TIPI di CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA
PLANARE

COLONNA
GC

LC

TLC

SFC

Carta

Elettroforesi

Esclusione

Scambio
ionico
Adsorbimento

Ripartizione

Fase Normale
(fase stazionaria polare
fase mobile non-polare)

Fase inversa
(fase stazionaria non-polare
fase mobile polare)

Cromatografia Liquida (LC)

la fase eluente un liquido

Nella Liquido-Liquido (LLC) o di ripartizione, la fase stazionaria un liquido,

immiscibile con la fase mobile, che impregna un supporto solido inerte; questo tipo di
cromatografia basato sulla diversa ripartizione di due o pi soluti fra le due fasi
liquide.
Nella Liquido-Solido (LSC) o di adsorbimento, la fase stazionaria un materiale
solido costituito da particelle con grande area superficiale: in questo caso il solido non
un semplice supporto inerte, ma in grado di adsorbire superficialmente i soluti da
separare. Il meccanismo di separazione quindi determinato dalla diversa affinit dei
soluti per la fase solida. Come materiali solidi adsorbenti si usano generalmente gel di
silice, allumina, carbone attivo.
Nella cromatografia a Scambio-Ionico (IEC), la fase stazionaria costituita da una
resina a scambio ionico, ossia un supporto organico al quale sono legati dei gruppi ionici o
ionizzabili (ad esempio SO3-, -COO-, -NR3+). I gruppi ionici della resina trattengono per
mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere
scambiati con gli ioni presenti nella fase mobile. Il meccanismo di separazione basato
perci sulla diversa affinit che i diversi soluti (ionici) presentano nei confronti dei gruppi
attivi della resina.
Nella cromatografia di Esclusione (SEC), la fase stazionaria costituita da materiale
poroso, avente i pori delle dimensioni delle molecole da separare (ad esempio setacci
molecolari inorganici, tipo zeoliti, oppure polimeri organici di porosit controllata). Il
meccanismo di separazione determinato esclusivamente dalle dimensioni dei soluti: le
molecole pi grandi si muovono velocemente lungo la fase stazionaria, mentre quelle pi
piccole sono pi trattenute perch penetrano allinterno dei pori della fase stazionaria.

Cromatografia su colonna classica

Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni
secondo le esigenze.
Il riempimento della colonna pu essere costituito da materiale solido adsorbente,
finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da
effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con supporto granulare inerte,
generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituir
la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica.
Il solvente (fase mobile)scelto per eluire i componenti la miscela da separare, viene
fatto fluire attraverso la colonna, dopo che la soluzione contenente gli analiti ha percorso
tutta la colonna.
I componenti che hanno pi affinit per la fase stazionaria si muoveranno pi
lentamente di quelli che hanno pi affinit per la fase mobile, pertanto si realizzer una
migrazione differenziale, con separazione dei componenti in bande. Le
sostanze separate sono trascinate lungo la colonna e raccolte in recipienti separati, per
la determinazione qualitative e quantitativa.

Battente di liquido

Separazione
bande

Recupero soluto 1

Recupero soluto 2

HPLC (High Performance Liquid Chromatography

La cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC)

rappresenta la naturale evoluzione strumentale della
cromatografia su colonna a bassa pressione.
Le elevate prestazioni che si possono ottenere con questa
particolare tecnica ne giustificano ampiamente il nome.
LHPLC, oggi, considerata la tecnica cromatografia pi
diffusa, efficace e versatile.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta pressione frutto
dellevoluzione tecnologica delle tecniche di cromatografia su colonna.
I principi sono sempre quelli delladsorbimento e della ripartizione, ma le fasi
stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con materiali di granulometria
molto fine (5-10 m) e controllata: in tal modo viene aumentata la superficie di
contatto fra fase mobile e fase stazionaria e limpaccamento diviene pi
omogeneo.
Utilizzando queste colonne necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad
alta pressione perch, attraverso colonne con impaccamento a granulometria
cos fine, il flusso delleluente diventa molto lento.
Con limpiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di 50-150 atm,
diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad ottenere
leluizione in tempi ragionevolmente brevi.

CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE

LHPLC pu essere classificata in diversi modi:
Cromatografia normale eseguita con fase stazionaria polare e fase mobile
apolare.
Cromatografia in fase inversa che utilizza fasi stazionarie apolari e fasi mobili
polari.
Se ci si basa sul meccanismo principale della separazione e sulla natura delle fasi:
Cromatografia di assorbimento liquido-solido (LSC)
Cromatografia di ripartizione liquido-liquido (LLC)
Cromatografia di esclusione (SEC)
Cromatografia di scambio ionico (IEC)
Cromatografia di coppia ionica (IPC)
Infine, se si fa riferimento alle particolari caratteristiche della fase stazionaria, si parla di:
Cromatografia su fase legata (BPC)
Cromatografia su fase chirale (CPC)

FASI MOBILI
Le fasi mobili utilizzate in HPLC sono liquide. La scelta di esse dipende dalla fase stazionaria
utilizzata. I requisiti generali cui deve rispondere un eluente indipendentemente sono:
Bassa viscosit
Immiscibilit con la fase stazionaria
Basso costo e facile reperibilit
Capacit di solubilizzare il campione
Bassa volatilit
Compatibilit con il rivelatore
Minima tossicit possibile
Bassa corrosivit
Elevata purezza

FASE STAZIONARIA
La fase stazionaria costituita da materiale solido con una
granulometria in genere dellordine di 3/10 mm.
Esistono due diverse tipologie di fasi stazionarie:
Costituite da microparticelle porose di forma irregolare o
sferiche e con diverso grado di porosit, eventualmente
imbevute di un liquido.
Costituite da particelle pellicolari, con nucleo non poroso, di
forma sferica rivestito da uno strato microporoso solido.

Schema di unapparecchiatura HPLC

Il filtro e la precolonna presenti nel circuito servono ad evitare danneggiamenti della

colonna analitica, per leventuale presenza di solidi sospesi nel solvente.
Solvente e sostanza in esame passano attraverso la colonna nella quale avviene la
separazione.
I componenti separati, vengono quindi convogliati nella zona di misura del rivelatore e
quindi in un recipiente di raccolta degli scarti.
Il segnale prodotto dal rivelatore, opportunamente elaborato, viene registrato.

HPLC

HPLC: componenti del sistema

9 Degasatore
9 Pompa (isocratica o a gradiente):
- genera pressioni maggiori di 6000 psi
- non genera pressione pulsatile in
uscita
- velocit del flusso da 0.1 a 10 ml/min
- riproducibilit del flusso
- resistenza alla corrosione

SISTEMI DI INIEZIONE
Esistono due diversi modi per iniettare il campione in
colonna
1. Il primo prevede di iniettare il campione attraverso un
foro di iniezione, direttamente in colonna mentre il
sistema gi in funzione (e quindi sottoposto ad alta
pressione).
2. Laltro metodo, denominato sistema a valvola,
valvola
prevede appunto lutilizzo di una tipica valvola di
iniezione integrata da un capillare (loop) di volume
opportuno in cui viene iniettato il campione mediante
una normale siringa.

HPLC: Sistema di iniezione del campione

Sampling loop (il pi utilizzato):

- volumi da 5 a 500 l;
- alta riproducibilit del volume iniettato.

SISTEMI DI INIEZIONE

Valvole di iniezione
Linterfaccia universalmente utilizzata per
introdurre il campione la valvola a 6 (o 7) vie.

A seconda del loop montato varia il volume del campione iniettato in colonna

STOCCAGGIO DELLA FASE MOBILE

I contenitori destinati allo stoccaggio del carrier
in ingresso devono essere di materiale inerte e
devono avere una capacit tale da assicurare
lesecuzione di un certo numero danalisi.
I materiali usati sono solitamente il vetro o
lacciaio inox;
inox per quanto riguarda la capacit
sono sufficienti contenitori da 1-2 l.

