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SPETTROSCOPIA DI MOLECOLE CHIRALI:

POLARIMETRIA E DICROISMO CIRCOLARE

La polarimetria e il dicroismo circolare sono tecniche che utilizzano radiazioni elettromagnetiche asimmetriche, per cui sono intrinsecamente in grado di distinguere tra enantiomeri. Tuttavia anche tecniche molto diverse, come la spettroscopia NMR in solventi chirali, o reazioni chimiche catalizzate da enzimi (che sono molecole chirali) sono potenzialmente in grado di fornire un ambiente chirale idoneo a differenziare gli ena ntiomeri.

POLARIMETRIA

La polarimetria è un metodo di analisi non distruttivo che si basa sulla capacità delle molecole chirali di deviare il piano della luce polarizzata linearmente.

La luce polarizzata

La luce è un'onda elettromagnetica che consiste in un campo elettrico E ed un campo magnetico H oscillanti, che possono essere rappresentati da vettori perpendicolari tra loro, e perpendicolari alla direzione di propagazione (Figura).

e perpendicolari alla direzione di propagazione (Figura). Il piano di polarizzazione è il piano su cui

Il piano di polarizzazione è il piano su cui oscilla il campo elettrico E, ma poiché una sorgente di luce è di solito composta da un insieme di emettitori disposti in maniera casuale, la luce emessa è un insieme di onde con tutte le possibili orientazioni del vettore E. La luce polarizzata linearmente, invece, è una radiazione elettromagnetica in cui il vettore E oscilla in un solo ben preciso piano di polarizzazione. La luce polarizzata linearmente (spesso chiamata semplicemente luce polarizzata) è ottenuta dalla luce non polarizzata per mezzo dei cosiddetti filtri polarizzatori. Può sembrare strano che la luce polarizzata possa essere considerata una radiazione asimmetrica, in grado di interagire con due enantiomeri in maniera differente. In realtà la direzione di propagazione della radiazione, quella del vettore elettrico E e quella del vettore magnetico H costituiscono una terna di vettori ortogonali non sovrapponibile alla sua immagine speculare (Figura parte b).

DICROISMO CIRCOLARE

Il dicroismo circolare è una tecnica di analisi strutturale simile alla spettrofotometria

in quanto è basata sull'assorbimento da parte del campione di una radiazione UV o visibile. La differenza è che la radiazione usata in questo caso è polarizzata circolarmente, e quella che viene misurata è la differenza tra le assorbanze (De) riscontrate usando come radiazioni incidenti radiazioni polarizzate circolarmente nei due possibili versi orario e antiorario. Il dicroismo circolare (spesso abbreviato con la sigla CD) permette di trarre importanti informazioni su molecole chirali. Può essere usato per determinare la configurazione assoluta di una molecola, ma anche configurazioni relative e conformazioni. È inoltre una tecnica molto più sensibile della polarimetria, e, diversamente che per quest'ultima, il segno del De può essere sufficiente a trarre conclusioni sulla configurazione assoluta della molecola per specifiche classi di composti. Tutto questo giustifica perché questa tecnica sta trovando una diffusione sempre maggiore, nonostante necessiti di strumenti molto costosi (sopra i 150 milioni di lire).

Lo spettro CD

Un cromoforo chirale, ma anche un cromoforo non chirale che si trovi in un intorno chirale, può assorbire le luci polarizzate circolarmente destra e sinistra in maniera diversa, cioè con assorbanze A D ed A S (e quindi anche assorbanze specifiche molari e D ed e S ) diverse. Uno spettro CD è un grafico del dicroismo circolare, DA:

DA = A

S

- A

D

o del dicroismo circolare molare, De:

De = e

S

- e

D

in funzione della lunghezza d'onda. Uno spettro CD assomiglia quindi ad un normale spettro UV, ma DA e De possono anche assumere valori negativi. Naturalmente la relazione tra DA e De è ancora la legge di Lambert-Beer:

DA = De l c

dove l è espresso in cm e c è la concentrazione molare. In generale ogni transizione elettronica che dà origine ad un assorbimento

UV/visibile dà anche origine ad una banda nello spettro CD, chiamata effetto Cotton,

il cui massimo (o il minimo per bande con segno negativo) si trova più o meno alla

stessa lunghezza d'onda del massimo di assorbimento UV/vis ibile. Lo spettro CD è dato dalla sovrapposizione di bande positive e negative di questo genere. Un esempio di spettro CD è mostrato in Figura. Come ci si può aspettare da considerazioni di simmetria, gli spettri CD di enantiomeri sono uguali, ma hanno segni opposti.

A volte il dicroismo circolare è espresso sotto forma di ellitticità molare. Se la

radiazione incidente sul campione è polarizzata linearmente, all'uscita del campione

le due componenti hanno intensità diverse e la radiazione diventa polarizzata

ellitticamente. L'ellitticità y è definita come un angolo la cui tangente è uguale al rapporto tra l'asse minore ed asse maggiore dell'ellisse, e va da 0° per una luce polarizzata linearmente a 45° per una luce polarizzata circolarmente. tangy=b/a

Tuttavia poiché la differenza di assorbanza è sempre molto piccola, anche l'angolo y

assume sempre valori piccoli (si possono misurare ellitticità di 1/1000 di grado), ed

è quindi approssimativamente proporzionale alla concentrazione. Si può allora definire una ellitticità molare [q]:

[

q

]

