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Colture cellulari

Colture
Cellulari
.

Colture cellulari

Colture Cellulari
Insieme di cellule mantenute in vitro,
derivanti dalla disgregazione di tessuti,
isolate da fluidi biologici come il sangue o
linee cellulari immortalizate da forme
tumorali.
Le cellule vengono poste a contatto con tutti i
fattori e metaboliti necessari alla loro
crescita.
.

Colture cellulari

Colture cellulari

esempi

ambito

Colture cellulari

Altre applicazioni .
Per lo studio dei meccanismi di azione dei farmaci
In campo industriale le cellule in colture vengono
utilizzate per verificare gli effetti farmacologici e
tossicologici di preparati farmaceutici
Per analisi quantitative e qualitative riguardanti le
infezioni virali

Colture cellulari

Aspetti di sicurezza

Per impedire la contaminazione


accidentale dovuta a batteri
provenienti da fonti esterne
Per impedire la contaminazione
di se stessi o di terzi
.

Colture cellulari

Lavorare in condizioni sterili


Precauzioni fondamentali:
Evitare di parlare (soprattutto quando si apre
lincubatore cellulare)..starnutire..tossire
Spruzzare con etanolo al 70% tutto ci che
viene usato sotto cappa..bottiglie pipette
scatole dei puntali
Pulire la cappa prima delluso e dopo luso
Pulire immediatamente con etanolo al 70% le
superfici nel caso abbiamo inavvertitamente
rovesciato delle sostanze
.

Colture cellulari

Lavorare in condizioni sterili


Contaminazioni batteriche
Sospetti di avvenuta contaminazione:

Cambia il colore del terreno torbido (cambiamento del pH)


Esame al microscopio..tondeggianti..molto piccoli rispetto alla
cellula e in movimento
Le cellule eucariotiche non proliferano o comunque
proliferano meno rispetto ad un ciclo normale di crescita

Soluzione del problema...buttare via tutto!


tutti i risultati ottenuti su cellule contaminate da batteri non
sono attendibili
.

Colture cellulari

Lavorare in condizioni sterili


Contaminazioni da micoplasma
Come scoprirli:
Coltura microbiologica delle cellule presumibilmente infettate
3714 giorni o meno, condizioni aerobiche..ogni 3 giorni
un aliquota viene piastrata su agar e incubata poi
esamino al microscopio . in parallelo sempre un controllo
positivo

Colture cellulari

Lavorare in condizioni sterili

Contaminazioni da micoplasma
Come eliminarli:

Antibiotici: gentamicina o plasmocin

Colture cellulari

Metodi di Sterilizzazione
Sterilizzazione al calore secco mediante lutilizzo
di un forno ad una temperatura di circa 160C per
almeno 2 h. Particolarmente indicata per la
vetreria di laboratorio
Sterilizzazione al calore umido mediante lutilizzo
dellautoclave a 121 C per almeno 15 min.
Particolarmente indicata per mezzi liquidi non
sensibili al calore, per la vetreria di laboratorio,
per le scatole dei puntali (utilizzare il nastro
adesivo con le spore per tutto)

Colture cellulari

Laboratorio di Colture
Cellulari

Cappa a flusso laminare


Incubatore per cellule a 37 con CO2 5%
Centrifuga e mini centrifuga
Bagnetto termostatico
Microscopio invertito
Autoclave
Vortex
.

Colture cellulari

CAPPA A FLUSSO LAMINARE


Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di
aria sterile, filtrata attraverso filtri appositi, paralleli tra
loro ed aventi tutti la stessa velocit.
I filetti di aria sterile trascinano lontano dallarea di lavoro
i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici.

Filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air): prevengono la


contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di
microfibre di vetro ripiegati pi volte per aumentare la
superficie filtrante; lefficienza la capacit di trattenere
particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa
tra 99,97% e 99,99%.
Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la
protezione del campione da contaminazioni e la protezione
parziale delloperatore durante luso delle colture cellulari
.

Colture cellulari

Colture cellulari

Cappa a flusso laminare o


biologica

Colture cellulari

Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in


laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite
cappe di sicurezza microbiologica
Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una
chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le
manipolazioni allinterno della camera sono consentite da due
o pi guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa.
I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un
sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sullaria in
ingresso ed un doppio filtro HEPA sullaria in uscita
-Protezione totale delloperatore e dellambiente.
-Manipolazioni ad alto rischio biologico
.

Colture cellulari

Condizioni di coltura
Allinterno dellorganismo, le funzioni

vitali (nutrizione, controllo di pH,


protezione, mantenimento della
temperatura) sono regolate nei tessuti
da differenti sistemi di controllo. Una
volta che le cellule sono nel terreno di
cultura, queste funzioni, oltre allambiente
di coltura, devono essere sostituite
dallincubatore.
.

