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GAS CROMATOGRAFIA

GAS CROMATOGRAFIA

Tecniche cromatografiche: principi generali

Fase stazionaria (FS):

La fase stazionaria o fissa, può essere un solido o un liquido opportunamente supportato su di un solido o deposito sulle pareti della colonna.

Fase mobile (FM):

La fase mobile è un liquido o un gas che scorre sulla fase

fissa; provoca la migrazione del/degli analiti nella direzione del suo scorrimento.

GAS CROMATOGRAFIA

Fase mobile gassosa

Fase stazionaria

GAS CROMATOGRAFIA Fase mobile gassosa Fase stazionaria SOLIDA Cromatografia Gas -SOLIDO (silice , allumina o carbone)

SOLIDA

Cromatografia

Gas-SOLIDO

(silice , allumina o carbone)

Cromatografia Gas -SOLIDO (silice , allumina o carbone) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO Adatta alla separazione gas

CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO

Adatta alla separazione gas pemanenti o idrocarburi a basso p eb.

alla separazione gas pemanenti o idrocarburi a basso p eb. LIQUIDA Cromatografia Gas -LIQUIDO (liquido non

LIQUIDA

Cromatografia

Gas-LIQUIDO

(liquido non volatile legato covalentemente)

basso p eb. LIQUIDA Cromatografia Gas -LIQUIDO (liquido non volatile legato covalentemente) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE

CROMATOGRAFIA DI

RIPARTIZIONE

La cromatografia gas-liquido è molto più utilizzata di quella gas-solido, che presenta l’inconveniente di un forte e permanente adsorbimento degli analiti con conseguente scodamento dei picchi. Nella cromatografia gas-liquido la fase stazionaria liquida è supportata

su di un supporto solido inerte. Il meccanismo di separazione degli

analiti si basa sulla ripartizione fra fase mobile gassosa e fase stazionaria liquida, opportunamente supportata.

Tecnica idonea all’analisi di composti

VOLATILI (solidi o liquidi con tensione di vapore elevata)

TERMOSTABILI

DOTATI DI BASSO PESO MOLECOLARE (PM< 400)

GAS CROMATOGRAFIA

Principi generali

Fase stazionaria : solido o liquido

Fase mobile: gas inerte ( che fluisce in modo continuo

attraverso fase stazionaria contenuta in una colonna cromatografica (elio, azoto, argon)

Bassa densità

Puro e privo di acqua (può saturare la fase fissa)

GAS CROMATOGRAFIA Principi generali

Fase stazionaria : solido o liquido

Fase mobile: gas inerte ( che fluisce in modo continuo

attraverso fase stazionaria contenuta in una colonna

cromatografica (elio, azoto, argon)

Il campione da analizzare (che deve essere termostabile e volatile) è introdotto allo stato di vapore nella corrente di gas inierte; gli analiti si distribuiscono tra FS e FM in funzione della diversa forza con cui la fase stazionaria li trattiene

Un importante elemento che influisce sulla separazione cromatografica è la temperatura di esercizio

GAS CROMATOGRAFO-componenti

1.sistema di erogazione del gas di trasporto con regolazione e

misura della pressione e della portata

2.iniettore con possibilità di controllo della temperatura

3.colonna cromatografica con collegamenti all’iniettore e al rivelatore

4.forno per il controllo della temperatura (possibilità di effettuare un’analisi in isoterma o in gradiente di temperatura)

5.rivelatore (ad es. a conducibilità termica o a ionizzazione di

fiamma -FID)

6.sistemi adatti all’elaborazione dei dati (amplificatore, registratore,

integratore, etc…)

Schema di un gas-cromatografo

Schema di un gas-cromatografo

1)

sistema di erogazione del gas di trasporto:

contiene il gas che costituirà la fase mobile (carrier)

bombola che

Prima che il carrier venga introdotto nella colonna é

necessario eliminare le tracce di ossigeno e di anidride

carbonica; è inoltre necessario anidrificare il carrier, in quanto la presenza di acqua determinerebbe, nel caso di una gascromatografia di adsorbimento, una disattivazione dei siti

attivi della fase stazionaria. A tale scopo si utilizzano apposite

trappole

3) colonna cromatografica: contenente la fase stazionaria ed è posta all'interno di una camera opportunamente termostata - 4) forno - allo scopo di tenere in fase gassosa i vari costituenti della miscela da separare.

