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Metodi analitici

Metodi analitici

Classificazione Curve di calibrazione Caratteristiche di una misura analitica: Accuratezza Sensibilità

Precisione -Intervallo di linearità

Selezione del metodo analitico Campionamento

IL PROCESSO ANALITICO

è la determinazione della quantità di un analita in un campione. Un‟analisi può essere suddivisa nei seguenti stadi:

1.1 Campionamento

campione rappresentativo del materiale da analizzare

1.2 Preparazione del campione

Conversione del campione in una forma adatta all’analisi e rimozione degli interferenti.

1. Materiale da analizzare

1.3 Analisi

Determinazione della quantità di analita contenuta nel campione

1.4 Valutazione dei risultati

Determinazione del risultato finale e valutazione della sua attendibilità.

1.3 . Individuazione del metodo analitico

Esame della letteratura, metodi già utilizzati su matrici simili, ecc. Ottimizzazione

Adattamento della procedura di analisi al

campione in esame.

1.4 Studio dell’affidabilità del metodo (accuratezza, precisione, ecc).

CAMPIONAMENTO

In generale, un‟operazione di campionamento può essere divisa in due fasi:

Prelievo dal campione da analizzare

prelevare un certo numero di aliquote del campione da analizzare in modo tale da garantire che il campione sia rappresentativo del materiale da analizzare nel suo complesso.

Le procedure di campionamento vengono stabilite in funzione dello stato fisico del materiale da analizzare (solido, liquido, gassoso).

del materiale da analizzare (solido, liquido, gassoso). I problemi di campionamento maggiori si incontrano nel caso
del materiale da analizzare (solido, liquido, gassoso). I problemi di campionamento maggiori si incontrano nel caso

I problemi di campionamento maggiori si incontrano nel caso di materiali solidi, di grandi dimensioni e caratterizzati da un elevato grado di eterogeneità.

Il campionamento dei liquidi presenta problemi minori. La situazione è più complessa per le sospensioni, poiché se le particelle della sospensione sono presenti in piccolo numero, è difficile ottenere un campione grossolano rappresentativo.

CAMPIONAMENTO

I gas sono omogenei, e quindi il loro prelievo è relativamente semplice. Poiché le specie gassose occupano elevati volumi, si cerca spesso di concentrare l‟analita durante il prelievo (preconcentrazione), ad esempio

mediante una delle seguenti procedure:

condensazione Il prelievo viene effettuato mediante passaggio dell‟analita allo stato liquido o solido per raffreddamento

intrappolamento Durante il prelievo l‟analita viene legato chimicamente mediante una reazione chimica (es. CO 2 (g) + 2NaOH Na 2 CO 3 )

adsorbimento:

Durante il fisicamente

prelievo

sulla

l‟analita

di

superficie

viene

un adeguato

legato

materiale adsorbente (es. carbone attivo)

CAMPIONAMENTO

Il campione non deve subire alterazioni prima dell'analisi. I processi di alterazione dipendono da una serie di fattori controllabili (temperatura, umidità, pH, presenza di ossigeno, esposizione alla luce). I principali processi di alterazione sono:

processi fisici

Evaporazione, sublimazione, precipitazione, degradazione fotochimica

processi chimici

Reazioni con la matrice, ossidazione da parte dell‟ossigeno atmosferico

processi biologici

Attività enzimatica endogena in campioni clinici, contaminazione batterica

Un altro fattore da tenere in considerazione, in particolare per analiti in tracce,

sono le interazioni con il contenitore (es. le materie plastiche possono adsorbire analiti poco polari, il vetro può rilasciare ioni metallici, adsorbire analiti polari o

catalizzare reazioni di decomposizione). In casi limite si possono effettuare le

analisi direttamente sul luogo con strumenti portatili o utilizzare sistemi on line che eseguono l‟analisi in tempo reale.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

La preparazione del campione ha la funzione di convertire l‟analita presente nel campione nella forma più adatta per l‟analisi, specificatamente una soluzione. Sebbene in alcuni casi ciò si possa effettuare semplicemente aggiungendo un solvente, spesso occorre effettuare trattamenti per renderlo solubile La scelta del procedimento ottimale di trattamento richiede la conoscenza di:

chimica degli analiti

chimica della matrice

chimica delle interazioni fra matrice ed analiti

Nel trattamento del campione vengono anche comprese le procedure necessarie per l'eliminazione delle interferenze, specifiche per ogni tipo di analisi.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

L‟operazione di trattamento del campione è spesso un‟operazione critica per l‟analisi nel suo complesso, e può essere origine di errori rilevanti:

solubilizzazione incompleta dell'analita

Decomposizione e solubilizzazione incompleta dell'analita (oppure della matrice) determinano un recupero incompleto.

perdite di analita per volatilizzazione

La combinazione di trattamenti ad elevata temperatura ed impiego di certi reagenti può portare per determinati analiti alla formazione di specie volatili.

introduzione di analita come contaminante del solvente o dei reagenti

Solventi e reagenti vengono impiegati in forte eccesso: l'impiego di prodotti non sufficientemente puri può portare all‟introduzione di quantità significative di analita, in particolare nel caso di analisi di tracce.

introduzione di un analita attraverso le apparecchiature utilizzate

Durante trattamenti drastici piccole quantità di analita (es. cationi metallici) possono

derivare dall‟attacco delle pareti del recipiente da parte dei reagenti utilizzati.