Colture cellulari

Temperatura
Le cellule coltivate richiedono un controllo di
temperatura rigoroso almeno quanto quello
dellorganismo vivente.
Anche se normalmente le cellule di mammifero si
coltivano a 37C, per certi tipi di cellule
lincubatore deve poter essere regolato in modo
preciso anche a 30C o 34C.

Colture cellulari

pH
Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato
per mantenere costante il pH
Il pH del terreno dipende generalmente dalla %CO2
nellincubatore
La concentrazione di CO2 richiesta pu andare da 0.5% a
8.5% in funzione del terreno utilizzato e del pH desiderato
generalmente: pH 7.2-7.4
.

Colture cellulari

pH

In alcuni casi si pu incorporare nel medium


(terreno) di crescita un colorante sensibile al pH
per avere un controllo visivo dello stato del pH
durante la crescita.
rosso-arancio a ph 7.3

Rosso Fenolo

rosso-viola a ph alcalino

giallo-arancio a ph acido

Colture cellulari

pH
Viraggio del terreno per
controllare lo stato
proliferativo e leventuale
contaminazione batterica

Colture cellulari

CO2

La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella


coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata
allinterno dei tessuti Cos lincubatore riproduce
rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle
cellule.

Colture cellulari

Tipi di Coltura di Cellule

Coltura Primaria
(ex vivo)

Linee
immortalizzate
(in vitro)

Colture cellulari

Coltura Primaria
Coltura preparata direttamente da un tessuto o da
sangue intero nel caso di cellule del sistema immunitario: le
cellule sono in grado di compiere un numero finito di
divisioni cellulari dopo le quali vanno incontro a senescenza
(fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di
metaboliti appropriati per la crescita)
Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore
probabilit le attivit biochimiche delle cellule in vivo
Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a
lungo termine
.

Colture cellulari

Coltura Primaria
Coltura a breve termine

< 10 duplicazioni

Colture cellulari

Linee Cellulari
immortalizate (in vitro)
Si creano grazie allisolamento di ceppi clonali: il programma genetico
della senescenza stato annullato attraverso mutazioni spontanee o
indotte
Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni
genetiche di colture primarie non tumorali
Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule
cancerose
Vantaggi: cellule pi facili da coltivare, risposte riproducibili con
risultati meno variabili delle colture primarie
Svantaggi: non riproducono esattamente la risposta fisiologica cellulare
.

Colture cellulari

Coltura Secondaria o
immortalizata
Linea Cellulare Continua

>150-200 duplicazioni o comunque

a seconda delle proteine di nostro interesse o a seconda


delle regole di laboratorio.
.

Colture cellulari

Linea Cellulare
secondaria o
immortalizata o continua
Capacit di crescere
indipendentemente dallorganismo da
cui derivata
Crescita ininterrotta per oltre un
anno
Immortale
.

Colture cellulari

Le prime Linee Cellulari


Continue
1952, Johns
Hopkins
University

HELA

1963, University of
Ibadan

RAJI
.

Colture cellulari

Es. di linee cellulari Continue

Cellule JURKAT: linea tumorale di


Linfociti T helper

Cellule THP1: linea tumorale di


Monociti
e tanti altre.RAW
cells, CACO 2, COS

Colture cellulari

Es. di linee cellulari Continue


Esistono diverse banche di cellule che
permettono di acquistare direttamente il
tipo cellulare che pi ci interessa senza
doverle produrre ex novo.
Una delle banche ad es. la European
Collection of animal cell cultures (EACC)
con sede in gran bretagna.
http://www.lgcstandards-atcc.org/
.

Colture cellulari

Es. di linee cellulari Continue


Proviamo con ..
The ATCC Cell Biology Collection
..is the most comprehensive and diverse of its kind in
the world, consisting of over 3,600 cell lines from
over 150 different species. It holds over 950 cancer
cell lines and several special collections including
stem cells
http://www.lgcstandards-atcc.org/
.

Colture cellulari

Es. di linee cellulari Continue


Proviamo con ..
Jurkat,
Raw cells
http://www.lgcstandards-atcc.org/

Colture cellulari

linee cellulari Continue

In sospensione es. Jurkat

In adesione es. Raw cells

Colture cellulari

Medium di Coltura

I terreni base disponibili in commercio contengono i


componenti nutritivi necessari alla crescita delle
cellule
I pi comuni terreni base di coltura:
-MEM: Minimum Essential Medium
-DMEM: Dulbeccos modification of MEM
-RPMI: Roswell Park Memorial Institute
Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e
sali e per la concentrazione di glucosio
.

