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Rieti 26 - 27 Novembre 2009

Formazione
Formazione sulle tecnichesulle tecniche
di estrazione di del
e preparazione
campione su matrici ambientali e alimentari
estrazione e preparazione del
campione su matrici ambientali e
alimentari

Gianfranco Blasi Arpalazio Rieti


SPETTROFOTOMETRIA DI
ASSORBIMENTO ATOMICO

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Assorbimento Atomico
La spettrofotometria di assorbimento atomico
(Atomic Absorption Spectrophotometry, AAS)
è una delle tecniche maggiormente usate
nell’analisi degli elementi in tracce (soprattutto
metalli) in matrici di ogni genere, da quelle di
interesse ambientale, come acque e terreni,
fino agli alimenti e le leghe metalliche. E’ una
tecnica spettroscopica basata sullo scambio
di energia tra radiazione (luce) e sostanza
(particelle assorbenti).
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Assorbimento atomico

Questa tecnica si presta, in linea di


principio, all’analisi sia qualitativa che
quantitativa degli elementi, ma, di fatto,
viene usata quasi esclusivamente per
l’analisi quantitativa.

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Assorbimento atomico

In pratica, l’elemento in esame viene


atomizzato e bersagliato con radiazioni di
lunghezza d’onda opportuna, per effetto
dell’assorbimento atomico, l’intensità del
raggio diminuisce e l’attenuazione può
essere correlata alla concentrazione
dell’elemento nel campione mediante
un’equazione matematica.

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Assorbimento atomico
L’assorbimento atomico sia pure in un intervallo di
linearità abbastanza ristretto segue una legge
analoga alla legge di Beer, che si può
rappresentare:
A = xbN
dove x è il coefficiente spettrale di assorbimento
atomico; b lo spessore dello strato assorbente (il
cammino ottico); N il n° totale di atomi liberi.

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Schema GFAAS - fornetto

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Schema FAA - FIAMMA

1)lampada a catodo cavo -2)chopper - 3) lampada deuterio – 4) sistema di


specchi - 5)bruciatore fiamma o fornetto di grafite – 6)monocromatore
7)detector

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Sorgente
La più usata è la lampada a catodo cavo: è costituita
da un bulbo in vetro, con finestra di quarzo in cui al
suo interno contiene un catodo e un anodo;
l’ambiente interno e riempito di gas (Ar o Ne). Il
catodo e costituito da una capsulina, la quale nel
fondo contiene l’elemento caratterizzante della
lampada.

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Chopper

La luce dalla sorgente viene modulata


(pulsata) mediante un chopper, in modo da
distinguere la luce emessa dalla lampada
dalla luce emessa dall’atomo eccitato.

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Monocromatori e sistema ottico
Il monocromatore è un sistema che permette di
selezionare una sola lunghezza d'onda (o un
range ristretto di lunghezze d'onda) di interesse
per l'analisi che si vuole effettuare. Si basa sui
fenomeni di diffrazione della luce, grazie a una
serie di dati che imposta l'operatore il
monocromatore, tramite una serie di specchi e
lenti mobili, può isolare una sola componente
cromatica (ovvero lunghezza d'onda) per poi
utilizzarla.
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Rivelatori e sistema di lettura
Il rilevatore è "l'organo sensoriale" dello strumento.
Questo è quasi sempre un fotomoltiplicatore, ma
può essere anche sostituito da fotodiodi o
fotocellule nei casi in cui l'intensità della radiazione
elettromagnetica sia molto forte (vedi Laser) o
quando non si richiede una particolare accuratezza
analitica. Il fotomoltiplicatore ha, il compito di
trasformare il segnale luminoso dato dalla
radiazione elettromagnetica in un segnale elettrico
utilizzabile dal sistema di elaborazione.

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Il sistema di elaborazione

Il sistema di elaborazione è generalmente


un PC interfacciato con appositi hardware
allo strumento. Un software permette
all’operatore di comunicare e quindi
gestire le varie fasi , dall’impostazione
della metodica analitica all’elaborazione
dei dati.

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Vari tipi di atomizzatore
Esistono vari tipi di sistemi di atomizzazione:
Atomizzazione mediante fiamma; Atomizzazione
mediante fornetto di grafite; Atomizzazione
mediante vapori freddi.
Il fornetto di grafite fornisce una maggiore
sensibilità rispetto alla fiamma, consente di
abbassare notevolmente (1000 volte) i limiti di
rivelabilità, inoltre consente di lavorare su
aliquote molto piccole di campione ma ha tempi
di analisi molto più lunghi. Il metodo vapori freddi
è molto utilizzato nell'analisi del mercurio.