=

y

l c

dove l è espresso in dm e c è la concentrazione decimolare, ossia espressa in moli per 100 ml (o dmol/l; si notino ancora una volta le insolite unità di misura). L'ellitticità molare [q] è legata al dicroismo circolare molare dalla relazione:

[q]ª 3300 De

Applicazioni del dicroismo circolare

Un prerequisito perché una molecola chirale possa essere studiata con il dicroismo circolare è che possieda un cromoforo, ossia assorba nell'UV/visibile. Tuttavia è sufficiente anche un assorbimento molto debole, come la transizione nÆp * dei carbonili chetonici con e ª 30. L'applicazione concettualmente più semplice che si può fare del dicroismo circolare è il riconoscimento di enantiomeri avendo a disposizione spettri di riferimento. Rispetto alla polarimetria, si ha comunque il vantaggio di disporre di un intero spettro invece che di una misura in un singolo punto, e questo permette di evidenziare più facilmente la presenza di eventuali impurezze che modificano la forma dello spettro. D'altra parte è più difficile disporre di spettri di riferimento, poiché i dati CD sono molto meno comuni in letteratura rispetto alle rotazioni specifiche. È anche possibile, sebbene non molto comune, effettuare misure quantitative per determinare eccessi enantiomerici. Determinazione della struttura secondaria delle proteine, e per monitorare processi come la denaturazione

Polarizzazione circolare della luce Abbiamo visto che in una radiazione elettromagnetica polarizzata linearmente il vettore campo elettrico E oscilla in un piano. Esiste un altro tipo di luce polarizzata, la luce polarizzata circolarmente, in cui il vettore campo elettrico E rimane sempre della stessa intensità, ma ruota con frequenza pari alla frequenza della radiazione: il risultato è che la punta del vettore percorre una traie ttoria a spirale. La rotazione può naturalmente avvenire in due versi. Se guardando verso la sorgente della luce il vettore E ruota in senso orario, la luce è detta luce polarizzata circolarmente destra, se la rotazione è antioraria si parla di luce polarizzata circolarmente sin istra.

In una luce linearmente polarizzata il vettore campo elettrico oscilla lunga una e una sola direzione (quella z, nella figura) e perpendicolare all’asse di propagazione (quello x). Un osservatore situato sull’asse x vedrà il vettore campo elettrico raggiungere un massimo al tempo t1 e poi diminuire fino a passare per lo zero (t3), cambiare verso, raggiungere un minimo (t5) e poi ricrescere di nuovo. L’onda sinusoidale rimane sempre confinata nel piano xz e l’osservatore vedrebbe un vettore oscillare lungo z. Un altro modo per descrivere lo stesso fenomeno è quello di considerare una radiazione polarizzata linearmente come la somma di due onde polarizzate circolarmente, una sinistrorsa e una destrorsa.

Una molecola otticamente attiva può alterare le proprietà della luce trasmessa in vari modi e gli effetti osservati sono diversi. Poiché la luce polarizzata circolarmente è dissimmetrica è lecito attendersi che le due componenti interagiscano differentemente con il mezzo chirale. Ciò può manifestarsi nei due modi seguenti:

ÿ Le due onde si propagano con velocità differenti cioè sono caratterizzate da indici di rifrazione differenti. In altre parole esse usciranno dal campione l’una in ritardo rispetto all’altra cioè fuori fase.

Sommando settorialmente le due componenti si ottiene sempre una luce linearmente polarizzata ma la direzione di polarizzazione sarà ruotata di un angolo f rispetto alla direzione originale. La differenza tra i due indici di rifrazione (n L -n R ) è detta birifrangenza circolare e l’angolo di deviazione è chiamato rotazione ottica.

Per poter paragonare campioni a differente concentrazione è stata definita la rotazione molare.

ÿ Le due componenti vengono assorbite in modo differente dal campione (tale fenomeno viene detto dicroismo circolare) e i vettori campo elettrico escono dal mezzo con intensità differenti

Sommando i vettori elettrici delle due onde agli stessi tempi troviamo che il vettore somma traccia un ellisse.

Lo spettrofotometro CD

In linea di principio, per misurare uno spettro CD servirebbero due sorgenti per le due radiazioni polarizzate circolarmente destra e sinistra, ognuna con il suo monocromatore. In pratica si usa invece una radiazione polarizzata linearmente, che come abbiamo visto è la somma di due componenti polarizzate circolarmente. La radiazione è generalmente prodotta da una lampada a Xeno (a), che per la grande precisione richiesta per la misura e per i numerosi filtri da attraversare deve essere molto potente (150-450 W). La radiazione passa poi attraverso il monocromatore (b), che seleziona la lunghezza d'onda desiderata, e attraverso il filtro polarizzatore (c), che la polarizza linearmente. Il cuore dello spettropolarimetro CD è il cosiddetto modulatore elettro-ottico (d), costituito da un cristallo capace di far passare alternativamente la componente destra o sinistra della luce polarizzata linearmente a seconda del campo elettrico a cui è sottoposto. Il modulatore elettro-ottico è sottoposto ad un campo elettrico alternato, per cui il campione (e) è attraversato alternativamente dalle componenti destra e sinistra. Se le due componenti sono assorbite in maniera diversa, il rivelatore (f) origina un segnale di intensità oscillante. L'ampiezza di questa oscillazione permette di mis urare il dicroismo circolare.

un segnale di intensità oscillante. L'ampiezza di questa oscillazione permette di mis urare il dicroismo circolare.