Colture cellulari

Medium di Coltura
Sali inorganici
Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni
cellulari e agiscono anche come tampone per le
fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai
prodotti del catabolismo
Cloruro di calcio anidro
Solfato di magnesio anidro
Cloruro di potassio
Nitrato di potassio
Cloruro di sodio
Fosfato di sodio bibasico
Bicarbonato di sodio
.

Colture cellulari

Medium di Coltura,
Vitamine
Biotina
Pantotenato
Acido folico
Inositolo
Nicotinamide
Piridossina
Riboflavina
Tiamina
Vitamina B12
.

Colture cellulari

Medium di Coltura
Amminoacidi-isomeri L
Alanina
Leucina
Arginina
Lisina
Asparagina
Metionina
Acido aspartico
Fenilalanina
Cisteina
Prolina
Glutamina
Serina
Acido glutamico
Treonina
Glicina
Triptofano
Istidina
Tirosina
Isoleucina
Valina
Necessari per la sintesi delle proteine
.

Colture cellulari

Medium di Coltura
Zuccheri
Glucosio
Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonio
per le biosintesi

Colture cellulari

Medium di Coltura
Il terreno base viene conservato a 4C e,
prima di essere utilizzato, viene
complementato con:

Antibiotici (penicillina/streptomicina)
Siero (supplemento pi comune delle colture
cellulari)
.

Colture cellulari

SIERO
Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali
per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule
Fattori di crescita
Fattori di adesione ad es. fibronectina, vitronectina
Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi
grassi e glucorticoidi, elementi minerali
Il siero di uso pi comune il siero fetale di bovino (FBS,
Fetal Bovine Serum) oppure lFCS Fetal Calf Serum e
per alcune cellule nervose si usa anche il siero equino
.

Colture cellulari

SIERO

Scomplementazione del siero


mezzora in un bagnetto termostatato a 56C
(ricordarsi il parafilm) in modo da distruggere
le proteine del complemento, poich la cascata
di reazione del complemento porta alla lisi
cellulare e quindi alla morte della coltura
tenuta in vita.
A scomplementazione avviene una sola volta
per ogni bottiglia nuova di siero

Colture cellulari

SIERO

Il complemento ..
costituito da una ventina di proteine
circolanti e di membrana, capaci di interagire
reciprocamente e con le membrane cellulari.
Il sistema del complemento, come gli
anticorpi uno dei meccanismi contro gli agenti
infettivi.

Colture cellulari

SIERO

Colture cellulari

Sistemi di Crescita

ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o mesenchimale (che in vivo


fanno parte di tessuti solidi)
Fenomeno che richiede linterazione
di recettori di membrana con proteine
adesive, adsorbite sulla superficie della
piastra di coltura

SOSPENSIONE: cellule di origine


ematopoietica (che normalmente vivono in
un mezzo fluido)

Colture cellulari

Distacco delle cellule in


adesione
Soluzione di EDTA e tripsina
-EDTA
-Tripsina: enzima proteolitico, derivato da
pancreas porcino. Degrada le proteine che
mantengono le cellule aderenti al substrato

Colture cellulari

Protocollo di tripsinizzazione
Lavare le cellule (2X) con PBS
(phosphate buffered saline)
Aggiungere un volume adeguato di tripsina
(pre-riscaldata)
Incubare a 37C per almeno 3 min
Neutralizzare la tripsina con medium completo
di FBS
( che contiene inibitori della tripsina)
.

Colture cellulari

Protocollo di tripsinizzazione
Trasferire la sospensione in una falcon da 15 o
da 50 e centrifugare 5 min

Aspirare il surnatante
Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule
Distribuire nelle nuove piastre
Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidit
in modo da tenere le cellule fuori dallincubatore il minor tempo
possibile
.

Colture cellulari

Distacco delle cellule in


adesione
Tramite scraper

Colture cellulari

Distacco delle cellule in


adesione

Tramite scraper
Elimino il terreno
Lavo due volte con pbs a 4
Aggiungo altro PBS e passo lo scraper
Raccolgo le cellule in una falcon

Colture cellulari

Efficienza di semina

-Generalmente le cellule, al di sotto di una certa


densit non crescono in modo efficiente
- Al contrario se troppo dense tendono a soffrire.
-Regola generale: densit > 104 cellule/cm2

Tempo di duplicazione
-La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il
numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione
-Il tempo impiegato per ogni duplicazione caratteristico di
ogni linea cellulare.
.

