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Ing.

delle cellule animali

Attrezzature e terreni di coltura

Lezione 1 del 28.03.08

Prof Di Sano Federica


mail: federica.di.sano@uniroma2.it
Ci saranno sei lezioni. La materia prevede anche un piccolo laboratorio. Il corso vale 2 crediti ed ad
idoneit.
--L'esigenza di usare colture cellulari nata per studiare le sostanze xenobiotiche. Queste sostanze sono
molecole di sintesi estranee agli organismi quindi di origine non naturale (diversamente dalle tossine, ad
esempio, che sono naturali). Queste sostanze di origine non naturale derivano essenzialmente da attivit
umane: esempio sostanze che si accumulano alla fine dei cicli di produzione e vengono immesse
nell'ambiente. E' per necessario fare una sperimentazione che valuti la tossicit di queste sostanze sia
per inalazione che per contatto che per ingestione.
I metodi che anche oggi vengono utilizzati per valutare la tossicit di queste sostanze sono:
Non biologici: che sia avvalgono di simulazioni e modelli matematici, cercando di simulare quello
che pu avvenire nell'organismo e valutare in via teorica quella che pu essere la tossicit;
Biologici: sono metodi che possano usare sia sistemi in vivo (quindi su cellule animali) che sistemi
in vitro. Tra gli ultimi abbiamo sia culture cellulari che colture di organi e di tessuti. Le colture
cellulari, rispetto ai prime due (organi e tessuti), sono sistemi per pi economici, reperibili e pi
facilmente utilizzabili oltre ad avere meno problemi di tipo etico e legislativo.
Cenni storici.
Nel 1885 Roux dimostra che le cellule di embrione di pollo al di fuori dell'animale in una soluzione salina
calda potevano sopravvivere per un certo periodo di tempo.
Nel 1952 Grey e collaboratori sono riusciti a stabilire una linea di cellule che si propagava indefinitamente,
una linea derivata da un carcinoma cellulare umano. La signora, H. L., era malata di un tumore alla cervice,
un tumore molto aggressivo, e, ogni volta che andava dal dottore Grey lui per curarla e medicarla
prelevava le cellule del tessuto della cervice ma, invece di gettarle via, le metteva in coltura facendo delle
colture di cellule tumorali che si propagavano indefinitivamente. Il nome di questa coltura, la prima linea
cellulare, prese il nome di HeLa in onore della signora donatrice. La famiglia lo seppe solo dopo 20 anni
anche perch allora, come oggi, tutto il materiale di scarto che deriva da cure mediche diventa di propriet
dell'istituzione medica e quindi non necessario ottenere un'autorizzazione. Da allora l'uso di queste
cellule si diffuso ed stato usato per migliaia di esperimenti come anche per lo sviluppo del vaccino
della
poliomielite.
Questa linea cellulare immortale e pu riprodursi per un numero illimitato di volte ma sono anche
cellule molto aggressive e quindi possono infettare anche altre cellule. Queste cellule tendono ad infettare
le altre e oggi si stima che circa il 10% delle colture cellule infettata da questa linea tumorale.
Successivamente nel 54 la Ritalevi Montalcini ha dimostrato la capacit di stimolare la crescita degli assoni
in coltura tramite il NGF. Pi tardi Eagle comp uno studio sistematico sugli elementi nutritivi necessari
affinch una coltura cellulare possa essere mantenuta. Egli dimostr che le cellule animali possono
propagarsi in maniera indefinita attraverso l'uso di una miscela di molecole a cui viene aggiunta una
proporzione di proteine del siero.

