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COLORAZIONI

ISTOMORFOLOGICHE
CLASSIFICAZIONE DELLE COLORAZIONI:

Le colorazioni, indipendentemente dal meccanismo d’azione del


colorante, possono essere divise in due gruppi:

1.colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto nervoso,


collagene, ecc...);

2. colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze


chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):

L’ematossilina è una sostanza vegetale isolata da un estratto di legno azzurro


(legno di campeggio, Haematoxylum campechianum ) un albero originario del
centro America. Questa è di per sé incolore (o si presenta sotto forma di
cristalli giallo-bruni) incapace di colorare. Il vero colorante non è
l’ematossilina, ma il suo prodotto di ossidazione: l’emateina (per questo
all’ematossilina vanno aggiunte sostanze ossidanti come il permanganato di
potassio, l’idrato di potassio, iodato di sodio, ecc.).

Ematossilina Emateina
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):

L’emateina è colorata e costituisce il cromoforo, è anionica e non ha particolari


affinità con gli acidi nucleici. Per conferire al composto una carica positiva è
necessario aggiungere un mordente (ad es. l’allume potassico: KAl(SO 4)2 ·

12H2O) che costituirà con l’emateina, una lacca relativamente insolubile:


l’emallume. L’ematossilina più usata nel laboratorio e’ quella di Mayer, ed e’ così
costituita:
-ALLUME DI POTASSIO;
-EMATOSSILINA;
-IODATO DI SODIO;
-ACIDO CITRICO;
-CLORALIO (tossico; corrosivo).

Alcuni metodi di colorazione comportano una mordenzatura. Questa operazione consiste nel trattare
il tessuto con un composto capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali a loro volta,
potranno legarsi con un colorante basico o acido. Il composto che costituisce questo termine di
collegamento fra il tessuto e il colorante è detto mordente .
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)

EMATEINA  ossidazione di ematossilina

Compl. con Al  EMALLUME (Mayer - Carazzi)

Fe  EMAT. HARRIS (Lillie)

progressive - Differenziazione
Ematossiline
regressive - pH
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):

A seconda del mordente usato, alluminio, ferro, cromo, ecc..., si


distinguono ematossiline alluminiche (o emallumi), ematossiline
ferriche, ematossiline cromiche, ecc... .
Le soluzioni ematossiliniche emalluminiche più usate in istologia sono:
1. Ematossilina di Mayer;
2. Ematossilina di Harris;
3. Ematossilina di Delafield;
4. Ematossilina di Carazzi;
5. Ematossilina di Ehrlich.
1. Ematossilina di Weigert;
2. Ematossilina di Heidenhain.
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):

L’eosina è un colorante artificiale debolmente acido, di cui esistono


varie forme, che colora i citoplasmi, il tessuto connettivo e la
sostanza intercellulare in varie tonalità di rosa. L'eosina è
chimicamente una tetrabromofluoresceina. Più precisamente, sono di
comune utilizzo due molecole di eosina denominate Y e B.

Eosina Y Eosina B
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):

• sezioni in H2O distillata

• Emallume acido di Mayer, filtrato ( 7’)

• lavare H2O corrente (10’)

• Eosina [0.25 %], acidificata con qualche Risultati:


goccia di CH3COOH (1’) Nucleo  Blu - viola
• lavare in H2O distillata (2’) Citoplasma  Rosa - rosso
• disidratare in etanolo 95° (4’)
• disidratare in etanolo 100° (4’) (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan
o balsamo Canada)
EMATOSSILINA DI EHRLICH
METODI CITOLOGICI

La colorazione EE può essere descritta come un metodo che si


utilizza per lo studio topografico e generale per tessuti e organi.
Ci sono però alcuni metodi in grado di mettere in evidenza strutture
specifiche: ci sono quindi metodi che evidenzieranno il connettivo
piuttosto che il tessuto nervoso, ma anche tecniche per lo studio
fine di organuli cellulari.
METODI CITOLOGICI CON COLORAZIONE
REGRESSIVA DI LACCHE DI EMATOSSILINA

Si tratta di metodi di cui non si conosce ancora appieno il


meccanismo di azione.

EMATOSSILINA FERRICA (Metodo di Heidenhain)


Metodo di elezione per lo studio della cariocinesi. Regolando la
differenziazione si possono mettere in evidenza anche i centrioli o
inclusioni citoplasmatiche.
EMATOSSILINA FERRICA
STUDIO DEI TESSUTI E
DEGLI ORGANI
TESSUTO
NERVOSO
TESSUTO NERVOSO

Tra le prime tecniche per lo studio del tessuto nervoso vanno


ricordate quelle per mettere in evidenza i Corpi di Nissl.
Uno di questi metodi prevede l’uso del Cresyl Violet. Si tratta di un
colorante basico che lega rapidamente le componenti acide del
citoplasma dei neuroni (soprattutto l’RNA dei ribosomi, compresi i
nuclei). Questo colorante mette ben in evidenza i Corpi di Nissl che
sono appunto aggregazioni del RER tipiche dei neuroni.
Risultati:
RNA  nero
Altre strutture  viola

Altri metodi impiegano l’uso del Blu di Toluidina.