Colture cellulari

Plastica per coltura


Sono generalmente in polistirene:
-materiale rigido con superficie lucida
-buona resistenza chimica a soluzioni acquose
-limitata resistenza a solventi
-totale assenza di tossicit per le cellule in coltura
-trasparenza che consente una osservazione
diretta al microscopio
-la superficie trattata chimicamente per
renderla idrofila e carica negativamente (per
favorire i legami stabili con i fattori di adesione
presenti nel siero)
.

Colture cellulari

Piastre

Colture cellulari

Tipi di Piastre
Diametro
(mm)

Superficie
(cm2)

Volume
(ml)

35

1-2

60

21

4-5

100

55

10-12

150

148

20-30
.

Tipi di Multi-well

Colture cellulari

Multi-well

Superficie
(cm2)

Volume
(ml)

96

0,32

0,1-0,2

48

1,0

0,3-0,6

24

1,88

0,5-1,2

12

3,83

1,0-2,4

9,40

2.0-3,0
.

Colture cellulari

Fiasche

Tipi di Fiasche

Colture cellulari

Fiasche

Superficie
(cm2)

Volume
(ml)

T-25

25

5-10

T-75

75

15-25

T-150

150

30-50

T-175

175

35-60

T-225

225

45-70
.

Colture cellulari

Conta Cellulare
Diversi metodi: un metodo semplice ed
economico luso dellemocitometro o camera
di Burker o di nageotte o thomas zeiss etc.

-La camera costituita da un vetro in cui


ricavata una camera capillare; la parte
superiore della camera costituita da un
vetrino bloccato lateralmente.
.

Colture cellulari

Procedura per Conta Cellulare


/vitalit

Preparare la sospensione cellulare (15 ul di


sospensione cellulare + 15 ul di trypan blue)
Trasferire una piccola quantit di sospensione
cellulare nella camera del vetrino, permettendo il
riempimento per capillarit
Contare le cellule bianche nei 4 quadranti media
artimetica e conta specifica a seconda del tipo di
camera usata.
.

Colture cellulari

Percentuale di Vitalit
Metodica di esclusione con Trypan blue
-Il trypan blue in grado di colorare le cellule necrotiche
-Percentuale di vitalit:
N cellule vitali/Ncell. non vitali + cellule vitali X 100

Concentrazione Cellulare
N cellule vitali (media dei 3 quadrati) X 10000 X 2

Emocitometro
MARI0600110
4 grandi quadrati agli angoli sono
suddivisi in 16 quadrati ciascuno
Il grande quadrato al centro
suddiviso in 16 quadrati di gruppo,
ognuno dei quali ulteriormente
suddiviso in 16 quadratini

Conta cellulare:
Counter elettronico
Metodo automatizzato che consente di
misurare il numero e le dimensioni di
particelle microscopiche.
Lo strumento costituito da una sonda di
vetro nella quale inserito un elettrodo
connesso a un oscilloscopio e a un elettrodo
esterno. ..la sonda presenta in prossimit
dellestremit inferiore una piccola
apertura di diametro fisso.

Conta cellulare:
Counter elettronico
La sonda viene immersa nel terreno o
soluzione contenente le cellule.le cellule
entrano e causano un momentaneo aumento
della resistenza elettrica dovuto alla
parziale interruzione del flusso di
corrente..ad ogni segnale registrato
corrisponde una cellula

Scongelamento (colture
cellulari)
Rapidamente!
Prendere un criotubo dallazoto liquido
Scongelare in un bagnetto a 37
Trasferire in una falcon da 15 contenente 10
ml di terreno completo
Centrifugare
Aspirare il surnatante
Aggiungere nuovo terreno e risospendere

Congelamento (colture
cellulari)
Lentamente!!
Centrifugare le cellule
Aspirare il surnatante
Risospendere in terreno con DMSO
Trasferire in criotubi
Trasferire al -80 ed se possibile dopo un
paio di giorni in azoto liquido
Label le provette!!

Congelamento (colture
cellulari)
DMSO=
Dimetilsolfossido
un composto organico appartenente alla
categoria dei solfossidi. A temperatura
ambiente si presenta come un liquido
incolore ed inodore.
un agente crioprotettivo.

Cellule vegetali
Il primo step dato dallescissione e la
sterilizzazione superficiale dellespianto
che deriver da pari diverse della pianta a
seconda dello studio.
Gli espianti:
Da piante cresciute sul campo
Da piante in serra
Da piante incubate in condizioni sterili

Cellule vegetali
La sterilizzazione avviene tramite esposizione per 5
minuti con ipoclorito di sodio, allesposizione
seguono dei lavaggi abbondanti con acqua sterile
distillata.

Le cellule hanno una maggiore probabilit di


sopravvivere quando il tessuto scelto
fisiologicamente attivo.
Il callo che si forma allaltezza di una pianta ferita
spesso usato come materiale di partenza.