SELEZIONE DEL METODO ANALITICO

La definizione del metodo analitico da utilizzare presuppone la conoscenza di una serie di fattori, fra i quali:

1. Natura dell‟analita

2. Natura del campione: la presenza di particolari sostanze nella matrice del campione può influenzare l'applicabilità o le prestazioni

di una tecnica analitica.

3. La concentrazione dell‟analita

4. Affidabilità richiesta per l‟analisi

Questi parametri determinano la scelta della tecnica (alcune potrebbero non

essere utilizzabili perché le concentrazioni da determinare sono troppo basse

oppure la tecnica non è abbastanza precisa). D‟altra parte, effettuare una

analisi più precisa o accurata del necessario spesso comporta una spesa aggiuntiva inutile.

SELEZIONE DEL METODO ANALITICO

Le prestazioni richieste ad una metodica analitica dipendono anche dalla quantità di analita nel campione: per analiti presenti in tracce ed ultratracce sono tollerate accuratezze e precisioni molto minori rispetto a quelle richieste nella determinazione dei costituenti principali di un campione.

Deviazioni

standard

dei

risultati

di

analisi

effettuate

in

diversi

laboratori

in

funzione

della

concentrazione

dell‟analita

determinare.

da

effettuate in diversi laboratori in funzione della concentrazione dell‟analita determinare. da

CARATTERISTICHE DI UNA METODICA ANALITICA

La conoscenza delle caratteristiche di una metodica analitica permette di verificare l'adeguatezza della tecnica a quella particolare applicazione. I parametri quantitativi che definiscono le prestazioni della tecnica analitica.

Questi parametri sono i primi dati da verificare per stabilire se un metodo analitico è adatto per una determinata analisi.

Accuratezza

Precisione

Sensibilità

Limite di rivelabilità (LR) e di dosabilità (LD)

Intervallo di linearità

Selettività

PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE QUANTITATIVE

Classificazione in base al metodo di

analisi

metodi classici

gravimetria

volumetria

metodi strumentali (fisici e chimico-

fisici)

spettrofotometria

Conduttometria

Potenziometria,

ecc

CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI

Metodi gravimetrici:

L'analita viene determinato misurando la sua massa oppure la massa di un composto ad esso correlato.

Si trasforma l‟analita in una specie chimica che possa essere separata, purificata e pesata.

Ad esempio, in una determinazione gravimetrica dello ione Ba 2+ esso viene precipitato sotto forma di BaSO4 mediante aggiunta di un eccesso di ione SO4 2- . Se mBaSO 4 è la massa del precipitato di BaSO4, la massa dello ione Ba 2+ contenuta nel campione analizzato è data dalla relazione

m

Ba

2

M Ba

2

M BaSO

4

m

BaSO

4

Oltre alla massa di BaSO4, in questa relazione non sono presenti altre grandezze che devono essere determinate (o confermate)

sperimentalmente.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI

Metodi volumetrici: L'analita viene determinato misurando il volume di una soluzione contenente un reagente (titolante) in quantità sufficiente per reagire completamente con esso. Si misura il volume di una soluzione contenente il reagente a concentrazione nota (soluzione titolata) necessario per reagire completamente con l‟analita contenuto in un volume noto di soluzione

La standardizzazione comporta l'impiego di un adatto analita (standard primario), del quale è possibile prelevare una quantità esattamente nota mediante pesata diretta. Questa soluzione viene poi titolata con il titolante da standardizzare per determinarne la

concentrazione. Ad esempio, se la titolazione con NaOH (titolante da standardizzare) di una massa eq C6H5COOH di acido benzoico (standard primario) richiede un volume V NaOH di titolante, la concentrazione N NaOH di NaOH è data dalla relazione

  ME

m

C H COOH

6

5

C H COOH

6

5

eq

C H COOH

6

5

N NaOH

V

NaOH

V

NaOH

Metodi strumentali

Si eseguono analisi qualitative e quantitative misurando una grandezza fisica o una proprietà chimico-fisica che è in relazione con il tipo e/o con la quantità di analita presente.

Metodo basato su una relazione matematica che lega il parametro misurato con la concentrazione (o la quantità assoluta) dell‟analita.

Assorbanza a 412 nm

CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI

Metodi analitici che richiedono calibrazione.

In questa categoria di metodi (a cui appartiene la maggior parte dei metodi analitici strumentali) la dipendenza fra la grandezza misurata e la concentrazione deve essere determinata sperimentalmente mediante la costruzione di una curva di calibrazione o retta di taratura.

La curva di calibrazione descrive l’andamento del segnale ottenuto in un metodo analitico strumentale in funzione della concentrazione dell’analita.

Fe ++ +

3

N N
N
N

Fe

N N
N
N

3

fenantrolina

[Fe(fenantrolina) 3 ] 2+

++

[Fe 2+ ]

CURVE DI CALIBRAZIONE

In

generale nella messa a punto di un metodo analitico si cerca

di

ottenere una curva di calibrazione di tipo lineare, nella quale

il segnale (S) è legato alla concentrazione dell'analita (C) da una equazione generale del tipo

S mC b

dove b è il segnale del bianco (che può anche essere nullo).

Una curva di calibrazione lineare :

dipende da due soli parametri (k ed b), facilmente calcolabili mediante una procedura di regressione lineare

TIPI DI ERRORE NELLE ANALISI CHIMICHE

Gli errori sperimentali possono essere suddivisi in

casuali,

sistematici

L‟individuazione del tipo di errore presente in una misura è importante poiché da questo dipendono le sue caratteristiche ed il modo in cui può essere gestito.