POMPE
Le pompe hanno un importante ruolo nellHPLC.
Vengono utilizzate pompe pneumatiche e pompe
meccaniche ma tutte devono fornire un flusso costante e
riproducibile. Devono inoltre:
- Fornire elevate pressioni in ingresso,
- Avere un adeguato sistema di smorzamento delle
pulsazioni,
- Avere una notevole inerzia chimica,
- Avere un elevata autonomia,
- Consentire rapide operazioni di ricambio della fase
mobile e di pulizia,
-Essere poco rumorosa,poco ingombrante e priva di
vibrazioni eccessive.

POMPE

Pompe e valvole di iniezione

La pompa pi diffusa quella alternativa a pistone. Il pistone viene mosso
da un motore mentre le valvole di ritegno si aprono alternativamente.
Vantaggi:
Robustezza
Pressioni in uscita molto elevate (fino a
700 bar)
Volume interno ridotto (50 l) -> adatte
allutilizzo in gradiente
Flussi costanti

Valvola di ritegno
a sfera

Il principale difetto che produce un flusso

pulsato che deve essere smorzato ->
fluttuazioni della linea di base

Come alternativa si possono utilizzare pompe a siringa e pneumatiche

FILTRI
Costituiti da uno strato di materiale inerte,
servono ad impedire (tramite filtrazione)
che granelli di materiali di qualunque tipo
entrino allinterno della colonna. Possono
essere liberamente applicati in qualsiasi
punto ma il sistema pi efficace quello
fissato a monte delliniettore.

FILTRI

SISTEMI PER REALIZZARE

IL GRADIENTE DI ELUIZIONE
Quasi tutti i cromatografi sono corredati di un sistema di
miscelazione adatto alleluizione in gradiente anche se si
tratta di uneluizione isocratica.
La miscelazione dinamica di solventi pu essere
realizzata in due modi:
- Ad alta pressione, inviando sotto pressione (mediante
una pompa per ciascuno) ogni solvente al sistema;
- A bassa pressione, con una sola pompa.

COLONNE PER HPLC

Colonne classiche per HPLC:

- materiale: acciaio o vetro ricoperto di metallo
-lunghezza variabile da 10 a 30 cm
-diametro interno da 4 a 10 mm
-impaccate con particelle di diametro da 5 a 10 m
-piatti teorici: da 40.000 a 60.000 piatti per metro

Micro-colonne per HPLC:

-lunghezza dai 3 ai 6.5 cm
-diametro interno da 1 a 4-6 m
-impaccate con particelle di diametro da 3 a 5 m
-piatti teorici: >100.000 per metro
-maggiore velocit operativa e minore consumo di fase mobile

COLONNE

Le colonne utilizzate in lHPLC sono generalmente dacciaio inossidabile,

con una lunghezza che va dai 5 cm a 25 cm.

Colonne per HPLC

Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con diametro
interno di 1-5 mm.
Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o da particelle o
impurezze presenti nel campione e nel solvente. per questo che necessario
proteggere lingresso della colonna principale con una pre-colonna che contiene la
stessa fase stazionaria della colonna principale, ma pi corta e pu venire
periodicamente sostituita.

Fasi stazionarie
La fase stazionaria pi comune costituita da particelle microporose di silice ad
elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area superficiale (alcune centinaia
di m2/g). Questa fase stazionaria viene generalmente impiegata per cromatografia di
adsorbimento. Pi comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando
fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie della silice.
Fasi polari comuni

Fasi non polari comuni

R = (CH2)3NH2

ammino

R = (CH2)17CH3

ottadecile

R = (CH2)3CN

ciano

R = (CH2)7CH3

ottile

La C18 (anche indicata con ODS) la fase

stazionaria di gran lunga pi utilizzata in HPLC

Il processo di eluizione
In cromatografia di adsorbimento, le molecole di solvente competono con le molecole di
soluto per la fase stazionaria: leluizione avviene quando il solvente sposta il soluto dalla
fase adsorbente. La forza eluente () una misura dellenergia di adsorbimento di vari
solventi sulla superficie di silice, scegliendo come 0 di riferimento il pentano. Si creata
cos la seguente scala definita serie eluotropica di vari solventi.
Solvente

Forza eluente ()