Nel 1976 Sato ha dimostrato che le linee cellulari necessitano di miscele di ormoni e fattori di crescita nel
caso in cui vengano fatti crescere in un mezzo privo di siero; quindi o si aggiunge il siero (che contiene
tutti i fattori di crescita) oppure bisogna aggiungere alle miscele di cui abbiamo detto prima degli ormoni
e fattori di crescita affinch le cellule possano propagarsi nel tempo.
Nel 1986 Martins e Evans hanno isolato per la prima volta le cellula staminali da cellule embrionali di
topo, mentre nell'88 Thompson ed Evans hanno isolato per la prima volta le cellule staminali umani.
Le cellule normalmente si guardano tramite microscopi invertiti. Essi hanno la luce proveniente dall'alto
mentre gli obiettivi sono nel basso. Le cellule in coltura in base al tipo di cellule mantengono molte delle
caratteristiche che hanno in natura. Esempio i mioblasti in coltura tendono a fondersi per formare delle
fibre muscolari multinucleate cos come avviene nella normale formazione delle fibre muscolare. La
morfologia assomiglia quindi molto alle cellule presenti in natura.
Campi di applicazione.
Esse vengono usate nell'ambito della biologia cellulare per studi di tipo funzionale e per studi di
regolazione e funzionamento di proteine e geni; per studiare i meccanismi di crescita, metabolismo e
differenziamento cellulare. Possono essere utilizzate per esperimenti di ingegneria genetica e tissutale la
produzione di tessuti in vitro (esempio tessuto epidermico artificiale prodotto in vitro); infine per la
produzione di cellule staminali. Nel campo della biologia molecolare le cellule possono essere usate per
l'estrazione di acidi nucleici (RNA e DNA), per la purificazione di proteine, per studi di espressione genica
ed analisi dell'effetto delle mutazioni genetiche.
Nel campo della citogenetica si usano per diagnosi prenatali che si basano su indagini di tipo cariologico.
Nel campo dell'oncologia le cellule vengono usate per caratterizzare dal punto di vista biochimico e
molecolare diversi tipi di tumori. In farmacologia le cellule vengono usate in test di citotossicit per
l'efficacia e la tossicit di droghe, farmaci ed inquinanti. Nel campo della biotecnologia e immunologia
servono per la produzione di proteine ricombinanti e di anticorpi monoclonali.
Vantaggi e svantaggi.
Le colture cellulari presentano dei vantaggi e degli svantaggi. I vantaggi sono che esse rappresentano
sistemi molto semplici ed altamente riproducibili. Consentono di analizzare meccanismi sia cellulari che
molecolari. L'ambiente in cui vengono coltivate le cellule altamente controllabile dall'operatore. Sono
sistemi abbastanza economici e rapidi nel tipo di risposta che possono dare (di solito esperimenti di max
3-4 giorni); hanno una disponibilit molto elevata (esistono cellule di tutti i tipi). Non hanno infine
problemi di tipo etico o legale a differenza dell'uso di animali.
Vediamo gli svantaggi: il fatto di essere sistemi molto semplificati fa si che rispetto all'organismo intero
questa semplificazione possa essere un limite perch quello che osserviamo in una cellula non pu essere
vero a livello di un organismo in toto: le condizioni di esposizione alle cellule ad una determinata sostanza
o condizione possono infatti essere molto diverse da quelle che si avrebbero in un organismo in vivo.
Esiste anche una difficolt nel correlare le concentrazioni di tossicit di certe sostanze che potrebbero
variare tra esperimenti su colture o in vivo. Le sostanze che diamo potrebbero interagire con le sostanze
del terreno e dare risultati non veri. I costi sono elevati (varie apparecchiature e materiale usa e getta). Le
cellule in coltura sono soggette ad una instabilit genetica, ovvero subiscono mutazioni che fanno perdere
alcuni caratteri dopo un certo numero di passaggi. I risultati sulle colture sono legati anche all'esperienza
dell'operatore.
Apparecchiature.
Condizione fondamentale la sterilit, le cellule devono essere coltivate in condizioni sterili.

