C.d.L.

in Tecniche di Fisiopatologia Cardiocircolatoria

e Perfusione Cardiovascolare
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Anno Accademico 2011-2012

[Link] Arianna POMPILIO

Aree in cui il controllo dei microrganismi
è necessario (a differenti livelli)

MICROBIOTA

Ambiente
NORMAL HUMAN
MICROBIOTA
Industria

Agricoltura
Microbiota capace di
Animali causare malattie
nell’uomo
DOVE e PERCHE’ è NECESSARIO il
CONTROLLO dei MICRORGANISMI:
alcuni esempi Prevenzione di infezioni
iatrogene, infezioni chirurgiche,
infezioni crociate, diffusione di
Sanitizzazione microrganismi e geni associati
delle aree MICROBIOTA ad antibiotico-R, etc

Ambiente
NORMAL HUMAN
MICROBIOTA
Industria

Agricoltura Animali, pollame,

Animali (conservazione,
Malattie di alberi, produzione), etc
raccolto, piante, etc
Quali sono i mezzi a nostra
disposizione?

 Metodi chimici
 Metodi fisici (talvolta)

 Metodi fisici
 Metodi chimici
 Metodi chimico-fisici
Termini (… o definizioni !)

 Rimozione di materiale organicodalla

strumentazione e dalle attrezzature:
 sciacquare l’oggetto con acqua fredda
 applicare il detergente e rimuovere
meccanicamente il materiale organico
 risciacquare l’oggetto con acqua tiepida

 asciugare l’oggetto, quindi disinfettare /

sterilizzare
Termini (… o definizioni !)
DECONTAMINAZIONE

 Trattamento che rende un oggetto od una

superficie tale da poter essere maneggiata o
toccata senza rischio di contaminazioni
 Il concetto di decontaminazione è relativo. Può
essere prodotta tramite:

a seconda della pericolosità e della concentrazione

del microrganismo
Termini (… o definizioni !)

Qualsiasi procedimento che si prefigga la distruzione di

tutti i microrganismi (patogeni e non) presenti in un
determinato materiale.
 Un materiale è considerato sterile se il SAL (livello di sicurezza
di sterilità) è inferiore a 10-6; ovvero quando la probabilità di
trovarvi un microrganismo è inferiore ad uno su un milione.
 Utilizzo di procedure chimiche, fisiche e/o chimico-fisiche per la
completa eliminazione o distruzione di qualsiasi forma di vita
microbica, incluse le spore batteriche (forme di resistenza).
 Concetto assoluto, sebbene influenzato dalla capacità di
rilevare la presenza di microrganismi (ad esempio, una
soluzione filtrata non è tecnicamente sterile, poiché non
rimuove la componente virale)
Termini (… o definizioni !)

 Processo che riduce o elimina completamente tutti i

microrganismi patogeni allo stato vegetativo (non
attiva sulle spore) presenti nell’ambiente:
 Disinfezione: trattamento di superfici o sostanze
inanimate (abiotiche)
 Disinfettante: agente chimico in grado di uccidere
microrganismi; dotato di diversi livelli di efficacia
 Antisepsi: complesso delle operazioni da effettuare per
impedire o rallentare lo sviluppo di patogeni che
causano infezione nell’organisno umano (applicazione topica
a mucose, cute od altri tessuti)
 Antisettico: disinfettante usato su tessuti viventi
Termini (… o definizioni !)
Are they dead or not ?