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Atomizzazione a fiamma
Nel dispositivo di atomizzazione a fiamma, una
soluzione di campione, viene aspirata nel
nebulizzatore (dove si trasforma in aerosol),
trasportata da un gas comburente (aria o
protossido d'azoto) all'interno di una camera di
premiscelazione (dove trova un dispositivo di
abbattimento gocce), e mescolata con il gas
combustibile. Nella testata del bruciatore si
avranno infine, la combustione e l'atomizzazione

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Tipi di Fiamma
Fiamma aria-acetilene – generalmente
sufficiente per atomizzare la maggior parte degli
elementi, utilizza una testata da 10 cm, con
singola o tripla fenditura, raggiunge una
temperatura pari a circa 2300°C.
– Fiamma protossido di azoto – acetilene –
utilizzata per gli elementi che formano composti
molto stabili alle alte temperature e quindi difficile
da atomizzare (Al, Ba, V, Ti, Si, Zr). La testata è di
5 cm e la temperatura raggiunge i 2800°C.
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Fornetto di grafite
La misura di assorbimento viene fatta sui
vapori atomici che si liberano rapidamente
nello stadio finale del riscaldamento. Il
segnale che si ottiene è un picco la cui area
(altezza) è direttamente proporzionale alla
massa dell’analita.

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Fornetto di grafite
Il riscaldamento del tubo di grafite è programmato con
una sequenza di riscaldamento a step successivi: uno
primo step per disidratare il campione (100-120°C), un
secondo di pirolisi per incenerire il campione ed
allontanare la matrice organica (200-600°C) ed un
terzo step di atomizzazione a temperature
elevatissime. Il programma di riscaldamento è
specifico per il tipo di analita e l’atomizzazione è
ottenuta in presenza di un flusso di argon per
prevenire l’ossidazione della grafite e la formazione di
composti refrattari.

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Fornetto di grafite
Il segnale che si ottiene è un picco la cui area (o altezza) è
direttamente proporzionale alla massa dell’analita
presente allo stato atomico nel tubo di grafite; l’intervallo
di linearità, è in genere più ampio di quello della classica
spettrofotometria in fiamma. L’area del picco fornisce
migliori risultati perché rappresenta l’intera popolazione
di atomi del campione prelevato per analisi e quindi non
dipende dal tempo necessario per la completa
atomizzazione di quest’ultimo. L’altezza del picco, invece,
dipende dalla concentrazione massima di atomi presenti
nel fornetto durante lo stadio di atomizzazione, che
risente in modo significativo dalla matrice.
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Atomizzazione a vapori freddi
Determinazione del mercurio
Facendo reagire il campione con una soluzione di Sodio Boro
Idruro (o cloruro stannoso) si riduce allo stato elementare il
metallo. I vapori di Hg sono quindi trasportati da un flusso di gas
inerte in una cuvetta alloggiata nel banco ottico dello
spettrometro. Dalla misura del segnale di assorbanza a 253,7
nm si ricava la concentrazione mediante confronto con una
curva di calibrazione ottenuta con soluzioni a concentrazioni
note comprese nel campo di indagine analitica. il sistema
permette di valutare concentrazioni dell'ordine dei decimi di
microgrammi litro.

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MERCURIO

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Assorbimento di fondo
• Le interferenze derivanti dall'assorbimento di radiazioni da
parte di molecole e radicali presenti nella fiamma sono dette
anche non specifiche. Questo assorbimento si somma a
quello specifico del solo analita ed è detto assorbimento del
fondo.
• L'assorbimento di fondo abbassa l’intensità della radiazione
emessa dalla lampada a catodo cavo e per eliminarlo si
utilizza:
– la lampada al deuterio nel caso che la lunghezza d'onda
dell'analisi sia nell'UV
– l’effetto Zeeman nel caso che si lavori con il fornetto di
grafite munito dell'apposito dispositivo, o più
semplicemente con il metodo delle aggiunte.

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Sorgente continua lampada D2
• Per superare il problema deve essere disponibile uno
strumento doppio raggio nel quale affiancare una sorgente
continua al deuterio (banda passante 0,2 nm) alla normale
sorgente a catodo cavo (banda passante 0,002 nm).