Errore casuale (o indeterminato)

è presente in ogni misura;

non può essere eliminato in quanto è insito nella misura

stessa;

Ha un valore variabile in modo

casuale ed il suo effetto sul risultato può essere studiato con un approccio statistico.

Errore sistematico (o determinato)

1. ha un valore costante per ogni misura effettuata nelle medesime condizioni

sperimentali, quindi può essere

corretto;

2. ha - almeno in linea di principio - una origine definita che può essere

individuata ed eventualmente eliminata.

ERRORE CASUALE: PRECISIONE

Ogni misura è soggetta ad errori estremamente piccoli e con uguale probabilità di essere positivo o negativo.

La curva che descrive la distribuzione dell'errore casuale in un insieme infinito di misure è la curva Gaussiana definita da una equazione matematica contenente due soli parametri, la media (μ) e la deviazione standard (σ) della popolazione .

Sebbene l'errore casuale non possa essere eliminato, il suo effetto può essere analizzato mediante un approccio di tipo statistico che permette di valutare l'errore casuale presente nella misura. Inoltre la media di un insieme di misure è più affidabile del risultato di una misura singola.

Una curva Gaussiana è (il concetto di grandezze statistiche relative alla popolazione

verrà definito meglio in seguito). N  N x i 2  ( x 
verrà definito meglio in seguito).
N
N
x
i
2
( x
)
 
i
1
i
N
i
1
N
 )   i  1 i N  i  1  N μ

μ

x

La media della popolazione (μ) - il

valore della grandezza che si sta

misurando - è definita come la media aritmetica della popolazione dei dati. In assenza di errori sistematici, la media della popolazione coincide con il valore vero della grandezza che si sta misurando.

popolazione (σ) - che

misura della dispersione della popolazione di dati - è data dalla relazione seguente:

è una

La

deviazione

standard

della

CURVA GAUSSIANA

Dal punto di vista matematico questa funzione rappresenta una distribuzione di probabilità, quindi il suo significato pratico è il seguente.

In una misura, la probabilità P(x 1 ,x 2 ) di ottenere un risultato compreso fra x 1 ed x 2 corrisponde all'area sottesa dalla curva fra questi due valori.

μ

x 1

x 2

P(x 1 ,x 2 )

x

CAMPIONE E POPOLAZIONE

La curva Gaussiana descrive rigorosamente la distribuzione dell'errore casuale in un insieme infinito di dati (popolazione), ma in pratica lo sperimentatore ha accesso soltanto ad numero limitato di dati (campione).

POPOLAZIONE insieme di tutte le misure

CAMPIONE

Misure

realmente

effettuate

La deduzione dei parametri statistici (es. la media) di una popolazione - cioè il dato che

effettivamente si vorrebbe ottenere da un’analisi - a partire da quelli misurati in un suo

campione rappresenta uno dei problemi principali affrontati mediante la statistica.

CAMPIONE E POPOLAZIONE

A causa delle dimensioni limitate, il campione non è rappresentativo dell'intera popolazione: in genere media e deviazione standard misurati su di un campione non coincidono con quelli della popolazione (i parametri misurati sul campione sono pertanto stime statistiche di quelli della popolazione).

Popolazione

μ

σ

x

Campione

s x
s
x

x

Per questa ragione, le grandezze statistiche vengono definite in modo differente a seconda che si riferiscano alla popolazione di dati o ad un campione di dati.

La media

x

N

x i è definita esattamente nello stesso modo della media della

i

1

popolazione,

N

La deviazione standard

ottenuta utilizzando x al posto di μ ed introducendo (N 1) al posto di N:

(s) del campione è data dalla equazione seguente,

N  2 (x i x)  i  1 N  1
N
2
(x
i x)
i
 1
N
 1

s

STATISTICA SU DATI REALI

Le relazioni statistiche valide per una popolazione devono essere corrette se applicate ad un campione, Una serie limitata di misure non permette di determinare il valore vero μ di una grandezza o la sua deviazione standard σ, ma soltanto x ed s. Utilizzando la statistica è però possibile definire un intervallo di valori (intervallo di fiducia) all’interno del quale si dovrebbe trovare la media μ della popolazione

intervallo di fiducia: un intervallo attorno al valore sperimentale all'interno del quale cadrà, con una certa probabilità, il valore vero

x

i

N

1

N

x

i

s

N  2 (x i x)  i  1 N  1
N
2
(x
i x)
i
 1
N
 1

Se N è troppo piccolo, la media del campione può non coincidere con la media della popolazione a causa della non rappresentatività del campione stesso.

La deviazione standard (s) del campione è data dalla equazione seguente, ottenuta utilizzando x al posto di μ ed introducendo (N 1) al posto di N:

Limite di fiducia

Data una serie di misure di cui sia nota la media e la relativa deviazione

standard (s

anziché con un numero limitato di dati) è possibile definire

Intervallo di fiducia: intervallo centrato attorno ad x all’interno del

quale ci si aspetta di trovare con una determinata probabilità (95% livello di fiducia, esiste comunque il 5% di probabilità che essa sia

dovuta all'errore casuale) il valore della media popolazione.

x della

Limite di fiducia inferiore

Intervallo di fiducia

Limite di fiducia superiore

ta

a = 5%

12,706

4,303

3,182

2,776

2,571

2,447

2,365

2,306

2,262

2,228

2,201

2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,201 x x dove t a è un parametro numerico (“t

x

2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,201 x x dove t a è un parametro numerico (“t

x

dove ta è un parametro numerico (“t di Student”), il cui valore può essere ricavato da apposite tabelle. Il valore di t dipende dal livello di fiducia desiderato e dal numero di gradi di libertà del sistema, cioè in ultima analisi dal numero di dati del campione.