• composto che uccide tutti i microrganismi viventi (patogeni

BIOCIDA e non-) incluse le spore (battericida, fungicida, virucida)

• composto che inibisce la crescita dei microrganismi, non

BIOSTATICO necessariamente uccidendoli (batteriostatico, fungistatico,
virustatico)

SEPSI • contaminazione microbica

• Uso di agenti chimici sulla cute o altri tessuti vivi con lo

ANTISEPSI scopo di inibire o eliminare i microbi (non c’è azione
sporicida)

ASEPSI • assenza di contaminazione microbica

STERILIZZAZIONE
Tecniche di
sterilizzazione

da: PR Murray et al. Medical

Microbiology 3rd ed.,Mosby,1998
STERILIZZAZIONE
Tecniche FISICHE

a. CALORE

 UMIDO
 SECCO

b. FILTRAZIONE

c. ONDE ELETTROMAGNETICHE

 RADIAZIONI U.V.
 RADIAZIONI IONIZZANTI
STERILIZZAZIONE
Calore
Il calore e’ il mezzo piu’ usato per la sterilizzazione,
limitatamente ai materiali termostabili:
 Facile da applicare
 Sicuro
 Non lascia residui.
UMIDO
 Si puo’ usare sottoforma di calore:
SECCO

 il calore umido (115-134°c) e’ piu’ efficace, prevede l’utilizzo

di vapore saturo sotto pressione ed agisce essenzialmente
provocando reazioni di idrolisi e denaturazione a livello del
substrato.
 il calore secco (160-180°c) e’ meno efficace, prevede l’utilizzo
di aria calda ed agisce provocando reazioni di ossidazione.
STERILIZZAZIONE
Calore
 Esistenza di una temperatura massima di crescita
specie/ceppo-specifica
 L’effetto letale indotto dal calore consiste nella
DENATURAZIONE (alterazione strutturale e
funzionale) delle macromolecole (proteine
enzimatiche):
 ossidazione (calore secco)
 coagulazione (calore umido)

 Letalità = k x temperatura
STERILIZZAZIONE FISICA
Calore umido: Autoclave
• Tecnica di sterilizzazione di uso più frequente
• Autoclave: camera a pressione che utilizza vapore saturo per
ottenere elevate temperature. L’aria viene rimossa dalla camera per
gravità o tramite prevuoto.
• Distruzione proteica per coagulazione
• Ciclo “classico”: 121°C, 15 min, 1 atm
• personalizzazione del ciclo in base alla tipologia di materiale
• Adatta per: materiali termostabili, terreni di coltura, rifiuti infettivi
• Non adatta per: chimici tox e/o volatili, radioisotopi, agenti
antineoplastici

AUTOCLAVE
Calore umido: Autoclave
Autoclave:
rimozione
d’aria per
gravità

da: AD Russell et al.

Principles & Practice of
Disinfection, Preservation &
Sterilization, Blackwell, 1999
 Autoclave
Ciclo di sterilizzazione

Ciclo di sterilizzazione: la temperatura dell’oggetto

sterilizzato aumenta più lentamente della temperatura
dell’autoclave
Sterilizzazione fisica
Calore secco
• Forno Pasteur, inceneritore, becco Bunsen
• Distruzione ossidativa delle proteine
• Meno efficace del calore umido e richiede tempi e
temperature maggiori
• Utilizzabile per materiali termostabili, danneggiati dal
vapore o ad esso impermeabili
• olii, polveri, oggetti taglienti, vetreria,
• rifiuti infettivi (alternativa all’autoclavaggio)

FORNO PASTEUR
Caldo secco – Forno Pasteur

Cicli di sterilizzazione:
 180°C, 30 min
 171o C, 60 min
 160o C, 120 min
 149o C, 150 min
 141o C, 180 min
 121o C, 12 h
STERILIZZAZIONE
Tecniche FISICHE

a. CALORE

 UMIDO
 SECCO

b. FILTRAZIONE

c. ONDE ELETTROMAGNETICHE

 RADIAZIONI U.V.
 RADIAZIONI IONIZZANTI
STERILIZZAZIONE FISICA
Filtrazione
• Rimozione “meccanica” (filtro dotato di pori) di particelle microscopiche da
soluzioni e gas (aria)
• Tipologie di filtri:
• Filtri a spessore (carta, amianto, lana di vetro)
• particelle “intrappolate” nello spessore del filtro
• generalmente usati come “prefiltri” (Ø poro = 1.2 m) per la chiarificazione di
sospensioni o per la sterilizzazione dell’aria in processi industriali
• Membrane filtranti (nitrato od acetato di cellulosa)
• azione simile ad un setaccio (Ø poro = 0.22-0.45 m)
• comunemente impiegati in microbiologia
• Filtro tipo Nucleopore (policarbonato): idoneo per microscopia

