire effetti
potenzialmente avversi
i solventi residui di Classe tre sono meno tossici, ma vanno utilizzati
solo se il loro impiego presenta vantaggi pratici.

La tecnica gas-cromatografica (GC) dello spazio di testa è usata

per la concentrazione e analisi di composti organici volatili
Le sostanze volatili contenute in un campione liquido possono
essere introdotte nel GC col metodo dello spazio di testa.

The European Pharmacopoeia

has standardised on a phase
composed of 6%
cynanopropyl phenyl: 94%
dimethylsiloxane, e.g.
DB-1301 or Rtx-1301.
The film thickness used is
generally 3 mm.
Rivelatore FID