Metodo di GOLGI-CAJAL

Per quanto riguarda lo studio della forma dei neuroni si possono


usare alcuni metodi colorimetrici sia vitali che non (un esempio di
colorazione vitale usata nei vertebrati è quella con il Blu di
Metilene). Risultati migliori si ottengono mediante impregnazioni
metalliche elettive. Fra questi metodi il più noto è quello
dell’impregnazione cromoargentica di Golgi (sec. Cajal) che utilizza la
precipitazione elettiva di cromato di argento sulle cellule nervose
quando queste sono state preventivamente fissate con tetraossido
di osmio e bicromato di potassio. Oltre l’argento si può usare anche
l’oro.
Metodo di BIELSCHOWSKY per neurofibrille

Metodo di elezione per la visualizzazione di neurofibrille, assoni,


dendriti, placca senile. I metodi di impregnazione argentica sono fra
i metodi più comunemente usati in neuroistologia.
Il principio su cui si basano le tecniche di impregnazione è il
seguente: l’argento, presente in alcuni composti allo stato di
ossidazione +1 (es. AgNO3), può essere ridotto da alcune componenti
tissutali allo stato metallico insolubile.
Selettività del metodo Bielschowsky: il diverso grado di argirofilia
degli elementi cellulari presenti del tessuto nervoso permette
attraverso una opportuna calibrazione della soluzione riducente di
evidenziare selettivamente neurofibrille, assoni, dendriti, placca
senile.
TESSUTO NERVOSO
(Luxol Fast Blue)

Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li


colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool
isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina
integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di
Schwann). Tale colorazione è spesso associata al Cresyl Violet
(Metodo di Klüver-Barrera).

Luxol Fast Blue:


Risultati:
Rame ftalocianina
Mielina  blu-azzurro solfonata

(X=SO3-)
Klüver-Barrera
TESSUTO
CONNETTIVO
AZAN-MALLORY (AM)
Colorazione AZAN (acronimo di AZocarmine-ANilin blue) modificata da Mallory. E’
una delle tecniche di colorazione utilizzate per mettere in evidenza le fibre collagene
del tessuto connettivo.
Il metodo associa una colorazione citologica ottenuta tramite un colorante acido
(azocarminio) ad una colorazione di contrasto effettuata con blu di anilina dopo
mordenzatura con acido fosfotungstico. Per ottenere buoni risultati occorre
sovracolorare con azocarminio, quindi differenziare lentamente con alcol-anilina, al
fine di evitare che la colorazione di contrasto predomini

Blu di anilina
Azocarminio
AZAN-MALLORY (AM)
Si utilizzano in sequenza due coloranti:
-Azocarminio (colora i nuclei in rosso vivo ed il citoplasma in rosso
chiaro)
-Miscela di Mallory (Blu d’anilina, Orange G e acido ossalico, evidenzia
il connettivo in azzurro).
Risultati:
Collagene, reticolo, granuli basofili (ipofisi)  blu-azzurro
Neurofibrille  rossastro
Muscolo  arancio
Nuclei, eritrociti e granuli acidofili (ipofisi)  rosso
Granuli citoplasmatici delle cellule delta dell’ ipofisi  azzurro

Il meccanismo di colorazione non è ancora completamente compreso. Alcune


spiegazioni propongono che l'acido fosfotungstico funga da mordente per
legare i colori basici al tessuto.
COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA (MGG):
COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA:

È una doppia colorazione utilizzata normalmente per colorare gli


strisci di sangue (simile al metodo Wright-Giemsa). Il sangue viene
strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per almeno 30 min.
all’aria e colorato prima con la miscela di May-Grüwald (blu di
metilene, colorante basico, e eosina, colorante acido). Segue poi un
lavaggio e una colorazione con l’eosinato azzurro (colorante di
Giemsa) composto da eosina giallastra, blu di metilene, azzurro A e B
e violetto di metilene.
Risultati:
Globuli rossi  rosa-arancio
Nuclei dei leucociti  blu-porpora
Granuli eosinofili  rosso brillante
Blu di metilene
Granuli basofili  blu
Acidofilo
Piastrine
Neutrofilo

Linfocita
Basofilo
Monocita
VERHOEFF – VAN GIESON (VVG)

Si tratta di un metodo combinato. Il metodo di Verhoeff è una colorazione


specifica per le fibre elastiche (in particolare per la proteina elastina). La
colorazione di Van Gieson è specifica per il collagene. In questo metodo le
sezioni sono colorate regressivamente con ematossilina (usando un eccesso
di mordente, il cloruro ferrico, in modo da avere una maggiore affinità della
stessa ematossilina ferrica per le fibre elastiche rispetto agli altri
elementi).

Risultati:
Fibre elastiche  blu-nero Collagene  rosso
Nuclei  blu-nero Altri elementi  giallo
WEIGERT - VAN GIESON (WvG):

Metodo combinato per la visualizzazione sul medesimo preparato delle


fibre elastiche, del connettivo, del collagene e dei nuclei.