FILTRAZIONE
Tipologie di filtri
Filtro a spessore

Filtro a membrana

Filtro tipo Nucleopore

STERILIZZAZIONE FISICA
Filtrazione

 Applicazioni:
 Sterilizzazione di terreni e
supplementi (enzimi, siero,
antibiotici) per colture cellulari
 Filtri HEPA (cabine biohazard,
camere bianche o cleanroom) nel
laboratorio biomedico, nell’industria
alimentare e farmaceutica (farmaci,
vaccini)
 Sterilizzazione delle acque
Dispositivi per la filtrazione di liquidi

Filtrazione di
piccoli volumi

Filtrazione di
grandi volumi

Filtrazione per conta

cellulare vitale
Filtrazione su membrana Nucleopore®

Enterococcus spp.

Batteri acquatici ed alghe

STERILIZZAZIONE
Tecniche FISICHE

a. CALORE

 UMIDO
 SECCO

b. FILTRAZIONE

c. ONDE ELETTROMAGNETICHE

 RADIAZIONI U.V.
 RADIAZIONI IONIZZANTI
Radiazioni elettromagnetiche
Le radiazioni elettromagnetiche sono una via efficace per il controllo della
crescita microbica. Si conoscono:
1. Raggi UV
2. Raggi X
3. Raggi γ
Agiscono sull’organismo con il quale vengono a contatto rompendone il
DNA, e provocandone la morte.
SPETTO ELETTROMAGNETICO
STERILIZZAZIONE FISICA
Radiazione Ultravioletta (U.V.)
• Onde elettromagnetiche (=220-300 nm) prodotte dal passaggio di corrente
elettrica attraverso vapori a bassa pressione di Hg contenuti all’interno di speciali
tubi in vetro
• Assorbiti dagli acidi nucleici (Amax=269 nm) e dalle proteine (Amax=280 nm)
• Danno cellulare (letale) per formazione di dimeri pirimidinici (T-T) che
interferiscono con la replicazione del DNA (effetto mutageno)
• Applicazioni:
• Materiale plastico termolabile; decontaminazione di superfici, aria, acqua in
ambienti confinati
• sterilizzazione “a freddo” di composti chimici, materiali plastici per uso
farmaceutico, siero per colture cellulari
• Fattori critici:
• scarsa penetrazione (non penetra carta, vetro, indumenti)
• distanza sorgente UV - materiale trattato
• specie microbica
• mutagena per l’uomo (cute, occhi)

Radiazioni U.V.
STERILIZZAZIONE FISICA
Radiazioni Ionizzanti
• Radiazioni elettromagnetiche a corta  (alta energia):
• microonde, raggi , raggi X, elettroni
• Effetto letale risultante da un’azione ionizzante (dislocazione di elettroni dagli
atomi) sulla molecola bersaglio:
• diretta: trasferimento di energia a biopolimeri (DNA, proteine), causandone la
rottura
• indiretta: diffusione di radicali liberi (OH•, e-, H•)
• Applicazioni:
• I costi elevati ne limitano l’utilizzo a processi industriali:
• Sterilizzazione di rifiuti sanitari,strumenti e dispositivi medicali (articoli
monouso, siringhe, terreni di coltura, suture, strumentazione chirurgica)
• Industria alimentare (carne fresca); Industria farmaceutica (antibiotici,
vaccini, pomate)
• Trapianti di tessuto (valvola cardiaca, tendine, pelle)
• Svantaggi: costi elevati, penetrano nei tessuti, mutagene per l’uomo

RADIAZIONI IONIZZANTI
 Sensibilità alle radiazioni di alcuni
microrganismi e funzioni biologiche

Specie/funzioni Tipologia D10 (Gy)

