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GASCROMATOGRAFIA

La tecnica cromatografica consiste nello sfruttare in modo


particolarmente efficiente la diversa attitudine che ogni molecola
o ione possiede nel distribuirsi tra due differenti fasi (una
stazionaria e una mobile).
La classificazione fondamentale dei metodi cromatografici si basa
sul fatto che la fase mobile pu essere un liquido (cromatografia
liquida) o un gas (cromatografia gassosa o gascromatografia).
Le miscele da separare possono essere costituite da gas, da liquidi
o da solidi sciolti in solventi volatili; i liquidi e i solidi devono per
essere vaporizzabili e, soprattutto, termostabili.
La termostabilit alla temperatura di vaporizzazione un
requisito molto importante; se i composti da analizzare infatti
subiscono decomposizioni termiche, si effettuer lanalisi dei
prodotti di pirolisi e non dei composti di partenza.

GASCROMATOGRAFIA
Secondo lo stato fisico della fase stazionaria, la gascromatografia si
pu suddividere in cromatografia gas solido (GSC) e in cromatografia
gas liquido (GLC).
La limitazione della gascromatografia la necessit di rendere
volatili i campioni da analizzare, per cui in alcuni casi essa
soppiantata dallHPLC (cromatografia liquida ad alto potere
risolutivo).
I meccanismi di separazione relativi alla GC sono sostanzialmente
due: ripartizione e adsorbimento. Il primo nel caso che la fase
stazionaria sia liquida, il secondo quando e solida.

GASCROMATOGRAFO
Filters/Traps

Data system
H

RESET

Regulators

Syringe/Sampler
Inlets
Detectors

Gas Carrier

Hydrogen

Air

Column

GASCROMATOGRAFO
Sistema di alimentazione gas di trasporto (carrier)
Si tratta di bombole di gas inerte (azoto, elio, argon), talvolta pu essere
utilizzato anche lidrogeno. Lo scopo principale quello di trascinare i
componenti della miscela in analisi lungo la colonna cromatografica.
Il gas permanente (carrier o gas di trasporto) rappresenta la fase mobile che
fluisce attraverso una colonna in cui posta la fase stazionaria.

GASCROMATOGRAFO
Iniettore o camera di iniezione
Liniettore un dispositivo posto immediatamente prima della colonna che ha la
funzione di consentire lintroduzione del campione in essa e assicurare listantanea
vaporizzazione del campione. La sua geometria e le relative specifiche tecniche ed
operative dipendono essenzialmente dal fatto che si operi con colonne impaccate o con
colonne capillari.
Per campioni liquidi o soluzioni si utilizzano apposite siringhe della capacit di 1-5 L
(colonne impaccate) e di 1 L (colonne capillari).
Per campioni gassosi si utilizzano siringhe da gas, con pistoni a tenuta e iniettori a
valvola rotante con loop di riempimento (come nella GLC), della capacit di 10-2000
L.ml.
Spesso si utilizzano quindi opportune tecniche (split, splitless) che consentono di far
entrare effettivamente in colonna solo una parte (ad esempio ca. 1/100) del liquido
iniettato.
La camera di iniezione corredata da un sistema di resistenze variabili attraverso le
quali possibile fissare la temperatura ritenuta pi adatta per la vaporizzazione della
miscela. Lintroduzione del campione viene effettuata con una iniezione su un apposito
disco di gomma al silicone, posto tra una ghiera metallica e il dispositivi di attacco alla
colonna.

GASCROMATOGRAFO
Tecnica split (con divisione): il
campione viene preliminarmente
miscelato con il gas di trasporto. Di
questa miscela solo una parte passa
realmente nella colonna,
mentre
buona parte viene indirizzata verso la
valvola regolabile di spurgo.
Tecnica splitless (senza divisione):
tutto il campione viene inviato
direttamente in colonna.