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Correzione rumore di fondo
La correzione dell’assorbimento dovuto a
speci non-atomiche (background) viene
eseguita con lampada al deuterio attraverso
comparazione elettronica dei due segnali:
Lampada HCL  ABS totale
Lampada D2  ABS Bakground
ABS Corretta = ABS totale - ABS Bakground
ABS Corretta = ABS lampada HCL - ABS lampada D2

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Correzione del rumore di fondo
Sistema Zeeman – Il sistema fa un confronto tra
l'analisi effettuata normalmente, e l'analisi effettuata
con l'applicazione di un campo magnetico.
Applicando un campo magnetico infatti, le righe di
assorbimento risentono dell'effetto Zeeman e si
suddividono in tre compenti, solo quella centrale però
ha lunghezza adatta per indurre l'assorbimento.
Questa riga però è polarizzata in direzione
perpendicolare alla riga emessa dalla lampada e
quindi quest'ultima subisce solo l'assorbimento di
fondo (non polarizzato).
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Effetto ZEEMAN
• Questo sistema presenta numerosi vantaggi:
• si possono correggere assorbanze specifiche
maggiori di due unità;
• la correzione dell’assorbimento di fondo viene
effettuata alla stessa lunghezza d’onda della riga di
risonanza, eliminando qualsiasi errore di misura;
• la correzione non risente di assorbimenti di fondo a
struttura fine;
• si possono correggere anche le interferenze
spettrali, se cadono a una distanza maggiore di
0,02 nm.
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Esempio fasi atomizzazione

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Risposta strumentale
standard Cd 2µg/L

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Curva taratura strumentale

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Suolo
La Comunicazione della CE - COM(2002)179 - afferma che
“l’introduzione di contaminanti nel suolo può
danneggiare o distruggere alcune o diverse funzioni del
suolo e provocare una contaminazione indiretta
dell’acqua. La presenza di contaminanti nel suolo oltre
certi livelli comporta una serie di conseguenze negative
per la catena alimentare e quindi per la salute umana e
per tutti i tipi di ecosistemi e di risorse naturali. Per
valutare l’impatto potenziale dei contaminanti del suolo,
è necessario non solo valutarne la concentrazione, ma
anche il relativo comportamento ambientale e il
meccanismo di esposizione per la salute umana e degli
ecosistemi”.

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Suolo
Le metodologie di analisi dei metalli pesanti nel suolo,
normate dal DM 13/09/99 n. 185 GU N. 248 del
21/10/1999-Metodi ufficiali di analisi chimica dei suoli,
sono di fondamentale importanza per controllare
l’inquinamento ambientale provocato dall’accumulo di
questi elementi chimici e per definire gli interventi da
attuare per ridurre gli effetti tossici negli ecosistemi
naturali ed agrari.
Per i campioni di suolo la determinazione di tutti gli
analiti deve essere effettuata sulla frazione
granulometrica passante al vaglio di 2 mm, ed i risultati
ottenuti vanno riferiti al peso secco del suolo passato a
tale vaglio.
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TERRE E ROCCE DA SCAVO

L’art 186 del D.Lgs 152/06 disciplina le terre e


rocce da scavo e all'effettivo utilizzo per
reinterri, riempimenti, rilevati e macinati che
possono costituire rifiuti se provenienti da
sito potenzialmente inquinato (un’area
sottoposta a bonifica e/o a caratterizzazione) e
quindi soggette ai controlli Arpa.

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I LICHENI

I licheni, sono strutture vegetali che


originano dalla simbiosi di un fungo ed un
alga, da ciò derivano caratteristiche uniche
che determinano una particolarmente
sensibilità all’inquinamento.

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I LICHENI
dipendono quasi esclusivamente
dall’atmosfera per il proprio nutrimento
(si possono infatti veder crescere
anche su rocce), e, a differenza delle
piante, non hanno meccanismi di
difesa come cuticola o stomi per
proteggersi da eventuali sostanze
tossiche presenti.

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I LICHENI

Agiscono come spugne, assorbendo


dall’atmosfera, insieme all’umidità,
anche tutte le sostanze presenti. Alga e
fungo vivono in un equilibrio che la
presenza delle sostanze inquinanti
perturba, condizionando sopravvivenza
e crescita del lichene.

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I LICHENI

Per questa ragione i licheni sono


sempre più studiati ed utilizzati
come preziosi bioindicatori, cioè
come indicatori viventi dei livelli di
inquinamento atmosferico

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I LICHENI
I licheni agiscono anche come
bioaccumulatori, infatti, non potendole
utilizzare, accumulano notevoli
quantità di sostanze tossiche, l’analisi
chimica di quello che si trova nei
licheni fornisce molte indicazioni su
ciò che c’è o che c’era nell’aria, e
quando le concentrazioni sono troppo
elevate il lichene muore.

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I LICHENI

Da quanto detto appare chiaro che i licheni


assumono ciò che di buono o cattivo capita
a loro portata, sono sensibili a tutti i
contaminanti più comuni e più tristemente
famosi quando si parla di inquinamento:
anidride solforosa, ossidi di azoto, e poi i
metalli pesanti come piombo, rame, nichel,
cadmio, zinco.