Attrezzature indispensabili:
Cappe a flusso laminare. Queste cappe fungono da barriera impedendo la fuoriuscita degli aereosol
ovvero goccioline che possono contenere materiale infettivo, frammenti cellulari ecc.. Esse sono
la sede dove le colture cellulari vengono maneggiate.
Incubatori che hanno diversi pianetti per le cellule. Essi sono incubatori a CO2 con concentrazione
del 5% che serve per la pressione osmotica ed il pH dei terreni di coltura. La temperatura di
solito 37 gradi.
Microscopio invertito.
Centrifughe (possibilmente refrigerate) che permettono di separare una cellula dall'altra e le diverse
componenti cellulari.
Bagnetto termostato (bagnomaria) che serve per riscaldare i terreni a 37 gradi tranne per alcune
linee cellulari come quelle di insetto. I terreni vanno riscaldati a 37 gradi prima di utilizzare le
cellule.
Frigoriferi e congelatori per la conservazione ed il mantenimento di terreni sieri ed altro.
Attrezzature per la crioconservazione: le cellule possono essere congelate. Per la crioconservazione
abbiamo bisogno di bidoni per azoto liquido e stanze dove vengono conservati.
Pipettatore automatico che sono delle specie di pistole con pipette usa e getta di plastica che
aspirano o sputano il terreno all'interno delle fiasche tramite la generazione di una pressione
negativa o per altri scopi.
Materiale monouso e contenitori per cellule come fiasche o piastre (di varie dimensioni). Provette
e puntali per micropipette.
Attrezzature utili:
Autoclavi che servono per la sterilizzazione.
Pompe aspiranti per rimuovere il terreno dalle fiasche cellulari.
Cell counter che serve per contare le cellule.
Cappe a flusso laminare.
Esse sono lo strumento indispensabile per le colture cellulari. Le cappe sono fornite di lampade a
ultravioletti per la sterilizzazione dei piani di lavoro. Il flusso delle cappe laminari pu essere orizzontale
o verticale. Le cappe devono essere mantenute libere da oggetti ed altro per mantenere l'ambiente sterile
(solo cose strettamente necessarie). Il flusso pu essere verticale dal basso verso l'alto, o orizzontale dal
fondo della verso l'operatore.
Nelle cappe a flusso laminare orizzontale l'aria entra, viene filtrata da un filtro Hepa e viene sputata in
direzione orizzontale investendo l'operatore: essa non ha una elevata sterilit e non sicura per l'operatore
perch gli spara l'aria in faccia. Non quindi idonea per maneggiare sostanze infette.
Le cappe a flusso laminari verticali sono invece quelle normalmente usate per le colture cellulari e possono
essere suddivise in tre classi in base alla sicurezza biologica.
L'efficacia di queste cappe dipende dal flusso dell'aria, dalla capacit di contenimento (quanto ermetica
ed a tenuta stagna), dal sistema di filtraggio ovvero dai filtri Hepa che trattengono il materiale particolato
senza farlo circolare nella cappa. La sicurezza biologica delle cappe dipende anche dalla loro posizione
all'interno della stanza sulla base delle correnti di aria e dai movimenti del personale.
Classe 1.
Il flusso dell'aria ha un andamento verticale e l'operatore al sicuro. La zona di lavoro presenta anche un
vetro che scherma eventuali contaminazioni sul volto dell'operatore. Oltre al filtro Hepa l'aria che entra
all'interno della cappa viene filtrata dal un filtro a carbone attivo che pulisce ulteriormente l'aria che viene
incalanata in un sistema di ricircolo dell'aria. Il sistema sia di espulsione che di riciclo: parte dell'aria