carrier gas

spurgo

campione

GASCROMATOGRAFO
Il campione iniettato in una camera di vaporizzazione di vetro (glass liner) nella quale
volatilizza rapidamente. Il flusso di gas relativamente elevato e segue 3 vie: una parte (purge
line) lambisce e pulisce il setto siliconico, una parte (sample line) trasporta i vapori di
campione nella colonna e una parte (split line) trasporta i vapori di campione alluscita del
separatore (splitter), regolato da una valvola a spillo (split valve). Il rapporto tra il flusso del
separatore (split flow) e il flusso della colonna (column flow) si chiama rapporto di
splittaggio (split ratio) ed quello che, regolato dalla split valve, determina la quantit di
campione che effettivamente entra nella colonna cromatografica.
Esempi
split flow = 50 ml/min
column flow = 2 ml/min
split ratio = 2:50 = 1:25 (solo 1/25 del campione iniettato entra in colonna)
split flow = 500 ml/min
column flow = 0,5 ml/min
split ratio = 0,5:500 = 1:1000 (solo 1/1000 del campione iniettato entra in colonna)

GASCROMATOGRAFO
Lo split mode:
semplice;
applicabile a campioni con un ampio intervallo di concentrazioni dei soluti, ma non a
bassa concentrazione;
produce picchi normalmente di ottima forma;
per le considerazioni precedenti particolarmente idoneo allanalisi di miscele di soluti con
un intervallo ridotto di volatilit (spazi di testa), operando in condizioni isoterme e ad
elevate temperature del forno.
Lo splitless mode:
ha maggiore sensibilit e precisione rispetto lo split mode;
applicabile a campioni a bassa concentrazione di soluti perch si possono
iniettare volumi elevati di campione (> 5 l);
applicabile a matrici cos dette sporche, cio non precedentemente
purificate per via preparativa;
particolarmente idoneo allanalisi di miscele di soluti basso-bollenti,
cio con tempi di ritenzione molto simili a quello del solvente, per fare in
modo che il picco del solvente sia molto stretto e non presenti asimmetria
tailing (scodamento).

GASCROMATOGRAFO
La disponibilit di siringhe capaci di iniettare anche frazioni di L (0,2-0,3) ha contribuito
alla diffusione di iniettori per capillari che introducono il campione direttamente nella

colonna. Gli iniettori on-column non prevedono un setto, ma una valvola di


introduzione manuale (a rotazione) che accoglie lago della siringa in un canale dellago.
La valvola viene aperta prima dellintroduzione della siringa e richiusa subito dopo la sua
estrazione. La miscela di soluti entra nella glass liner con liniettore mantenuto a
temperatura ambiente da un flusso di aria fredda; solo successivamente si opera il
riscaldamento delliniettore per ottenere levaporazione del solvente e la vaporizzazione
dei componenti del campione, che vengono trasportati dal gas dentro la colonna. La
modalit on-column utile nellanalisi di sostanze termolabili in soluzioni diluite, ma
anche la modalit che non discriminando in alcun modo i soluti fornisce lanalisi
quantitativa pi attendibile.

GASCROMATOGRAFO
Colonna
La colonna pu essere di due tipi: impaccata o capillare.
La fase stazionaria un liquido altobollente che riveste come film sottile una colonna di vetro
cava (colonna capillare) oppure impregna della silice e viene inserito in una colonna di vetro
o di metallo (colonna impaccata).
Limpaccata, usata nella gascromatografia classica, comporta una separazione in colonna di
acciaio o di vetro riempita di materiale inerte (supporto per la fase stazionaria) sul quale
distribuita una pellicola sottile di liquido (fase stazionaria) continuamente attraversata da un
gas (fase mobile) detto gas di trasporto. Il processo di separazione limitato dalla lentezza di
eluizione della molecole del campione lungo la colonna. La capillare, ormai di uso comune,
rappresenta unimportante innovazione per la sua rapidit di eluizione e per una migliore
risoluzione. Essa molto pi lunga dellimpaccata, di diametro molto minore e quindi
contiene una quantit molto minore di fase stazionaria, per cui la quantit di campione da

iniettare molto pi piccola e viene eluita prima.

GASCROMATOGRAFO
Colonna impaccata:
la fase stazionaria formata da
un solido granulare poroso o da
un liquido deposto su un
supporto
costituito
da
particelle inerti.
La colonna costituita da un
tubo di acciaio o vetro di
lunghezza da 1 a 6 metri con
diametro interno di 0.75-4 mm.

