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Cromatografia

Un processo cromatografico un processo di migrazione differenziata di una miscela di sostanze che ha lo scopo di garantire la separazione delle sostanze stesse. In ogni tipo di cromatografia vi sono sempre due fasi distinte immiscibili fra loro ovvero una fase fissa o stazionaria (solida o liquida) con la quale le molecole presenti nella miscela possono interagire e una fase mobile (liquida o gassosa) che ha la funzione di trascinare con s le componenti della miscela che non si sono legate alla fase fissa.

Un processo cromatografico pu essere effettuato su colonna o pu essere planare ovvero effettuato su carta o su strato sottile. Le interazioni che si instaurano tra le componenti che ho caricato e fase fissa e fase mobile sono quelle che determinano la migrazione differenziata. Le strutture delle due fasi determinano i meccanismi che governano una determinata separazione cromatografica. Quali sono le basi su cui si deve tenere conto per separare le componenti di una miscela? Bisogna sfruttare le propriet fisico-chimiche delle sostanze. Quali propriet? DIMENSIONI; FORMA; CARICA; SOLUBILITA, FUNZIONE BIOLOGICA. IDROFOBICITA,

Cromatografia su colonna classica


Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni secondo le esigenze. Il riempimento della colonna pu essere costituito da materiale solido adsorbente, finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con supporto granulare inerte, generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituir la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica.

Il solvente scelto, contenente la miscela da separare, viene fatto eluire attraverso la colonna.
I componenti che tendono ad essere trattenuti nella fase stazionaria si muoveranno pi lentamente di quelli che tendono a rimanere nella fase mobile, pertanto cui si realizzer una migrazione differenziale, con separazione dei componenti in bande. Una volta che tutta la soluzione contenente il campione eluita dalla colonna, si far scendere solo il solvente che trascina e ridiscioglie le sostanze separate fino a portarle alluscita della colonna dove verranno raccolte in recipienti separati, per poterne effettuare la determinazione quantitativa.

Battente di liquido

Separazione bande

Recupero soluto 1

Recupero soluto 2

METODI CROMATOGRAFICI PIU USATI


ADSORBIMENTO RIPARTIZIONE SCAMBIO IONICO GEL-FILTRAZIONE AFFINITA INTERAZIONE IDROFOBICA

Cromatografia per Scambio Ionico


Nella cromatografia per scambio ionico, la ritenzione si basa sullattrazione tra gli ioni del soluto e i siti carichi legati alla fase stazionaria. La fase stazionaria costituita da una resina a scambio ionico, ossia un supporto organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (ad esempio SO3-, -COO-, -NR3+). I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere scambiati con gli ioni presenti nella fase mobile. Il meccanismo di separazione basato perci sulla diversa affinit che i diversi soluti (ionici) presentano nei confronti dei gruppi attivi della resina.

Sephadex Sepharose Biogel Sephacril

CROMATOGRAFIA PER INTERAZIONE IDROFOBICA


Il processo che interessa questo tipo di cromatografia consiste in deboli interazioni idrofobiche tra le molecole proteiche ed una fase stazionaria che si ottiene legando gruppi non polari ad una matrice di tipo saccaridico.
I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d acqua ordinate le proteine tendono cos ad interagire fra loro (salting out). Nella HIC queste regioni cos esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.

Gascromatografia
In gascromatografia la fase mobile un gas che fluisce in una colonna in cui posta la fase stazionaria (solida o liquida). I meccanismi di separazione dei componenti la miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poich quella mobile funziona solamente da gas di trasporto (carrier). Condizione indispensabile per operare unanalisi gascromatografica su una miscela, che essa sia in grado di passare in fase vapore alla temperatura di lavoro.

Schema a blocchi di un gascromatografo

1) Sistema di alimentazione del carrier (bombola) 2) Sistema di alimentazione dei gas per il rivelatore (bombola) 3) Iniettore 4) Colonna

5) Rivelatore 6) Camera termostatatica 7) Dispositivo per la programmazione della temperatura durante lanalisi 8) Raccolta ed elaborazione dati

Gas carrier: H2, Ne, N2. Colonne: di acciaio o di vetro. Possono avere dimensioni diverse (diametro da 10 cm a 500 mm) e lunghezze mai inferiore a 10 m.

Applicazioni
Alcooli Esteri Steroidi Colesterolo

Barbiturati
Zuccheri

Cromatografia liquida su colonna


Vantaggi Si trattano grandi quantitativi di campione Uso di colonne usa e getta per campioni di piccole dimensioni (< 20 ml) Svantaggi Tempi di impaccamento ed esecuzione elevati Fasi stazionarie non riutilizzabili Impiego di grandi volumi di solvente

Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)


LHPLC rappresenta levoluzione strumentale della cromatografia liquida su colonna. Con questa tecnica possibile fare tutti i tipi di cromatografia: cambiano le colonne che sono di acciaio inossidabile e pre-impaccate dalla ditta produttrice cos da sopportare pressioni elevatissime.

Schema di unapparecchiatura HPLC

Il filtro e la precolonna presenti nel circuito servono ad evitare danneggiamenti della colonna analitica, per leventuale presenza di solidi sospesi nel solvente.

Solvente e sostanza in esame passano attraverso la colonna nella quale avviene la separazione.
I componenti separati, vengono quindi convogliati nella zona di misura del rivelatore e quindi in un recipiente di raccolta degli scarti. Il segnale prodotto dal rivelatore, opportunamente elaborato, viene registrato.

Le colonne utilizzate permettono tempi di analisi ottimali, hanno unefficienza elevatissima e un numero di piatti teorici che va dai 30000 ai 40000.
CROMATOGRAFIA IN FASE NORMALE (NP-HPLC).
Fase fissa: silice (solida)
Fase mobile: solvente organico (esano) acqua Ordine di eluizione: molecole apolari molecole polari

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA (RP-HPLC).


Fase fissa: catene idrocarburiche (liquida) legate a silice (matrice inerte) Fase mobile: acqua solvente organico (acetonitrile, metanolo, propanolo) Ordine di eluizione: molecole polari molecole apolari

Eluizione isocratica e a gradiente

Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante.

Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente necessaria per eluire i soluti pi fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.

Iniezione e rivelazione in HPLC:

Rivelatori

Sensibilit adeguata al problema


Buona stabilit e riproducibilit Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza Tempi di risposta rapidi Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o pi classi di soluti
Rivelatore Assorbimento UV LOD (ng) 0.1-1 Selettivit selettivo Utilizzabile in gradiente? SI

Indice di rifrazione
Fluorescenza Elettrochimico

100-1000
0.001-0.01 0.01-1

generale
selettivo selettivo

NO
SI NO

Conduttimetrico
Assorbimento IR Spettrometro di massa

0.5-1
1000 0.1-1

selettivo
selettivo generale

NO
SI SI

Applicazioni
Separazione di composti polari quali farmaci e loro metaboliti, peptidi, vitamine, polifenoli, steroidi, oligopeptidi e proteine.