Gram+,
Clostridium botulinum 3.300
sporigeno
Salmonella typhimurium Gram- 200
Aspergillus niger Muffa 500
Saccharomyces cerevisiae Lievito 500
Afta Virus 13.000
Inattivazione enzimatica 20.000-50.000

D10: quantità di radiazioni necessaria per ridurre di 10 volte la popolazione (o

l’attività) iniziale.
Gy (Gray) : dose di radiazione assorbita (1 Gy = 100 rad), dove: 1 rad = 100 erg/g.
Dose letale = 12 x D10
STERILIZZAZIONE
Tecniche CHIMICHE

a. ACIDO PERACETICO

b. GLUTARALDEIDE
STERILIZZAZIONE CHIMICA
Acido peracetico, Glutaraldeide
a. Acido peracetico:
 agente ossidante
 immersione (0.2% per 20’ - acqua sterile - aria sterile)
 micronizzato: industria alimentare, strumenti chirurgici
 efficace in presenza di materiale organico e produce prodotti
finali non tossici (acido acetico + O2)
b. Glutaraldeide:
 agente alchilante (aggiunta di –CH3, -CH2CH3)
 immersione (soluzione al 2%), tempi lunghi (ore)
 impiegata per materiale medico-chirurgico e preparazione di
vaccini
 il suo impiego è associato a rischio occupazionale (irritazione
mucose respiratorie, dermatite da contatto)
STERILIZZAZIONE
Tecniche CHIMICO-FISICHE

OSSIDO di ETILENE (ETO)

FORMALDEIDE (vapori)
STERILIZZAZIONE CHIMICO-FISICA
Ossido di Etilene (ETO)

 Alchilazione di gruppi funzionali (amminici,

carbossilici, fenolici, idrossilici)
 Sterilizzazione di materiale di laboratorio
termosensibile (plastica)
 12% ETO + 88% Freon (oppure CO2, N2)
 L’utilizzo deve essere regolamentato: ETO è
carcinogeno e mutageno
STERILIZZAZIONE
Tecniche CHIMICO-FISICHE

OSSIDO di ETILENE (ETO)

FORMALDEIDE (vapori)
STERILIZZAZIONE CHIMICO-FISICA
Formaldeide (vapori)

 Agente alchilante
 Vaporizzazione 2-5% formaldeide in presenza di
vapor acqueo a 60-80°C
 Impiegata per sterilizzare filtri HEPA
 Formaldeide è carcinogena
 “Tracce” residue in materiale polimerico
(cellulosa, gomma)
SCELTA DELLA TECNICA DI
STERILIZZAZIONE
 Attività: battericida, tubercolicida, fungicida, sporicida,
virucida
 Rapidità di azione: sterilizzazione raggiunta in breve
tempo
 Penetrazione: capacità di penetrare nel materiale trattato o
nella confezione in cui esso è contenuto
 Compatibilità: non causa rilevanti cambiamenti strutturali o
funzionali del materiale in seguito a ripetuti trattamenti
 Atossicità: sicuro per l’operatore e l’ambiente
 Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in
presenza di materiale organico
 Costo-efficacia: costi ragionevoli per attrezzatura,
installazione ed utilizzo
… in altre parole:

non esiste una

tecnica di sterilizzazione IDEALE !
DISINFEZIONE
Tecniche di disinfezione

da: PR Murray et al.

Medical Microbiology
3rd ed.,Mosby,1998
DISINFETTANTI
Aldeidi

 Formaldeide e glutaraldeide sono dotate di

rilevante attività disinfettante
 Alchilazione dei gruppi polari funzionali (amminici,
idrossilici, fenolici) delle proteine
 Formaldeide:
 37% (formalina), come sterilizzante: preserva campioni
biologici e preparazione di vaccini
 3-8%, come disinfettante
 Irrita le mucose, cancerogeno, forte odore
DISINFETTANTI
Aldeidi

 Glutaraldeide
 2% (Cydex)
 battericida, tubercolicida, fungicida,
virucida (10 minuti)
 sporicida (3 - 10 ore)