Colonna capillare:
la
fase
stazionaria
viene
depositata sotto forma di film
sottilissimo
(0.1-5m)
sulla
parete interna di un capillare con
diametro 0.1-0.75 mm e lungo da
15 a 100 m. Il carrier percorre il
canale lasciato libero dalla fase
stazionaria.

GASCROMATOGRAFO
Colonne capillari:
Colonne capillari aperte (Wall Coated Open Tubular, WCOT), in cui le pareti
sono ricoperte (o legate chimicamente) dalla fase stazionaria liquida;
Colonne capillari aperte con rivestimento supportato (Support Coated Open
Tabular, SCOT), in cui un materiale granulare poroso molto fine, su cui stato
depositato un sottilissimo film di liquido di ripartizione, viene fatto aderire
alle pareti della colonna;
Colonne capillari aperte con rivestimento poroso (Porous Layer Open
Tubular, PLOT); in cui la fase stazionaria costituita solo da particelle porose
fatte aderire alle pareti.

GASCROMATOGRAFO
Vantaggi delle colonne capillari
maggiore efficienza
pur avendo un diametro interno minore, offrono al gas un canale di
passaggio pi grande, e dunque ridotte perdite di carico. Ci consente
una lunghezza maggiore che consente di aumentare lefficienza

Vantaggi delle colonne impaccate


meno costose
hanno maggiore durata
consentono di usare campioni pi voluminosi senza rischio di
impaccamento

GASCROMATOGRAFO
La fase stazionaria deve essere stabile termicamente, non reattiva e non volatile
nellintervallo di temperatura a cui lavora la colonna.
La fase stazionaria pu essere non polare o polare.

Le fasi non polari separano i composti sulla base del punto di ebollizione.
Le fasi polari hanno anche interazioni dipolo-dipolo di vario grado con i
composti che passano sopra
Le interazioni tra soluto e fase stazionaria sono maggiori quanto pi simile la
loro polarit: sostanze che risulteranno avere una polarit simile alla fase
stazionaria saranno maggiormente trattenute in colonna (tempi di ritenzione
pi lunghi).
Un altro fattore che determina la separazione tra i soluti la volatilit, in
quanto i soluti meno volatili avranno maggiore tendenza a passare nella fase
liquida (liquido di ripartizione).

GASCROMATOGRAFO
Camera termostatica
Le colonne sono alloggiate in una camera termostatica, in genere a circolazione di aria
calda, con questo sistema viene assicurata una buona stabilit di temperatura. Un
dispositivo permette alloperatore di fissare la temperatura, la quale pu essere
mantenuta costante per tutta la durata dellanalisi (isoterma) oppure fatta variare
(programmata).
Una temperatura troppo bassa riduce i tempi di percorrenza della colonna, aumentando i
tempi di analisi, tuttavia una temperatura troppo elevata determina laccavallamento dei
picchi.

La scelta della temperatura della colonna molto importante


Le colonne sono termostatate in un forno a temperatura controllata. La temperatura
massima raggiungibile in genere di 400C.

GASCROMATOGRAFO
La temperatura cruciale nelle separazioni cromatografiche e pertanto la
colonna alloggiata in forni termostatati. Lanalisi GC pu essere effettuata a T
costante (isoterma) o variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di
temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau.

GASCROMATOGRAFO
Quando sono presenti composti
dalla volatilit molto diversa, una
temperatura troppo alta consente
una
buona
separazione
dei
componenti altobollenti ma fa uscire
troppo
rapidamente
quelli
bassobollenti, sovrapponendone i
picchi.

Al
contrario,
una
temperatura troppo bassa,
determina
tempi
di
permanenza troppo alti per i
componenti altobollenti.

GASCROMATOGRAFO
Isoterma (45C)

Isoterma (145C)

Gradiente (da 30 a 180C)

GASCROMATOGRAFO
Rivelatori
I rivelatori (detector) GC forniscono un segnale di tipo integrale o di tipo
differenziale.
E un dispositivo posto subito dopo il termine della colonna con la funzione di
indicare la presenza del componente alluscita della colonna, e di fornire la
misura della concentrazione di esso nel gas di trasporto.