Esistono due tipi di colonne:

1. impaccate 2. capillari le differenze fra le due sono riportate nella seguente tabella:

impaccate

capillari

0

, 5 - 10 m

Lunghezza

5

- 100 m

2

- 4 mm

Diametro interno

0

, 1 - 1 mm

10 g/picco

Capacità di carico

50 ng/picco

 

20

- 60 ml/min

Portata del gas

0

, 5 - 15 ml/min

5000

/m

Piatti teorici

150000

/m

WCOT wall coated open tubular Maggiore efficienza SCOT Support coated open tubular Maggiore capacità di

WCOT wall coated open tubular

Maggiore efficienza SCOT Support coated open tubular
Maggiore efficienza
SCOT Support coated open tubular

Maggiore capacità di carico

PLOT (Porous Layer Open Tubular) strato poroso polimerico o inorganico (adsorbimento) la fase stazionaria è rappresentata dalle pareti interne del capillare

Cromatografia Gas-liquido Le FS liquide più usate sono a base di polimetilsilossani diversamente sostituiti con gruppi a diversa polarità (es: fenile, cianopropile, trifluoropropile, dimetile). Trovano ampio impiego anche FS a base di glicole polietilenico, utilizzate soprattutto per la separazione di composti polari.

soprattutto per la separazione di composti polari. FS a base di polimetilsilossani la polarità dei gruppi

FS a base di polimetilsilossani

la polarità dei gruppi modula la polarità della FS.

Come scegliere il tipo di colonna da utilizzare in cromatografia Gas-liquido?

la

proprietà più importante da considerare nella scelta della colonna

La polarità della FS

è

nella scelta della colonna La polarità della FS è INOLTRE polarità della FS determina la capacità

INOLTRE

polarità della FS

determina la capacità di separare due o più

composti

La

E’ sempre necessario ricordare il principio:

“IL SIMILE SCIOGLIE IL SIMILE”

FS APOLARE

FS POLARE

Idonea a separare composti APOLARI APOLARI

SIMILE SCIOGLIE IL SIMILE” FS APOLARE FS POLARE Idonea a separare composti APOLARI Idonea a separare

Idonea a separare

composti POLARI

composti APOLARI

Es idrocarburi

composti APOLARI Es idrocarburi La separazione si basa essenzialmente sulla loro volatilità (p.eb) composti POLARI o

La separazione si basa essenzialmente sulla loro volatilità (p.eb)

composti POLARI o POLARIZZABILI

loro volatilità (p.eb) composti POLARI o POLARIZZABILI Interagiscono con FS polari o di media polarità mediante

Interagiscono con FS polari o di

media polarità mediante interazioni dipolo-dipolo

o di media polarità mediante interazioni dipolo-dipolo Le molecole si muovono con velocità diversa in funzione

Le molecole si muovono con velocità

diversa in funzione dell’entità delle loro

interazioni con la FS

si muovono con velocità diversa in funzione dell’entità delle loro interazioni con la FS p o
p o l a r i t à
p
o
l
a
r
i
t
à
Colonna media polarità OV5 che separa sulla base sul peso molecolare e forma N-alcani
Colonna media polarità OV5
che separa sulla base sul
peso molecolare e forma
N-alcani
Carbowax
Carbowax

Altri fattori da considerare nella scelta della colonna:

1)Diametro interno ID: influenza efficienza e capacità di carico della

colonna.