viene riciclata e parte viene espulsa. Queste cappe proteggono l'operatore dai contaminanti presenti
all'interno della cappa ma non dai materiali presenti all'interno della cappa stessa quindi ci sono diverse
procedure da seguire.
Classe 2.
Le cappe a flusso laminare verticali di classe 2 possono essere distinte in classe 2a e 2b in base alla quantit
di aria che viene riciclata nella cappa stessa rispetto a quella che viene espulsa. Nelle 2a il 70% dell'aria
viene riciclata mentre il 30% viene espulsa attraverso un filtro a carbone attivo. Nelle cappe 2b il 30% di
aria viene riciclata mentre il 70% viene espulsa. Si pu arrivare anche all'espulsione del 100% di aria.
Classe 3.
Sono cappe estremamente sicure perch sono cappe completamente chiuse. Sono quindi ermeticamente
chiuse a tenuta d'aria ed a pressione negativa. L'aria passa attraverso un filtro Hepa e quella che esce passa
invece attraverso due filtri Hepa posti in serie dato che sono cappe usate quando si maneggiano agente
molto infettivi. Sono dotate di manicotti per le mani che fungono da barriera totale tra operatore e piano
di lavoro.
In base agli agenti biologici che si maneggiano esistono quattro gruppi di classificazione sulla base della
pericolosit:
Il gruppo 1 racchiude tutti gli agenti non patogeni.
Il gruppo 2 comprende microrganismi che possono essere patogeni ma non causare epidemie.
Il gruppo 3 comprende patogeni che possono causare epidemie ma per i quali esistono delle cure
terapeutiche e preventive.
Il gruppo 4 comprende infine organismi patogeni che possono causare epidemie e per i quali non esistono
cure.
Di conseguenza avremo quattro classi di contenimento:
Abbiamo laboratori di livello T1 e T2, laboratori semplici in cui si maneggiano agenti biologici di classe
1 e 2.
Livelli di contenimento di tipo T3 e T4 in cui si maneggiano microrganismi di gruppo 3 e grandi quantit
di microrganismi di gruppo 2.
Infine livelli T4 per la manipolazioni di microrganismi di gruppo 4 con protezioni particolari.
Tecniche per usare in condizioni di sicurezza le cappe biologiche.
Tutti gli utenti di una cappa devono essere a conoscenza dei dispositivi di utilizzo: ci sono dei protocolli
scritti e vanno indossati sempre dei guanti dato che le mani non vengono protette dalla cappa. La cappa
non va usata se non perfettamente funzionante e quando la cappa in uso il pannello di vetro deve
essere chiuso. Le attrezzature presenti nella cappa devono essere ridotte al minimo. Non si devono usare
i becchi bunsen dato che il caldo prodotto dalla fiamma potrebbe danneggiare i filtri ed altro. Tutte le
operazioni devono essere eseguite sul fondo della cappa e non davanti. Tutti quanti gli apparecchi che
vengono messi nella cappa e poi vengono rimossi devono essere disinfettati. Deve essere ridotto al
minimo il passaggio di persone vicino alla cappa per evitare flussi di aria. Alla fine dell'operazione la cappa
deve essere lasciata accesa per almeno 5 minuti per ripulire l'aria.
Se avviene versamento di materiale biologico dentro la cappa non bisogna spegnere la cappa. Bisogna
rimuovere con carta assorbente imbevuta con disinfettante il materiale versato, pulire tutto... Lasciare
infine la cappa accesa per circa 10 minuti.
Supporti e superficie di crescita.