RIVELATORI DIFFERENZIALI
Sono i pi diffusi perch consentono la valutazione diretta della quantit di
sostanza rilevata. Sono classificati:
rivelatori con risposta in funzione della concentrazione del soluto (TCD)
rivelatori con risposta in funzione della massa del soluto (FID, ECD)

GASCROMATOGRAFO

Il segnale integrale produce un cromatogramma cumulativo, rappresentato da una serie di rampe a


cui corrispondono i soluti separati dalla colonna, con un ordine che corrisponde al loro ordine di
eluizione.
Il segnale differenziale produce un cromatogramma rappresentato da una serie di picchi a cui
corrispondono i soluti separati dalla colonna, con un ordine che corrisponde al loro ordine di
eluizione.

GASCROMATOGRAFO
Il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) si basa sul principio che una fiamma
prodotta dal giusto rapporto combustibile (H2)/comburente (aria o O2) pirolizza le
molecole organiche producendo ioni ed elettroni che possono condurre lelettricit
attraverso la fiamma. I due elettrodi collegati al circuito di misura sono lugello stesso
della fiamma (anodo) e il cilindro metallico che lo circonda (catodo). Tra gli elettrodi
applicata una d.d.p. di circa 300 volt. Se dalla colonna arriva soltanto il carrier gas
(inerte), la fiamma produce prevalentemente i radicali liberi dellacqua:
2H2 + O2 + 2H2O

3H. + .OH + .O

Se il carrier gas trasporta dei soluti organici la fiamma provoca la loro combustione
finale a CO2 e H2O, ma la pirolisi intermedia dei soluti organici forma i radicali R. e HC..
Questi ultimi reagiscono con i radicali .O presenti nella fiamma, secondo la reazione:
HC. + .O

HCO+ + e-

La formazione di ioni positivi e di elettroni produce la loro migrazione rispettivamente


verso il catodo e verso lanodo, con produzione di un flusso di cariche, cio di una corrente
elettrica capace di fornire un segnale. La risposta del FID non dipende dalla
concentrazione del soluto, ma dal numero di atomi di carbonio presenti nella molecola.

GASCROMATOGRAFO
CARATTERISTICHE DEL FID
selettivit: universale (composti
organici)
stabilit: elevata
modalit: distruttiva
gas di trasporto: N2 , He
temperatura limite: < 400C
esigenze: carrier gas puri e flusso
costante
I limiti del FID sono la sua scarsa
sensibilit verso i gruppi funzionali C=O,
-NH2, -OH e limpossibilit di ottenere il
segnale elettrico dalle molecole che
non possono essere carbonizzate (He,
Ne, Ar, Kr, Xe, O2, N2, H2O, CS2, H2S,
SO2, NO, N2O, NO2, NH3, CO, CO2, SiCl4,
SiF4).

GASCROMATOGRAFO
Il rivelatore a conducibilit termica (TCD) si basa sul principio che un gas, fluendo su
un filamento riscaldato, ne abbassa la temperatura rimuovendo parte del calore. La
quantit di calore rimosso dipende dal flusso e dalla conducibilit termica del gas che
fluisce.
In una miscela di gas, pertanto, dipende dalla conducibilit termica di ogni
componente (soluti, solvente, gas di trasporto) e dalla pressione parziale di ciascuno di
essi.
Il corpo del TCD a doppia cella un blocco metallico di massa ed inerzia termica
elevate nel quale sono ricavate due celle. Esso termostatato ad una temperatura di
circa 50C superiore a quella massima della colonna, in modo da evitare fenomeni di
condensazione.
Sia nella cella di riferimento che nella cella di misura alloggiato un filamento di
tungsteno (o di leghe tungsteno/renio) riscaldato elettricamente. Il carrier gas
attraversa sia la cella di riferimento che la cella di misura, mentre leffluente dalla
colonna (carrier gas, solventi e soluti) attraversa soltanto la cella di misura.
La resistenza R (in ohm) del filamento varia in funzione della temperatura

GASCROMATOGRAFO
CARATTERISTICHE DEL TCD
selettivit: universale
stabilit: buona
modalit: non distruttiva
gas di trasporto: He
temperatura limite: < 450C
esigenze: flusso e temperatura
costanti

Lalimentatore elettrico porta la temperatura del


filamento da T0 a T1 e, al passaggio del carrier gas,
che alla temperatura T0 , si ha un trasferimento di
calore per conduzione e per irraggiamento dal
filamento (che ritorna a T0) alle molecole del carrier
gas (che salgono a T1), ma anche per convezione tra
le molecole. Il blocco metallico costruito in modo
che il filamento trasferisca il calore al gas quasi
esclusivamente per conduzione (90%).