Colonne di piccolo diametro (0,2-0,25 mm) presentano, rispetto a colonne con id superiore (0,5 mm), maggiore efficienza e minore capacità di carico

2) Spessore della FS: aumentando lo spessore della FS in genere si

ottiene un allargamento del picco (< efficienza) e un aumento del tempo di ritenzione. Inoltre aumentando lo spessore si osserva generalmente un aumento della capacità della colonna e una diminuzione della

temperatura massima compatibile con la FS (è necessario lavorare a

temperature di esercizio più basse per evitare fenomeni di degradazione- esaurimento della colonna) FS sottili (0,1-0,25 mm): idonee all’analisi di composti aventi alto p.eb. in miscele non complesse

FS più spesse (1-5 mm): idonee all’analisi di composti apolare volatili,

anche in miscele complesse

Temperatura di esercizio

Temperatura della colonna: variabile molto critica in gas-cromatografia

per ottenere analisi riproducibili

in gas-cromatografia per ottenere analisi riproducibili Deve essere accuratamente definita e controllata! La

Deve essere accuratamente definita e controllata!

La temperatura ottimale dipende dal p.eb del campione:

Una temperatura leggermente superiore al p.eb. consente l’eluizione dell’analita in tempi compresi fra 2 e 50 min. Abbassando la temperatura aumenta la permanenza del campione in

colonna con conseguente aumento dei tr e miglioramento della risoluzione.

Modalità di esecuzione dell’analisi:

Isoterma In gradiente di temperatura (idonea all’analisi di analiti con p.eb molto diversi): la temperatura cresce nel tempo in modo lineare o a gradini.

SISTEMI DI INIEZIONE

Tramite l'iniettore (2) si introduce la miscela da analizzare in colonna.

Il campione può essere iniettato in fase gassosa, se la miscela è un gas, oppure solubilizzato in un opportuno solvente volatile se la miscela da analizzare è liquida o solida.

Per effettuare l’iniezione si utilizzano siringhe

di volume variabile (5, 10, 50, 100 l).

Nel sistema di iniezione è presente una

camera di evaporazione mantenuta ad una temperatura sufficientemente alta da

consentire l’immediata evaporazione del

campione; il campione vaporizzato viene quindi trascinato in colonna dal gas di trasporto.

NB: la temperatura del sistema di iniezione è

di solito mantenuta a circa 50°C al di sopra del punto di ebollizione del componente meno volatile del campione da analizzare.

mantenuta a circa 50°C al di sopra del punto di ebollizione del componente meno volatile del

Iniezioni in COLONNE CAPILLARI

Modalità di iniezione

1) Iniezione frazionata (split)/non frazionata (splitless)

2) Iniezione in colonna (on-column injection) a freddo

3) Iniezione tramite iniettore PTV

Iniezioni in COLONNE CAPILLARI

Iniezione frazionata (split)/non frazionata (splitless)

L’iniezione non viene effettuata direttamente in colonna, ma in un liner di vetro o quarzo riscaldato.

in colonna, ma in un liner di vetro o quarzo riscaldato. Modalità split Il campione viene

Modalità split

Il campione viene suddiviso in due porzioni diseguali, la più piccola delle quali va in colonna e la più grande viene eliminata

all’esterno con il flusso di gas di trasporto

tramite una valvola split. I rapporti di frazionamento (definiti rapporti di splittaggio) variano da 10:1 a 100:1. Utilizzato per campioni concentrati

Iniezioni in COLONNE CAPILLARI

Iniezione frazionata (split)/non frazionata (splitless)

L’iniezione non viene effettuata direttamente in colonna, ma in un liner di vetro o quarzo riscaldato.

in colonna, ma in un liner di vetro o quarzo riscaldato. Modalità splitless Tutto il campione

Modalità splitless

Tutto il campione è introdotto in colonna e la

valvola di spurgo dell’iniettore rimane

chiusa, dopo l’iniezione, per 0,5-1 minuti. Utilizzato per campioni più diluiti.