La definizione di intervallo di fiducia è valida solo in assenza di errori di tipo sistematico (le misure sono affette soltanto dall‟errore casuale).

TABELLA DEI VALORI DELLA t DI STUDENT

Gradi di

 

Livello di fiducia (%)

di dati

50

80

90

95

99

1

1,000

3,078

6,314

12,706

63,657

2

0,816

1,886

2,920

4,303

9,925

3

0,765

1,638

2,353

3,182

5,841

4

0,741

1,533

2,132

2,776

4,604

5

0,727

1,476

2,015

2,571

4,032

6

0,718

1,440

1,943

2,447

3,707

7

0,711

1,415

1,895

2,365

3,500

8

0,706

1,397

1,860

2,306

3,355

9

0,703

1,383

1,833

2,262

3,250

10

0,700

1,372

1,812

2,228

3,169

15

0,691

1,341

1,753

2,131

2,947

20

0,687

1,325

1,725

2,086

2,845

0,674

1,282

1,645

1,960

2,576

Libertà = numero

TABELLA DEI VALORI DELLA t DI STUDENT

Il valore di t aumenta

all’aumentare del livello

di fiducia richiesto

Gradi di

libertà

 

Livello di fiducia (%)

 

50

80

90

95

99

1

1,000

3,078

6,314

12,706

63,657

2

0,816

1,886

2,920

4,303

9,925

3

0,765

1,638

2,353

3,182

5,841

4

0,741

1,533

2,132

2,776

4,604

5

0,727

1,476

2,015

2,571

4,032

6

0,718

1,440

1,943

2,447

3,707

7

0,711

1,415

1,895

2,365

3,500

8

0,706

1,397

1,860

2,306

3,355

9

0,703

1,383

1,833

2,262

3,250

10

0,700

1,372

1,812

2,228

3,169

15

0,691

1,341

1,753

2,131

2,947

20

0,687

1,325

1,725

2,086

2,845

0,674

1,282

1,645

1,960

2,576

Il valore di t diminuisce

all’aumentare del numero

di gradi di libertà

Per

parametro t coincide con

quello di z (vedi dopo)

il valore del

N

=

INTERVALLO DI FIDUCIA

Alcune considerazioni sull'ampiezza dell'intervallo di fiducia:

L’ampiezza dell’intervallo di fiducia è proporzionale al valore di s.

L’ampiezza dell’intervallo di fiducia è inversamente proporzionale a √N. L’ampiezza può essere ridotta aumentando il numero delle misure. Aumentare

il numero delle misure è però conveniente solo fino ad un certo punto, oltre al

quale il miglioramento non giustifica il tempo richiesto per le analisi aggiuntive.

L’ampiezza dell’intervallo di fiducia è direttamente proporzionale a t. In base alla tabella precedente,

(a) t cresce all’aumentare del livello di fiducia richiesto

(b) t cresce al diminuire del numero dei dati.

Perché l'intervallo di fiducia sia abbastanza piccolo da

avere utilità pratica, talvolta si potrebbe dovere

accettare un livello di fiducia inferiore.

ORIGINE DELL'ERRORE SISTEMATICO

Gli errori sistematici hanno in genere una causa definita, e possono essere corretti eliminandola o semplicemente applicando una correzione ai risultati dopo avere

stabilito l'entità dell'errore. I più comuni tipi di errore sistematico sono:

Errori sistematici strumentali

Errori sistematici

personali

Errori sistematici di metodo

1. malfunzionamenti nella strumentazione

2. errori nella calibrazione delle apparecchiature

3. misure effettuate in condizioni

non appropriate

è

1. dovuto

all'errore

umano:

utilizzo scorretto

della strumentazione

delle

apparecchiature

laboratorio e

ad

di

delle procedure analitiche

Errori sistematici di metodo

lentezza o incompletezza di una reazione

instabilità di una specie chimica

non perfetta specificità dei reagenti

reazioni secondarie che competono con quella principale

CORREZIONE DELL'ERRORE SISTEMATICO

Rivelazione di errori

sistematici strumentali

Calibrazione periodica della

strumentazione per compensare fenomeni quali usura dei componenti dello strumento, risposta variabile nel

tempo, ecc.

Utilizzo di tecniche specifiche di calibrazione (es. metodo delle aggiunte standard) per compensare le interferenze dovute a specie presenti

 

nel campione.

 

es.:errore fotometrico

Rivelazione di errori

sistematici personali

Verifica sistematica delle letture strumentali, dei dati e dei calcoli.

Ripetizione dell’esperimento da parte di un altro sperimentatore.

Scelta di procedure analitiche

che non richiedono valutazioni

soggettive.

CARATTERISTICHE DI UNA METODICA ANALITICA

Per l'adeguatezza della tecnica a quella particolare applicazione, si valutano i parametri quantitativi che definiscono le prestazioni della tecnica analitica. Questi parametri sono i primi dati da verificare per stabilire se un metodo analitico è adatto per una determinata analisi.

