Cromatografia liquida ad alta pressione

La cromatografia liquida ad alta pressione o cromatografia liquida ad alta prestazione, in inglese High Pressure Liquid
Cromatography o High Performance Liquid Cromatography, pi semplicemente nota come HPLC un tipo di cromatografia.
Si tratta di una tecnica cromatografica che permette di separare due o pi composti presenti in un solvente sfruttando
l'equilibrio di affinit tra una "fase stazionaria" posta all'interno della colonna cromatografica e una "fase mobile" che fluisce
attraverso essa. Una sostanza pi affine alla fase stazionaria rispetto alla fase mobile impiega un tempo maggiore a percorrere
la colonna cromatografica (tempo di ritenzione), rispetto ad una sostanza con bassa affinit per la fase stazionaria ed alta per la
fase mobile.
Il campione da analizzare iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove "spinto" attraverso la fase stazionaria dalla
fase mobile applicando pressioni dell'ordine delle centinaia di atmosfere. Per ottenere un'elevata efficienza nella separazione
necessario che le dimensioni delle particelle del riempimento siano molto ridotte (di solito hanno diametri compresi da 3 a 10
m), per questo motivo indispensabile applicare un'elevata pressione se si vuole mantenere una ragionevole velocit di
flusso dell'eluente e quindi un tempo di analisi adeguato.
Alla fine della colonna applicato un rilevatore (IR, UV-VIS, spettrometro di massa) e un calcolatore che permettono una
analisi in continuo dell'uscita della colonna e quindi di poter quantificare e/o identificare le sostanze iniettate.
I vantaggi principali di questa tecnica sono: la dimensione ridotta della colonna che evita problemi di deviazioni longitudinali
(movimenti della fase mobile longitudinali) e di percorsi alternativi; velocit di eluizione (passaggio della fase mobile
attraverso la colonna) costante e regolabile; velocit di esecuzione ridotta; piccole quantit di composto necessaria all'analisi
(nell'ordine dei 5-10 microgrammi di campione solubilizzato in apposito solvente) tutto a favore di una maggiore accuratezza
e precisione.
Lo svantaggio principale degli apparecchi per HPLC il costo molto pi elevato rispetto ad una cromatografia su colonna
tradizionale (circa 20-30 mila euro per uno strumento completo dalle medie prestazioni), anche se non possibile paragonare
le due metodiche poich presentano campi di applicazione diversi.
Tipi di HPLC
Le pi importanti tecniche di cromatografia liquida sono:

Cromatografia di ripartizione
Cromatografia di adsorbimento
Cromatografia ionica
Cromatografia di esclusione molecolare

Spesso le diverse procedure sono complementari tra loro.

Strumentazione
A causa delle elevate pressioni di esercizio, la strumentazione per HPLC di norma pi complessa rispetto a quella per altre
tecniche cromatografiche. I componenti principali dell'apparecchiatura per HPLC sono:

Contenitori per la fase mobile

Pompe
Sistemi di introduzione del campione
Colonna
Riempimento della colonna
Rivelatori

Sistemi di introduzione del campione

La riproducibilit della quantit di campione introdotto nella colonna rappresenta il punto critico per la precisione di un'analisi
con HPLC. I sistemi attualmente in uso riescono a raggiungere precisioni relative dello 0,1% e di variare la quantit di
campione introdotto in un intervallo compreso tra 5 e 500 l, esistono anche valvole di iniezione per microcampioni con

volumi compresi tra 0,5 e 5 l. Sono valvole capaci di alloggiare e trasferire il campione, senza interruzione del flusso dalla
fase mobile attraverso la colonna. Sono costruiti in acciaio.
Colonne
il mezzo in cui il materiale separato, ed a seconda dei solventi, gli analiti possono raggiungere diverse velocit di
eluizione, in base anche alla loro composizione. Il materiale pi impiegato per la costruzione delle colonne per HPLC
l'acciaio inossidabile levigato, se si opera a pressioni inferiori a 10 atm si usano anche colonne in vetro spesso. La lunghezza
delle colonne di solito compresa tra 10 e 30 cm, ma possibile disporre di colonne pi lunghe per particolari esigenze. Il
diametro interno compreso tra 4 e 10 mm e il diametro delle particelle del riempimento tra 3,5 e 10m. Esistono anche
modelli di colonne, di recente progettazione, pi corte e sottili che permettono tempi di analisi inferiori e minor consumo di
solvente.
Le colonne commerciali sono spesso dotate di fornetti termostatici per tenere sotto controllo la temperatura della colonna fino
al decimo di grado centigrado. Il mantenimento di una temperatura costante garantisce di norma cromatogrammi migliori.
Nonostante i solventi impiegati in HPLC siano appositamente purificati, sempre possibile che contengano contaminanti che
potrebbero intaccare la buona funzionalit della colonna. Per ovviare a questo problema e dunque aumentare la vita media
delle colonne analitiche si applicano colonne di protezione, pi corte delle colonne analitiche, in cui la fase mobile viene fatta
passare prima di accedere alla colonna analitica. In sostanza la colonna di protezione funge da filtro. Inoltre serve anche per
saturare la fase mobile con la fase stazionaria, minimizzando quindi le perdite di fase stazionaria nella colonna analitica.
Riempimenti delle colonne
I riempimenti usati in HPLC sono sostanzialmente di due tipi, a particelle pellicolari e a particelle porose.
Le particelle pellicolari sono impiegate quasi esclusivamente per le colonne di protezione. Sono granuli sferici e non porosi di
vetro o materiale polimerico, di dimensione compresa tra i 30 e i 40 m. Sulla superficie dei granuli viene depositato uno
strato poroso di silice, allumina o resina a scambio ionico. Se si necessita di una fase stazionaria liquida, pu essere applicata
per adsorbimento.
Le particelle porose hanno diametri compresi tra 3 e 10 m, il materiale pi usato la silice microporosa, ma possono essere
costituite anche di allumina o resina a scambio ionico. Anche in questo caso vengono applicati rivestimenti specifici, legati o
per adsorbimento o attraverso legami chimici alla superficie delle particelle.
Rivelatori
Perch un rivelatore sia idoneo all'uso in HPLC dovrebbe soddisfare le seguenti caratteristiche:

Sensibilit adeguata, che ovviamente dipende sia dalle particolari esigenze dell'operatore che dal tipo di campione da
analizzare
buona stabilit e riproducibilit
risposta lineare per pi ordini di grandezza
tempo di risposta breve
elevata facilit d'uso e affidabilit
uniformit di risposta nei contronti di tutti gli analiti o al contrario elevata specificit per particolari composti
rivelazione non distruttiva
piccolo volume interno per evitare allargamento delle bande

I rivelatori pi usati sono ad assorbimento UV, vi sono poi i metodi a fluorescenza, sull'indice di rifrazione, la costante
dielettrica, rivelatori elettrochimici, a spettrometro di massa ed altri ancora.