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MITILI
La caratteristica più importante, che la specie
scelta come bioindicatore deve presentare, è
la mancanza di meccanismi biochimici o
fisiologici in grado di regolare le
concentrazioni tissutali dei contaminanti. In
questo modo, infatti, l’organismo concentra
queste sostanze nei propri tessuti in maniera
proporzionale al loro livello ambientale

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MITILI
I principali vantaggi offerti da un programma di
monitoraggio condotto mediante l’utilizzo di
bioindicatori si possono riassumere nei seguenti punti:
- valutazione del grado di contaminazione dell’area costiera
secondo una misura “integrata nel tempo” e non
riferibile, quindi, al solo momento in cui è stato
effettuato il prelievo;
- possibilità di evidenziare facilmente gradienti di
inquinamento sia in senso spaziale che temporale,
nonché di effettuare confronti tra aree geograficamente
distanti

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MITILI

- stima della “biodisponibilità” delle sostanze


tossiche presenti nell’ambiente marino e
valutazione del rischio legato al trasferimento
di questi elementi attraverso le catene
alimentari.

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MITILI
La specie sicuramente più utilizzata a livello
mondiale per questo tipo di studi è il mitilo
comune (Mytilus galloprovincialis), per il quale
la letteratura internazionale offre numerosi
dati di riferimento ed indicazioni sulle
principali variabili biologiche da considerare
nella interpretazione dei dati.

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MITILI
dopo il prelievo, i campioni destinati allo studio
del bioaccumulo possono essere mantenuti
refrigerati a circa 4°C, in ambiente umido ma
non immersi in acqua, fino a un massimo di 24
ore dal momento del prelievo; oppure possono
essere congelati a -20°C per tempi di analisi
più lunghi.

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Analisi del contenuto di metalli pesanti in
Mytilus galloprovincialis
Il metodo prevede la digestione dei campioni
con opportune soluzioni acide mediante
sistema chiuso, a microonde. Il contenuto dei
metalli è determinato per spettrofotometria
ad assorbimento atomico con atomizzazione a
fiamma o termoelettrica. Per il mercurio si
utilizza la tecnica dello strippaggio a vapori
freddi previa riduzione del mercurio con
cloruro stannoso o sodio boridruro.

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Esempio di preparazione della soluzione
per la mineralizzazione con forno a
microonde
Indipendentemente dalle metodologie ed
apparecchiature utilizzate per la
mineralizzazione dei campioni e la
determinazione degli elementi, nel rapporto di
analisi devono essere specificati il limite di
rilevabilità della metodica utilizzata e le
percentuali di recupero dei singoli elementi
(accuratezza) rispetto a matrici organiche
certificate.
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Esempio di preparazione della soluzione
per la mineralizzazione con forno a
microonde

• Trasferire circa 0,3 g di campione (sostanza secca)


nell’apposito contenitore.
• Addizionare 7 ml di HNO3 e 1 ml di H2O2.
• Lasciare riposare dopo l’aggiunta dei reattivi per 15/20
minuti.
• Impostare il ciclo operativo appositamente
predisposto.
• Dopo raffreddamento travasare in un matraccio tarato
e portare a volume (100ml) con acqua ultrapura.
• La prova in bianco viene effettuata con le stesse
modalità operative e con le stesse quantità di reagenti

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RIFIUTI
La normativa di riferimento a livello nazionale in
materia di rifiuti è rappresentata dal Decreto
legislativo n. 152 del 3 aprile 2006, emanato in
attuazione della Legge 308/2004 “delega
ambientale” e recante “norme in materia
ambientale”. Tale Decreto dedica la parte IV alle
“Norme in materia di gestione dei rifiuti e di
bonifica dei siti inquinati” (articoli 177 – 266) ed ha
abrogato una serie di provvedimenti precedenti tra
cui il Decreto legislativo n. 22 del 5 febbraio 1997,
cosiddetto Decreto “Ronchi”.

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RIFIUTI

• La classificazione dei rifiuti presente nel D.lgs.


152/06 distingue i rifiuti secondo l’origine in:
Rifiuti urbani e Rifiuti speciali,
• secondo le caratteristiche di pericolosità in:
Rifiuti pericolosi e non pericolosi.
• L’art. 184, comma 5), stabilisce che sono rifiuti
pericolosi quelli contrassegnati da apposito
asterisco nell’elenco CER2002.

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RIFIUTI

• In tale elenco alcune tipologie di rifiuti sono


classificate come pericolose o non pericolose fin
dall’origine, mentre per altre la pericolosità dipende
dalla concentrazione di sostanze pericolose e/o
metalli pesanti presenti nel rifiuto. I "metalli pesanti"
sono antimonio, arsenico, cadmio, cromo (VI), rame,
piombo, mercurio, nichel, selenio, tellurio, tallio e
stagno: possono essere presenti sia puri che,
combinati con altri alementi, in composti chimici.