Il metodo (Weigert “metodo lungo”) sfrutta l’ affinità per le fibre


elastiche del precipitato (cresofucsina) ottenuto facendo reagire
resorcina, fucsina basica e cristalvioletto con perclorato di ferro. La
specificità del metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e
membrane basali possono colorarsi; è quindi importante una accurata
differenziazione per ottenere una colorazione marcata e selettiva delle
fibre elastiche. Il contrasto con la colorazione tricromica di Van Gieson
permette di differenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel
contempo anche i nuclei.
Applicazione : fibre elastiche.
Weigert - Van Gieson:

Resorcina

Fucsina basica Cristalvioletto

Risultati
Fibre elastiche  da blu scuro a nero
Nuclei  neri
Collagene  rosso,
Connettivo, eritrociti, ecc  giallo
TRICROMICA DI GOLDNER:

Una colorazione è detta tricromica quando si usano due o più coloranti per
tingere differenzialmente diverse strutture istologiche.
Il metodo della tricromica di Goldner (conosciuto anche come Masson-
Goldner) utilizza l’ematossilina, rosso Ponçeau, orange G e light green.

Risultati:
Strutture basofile (come la cromatina)  marrone-nero
Strutture debolmente acidofile (cartilagine)  rosso-arancio
Strutture fortemente acidofile (fibre collagene, osso)  azzurro-verde

Rosso Ponceau Orange G Light green


TRICROMICA DI MASSON:

Metodo di elezione per il tessuto connettivo, particolarmente


indicato per gameti, nuclei, neurofibrille, nevroglia, collagene,
cheratina, fibrille intracellulari e immagini in negativo dell’ apparato
di Golgi.
Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con ematossilina
ferrica di Weigert, una colorazione delle emazie con acido picrico e
una colorazione del connettivo con due differenti coloranti acidi
(Light Green oppure blu di anilina/blu di metilene)
Risultati :
Nuclei e gameti  nero
Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili  rosso
Collagene, muco, granuli basofili dell’ipofisi  blu /verde
Eritrociti  giallo
PENTACROMICA DI MOVAT:

Questo metodo, piuttosto lungo e laborioso, consente di rivelare


contemporaneamente le mucosostanze acide e i diversi componenti
del connettivo. Coloranti utilizzati: alcian blu, resorcifucsina, blu di
celestina sec Culling, ematossilina di Weigert e miscela di Van
Gieson.

Risultati:
Mucine acide e sostanza fondamentale  blu
Collagene  rosso
Elastina  rosso purpureo
Muscolo  giallo
Neclei  neri
Tessuto osseo
Per l’osservazione microscopica del tessuto osseo si
utilizzano tecniche particolari che tengono conto della
struttura dura e mineralizzata dell’osso stesso. Per
allestire un preparato sottile di tessuto osseo per
l’osservazione microscopica vengono generalmente
impiegate delle varianti delle procedure tradizionali
che possono essere schematizzate come segue:

1) METODI PER DECALCIFICAZIONE

2) METODI PER USURA


Osso – Metodo per decalcificazione

I metodi per decalcificazione servono per mantenere la componente


organica dell’osso, a scapito tuttavia della componente minerale che viene
più o meno completamente rimossa. Il frammento di osso da esaminare
viene fissato subito dopo il prelievo, al fine di preservare al meglio la
morfologia delle cellule e l’integrità delle molecole organiche della sostanza
intercellulare. Successivamente si procede alla rimozione della componente
minerale, che viene dissolta chimicamente mediante il soggiorno del
frammento in una soluzione acida. Per queste tecniche si possono usare o
soluzioni di acidi organici (es. acido citrico, acido ascorbico) o di chelanti
del calcio (es. acido etilendiamminotetraacetico o EDTA, acido
etilenglicoltetraacetico o EGTA), che rimuovono la parte inorganica senza
troppo danneggiare la parte organica. Una volta rimosso il minerale, il
campione viene trattato come qualunque altro campione molle: inclusione in
paraffina, sezionamento con microtomo e colorazione.
Osso – Metodo per usura

I metodi per usura sono utilizzati quando si vuole preservare la componente


minerale (ma anche la componente organica – collagene – mineralizzata). La
componente cellulare (componente organica non mineralizzata) viene
eliminata facendo macerare in acqua (per un tempo sufficiente) il
frammento osseo prelevato. Successivamente dal frammento macerato
viene tagliata manualmente una sezione piuttosto spessa che viene fatta
asciugare e poi aderire ad un vetrino portaoggetto tramite una goccia di
mezzo di montaggio (es. balsamo del Canadà o balsami sintetici). Una volta
che questo si è solidificato, la sezione di osso viene lavorata con carta
abrasiva a grana decrescente, fino a ridurla per usura ad uno spessore
sufficientemente sottile da renderla attraversabile dalla luce. Viene poi
messo sopra il montante e il vetrino coprioggetto.