Pentano

0.00

Esano

0.01

Eptano

0.01

Triclorotrifluoroetano

0.02

Toluene

0.22

Cloroformio

0.26

Diclorometano

0.30

Etere dietilico

0.43

Acetato di etile

0.48

Metil t-butil etere

0.48

Diossano

0.51

Acetonitrile

0.52

Acetone

0.53

Tetraidrofurano

0.53

2-propanolo

0.60

Metanolo

0.70

Cromatografia a fase normale

- Fase stazionaria polare, solvente meno polare
- Solventi pi polari hanno maggiore forza eluente

Cromatografia a fase inversa

- Fase stazionaria apolare, solvente pi polare
- Solventi meno polari hanno maggiore forza eluente

La cromatografia in fase inversa elimina la codatura dei picchi poich la fase

stazionaria ha pochi siti che possono adsorbire fortemente il soluto.
anche meno sensibile alle impurezze polari (come lacqua) nel solvente.

Eluizione isocratica e a gradiente

Con 1 solo solvente o con

una miscela di solventi di
composizione costante.

Variazione
continua
della
composizione del solvente per
aumentare la forza eluente.
Una forza eluente crescente
necessaria per eluire i soluti
pi fortemente trattenuti e
per migliorare le separazioni.

Rivelatori

Sensibilit adeguata al problema

Buona stabilit e riproducibilit

Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

Tempi di risposta rapidi

Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o pi classi di soluti
Rivelatore

LOD (ng)

Selettivit

Utilizzabile in gradiente?

0.1-1

selettivo

SI

100-1000

generale

NO

Fluorescenza

0.001-0.01

selettivo

SI

Elettrochimico

0.01-1

selettivo

NO

Conduttimetrico

0.5-1

selettivo

NO

Assorbimento IR

1000

selettivo

SI

Spettrometro di massa

0.1-1

generale

SI

Assorbimento UV
Indice di rifrazione

RIVELATORE ELETTROCHIMICO
Il rivelatore elettrochimico rappresentato dal
conduttimetro. Esso misura la variazione di
conduttanza della fase mobile.

Rivelatori
Rivelatore UV a fissa

La radiazione proveniente da una

lampada a vapori di Hg passa
attraverso la cella del campione e
arriva al fotodiodo.
Lintensit della luce assorbita
proporzionale alla concentrazione
dellanalita.

Vantaggi e svantaggi
Il principale vantaggio il basso costo.
Inoltre lelevata intensit della radiazione
della lampada a Hg permette di ottenere
elevata sensibilit per composti che
assorbono a 254 nm.
Il principale svantaggio determinato dalla
scarsa selettivit dovuta alla necessit di
lavorare a fissa.

Rivelatori
Rivelatore UV a variabile

Il rivelatore UV a variabile
sicuramente quello
maggiormente utilizzato in HPLC.
La luce UV proveniente dalla
lampada a D2 e scissa nelle sue
componenti attraverso un
monocromatore a gradini.
Lintensit della luce trasmessa
misurata attraverso un fotodiodo
ed proporzionale alla
concentrazione dellanalita

Vantaggi
- Versatilit: possibilit di selezionare da 190 a 800 nm.
- Elevata sensibilit: potendo scegliere la ottimale (max assorbanza) per un
analita.
- Selettivit: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si pu variare la l in modo
tale da minimizzare lassorbimento degli interferenti.
- Possibilit di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una alla quale la miscela
solvente non assorbe.

Rivelatori
Rivelatore UV a diode array

Il rivelatore UV a diode array

quello che attualmente viene sempre
pi utilizzato in HPLC.
La luce UV proveniente dalla lampada
a D2 passa attraverso una cella a
flusso prima che venga scissa nelle
sue
componenti
attraverso
un
monocromatore a gradini. Lintensit
della luce trasmessa ad ogni
misurata simultaneamente attraverso
un array di alcune centinaia di
fotodiodi. Un pc pu processare,
registrare e mostrare gli spettri in
continuo durante lanalisi. Inoltre si
possono registrare i crmatogrammi a
ciascuna .

Vantaggi e svantaggi
Presenta gli stessi vantaggi in termini di versatilit, sensibilit e selettivit del rivelatore a
variabile. Fornendo anche gli spettri degli analiti, permette di effettuare anche il
riconoscimento dei composti analizzati.
Svantaggio: pi costoso rispetto al rivelatore a variabile.