Accuratezza

Precisione

Sensibilità

Limite di rivelabilità (LOD) e di quantificazione o dosabilità (LOQ o LOD)

Intervallo di linearità

Selettività

ACCURATEZZA

scarto tra il valore vero della quantità di analita presente ed il valore stimato espresso dalla media

L'accuratezza rappresenta l'errore commesso nell'analisi e viene in genere espressa attraverso l‟errore relativo percentuale dell'analisi e indica quanto una misura sia approssimabile al valore vero

Errorerelativo (%)

vera

conc.

vera

100

conc.

misurata

conc.

Siccome le caratteristiche di un metodo possono variare in funzione della concentrazione di analita presente nel campione, spesso esse vengono determinate per differenti concentrazioni di analita. corrispondenti a valori bassi, medi ed alti nell'intervallo di applicazione del metodo.

Errore fotometrico

Errore fotometrico a concentrazioni elevate, al di là delle possibili interazioni fra le molecole, la radiazione

a concentrazioni elevate, al

di là delle possibili interazioni fra le molecole, la radiazione uscente risulta troppo tenue, per cui il rivelatore, anche con elevata sensibilità, non è

in grado di apprezzarla

In spettrofotometria

A = - log T = εbc

Un errore dT comporta un errore dc:

T = 10 -εbc (è una esponenziale)

a basse concentrazioni interviene l‟errore di lettura del rivelatore.

dc : c vero = x :100 dc E  % 100 c Si vede
dc : c vero = x :100
dc
E 
%
100
c
Si vede che l’errore è minimo se la
• T% è compresa tra il 20% e il 60% o tra
0,69 e 0,22 di A.

Si può calcolare l‟errore relativo percentuale:

cioè:

Il valore ottimale corrisponde al punto di minimo della funzione in cui

T% = 36,8% e l’A = 0,434
T% = 36,8% e l’A = 0,434

PRECISIONE

La precisione di una metodica analitica esprime la riproducibilità di una misura,

ovvero la dispersione dei dati ottenuti da una serie di misure attorno al loro valore

medio

La precisione di una misura viene espressa come deviazione standard del valore

ottenuto dall'analisi dei replicati o attraverso grandezze correlate. In particolare,

una grandezza molto utilizzata è il coefficiente di variazione (deviazione standard relativa percentuale):

Deviazione standard

Deviazione standard relativa

Coefficiente di variazione (dev. st. relativa percentuale)

s

N  2 (x i x)  i  1 N  1
N
2
(x
i x)
i
 1
N
 1

s

DSR

DSR 

x

 

s

CV%

CV%   100%

100%

x

I parametri relativi

sono preferiti in quanto

forniscono maggiori informazioni sulla

precisione della misura

Come l'accuratezza, anche la precisione di un metodo può variare in funzione della concentrazione di analita e può essere determinata per differenti concentrazioni.

PRECISIONE

Per misurare la PRECISIONE viene misurato un parametro statistico s scarto quadratico medio o deviazione standard; più alta è la

precisione minima sarà s, che quantifica la dispersione dei valori ottenuti in una serie di misure

n-1 =

3

n

C (mg/L)

Media

scarto

quadrato

somma

/n-1

1

1.36

1,33

0,03

0,0009

0,0013667

0,0004556

0,0213437

2

1,35

 

0,02

0,0002778

     

3

1,32

 

-0,013333

0,0001778

     

4

1,33

 

-0,003333

1,111E-05

     

ACCURATEZZA vs. PRECISIONE

Precisione ed accuratezza di una misura sono grandezze indipendenti fra di loro.

Elevate precisione ed accuratezza

Elevata precisione, bassa accuratezza

Bassa precisione ed accuratezza

Bassa precisione, elevata accuratezza

ACCETTABILITA'

I valori di accuratezza e precisione minimi richiesti per una metodica analitica variano con l‟importanza relativa del componente da analizzare. Nell'analisi di

componenti in tracce (a livello di ppm) ed ultratracce (a livello di ppb), quali ad

esempio gli inquinanti, sono tollerate accuratezze e precisioni molto minori

rispetto a quelle richieste nella determinazione dei componenti principali del

campione.

nella determinazione dei componenti principali del campione. Deviazioni standard relative percentuali dei risultati di

Deviazioni standard relative percentuali dei risultati di una analisi in funzione della concentrazione dell‟analita da

determinare.

Segnale

SENSIBILITA’

La sensibilità di una metodica analitica rappresenta una misura della variazione del segnale in funzione della concentrazione dell'analita.

La sensibilità della calibrazione è definita come la variazione del segnale per unità di variazione della concentrazione dell'analita, ed è quindi la pendenza della curva di calibrazione.

Sensibilità dellacalibrazione

segnale

conc.

Se la curva di calibrazione è lineare, la sensibilità della calibrazione è costante ed indipendente dalla concentrazione dell'analita. In caso contrario, la sensibilità della calibrazione dipende dalla concentrazione alla quale essa viene calcolata.

conc.

segnale

Concentrazione

La sensibilità della calibrazione non indica però la capacità del metodo di discriminare fra differenti concentrazioni di analita, poiché non considera l'errore associato alla misura del segnale.

SENSIBILITA'

L

Per una funzione L = f©; la SENSIBILITA' è la pendenza della retta di taratura ossia la derivata della funzione (dL/dC)

M 1

L

C 1

C 2

M 2

Per misurare la PRECISIONE viene misurato un parametro statistico scarto quadratico medio o deviazione standard , più alta è la precisione

minima sarà , che quantifica la la dispersione dei valori ottenuti in una serie di misure

Segnale

LIMITI DI RIVELABILITA' E DI DOSABILITA’

Il limite di rivelabilità (LR) di una metodica analitica è definito come la minima concentrazione di analita rivelabile ad un determinato livello di fiducia, cioè che produce un segnale discriminabile dal segnale del bianco. Siccome a questa

concentrazione non è possibile ottenere dati quantitativi affidabili, il LR viene

utilizzato solo per definire la presenza o l‟assenza dell‟analita.