Iniezione in colonna (on-column injection) a freddo

L’iniettore viene opportunamente raffreddato in modo da permettere introduzione del campione liquido direttamente in colonna. L’aumento programmato della temperatura della colonna determina l’evaporazione progressiva dei componenti della miscela da separare.

Iniettore PTV

Il sistema di iniezione è sottoposto ad un aumento programmato di

temperatura: inizialmente la temperatura è più bassa della temperatura di ebollizione di tutti i componenti della miscela; la temperatura viene successivamente aumentata in modo progressivo, così da vaporizzare ogni componente della miscela alla sua “temperatura ideale”.

Riassumendo…cosa influenza la separazione in GC

Tipo e flusso del gas

Temperatura della colonna

Lunghezza della colonna

Spessore di liquido della FS

Diametro interno della colonna

RIVELATORI

Alla fine della colonna viene posto un rivelatore (5) in grado di evidenziare

le varie sostanze che fuoriescono in tempi diversi emettendo un segnale con una intensità proporzionale alla loro concentrazione; il segnale viene registrato da uno strumento che darà così luogo al gas-cromatogramma.

NB Rivelatori: hanno il compito di trasformare

in impulso elettrico

il

passaggio di ciascun componente della miscela gassosa cromatografata

I rivelatori più diffusi sono:

- rivelatori a ionizzazione di fiamma

- rivelatori a cattura di elettroni

- rivelatori a conducibilità termica

Spettrometro di massa
Spettrometro di massa

- rivelatori a rivelatori a ionizzazione di fiamma

- rivelatori a cattura di elettroni

- rivelatori a conducibilità termica

a cattura di elettroni - rivelatori a conducibilità termica Rivelatori di tipo differenziale: sono strutturati in

Rivelatori di tipo differenziale: sono strutturati in maniera tale che quando vengono attraversati dal gas di trasporto puro non danno alcun tipo di risposta, mentre, quando sono attraversati da un componente che fuoriesce dalla colonna cromatografica danno una risposta direttamente proporzionale alla quantità di quel componente. Non appena il componente è passato, il rivelatore torna a dare una risposta nulla perchè attraversato di nuovo soltanto dal carrier.

Rivelatori a ionizzazione di fiamma FID

Rivelatori a ionizzazione di fiamma FID Si basa sulla ionizzazione di vari componenti organici prodotta mediante

Si basa sulla

ionizzazione di vari

componenti organici

prodotta mediante combustione in una fiamma alimentata da

aria e

H 2 .

La risposta del rivelatore FID è proporzionale al numero di atomi di carbonio presenti

nella sostanza. La sensibilità è legata al peso molecolare della sostanza organica eluita. Il FID è un rivelatore assai poco selettivo ( rivela tutte le sostanze in grado di generare specie cariche) ma presenta una sensibilità molto elevata, essendo in grado di rilevare sostanze presenti i quantità comprese tra 10 -5 g e 10 -11 g. •Il FID è selettivo per le sostanze organiche e non risente della presenza dell’acqua perciò è molto utile per l’analisi di componenti in tracce in campioni a base acquosa.

Rivelatori a cattura di elettroni

In questi rivelatori sono presenti due elettrodi e una sorgente di raggi b; viene misurata la conducibilità del gas fra due elettrodi.

viene misurata la conducibilità del gas fra due elettrodi. Quando il carrier attraversa i due elettrodi

Quando il carrier attraversa i due elettrodi viene ionizzato da un sistema a bassa radioattività (raggi b) secondo il seguente processo:

radioattività (raggi b ) secondo il seguente processo: la formazione di questi ioni e dei rispettivi

la formazione di questi ioni e dei rispettivi elettroni dà luogo alla cosiddetta corrente di fondo che nel cromatogramma rappresenta la linea di base.