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RIFIUTI
Già con il Dlgs 22/97 in Italia incominciò il
"nuovo corso dei rifiuti" emanato con l'intento
e con la necessità di avvicinarsi alle Direttive
europee in materia.
Ma è con l'introduzione del D.Lgs. 36/03 e del
Decreto Ministeriale del 13 marzo 2003 che lo
scenario dello smaltimento e della
classificazione dei rifiuti in Italia è cambiato.

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NORMATIVA CONTAMINANTI NEGLI ALIMENTI
Quadro legislativo
Regolamento (CEE) n. 315/93 del Consiglio, dell’8 febbraio 1993,
che stabilisce procedure comunitarie relative ai contaminanti nei prodotti
alimentari (G.U. Serie L n. 37 del 13 febbraio 1993)
Tenori massimi
Regolamento (CE) n. 1881/2006 della Commissione del 19
dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei
prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 364 del 20 dicembre 2006)
Regolamento (CE) n. 1126/2007 della Commissione del 28
settembre 2007 che modifica il regolamento (CE) n. 1881/2006 che
definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari
per quanto riguarda le Fusarium-tossine nel granoturco e nei prodotti a
base di granoturco
(G.U.U.E. Serie L n. 255 del 29 settembre 2007)

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NORMATIVA CONTAMINANTI NEGLI ALIMENTI
Regolamento (CE) n. 565/2008 della Commissione del 18 giugno
2008 recante modifica del regolamento (CE) n. 1881/2006, che
definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari
per quanto riguarda la definizione del tenore massimo di diossine e
PCB nel fegato di pesce.
Regolamento (CE) n. 629/2008 della Commissione del 2 luglio
2008 che modifica il regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i
tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari.
Campionamento ed analisi
Regolamento (CE) n. 1882/2006 della Commissione del 19
dicembre 2006 che stabilisce metodi di campionamento ed analisi
per il controllo ufficiale del tenore di nitrati in alcuni prodotti alimentari
(G.U.U.E. Serie L n. 364 del 20 dicembre 2006)

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NORMATIVA CONTAMINANTI NEGLI ALIMENTI
Campionamento e analisi
Regolamento (CE) n. 401/2006 della Commissione del 23 febbraio
2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo
ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari
(G.U.U.E. Serie L n. 70 del 9 marzo 2006)
Regolamento (CE) n. 333/2007 della Commissione del 28 marzo
2007 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo
ufficiale dei tenori di piombo, cadmio, mercurio, stagno inorganico, 3-
MCPD e benzo(a)pirene nei prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 88
del 29 marzo 2007)
Regolamento (CE) n. 1883/2006 della Commissione del 19
dicembre 2006 che stabilisce metodi di campionamento d’analisi per il
controllo ufficiale dei livelli di diossine e di PCB diossina-simili in alcuni
prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 364 del 20 dicembre 2006)

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Campionamento e analisi Alimenti
Quelli che ha noi interessano maggiormente, visto che
trattano degli unici metalli (Pb, Cd, Hg e Sn) per i quali è
previsto un limite massimo negli alimenti, sono:
Regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i tenori
massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari in
particolare Pb, Cd, Hg e Sn
Regolamento (CE) n. 333/2007 relativo ai metodi di
campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori
di piombo, cadmio, mercurio, stagno inorganico,

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Campionamento e analisi Alimenti
In fase di campionamento occorre adottare
precauzioni per evitare qualsiasi alterazione che
possa incidere sul tenore dei contaminanti,
compromettere la determinazione analitica o la
rappresentatività dei campioni globali. I campioni
devono essere prelevati per quanto possibile in vari
punti distribuiti nell'insieme della partita o della
sottopartita. Qualsiasi deroga a tale procedura va
segnalata nell’apposito verbale

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Campionamento e analisi Alimenti
L'analista deve garantire che i campioni non subiscano
alcuna contaminazione durante la loro preparazione.
Se possibile, le apparecchiature e le attrezzature che
vengono a contatto con il campione non devono
contenere i metalli da determinare e devono essere
realizzate con materiali inerti, ad esempio materie
plastiche come il polipropilene, il politetrafluoroetilene
(PTFE), ecc. La pulizia dovrebbe essere effettuata con
acidi per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
Per le lame è consentito l'impiego di acciaio
inossidabile di elevata qualità.