GASCROMATOGRAFO
Se il flusso di gas costante la temperatura del filamento si porta ad un
valore di equilibrio (ovviamente dipendente dal valore del flusso) e se la
temperatura costante anche la resistenza elettrica R costante.
Quando il carrier gas trasporta sul filamento un soluto volatilizzato del
campione, in teoria ci potr essere un minore o maggiore trasferimento di
calore in funzione del fatto che il soluto abbia rispettivamente una minore o
una maggiore conducibilit termica rispetto il carrier gas. In realt i gas di
trasporto impiegati nel TCD sono quelli a pi elevata conducibilit termica
(H2 e He, questultimo preferito per problemi di sicurezza e di minore
reattivit con i soluti) in modo che la presenza di soluti produca un
abbassamento della conducibilit termica del carrier gas. Questo effetto
produce un aumento di temperatura del filamento che determina un
aumento della sua resistenza R, ovvero una diminuzione dellintensit I della
corrente.
conducibilit termica ( )
(W/cmK)

H2 = 18,1 . 10-4
He = 15,2 . 10-4
N2 = 2,6 . 10-4
Ar = 1,8 . 10-4

GASCROMATOGRAFO
La risposta R di un rivelatore differenziale sensibile alla concentrazione del soluto un picco
gascromatografico la cui area A proporzionale alla concentrazione del soluto rivelato.

Larea A del picco data dallintegrale:

GASCROMATOGRAFO
Ogni sostanza in uscita dalla colonna genera un
segnale
che verra registrato sotto forma di 'picco'.
Ogni picco e caratterizzato da:
-Altezza del picco. E la distanza fra il massimo
del picco e la sua base, misurata
perpendicolarmente allasse dei tempi.
-Ampiezza del picco. E il segmento delimitato
sulla base del picco dai punti di intersezione
delle tangenti tracciate nei punti di flesso di
ambedue i lati.
La successione dei vari picchi, corrispondenti alle
varie sostanze in uscita dalla colonna, costituisce
il 'cromatogramma'.
Il cromatogramma si presenta come in figura,
dove in ordinate e riportata la risposta del
rivelatore e in ascisse i tempi di uscita delle varie
sostanze.

GASCROMATOGRAFO
Lanalisi quantitativa cromatografica basata sulla misura delle aree dei picchi,
dalle quali, dopo opportuna elaborazione, si risale alle concentrazioni
percentuali dei componenti.
Detector Response
C18
Peak Area (cm2 )

C 16

10
8
6

C14

4
2
0.5

Retention Time

cromatogramma

1.0

1.5

2.0

2.5

Sample Concentration (mg/ml)

curva di taratura

3.0

GASCROMATOGRAFO

cromatogramma

GASCROMATOGRAFO

t = 42.513 min
Area= 20108
t = 42.948 min
Area= 91801
t = 43.956 min
Area= 12933

cromatogramma

GASCROMATOGRAFO
Methyl stearate

Tempo di ritenzione [min]

Concentrazione [mg/mL]

Area

42,572

5,0

480579

42,552

2,5

202520

42,565

1,25

85161

Methyl oleate

Tempo di ritenzione [min]


42,958
42,954
42,961

Concentrazione [mg/mL]
5,0
2,5
1,25

Area
538250
253632
74931

Tempo di ritenzione [min]

Concentrazione [mg/mL]

Area

44,010

5,0

417520

43,998

2,5

209624

44,006

1,25

97192

Methyl linoleate

Esercizio:
Costruire la retta di taratura per ciascun composto organico;
Determinare la concentrazione dei tre composti organici