Esistono varie definizioni del limite di rivelabilità. Per i metodi che utilizzano una curva di calibrazione lineare il LR, definito come la concentrazione di analita che produce un segnale pari al segnale del bianco (S b ) più k volte la sua deviazione standard (s b ), può essere calcolato sulla base della pendenza della curva di calibrazione.

LR

k s

b

pendenza

Il valore di k dipende dal livello di fiducia

prescelto (ad esempio per k ~ 3 solo l‟1% dei bianchi presenterà un segnale maggiore di S b + 3 s b , causando quindi un falso positivo).

S b + k s b

S b

un segnale maggiore di S b + 3 s b , causando quindi un falso positivo).
un segnale maggiore di S b + 3 s b , causando quindi un falso positivo).
un segnale maggiore di S b + 3 s b , causando quindi un falso positivo).
un segnale maggiore di S b + 3 s b , causando quindi un falso positivo).

LR

Concentrazione

LIMITE DI RIVELABILITA' E DI DOSABILITA’

In termini quantitativi la minima concentrazione determinabile da un metodo è

invece è rappresentata dal limite di quantificazione.

Il limite di dosabilità (LD) di una metodica analitica è definito come la minima concentrazione di analita quantificabile con precisione ed accuratezza accettabili.

Come per il limite di rivelabilità, esistono varie definizioni del limite di

quantificazione. Nel caso di una curva di calibrazione lineare, il LD può essere definito e calcolato in modo analogo al LD sulla base della pendenza della curva

di calibrazione.

LD

k ' s

b

pendenza

I valori di k' impiegati per il calcolo del LD sono però significativamente più

elevati (ad esempio, se per determinare il LR è stato usato k = 3, per calcolare il

LD si usa in genere k' = 10).

Segnale

Segnale

LIMITE DI RIVELABILITA' E DI DOSABILITA’

Le definizioni di LR e LD possono dipendere anche dalla tecnica analitica. In una tecnica cromatografica il segnale viene misurato in funzione del tempo. Per individuare i segnali significativi si determinano il valore medio e la deviazione

standard del segnale di un bianco (o del segnale di un campione in una zona

priva di analita). Soltanto i segnali con ampiezza pari al segnale medio del bianco più k volte la sua deviazione standard verranno considerati indicativi della presenza di un analita.

Cromatogramma di un bianco

Sb + ksb

Sb + ksb

Sb

Sb

Tempo

Cromatogramma di un campione

Segnale non significativo

Segnale

significativo

Tempo

n La lettura < 3s non è significativa  ( x  x ) Limite
n
La lettura < 3s non è
significativa
(
x
x
)
Limite
i
1
n
 1
LIMITE DI
LEGGIBILITA„
(LL=3s)
LIMITE DI
RIVELABILITA„
LIMITE DI
DOSABILITA„
buretta con divisione
0,1 mL:
(LR= 3s)
(LD = 10s)
LL = 0,1mL
Spettrofotmetro con
L'analita sarà
rivelabile se
L'analita sarà
dosabile se
1%T = 0,044 A
LL = 0,044
LL = 3s= LR
LL = 10 s = LR
LL = 3s, l'analita sarà
rilevabile ma non
dosabile non suscettibile
di determinazione
quantitativa
LL = 10 s, L'analità è
rivelabile e dosabile

SELETTIVITA’

La selettività di una metodica analitica è la capacità di un metodo analitico di

rispondere preferenzialmente all’analita in esame piuttosto che ad altre

sostanze presenti nel campione.

Pochi metodi analitici sono specifici (cioè rispondono soltanto all'analita in esame), soprattutto in presenza di composti con caratteristiche chimico-fisiche

simili. In generale i metodi analitici sono selettivi, cioè la loro risposta in presenza dell'analita è maggiore se confrontata a quella ottenuta dalle specie interferenti

presenti nel campione. La selettività di un metodo analitico nei confronti di un

interferente X può essere descritta attraverso il coefficiente di selettività, dato dal rapporto fra le sensibilità della calibrazione relative all'interferente ed all'analita (assumendo una curva di calibrazione lineare):

Sensibilità dellacalibrazione(X)

Sensibilità dellacalibrazione(analita)

k analita,X

Se il coefficiente di selettività è maggiore di 1, il metodo risponde in realtà preferenzialmente all'interferente. Tanto più il coefficiente di selettività è basso, tanto più grandi sono le concentrazioni della specie interferente che possono essere presenti durante l‟analisi senza influenzare in modo significativo la determinazione dell‟analita

Segnale

INTERVALLO DI LINEARITA’

L’intervallo di linearità di un metodo rappresenta l‟intervallo di concentrazioni all'interno del quale esiste una relazione lineare fra il segnale e la concentrazione dell‟analita.

Questo intervallo rappresenta quindi la zona di validità di una curva di

calibrazione lineare. Esso è delimitato dal limite di quantificazione del metodo e dalla concentrazione alla quale termina la relazione lineare fra il segnale e la concentrazione dell‟analita (questa deviazione può essere dovuta a fattori quali comportamento non ideale del sistema o una intensità di segnale troppo alta).