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Campionamento e analisi Alimenti
L’analisi va effettuata su un campione più possibilmente
omogeneo e rappresentativo, una cui porzione (±0.5g)
viene mineralizzata con acidi altamente ossidanti, in
genere HNO3 ed in presenza di H2O2 per garantire la
completa distruzione della sostanza organica. Ottenuta
la dissoluzione si porta il liquido ad un volume noto
(100 ml) e si procede alla lettura in assorbimento
atomico. Vista la complessità delle matrici in esame è
opportuno utilizzare i modificatori di matrice.

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Campionamento e analisi Alimenti
Il ricorso ad un idoneo modificatore consente di
rendere la matrice più volatile o di formare composti
più stabili con l’elemento in esame; mediante un
opportuno ciclo elettrotermico è possibile
allontanare la matrice senza perdere l’analita di
interesse. Permettono di ottimizzare le condizioni
analitiche consentendo agli strumenti di raggiungere
migliori limiti di rilevabilità e di dare una migliore
risposta durante l’analisi.

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Estrazione e preparazione

La determinazione dei metalli nelle matrici


ambientali, solide in particolare, è una
combinazione di procedure di digestione con
lo scopo di dissolvere il campione per la
successiva analisi.

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Estrazione e preparazione

Nel campo nazionale ed internazionale


vengono usate diverse tipologie di tecniche di
digestione anche in funzione delle diverse
matrici. Le tipologie di digestioni variano dalla
determinazione totale ottenuta usando la
dissoluzione completa della matrice fino alla
digestione parziale (con presenza di una
frazione residua).

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Estrazione e preparazione

La digestione è quindi una combinazione di un


processo di ossidazione della materia organica
e dissoluzione/estrazione della parte minerale
dove vengono portati in soluzione gli elementi
di interesse per la successiva determinazione
strumentale.

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Estrazione e preparazione

Le tecniche di digestione nell' analisi di matrici


ambientali sono essenzialmente rivolte al
trattamento mediante acidi forti o miscele di essi. Vi
sono metodi che prevedono l'uso di acidi diluiti e
tecniche cosiddette di "fusione" usando acidi e basi
concentrate a temperature maggiori di 300°C.

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Estrazione e preparazione

L'acido nitrico concentrato (68%, 16M), è il più


comunemente usato per la digestione acida.
E’ un forte ossidante usato per la dissoluzione
di leghe e campioni biologici, sebbene spesso
risulta necessaria l'aggiunta di HCl o HF per
completare la dissoluzione di molti metalli e
minerali, che formano specie complesse.

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Estrazione e preparazione

In generale l'acido nitrico forma un azeotropo


con l'acqua al 68%; HNO3, ha punto
d'ebollizione a 122°C. Il punto d'ebollizione
relativamente basso fa si che spesso si rende
necessaria l'aggiunta di altri forti ossidanti
come H202 o HCl04. Le proprietà ossidanti dell'
HNO3 vengono a mancare sotto la
concentrazione 2 M.

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Estrazione e preparazione
L'acido cloridrico concentrato (36%, 12
M) è un ottimo solvente per molti ossidi
di metalli, ma viene raramente usato da
solo per la digestione acida. Viene
comunemente usato con HNO3 in
rapporto 3:1(acqua regia).

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Estrazione e preparazione

L’acido fluoridrico risulta essere l'unico


acido capace di dissolvere
completamente i materiali a base di silice,
come sedimenti, terreni ecc. Solitamente
a livello commerciale è disponibile alla
concentrazione del 48% corrispondente a
29M

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Estrazione e preparazione

L'acido fluoridrico corrode il vetro, pertanto le


mineralizzazioni devono essere condotte in
contenitori di plastica, preferibilmente di
teflon; è un acido tossico e corrosivo, risulta
essere uno dei più pericolosi che si possono
usare in laboratorio.

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Estrazione e preparazione

Le ragioni che conducono all'uso delle miscele di acidi


possono essere:
- Sfruttare le proprietà di ogni singolo acido che
compone la miscela (ad esempio il potere ossidante
insieme al potere complessante).
- Due o più acidi hanno un potere reattivo elevato.
- Moderare la proprietà di un singolo acido con la
presenza di un altro acido.