 Meno irritante e più efficace della

formaldeide
 Disinfezione strumentazione
ospedaliera
DISINFETTANTI
Agenti Ossidanti

 Perossido d’idrogeno (H2O2)

 Acido peracetico
 Formazione di radicali ossidrilici (OH•) in grado di
ossidare sistemi enzimatici “critici” per il
microrganismo
 Battericidi, fungicidi, virucidi, sporicidi
 Acido peracetico (come sterilizzante di strumentazione
e matrici alimentari): battericida e fungicida (5 min),
virucida e sporicida (30 min)
 H2O2 (come antisettico, non per ferite aperte)
DISINFETTANTI
Agenti Ossidanti

 Etanolo, isopropanolo (60-85%)

 Danneggiano membrana citoplasmatica:
 denaturazione (coagulazione) delle proteine
 solubilizzazione dei lipidi

 Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi

 Attività influenzata dalla presenza di materiale organico
 Isopropanolo più efficace dell’etanolo

 Antisettici (non per ferite aperte)

 Disinfettanti (sol. acquosa): superfici ben ventilate e
lontane da fiamme
DISINFETTANTI
Fenoli e derivati fenolici
DISINFETTANTI
Fenoli e derivati fenolici
 Fenolo (Lister): tossico, corrosivo, carcinogenico
 Derivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo,
alchil, benzil, phenyl, amil) a sostituzione di un H
dell’anello aromatico
 Distruzione membrana plasmatica, denaturazione
proteica
 Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi
 2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi)
 Attività persistente e non influenzata
dalla presenza di materiale organico
 O-phenylphenol (Lysol), Irgasan

 Esaclorofene (Phisohex)
 Elevata efficacia vs cocchi Gram+
 Strumenti chirurgici
DISINFETTANTI
Alogeni

 loduri, Cloruri, Bromuri, Fluoruri

 Eliminazione di gruppi S-H per:
 Ossidazione: formazione di ponti di-sulfidrilici inattivi
 Combinazione: ione metallico “sottrae” SH liberi
 Battericidi, fungicidi, virucidi, sono combinati (Na,
metalli) per ridurre tossicità, instabilità e corrosività
 Ioduri:
 Soluzione alcolica: Tintura di iodio
 Iodofori: PVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico
 Cloruri:
 Disinfezione di acqua, piscine, acque di scarico
 Cl + p-toluene-sulfonamide (cloramina T)
 1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischio ematogeni
DISINFETTANTI
Composti ammonio quaternario
 Detergenti cationici, derivati da
modificazioni di NH4+
 Distruzione membrana cellulare,
inattivazione enzimatica, denaturazione
(coagulazione) proteica
 Batteriostatico (battericida ad elevate concentrazioni),
sporostatico, fungistatico, virustatico
 Scarsamenta attivi vs Gram-: frequenti infezioni da
Pseudomonas spp QUATs-resistenti
 Neutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti
anionici
 Non corrosivi, non tossici, stabili, inodori

 Zephiran (benzalconio cloruro), cetrimide, clorexidina

ANTISETTICI
 Alcooli (isopropanolo, etanolo):
 azione veloce ed efficace (spettro esteso)
 disidratano la pelle
 Clorexidina gluconata:
 solo attività battericida
 ridotta efficacia in presenza di acqua calcarea o di alcuni
saponi
 Iodofori:
 esteso spettro di azione
 colorano ed irritano la cute
 Triclosan:
 attivo solo su Gram+ e Gram- (tranne Pseudomonas spp)
SURFATTANTI

 Saponi e detergenti
 Utilizzati in associazione con gli antisettici
 L’azione dei surfattanti si espleta attraverso:
 degradazione della pellicola idrolipidica sopracutanea
(emulsificazione)
 rimozione “meccanica” dei microrganismi (flora
transitoria: Gram-, 80%) per sfregamento
 DISINFEZIONE