LOQ

Intervallo

di linearità

Concentrazione

L‟ampiezza dell‟‟intervallo dinamico di linearità dipende dalla tecnica utilizzata e può variare da 1-2 a 5-6 ordini di grandezza. Un metodo analitico può non avere un intervallo dinamico di linearità molto ampio se le variazioni attese della concentrazione dell‟analita sono relativamente piccole.

Segnale

CURVE DI CALIBRAZIONE

La curva di calibrazione è alla base della maggior parte delle tecniche di analisi strumentale.

Soluzioni standard Curva di calibrazione Bianco Campione incognito
Soluzioni standard
Curva di
calibrazione
Bianco
Campione incognito

Concentrazione del campione incognito

Parametri dell'equazione della retta:

pendenza (m) ed intercetta (b)

Tipica curva di calibrazione lineare e principali parametri che la definiscono.

Bianco

Intervallo

di linearità

Soluzioni

standard

Segnale del

bianco (Sb)

Concentrazione

Limite di rivelabilità (LR) Limite di dosabilità (LD)

CURVA DI CALIBRAZIONE

La curva di calibrazione viene ottenuta preparando soluzioni standard. La concentrazione dei campioni viene poi determinata per interpolazione del loro segnale sulla curva di calibrazione.

La concentrazione dei campioni deve essere compresa nell'intervallo di

concentrazioni degli STD, una curva di

calibrazione non può essere utilizzata al di fuori di tale intervallo.

Concentrazione analita nella soluzione misurata

Segnale analita

Bianco

analita nella soluzione misurata Segnale analita Bianco 0 S b Soluzioni standard a concentrazione nota di

0

S b

Soluzioni standard a concentrazione nota di analita

0 S b Soluzioni standard a concentrazione nota di analita C S 1 1 C S

C

S

1

1

Soluzioni standard a concentrazione nota di analita C S 1 1 C S 2 2 C

C

S

2

2

standard a concentrazione nota di analita C S 1 1 C S 2 2 C S

C

S

3

3

a concentrazione nota di analita C S 1 1 C S 2 2 C S 3

C

S

4

4

Campione

nota di analita C S 1 1 C S 2 2 C S 3 3 C

C

S

Sono indicate le concentrazioni finali nelle soluzioni analizzate.

Segnale

CURVA DI CALIBRAZIONE

Procedura per una analisi con calibrazione

Sottrazione del segnale del bianco Sb a tutti i segnali misurati per ottenere i segnali corretti S. (autozero)

di

calibrazione usando i valori di segnale corretto S' misurati nelle soluzioni

standard e le loro concentrazioni.

Costruzione

della

curva

Interpolazione del segnale S‟ misurato

nel campione sulla curva di calibrazione per ottenere la concentrazione C del

campione.

S‟

C Concentrazione

La concentrazione del campione incognito deve essere compresa nell'intervallo di concentrazioni degli standard: non è corretto utilizzare una curva di calibrazione al di fuori di tale intervallo (cioè ricavare la concentrazione di un campione per estrapolazione).

CURVA DI CALIBRAZIONE

La calibrazione mediante standard esterno è la tecnica di calibrazione più

utilizzata in chimica analitica.

Vantaggi

Semplicità. L'analisi è molto semplice, i campioni e le soluzioni standard devono essere semplicemente analizzati utilizzando la stessa procedura.

Rapidità. Una sola curva di calibrazione può essere impiegata per l'analisi di un numero elevato di campioni.

Necessità di un numero ridotto di soluzioni standard. Una curva di calibrazione (soprattutto se è una retta) può essere ottenuta con un numero limitato di soluzioni standard di analita.

Svantaggi Risente dell'effetto matrice. Questo metodo di calibrazione presuppone che le soluzioni standard e il campione non devono presentare interferenze da parte degli altri costituenti del campione (effetto matrice). Questa condizione può essere

difficile da soddisfare, soprattutto per campioni a composizione

complessa (es. materiali biologici).

segnale

segnale

ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE

Una operazione comune in chimica

analitica

consiste

nel

ricavare

una

curva

di

calibrazione o di taratura,

cioè

la

relazione

fra

un

segnale

misurato

e

la

concentrazione di un analita, mediante analisi di campioni a concentrazione nota

(campioni standard).

In termini matematici, questo significa trovare i coefficienti dell'equazione che lega la variabile segnale (y) alla concentrazione dell'analita (x). Anche conoscendo la forma matematica dell'equazione della curva di calibrazione, la presenza dell'errore casuale nelle misure sperimentali rende però difficoltoso l'ottenimento dell'equazione esatta.

?

concentrazione

Errore casuale

concentrazione

ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE

Nel caso più semplice il segnale è direttamente proporzionale alla concentrazione e la curva di calibrazione è una retta. L’analisi di regressione lineare applicata attraverso il metodo dei minimi quadrati permette di ottenere la “migliore” retta che passa attraverso una serie di punti sperimentali.