Quando la sostanza A attraversa il rivelatore interagisce con le particelle presenti secondo le seguenti reazioni:

con le particelle presenti secondo le seguenti reazioni: La sostanza A “cattura” gli elettroni

La sostanza A “cattura”

gli

elettroni

formando

specie

anioniche

che

neutralizzano le cariche positive

specie anioniche che neutralizzano le cariche positive Diminuzione della corrente fra i due elettrodi che si

Diminuzione della corrente fra i due elettrodi che si traduce nella comparsa di un picco nel gas-cromatogramma.

NB Il processo di cattura degli elettroni è legato alla

affinità per gli elettroni che possono avere gli atomi/gruppi funzionali presenti nella molecola A:

questo tipo di rivelatore è particolarmente adatto

all’analisi di alogenoderivati, nitroderivati, composti

organometallici, ecc.

Rivelatore selettivo
Rivelatore
selettivo

Rivelatore a conducibilità termica

Si basa sulle variazioni di conducibilità termica che subisce il gas di trasporto quando con esso vengono eluiti gli analiti. E’ costituito da due o più resistenze collegate e scaldate mediante corrente

elettrica; una (o più) si trova “immersa” nel gas di trasporto prima del suo passaggio

nella camera di iniezione del campione,

l’altra (o le altre) all’uscita della colonna.

Quando esce solo gas dalla colonna il sistema è bilanciato e non si rivela alcun segnale.

Quando

il

gas

esce

insieme

ad

altri

componenti si ha una variazione

di

conducibilità termica del gas stesso, il sistema non è più bilanciato e viene

rivelato un segnale che si tradurrà poi in

un picco sul gas-cromatogramma.

Rivelatore non distruttivo
Rivelatore non
distruttivo
bilanciato e viene rivelato un segnale che si tradurrà poi in un picco sul gas-cromatogramma. Rivelatore

Quando si esegue l’analisi, vanno sempre indicati:

I gas che vengono utilizzati, ovvero il carrier, l’ausiliario ed,

eventualmente, i gas di alimentazione del FID e di tutti va specificata la pressione alla quale vengono fatti fluire attraverso la colonna.

Il tipo di colonna utilizzata.

La temperatura alla quale si esegue l’analisi e, nel caso l’analisi sia in gradiente di temperatura, la temperatura iniziale, la velocità di riscaldamento e la temperatura finale che viene raggiunta.

La temperatura dell’iniettore.

La temperatura del detector.

In tutto il mondo l’analisi di solventi residui negli intermedi di processo,

negli eccipienti e nelle formulazioni dei prodotti medicinali rappresenta

un importante strumento di salvaguardia a garanzia della sicurezza dei prodotti farmaceutici

USP raggruppa i solventi residui in tre classi:

i solventi residui di Classe uno sono caratterizzati da livelli inaccettabili

di tossicità ed è necessario evitarne l’uso nella produzione dei prodotti

medicinali

i solventi residui di Classe due presentano una tossicità meno grave, tuttavia il loro uso deve essere limitato per prevenire effetti

potenzialmente avversi

i solventi residui di Classe tre sono meno tossici, ma vanno utilizzati solo se il loro impiego presenta vantaggi pratici.

La tecnica gas-cromatografica (GC) dello spazio di testa è usata per la concentrazione e analisi di composti organici volatili

Le sostanze volatili contenute in un campione liquido possono essere introdotte nel GC col metodo dello spazio di testa.

essere introdotte nel GC col metodo dello spazio di testa . The European Pharmacopoeia has standardised

The European Pharmacopoeia

has standardised on a phase composed of 6% cynanopropyl phenyl: 94% dimethylsiloxane, e.g.

DB-1301 or Rtx-1301.

The film thickness used is generally 3 mm.

of 6% cynanopropyl phenyl: 94% dimethylsiloxane, e.g. DB-1301 or Rtx-1301. The film thickness used is generally
Rivelatore FID

Rivelatore FID