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TIPI DI MINERALIZZAZIONE

Tra le più comuni procedure di digestione


acida (mineralizzazione) vi è la cosiddetta
mineralizzazione a ricadere. Questa procedura
che ha anche problemi di riproducibilità
dovuta alla presenza di metalli volatili che
vengono persi durante la mineralizzazione è
stata completamente soppiantata dal sistema
chiuso in forno a microonde.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE
Il più grosso vantaggio della digestione a
microonde è la possibilità di scaldare
rapidamente il campione e poter controllare
nel migliore dei modi la temperatura e la
pressione di reazione; inoltre il sistema chiuso
minimizza la perdita di metalli volatili come ad
esempio As e Se.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

Altri vantaggi consistono nell'impiego di un


minor volume di acidi e nella notevole
riduzione dei tempi. Generalmente si fanno
reagire da 0.5g-2g di campione in 6-8ml di
acido o miscela acida per 10÷15 minuti.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

Il sistema è costituito da più contenitori (max 12),


generalmente in teflon (Vessel),nei quali si inserisce il
campione e gli acidi necessari alla digestione, la
chiusura è ermetica mediante tappo munito di
valvola di sicurezza. Il tutto, assemblato nell’apposto
rotore viene introdotto all'interno del un forno a
microonde e dopo aver collegato i sensori di
temperatura e pressione si procede alla
mineralizzazione attivando il programma
appositamente predisposto.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE
Finito il ciclo si lascia raffreddare e si procede al recupero
del campione portando ad un volume noto (100ml) con
acqua ultrapura avendo cura di lavare accuratamente il
contenitore. Eventuale presenza di residui insolubili viene
rimossa per centrifugazione. La soluzione limpida ottenuta
viene portata alla lettura strumentale per determinare la
concentrazione dei metalli, confrontando le varie assorbanze
ottenute con una retta di calibrazione creata per ogni singolo
elemento avendo cura della linearità della stessa nel range
in esame. Per concentrazioni che non rientrano nel range di
calibrazione si procede alla diluizione dei campioni o
all’utilizzo di una lunghezza d’onda meno sensibile

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Esempio di mineralizzazione per i sedimenti
Trasferire circa 0,5 g del campione di sedimento tal quale
nell’apposito contenitore, tolti manualmente eventuali corpi
grossolani superiori a 0,5 centimetri. Addizionare 3 ml di HCl e 9
ml di HNO3 e lasciare riposare 15-20 minuti. Eseguire il ciclo
operativo appositamente programmato, lasciare
raffreddare,addizionare 2 ml di HF, lasciar riposare 15-20 minuti
e ripetere il ciclo di mineralizzazione. Dopo raffreddamento
aggiungere 30 ml di soluzione satura di H3BO3, trasferire la
soluzione in contenitore tarato e portare a volume (100 ml) con
acqua ultrapura.
La procedura dovrà essere eseguita in doppio per ogni
campione.
La prova in bianco viene effettuata con le stesse modalità
operative sulla soluzione composta da 3 ml di HCl e 9 ml di
HNO3 e 2 ml di HF.
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Esempio di mineralizzazione per i sedimenti
Tutte le procedure di digestione ed analisi dovranno essere
ripetute su campioni certificati. I risultati finali vanno
espressi in mg/kg peso secco.
I risultati cosi ottenuti sono riferiti ad 1 kg di sostanza secca
a 105°C, previa determinazione gravimetrica del contenuto
di umidità residua, come indicato dal D.M. 185 del 13/09/99
“Approvazione dei metodi ufficiali per l’analisi chimica del
suolo” (Metodo II.2). Le pesate per ottenere il valore di
umidità (almeno in doppio) vanno eseguite
contemporaneamente a quella per la determinazione dei
metalli.

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Forno a microonde

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Forno a microonde

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Forno a microonde

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Forno a microonde
1)Contenitore in teflon (vessel); 2) Tappo con valvola di sicurezza; 3) Camicia; 4) sensore
pressione; 5) sensore temperatura

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Forno a microonde

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE
Il riscaldamento è ottenuto con un sistema generatore
di microonde ad elevata frequenza 2450 MHZ. Le
microonde sono onde elettromagnetiche con una
frequenza (al disopra del IR e al disotto delle onde
radio) particolare che determina un forte movimento
convettivo delle molecole di acqua che si traduce in
un riscaldamento rapido e molto efficiente (sono
sufficienti pochi minuti di irradiazione con microonde
per portare alla temperatura di ebollizione una
soluzione)

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

Generalmente la temperatura massima


utilizzata in questa apparecchiatura per
evitare la deformazione e la rottura dei
contenitori di Teflon è di 240°C ed una
pressione limite di 8,3 MPa.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE
La determinazione quantitativa degli elementi nelle
soluzioni ottenute con i diversi metodi di
mineralizzazione può essere soggetta a diversi errori
che sono indipendenti dalla metodologia utilizzata per
l’analisi dei metalli pesanti. Gli errori più frequenti sono
la presenza di impurezze o contaminazioni provenienti
da reagenti o da acidi casualmente contaminati o di
bassa purezza, utilizzazione di vetreria non
perfettamente pulita, solubilizzazione di elementi dai
contenitori di vetro o speciali durante l’attacco acido.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