Dati sperimentali:

coppie di valori (x i ,y i ) affette da errore casuale

y

x

Retta “migliore” con equazione y = mx + b:

pendenza (m)

intercetta (b)

coefficiente di determinazione (r 2 )

y

x

ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE

In una analisi di regressione lineare si ipotizza che

la dipendenza del segnale dalla concentrazione

(modello di regressione) sia descritta da una equazione del tipo y = mx + b. Inoltre, si assume normalmente che la deviazione dei dati sperimentali dalla retta dipenda soltanto da errori commessi nella misurazione del segnale: l’errore è soltanto sulla variabile y ed è definito per ogni dato sperimentale

(x i ,y i ) dal suo residuo r i .

y i

r i

m x i + b

x i

punto sperimentale (x i ,y i )

corrispondente punto “teorico

sulla retta di calibrazione (x i , mx i + b)

Il calcolo dei coefficienti della retta mediante il metodo

una

distribuzione Gaussiana degli errori sull’asse y, e

l'equazione della retta viene ricavata da considerazioni

statistiche: i coefficienti ottenuti descrivono la retta che ha massima probabilità di rappresentare la reale dipendenza

dei

minimi

quadrati

si

effettua

assumendo

di y da x.

y

i

r i

mx i + b

x

i

La retta “migliore” che approssima i punti sperimentali è quella con coefficienti m e b
La retta “migliore” che approssima i punti sperimentali è quella con coefficienti m e b tali che la
N
N
SS
 i
r
2
y
somma dei quadrati dei residui è minima:
(mx
b)
2
MINIMO
resid
i
i
i
1
i
1
dove N è il numero di punti sperimentali presi in considerazione.

dove N è il numero di punti sperimentali presi in considerazione.

ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE

Per determinare i valori di m e b che minimizzano la somma dei residui SS resid si calcolano le sue derivate parziali rispetto ad m e b e le si pongono pari a zero:

m

N

i

1

SS

resid

b

N

i

1

SS

resid

m

N

i

1

b

N

i

1

y

y

i

i

(mx

i

(mx

i

b)

2

b)

2

0

0

La risoluzione di queste due equazioni porta alle due espressioni

S

xx

N

i

1

(x

i

S

S

xx

m

xy

b y mx

x)

2

S

yy

N

i

1

(y

i

y)

2

S

xy

N

i

1

(x

i

x)(y

i

y)

EFFETTO MATRICE

Con il termine effetto matrice si indica l’interferenza dei componenti del

campione (matrice del campione) sul segnale dell‟analita. Questo effetto

determina differenze nel segnale ottenuto da standard e campioni ad eguale concentrazione, falsando il risultato di un‟analisi effettuata con il metodo di calibrazione con standard esterno. L‟effetto matrice può verificarsi in qualunque tipo di campione, sebbene sia più probabile nei campioni complessi (es. biologici) e/o contenenti concentrazioni

elevate di altre sostanze.

sebbene sia più probabile nei campioni complessi (es. biologici) e/o contenenti concentrazioni elevate di altre sostanze.

CALIBRAZIONE CON AGGIUNTA DI STANDARD

Se il metodo analitico impiegato è di tipo non distruttivo, è possibile ridurre la quantità di campione necessaria effettuando aggiunte sequenziali di analita alla stessa aliquota di campione e misurando il segnale prima di ogni ulteriore aggiunta.

Concentrazione analita aggiunto

Concentrazione analita totale

Segnale analita

Bianco

analita totale Segnale analita B i a n c o 0 S b Campione Aggiunte sequenziali
analita totale Segnale analita B i a n c o 0 S b Campione Aggiunte sequenziali

0

S b

Campione

totale Segnale analita B i a n c o 0 S b Campione Aggiunte sequenziali di

Aggiunte sequenziali di analita a concentrazione nota

Aggiunte sequenziali di analita a concentrazione nota C S C a g g 2C a g

C

S

C a g g

C agg

2C a g g C +

2C agg

C +

3C a g g C +

3C agg

C +

C + C agg

2C agg

3C agg

S 1 agg

S 2 agg

S 3 agg

SegnaleSegnale

CALIBRAZIONE CON AGGIUNTA DI STANDARD

Procedura per una analisi con calibrazione mediante aggiunta di standard.

Sottrazione del segnale del bianco Sb a tutti i segnali misurati per ottenere i segnali corretti S

(autozero).

S

S

S

'

'

1agg

'

2 agg

S

S

b

S

1agg

S

2 agg

S

b

S

b

Costruzione della curva di calibrazione (in questo caso necessariamente una retta) usando i segnali corretti S' misurati campione

prima e dopo l'aggiunta di concentrazioni

note di analita e le concentrazioni di analita aggiunto.

Estrapolazione della curva di calibrazione per ottenere la concentrazione del campione

C, corrispondente all'intersezione della retta

con l'asse orizzontale.

Sull'asse orizzontale si riporta la concentrazione di analita aggiunto.

C

Concentrazione aggiunta

Concentrazione aggiunta

 

n-1

4

n =

5

2,236068

 

n

C (mg/L)

Media

scarto

quadrato

Devianza

Varianza

 

LR

LD

ta

1

1,35

1,34

0,01

0,0001

0,0046

0,00115

0,033912

0,101735

0,339116

a = 5%

2

1,30

 

-0,04

0,0016

         

12,706

3

1,34

 

0,00

0

         

4,303

4

1,32

 

-0,02

0,0004

         

3,182

5

1,39

 

0,05

0,0025

         

2,776

6

                 

2,571

7

                 

2,447

8

                 

2,365

9

                 

2,306

10

                 

2,262

11

                 

2,228

12

                 

2,201

 

1,34

0,0046

ESPRESSIONE DEI RISULTATI ANALITICI

 

valore medio

t *  a n
t
*
a
n
 
 

1,34

0,04

LIMITI FIDUCIALI al 95%

deviazione valore medio

   n
 
n

0,015166