La superficie di crescita importante perch influenza la crescita delle cellule che possono farlo in
adesione o in sospensione all'interno del terreno di coltura. Il supporto che usiamo importante perch
la superficie di crescita influenza l'adesione delle cellule; la loro crescita; la morfologia di una cellula che
pu variare sensibilmente in base al substrato; il differenziamento cellulare che pu dipendere anche dal
substrato.
Tra i vari substrati che possiamo usare abbiamo le fiasche che sono dotate di un tappo a vite che pu
avere o meno un filtro interno che garantisce la sterilit: il tappo non deve essere aperto tranne che sotto
cappa. Per le cellule adese esse crescono sulla superficie in basso coperte dal terreno di coltura. Il tappo
deve essere completamente chiuso se il tappo dotato di filtro mentre se il tappo non dotato di filtro,
quando vengono riposte nell'incubatore, esso va parzialmente svitato per permettere lo scambio di gas.
Le capsule petri sono dotate invece di un tappo che non a chiusura stagna: esse vanno aperte solo sotto
cappa. Abbiamo anche supporti pi piccoli che sono le chamber slides che sono supporti costituiti da un
vetrino coperto da una cameretta che pu essere dotato o meno di un tappo e pu essere suddiviso in
due o quattro sottocamerette: ognuna di queste sigillata rispetto alle camerette adiacenti cosa che
permette di fare analisi contemporanee in diverse condizioni. Quando il trattamento finito la porzione
superiore pu essere rimossa ed avremo alla fine un vetrino in cui avremo cellule adese che possiamo
usare per esprimenti successivi. Vengono usati soprattutto per cellule che dobbiamo studiare adese sul
vetrino.
Le fiasche hanno dimensioni e volumi diversi. Abbiamo fiasche da 25 cm2 da 75 e 125. Le cellule, una
volta raggiunto il grado di confluenza (quando formano un tappeto omogeneo), saranno in numero
differente come per esempio nelle cappe da 25cm2 avremo tra le 2-2,5*106 cellule circa; in quelle da 75cm2
avremo tre volte tanto e cos via. Chiaramente il numero dipende anche dal tipo di cellule che stiamo
coltivando che possono essere grandi o piccole. Il numero di cellule importante da conoscere per vari
motivi: spesso molti esperimenti sono correlati al numero di cellule, ad esempio per sapere quante mg di
proteine o di acidi nucleici possiamo ricavare da quella fiaschetta. Le cellule possono essere rimosse dalle
fiasche tramite gli scrapers per raschiare le cellule dalla superficie e raccoglierle.
Tutti i supporti possono essere sia di vetro che di plastica. Il vetro permette di osservare meglio al
microscopio, carico elettricamente e permette una adesione migliore per alcuni tipi di cellule, resistente
a solventi acidi e basi e non produce effetti di autofluorescenza (ottimo per esprimenti di
immunofluorescenza). La plastica invece pi pratica, ha una buona qualit ottica ed idrofobica. Il
materiale pi usato il polistirene che idrofobico e cattivo conduttore di calore. Esso viene trattano con
radiazioni o sostanze chimiche, o attraverso elettricit per generare delle superfici cariche idrofiliche dove
le cellule possano aderire; questo permette anche alle cellule di legare i fattori di crescita presenti all'interno
del siero. Le superfici possono essere anche pi complesse rispetto a quelle semplici viste prima. Possiamo
avere superfici rivestite da particolari polimeri di polilisina, collagene, fibronectina o matrigel che
permettono una maggiore adesione delle cellule di alcuni tipi particolari. Oltre al rivestimento le superfici
possono anche essere modificate con reagenti chimici o con cariche elettriche.
Esempi:
Le cellule BHK o L929 (cellule polmonari tumorali) sono cellule molto aderenti e quindi crescono su
supporti semplici di plastica. Le cellule di tipo epiteliale sono meno aderenti e necessitano di plastiche
modificate. I neuroni primari sono invece cellule molto poco aderenti e necessitano di un supporto
polilisinato di vetro o di plastica.
I supporti permeabili sono dotati di una membrana che pu essere pi o meno permeabile ad alcune
sostanze. Essi servono per essere inseriti in certe capsule petri per dividere un tipo cellulare nella parte
superiore ed uno nella parte inferiore e studiare ad esempio i meccanismi di interferenza tra i due tipi, di
migrazione cellulare, o anche di influenzamento dato dal rilascio di determinati fattori che sono prodotti

dalle cellule che sono nella parte superiore, quindi anche per studi di ancoraggio dipendente o
indipendente delle linee cellulari. Permettono inoltre alle cellule polarizzate di sviluppare le proprie
attivit. Permettono di effettuare delle coculture tra compartimento superiore ed inferiore e vedere gli
affetti che queste linee cellulari hanno fra loro.
L'ambiente di coltura.
Le richieste di una cellula per vivere fuori da un organismo sono:

anidride carbonica e ossigeno

temperatura controllata

substrato di adesione

mezzo di coltura (mezzo liquido contenente tutte le sostanze per far sopravvivere la cellula)

pH strettamente controllato
Il mezzo di coltura rappresentato da un terreno e siero. La crescita di una cellula assicurata da alcuni
fattori fondamentali. Gli elementi nutritivi di base presenti nel terreno come fonti di zuccheri, AA e sali
minerali. Poi abbiamo fattori di crescita e di adesione presenti nel siero. I mezzi di coltura possono essere
distinti in terreni in cui viene aggiunto il siero (dal 2 al 20%) o terreni sintetici o definiti che contengono
invece fattori di crescita purificati (quindi non contengono siero). Entrambi per devono avere la capacit
di fornire vitamine, minerali, ioni ed elementi per mantenere il metabolismo energetico. Deve poter
mantenere i parametri fisiologici (pH e pressione osmotica) e non deve essere tossico. Il mezzo di coltura
fornisce metaboliti e fattori di crescita per permettere la proliferazione in coltura.
Composizione dei terreni di coltura.
Le sostanze normalmente presenti in un terreno di coltura sono carboidrati (glucosio e galattosio), AA,
tutti quelli essenziali o solo alcuni, ma sempre glutammina che serve come fonte di energia e carbonio
per le cellule e che deve essere aggiunta fresca dato che non stabile per lunghi periodi a temperature
inferiori ai 4 gradi, vitamine che fungono da cofattori enzimatici necessari per la crescita ed il
differenziamento della cellula, sali minerali (sodio, calcio, magnesio e ferro) che regolano l'equilibro
osmotico ed il potenziale di membrana, fungono da cofattori enzimatici e favoriscono l'attacco delle
cellule al substrato, elementi in tracce (selenio), proteine (albumina, fibronectina) che agiscono da fattori
di trasporto (devono essere aggiunti nei terreni senza siero), acidi grassi e lipidi come colesterolo e steroidi
(sempre per terreni sierum free), fattori di crescita (FGF, EGF, interleuchine..), infine antibiotici per
prevenire contaminazioni batteriche (penicilline, streptomicine e gentamicina) anche se per possono
interferire con alcune sostanze.
Ogni terreno di coltura formato da una soluzione salina di base che regola il pH e la pressione osmotica
all'interno delle cellule come soluzione saline a base di fosfati (PBS) o altre. Abbiamo poi terreni di coltura
basali che vengono usati per cellule che non hanno esigenze particolari e che quindi sono in grado di
crescere anche su terreno minimo come il Mem ed il Dimem (terreno un po' pi ricco rispetto al Mem).
Poi abbiamo mezzi di coltura complessi molto pi arricchiti delle sostanze che abbiamo visto come l'Rtmi
ed il Dimem. Esistono anche altri terreni specifiche per colture di insetti.
Il terreno di coltura deve avere dei prerequisiti per mantenere dei parametri fondamentali come la
pressione osmotica ed il pH che deve essere tra 7,2 e 7,4. I terreni hanno un indicatore di pH che il
rosso fenolo. Quando il pH diventa acido il terreno vira sul giallo (vuol dire che le cellule stanno bene
anche se il terreno si esaurito ed stato metabolizzato); quando il terreno vira verso il violetto, pH
basico, vuol dire che le cellule non sono cresciute bene, non hanno metabolizzato: le cellule non stanno
bene. Il rosso fenolo permette quindi di monitorare il pH all'interno di una coltura cellulare.