 Sensibilità relativa
 Limitazioni
Efficacia di differenti disinfettanti
Applicazione delle tecniche di
disinfezione
 Un approccio conveniente è quello suggerito da
Spaulding, applicato nelle linee-guida U.S.
 Gli oggetti sono classificati, sulla base del loro
impiego, come:
1. CRITICI
2. SEMI-CRITICI
3. NON CRITICI
 I relativi livelli di disinfezione richiesti sono:
 Alto livello (High Level of Disinfection, HLD)
 Livello Intermedio (Intermediate Level of Disinfection,
ILD)
 Basso livello (Low Level of Disinfection, LLD)
Trattamento di oggetti “CRITICI”

 Oggetti “critici”
 A contatto con tessuti viventi od inseriti nel sistema
vascolare (strumentazione chirurgica, cateteri,
artroscopi, etc)
 Obiettivo:
 Inattivazione forme vegetative e sporali (sterilità)
 Metodo:
 Vapore, sterilizzazione chimica (glutaraldeide, perossido
di idrogeno, acido peracetico)
Trattamento di oggetti “semi-critici”

 Oggetti “semi-critici”
 A contatto con mucose o con la cute non integra
(endoscopi, termometri, attrezzatura per terapia
inalatoria)
 Obiettivo:
 Inattivazione delle forme vegetative
 Metodo:
 High and Intermediate Level of Disinfection (HLD, ILD):
 glutaraldeide, perossido di idrogeno, perossido di
idrogeno+acido peracetico
Trattamento di oggetti “non critici”

 Oggetti “non critici”

 Non vengono a contatto con mucose o con la cute non
integra (superfici di strumentazioni mediche e superfici
ambientali)
 Obiettivo:
 Basso grado di contaminazione
 Metodo:
 Intermediate and Low Level of Disinfection (ILD, LLD):
 Alcool etilico, ioduri, composti dell’ammonio quaternario,
fenoli
Spaulding’s scheme

Alto livello di
bassa S
disinfezione

Livello intermedio
di disinfezione

Basso livello di
disinfezione
elevata S
DISINFEZIONE
“Fattori critici”
 Ambiente:
 temperatura
 optimum: 20-37°C. Efficacia = K x temperatura. Un aumento pari a 10°C
determina un aumento 2x della velocità di azione
 pH del mezzo in cui deve agire il disinfettante
 Materiale:
 natura del materiale (porosità)
 presenza di materiale organico (sangue, pus, vomito, feci)
 inattivazione principio attivo
 rivestimento della superficie batterica
 adsorbimento (eliminazione) del principio attivo
 Disinfettante:
 concentrazione del principio attivo
 tempo di applicazione (contatto con materiale)
 qualità acqua per diluizione disinfettante
DISINFEZIONE
“Fattori critici”
 Microrganismo:
 tipologia
 I batteri Gram-negativi (presenza della membrana esterna) sono
generalmente più resistenti dei Gram-positivi ai disinfettanti ed
antisettici
 Micobatteri, endospore e cisti protozoarie sono molto resistenti ai
disinfettanti ed antisettici
 I virus sprovvisti di envelope sono generalmente più resistenti a
disinfettanti ed antisettici rispetto ai virus con envelope
 carica microbica
 organizzazione
 Presenza di biofilm: comunità cellulare multistratificata sessile in cui
gli elementi cellulari sono immersi in una matrice polisaccaridica di
derivazione batterica. La matrice potrebbe influenzare l’attività del
disinfettante o inattivandolo interagendo chimicamente con esso o
rallentandone la diffusione attraverso gli strati cellulari più profondi
Caratteristiche “ideali” di un disinfettante

 Attività: esteso spettro di azione (battericida, fungicida,

sporicida, tubercolicida, viricida)
 Rapidità di azione: breve “tempo minimo di
applicazione”: 1-10 minuti
 Atossicità: non irritante per occhi, mucose, cute
 Non deve possedere capacità tintoriali
 Non corrosivo
 Stabilità: per diluizioni e tempi consigliati (anche in
presenza di materiale organico)
 Buona capacità di penetrazione e detersione
 Costi: ragionevoli (economicità)
… in altre parole:

non esiste il disinfettante

IDEALE !