Rivelatori
Rivelatore a indice di rifrazione

Il rivelatore a indice di rifrazione misura la differenza nellindice di rifrazione tra la cella del
campione e una cella di riferimento che generalmente contiene soltanto leluente. Si
utilizza un fascio di luce collimato e filtrato per rimuovere la luce IR che riscalderebbe il
campione. Quando leluente contenente lanalita entra nella cella del campione, il raggio
viene deflesso e inviato al fotodiodo producendo un segnale in uscita differente rispetto a
quello prodotto dal solo eluente.
Vantaggi e svantaggi
un rivelatore universale, cio risponde a tutti i composti. Si utilizza per analiti che non
assorbono in UV (es. idrocarburi saturi, alcool, eteri)
Svantaggi: poco sensibile, non compatibile con gradiente di eluizione ed sensibile a
variazioni di p e T.

Rivelatori
Rivelatore a Fluorescenza
La luce UV proveniente da una lampada (filtrata
alla opportuna l) o da un laser, passa attraverso
la cella a flusso. Quando un campione
fluorescente passa attraverso la cella, assorbe la
radiazione, viene eccitato e quindi emetter la
radiazione di fluorescenza ad una maggiore l.
Lintensit della luce emessa viene misurata
attraverso un fotomoltiplicatore posto a 90
rispetto al fasco incidente.

Vantaggi e svantaggi
un rivelatore molto sensibile, ma risponde soltanto ai pochi analiti fluorescenti. Per
aumentarne lapplicabilit si possono legare covalentemente dei marker fluorescenti.
Questa derivatizzazione pu essere fatta o prima della separazione o post-colonna
aggiungendo i reattivi marcanti tra la colonna e il rivelatore.

Rivelatori
Rivelatore elettrochimico amperometrico

Questo rivelatore permette lanalisi di composti elettroattivi che possono essere cio
ossidati o ridotti. Ad esempio possono essere elettrochimicamente ossidati fenoli, ammine,
mercaptani, perossidi, purine e alcuni eterocicli. Mentre possono essere
elettrochimicamente ridotti aldeidi, chetoni e nitrocomposti.
Un potenziale costante viene mantenuto tra lelettrodo di lavoro e lelettrodo di riferimento
e la corrente, prodotta dalla reazione di ossidazione o riduzione dellanalita, misurata tra
lelettrodo di lavoro e il controelettrodo ed proporzionale alla concentrazione di analita
nel campione. Per soluti ossidabili si utilizzano elettrodi in Cu o glassy carbon, mentre per
specie riducibili si utilizzano in genere elettrodi di Hg.
Poich sono necessari eluenti conduttivi, questo tipo di rivelatori utilizzato nelle
separazioni a fase inversa impiegando solventi acquosi o polari contenenti elettroliti
disciolti, generalmente dei tamponi.

Rivelatori
Spettrometro di massa
Lo spettrometro di massa pu fornire informazioni qualitative e quantitative sui
componenti della miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere uno spettro di massa,
le molecole portate in fase gassosa, vengono ionizzate. Gli ioni sono quindi accelerati
per mezzo di un campo elettrico e vengono poi separati in base al loro rapporto
massa/carica (m/q).
Laccoppiamento HPLC-MS una tecnica relativamente giovane e sempre pi
utilizzata.
Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS pu servire come rivelatore universale (o
comunque come un rivelatore che risponde ad unestesa gamma di soluti) e sensibile.
Laccoppiamento HPLC/MS stato tentato gi molti anni fa (fine anni 60), ma soltanto
dalla met degli anni 70 appaiono le prime pubblicazioni scientifiche.
Le difficolt di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si utilizzano
solventi molto diversi, in funzione del tipo di analisi, (es. acqua, solventi organici,
tamponi); inoltre i flussi in LC sono molto elevati rispetto a quelli richiesti per lo
spettrometro di massa. Per accoppiare le 2 tecniche sono pertanto necessarie
opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi dovranno consentire anche la
vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.