Altre fonti di errore possono essere causate dalla


metodologia utilizzata per la digestione del campione:
incompleta dissoluzione, perdite di alcuni elementi per
volatilizzazione, formazione di complessi refrattari
(monossidi) come Al, Ti, Mo e V. Questi errori
comportano, generalmente, una sovrastima della
concentrazione di alcuni elementi comparati con i
contenuti dei CRM (Certified Reference Materials)

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

Per l'analisi di Campioni reali, sono disponibili


Matrici di Riferimento Certificate (CRM-
Certified Reference Materials) per la
quantificazione ed il monitoraggio di
microcontaminanti organici, elementi in tracce
(metalli pesanti) e altri composti organici
(VOC, COV, TPH, Clorurati, TOC), in Suoli,
Sedimenti, Ceneri, Acque di Scarico, Ambiente
Marino e Lacustre, Piante, Alimenti etc.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE
L’utilizzo di materiali di riferimento certificati nelle
prove di laboratorio assicura che i risultati siano
riferibili, ovvero che il risultato finale possa essere
messo in relazione con un riferimento
riconosciuto (unità di misura primaria); consente
inoltre di verificare se la procedura utilizzata è più
o meno adeguata allo scopo prefisso.E’ quindi
importante per la validazione di un metodo.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

L'uso appropriato dei materiali di riferimento


certificati ci da la possibilità di valutare la
qualità del metodo e del dato analitico, quali
la linearità di risposta, l'esattezza, la
precisione, l’accuratezza, i limiti di rivelazione
e di quantificazione, la selettività e la
specificità.

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MICROONDE-MINERALIZZAZIONE

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TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

• EN 12457-1:2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio


of 21/Kg with particle size below 4 mm (without or with size
reduction).
• EN 12457-2:2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio
of lO 1/Kg with particle size below 4 mm (without or with size
reduction).
• EN 12457-3:2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio
of 2 l/Kg anf S1/Kg with particle size below 4 mm (without or
with size reduction).
• EN 12457-4 :2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio
of lO 1/Kg with particle size below lO mm (without or with
size reduction).

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TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

l quattro test di cessione prevedono l'uso


dell'acqua deionizzata e sono molto simili tra
di loro. Le differenze riguardano il rapporto
liscivante / solido (L / S) che è pari a 2 nel
primo test e a 1O nel secondo e nel quarto, ed
è costituito da due stadi sequenziali nel terzo.
In questa sede tratteremo solo il 2 che è
quello più utilizzato.

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TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

La NORMA UNI EN 12457-2


Pezzatura del rifiuto
Il materiale viene esaminato nello stato in cui è
utilizzato o smaltito e comunque a pezzatura
inferiore a 4 mm. La parte di campione con
granulometria maggiore di 4 mm se è superiore a14
% viene macinata in un mulino a mascella o a
martelli, dopo eventuale essicamento all'aria a
temperatura non superiore a 40°C; in nessun caso il
materiale deve essere finemente macinato

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TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

Condizioni di prova e fase di liscivazione


Durante l'esecuzione della prova, la temperatura deve
essere intorno ai 20-25 cc.
100±5 g di campione (rispetto alla massa secca)
vengono posti in un recipiente di dimensioni tale da
avere il minimo spazio morto possibile (es. bottiglie
da 1l di polietilene) e si aggiunge acqua in modo tale
da ottenere un rapporto liquido I solido pari a 1O ±
2% I/Kg. Si agita per 24 ±0.5 ore utilizzando dispositivi
che prevedono la rotazione della bottiglia sull'asse
verticale
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TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

Fase di separazione liquido /solido


Si lascia decantare la sospensione per 15 ± 5 min e si filtra
l'eluato su una membrana filtrante da 0.45 µm di 47 mm
di diametro sotto vuoto o a pressione, senza risciacquare
il filtro. Se la filtrazione non risulta possibile in meno di
un' ora con una velocità di flusso di almeno 30 ml/ cm2
ora, si deve adottare una procedura di separazione
liquido-solido alternativa che andrà poi descritta nel
rapporto di prova. Se per le caratterizzazioni analitiche
serve una quantità di eluato inferiore al totale filtrabile, è
possibile evitare di separare tutto l'eluato.

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TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

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DETERMINAZIONE DEGLI ANALITI NEGLI
ELUATI
Gli eluati vengono determinati per il loro
contenuto totale utilizzando, per i metalli, la
tecnica della spettrofometria per
assorbimento atomico. Dalla misura del
segnale di assorbanza, alla specifica lunghezza
d’onda, si ricava la concentrazione mediante
confronto con una curva di calibrazione
ottenuta con soluzioni a concentrazioni note
comprese nel campo di indagine analitica.

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DETERMINAZIONE DEGLI ANALITI NEGLI ELUATI
Tabella metodi di prova unificati

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