Al terreno si pu aggiungere il siero che contiene fattori di crescita e di adesione necessari per le cellule.
Il siero di solito fetale e non ha anticorpi (o quasi). Esso, prima di essere utilizzato, viene inoltre
scomplementato inattivando tutte le proteine del complemento incubando la bottiglia a 56 gradi per una
mezz'ora. L'usare il siero ha vantaggi e svantaggi. Esso protegge le membrane e ne garantisce la corretta
viscosit, contiene fattori di crescita ed ormoni che fanno si che la cellula cresca in maniera ottimale,
contiene ferro, lipidi e molecole organiche, favorisce le interazioni tra le cellule ed il substrato, contiene
inibitori della tripsina. Le cellule, una volta che hanno raggiunto il massimo volume (monostrato), devono
essere subcoltivate usando tripsina (che rompe legami tra proteine) che stacca le cellule dal substrato cos
da poterle mettere in una nuova piastra. La tripsina deve per essere fermata nella sua azione: il siero
contiene fattori che inibiscono la tripsina quindi viene aggiunto per fermare la sua azione quando vediamo
che le cellule si sono staccate. Il siero pu anche legare e metabolizzare tossine presenti nel mezzo di
coltura. Per quanto riguarda gli svantaggi esso presenta una possibile tossicit degli anticorpi rimasti nel
siero, la variabilit da un lotto ad un altro che pu cambiare la modalit di crescita delle cellule, ha una
data di scadenza, comporta una difficile standardizzazione dei risultati a causa della variabilit tra un lotto
ed un altro, la presenza dei fattori del complemento o inibitori metabolici, possibile contaminazione di
batteri o altri agenti, infine problemi per il recupero e la purificazione dei prodotti e costo elevato (5 ml
di siero ogni 50 ml di coltura).
Infine vediamo i terreni definiti o sintetici che sono privi di siero. Essi vengono usati per esperimenti
controllati, riproducibili e specifici per un tipo cellulare. I vantaggi di questi terreni sono la riproducibilit
e la standardizzazione degli esperimenti. Esso favorisce anche la coltura di subpopolazioni specifiche di
cellule. Favorisce anche la purificazione dei prodotti a differenza del siero che invece pu interferire. Gli
svantaggi sono invece che le cellule crescono pi lentamente, pi costoso (deve contenere fattori di
adesione, ormoni, inibitori della tripsina), sono diversi e specifici per i vari tipi cellulari quindi servono
pi terreni diversi. Le cellule sono pi sensibili alle condizioni ambientali. L'adesione deve avvenire
necessariamente su piastre trattate con laminina e fibronectina.
Ingegnerizzazione di Cellule per Fini Biotec
Lezione 2, 4/4/08
Libro: Introduzione alle colture cellulari: Metodiche relative, di Mariottini Capicchioni ecc (Morgan
Edizioni Tecniche).
Entriamo nel dettaglio, vedremo quanti e quali tipi di colture cellulari esistono. Abbiamo detto la scorsa
volta che acquisire le nozioni di base per lavorare in un laboratorio di biologia cellulare utile a vari livelli,
qualsiasi specializzazione andremo a prendere; in ogni caso la tecnica delle colture cellulari ad ampio
spettro, utile quindi riuscire a capire cosa sono e come vengono utilizzati i vari tipi di colture.
Dobbiamo distinguere tra le colture cellulari primarie, che sono le cellule che derivano direttamente per
dissociazione di tessuti di varia origine, sia embrionali che adulti. Hanno capacit di replicazione limitata:
resistono per un certo numero di cicli, dopo di che sono destinati a morire. Questa tendenza di perdita di
capacita di replicarsi dovuta dalla senescenza.
Le colture secondarie e terziarie derivano da colture cellulari precedenti (primarie), sono le cosiddette
linee cellulari come la HELA che sono stabili. Derivano da colture primarie, o normali o tumorali. La
capacit di mantenersi si origina anche in seguito a manipolazioni genetiche (immortalizzazione) o sono
cellule tumorali, che gi proliferano in maniera indefinita.
Esistono linee cellulari a vita finita: corredo cromosomico diploide, resistono in coltura circa 50 cicli e
poi decadono, risentono dellinibizione da contatto (le cellule crescono fino a ricoprire formando un
mostrato la superficie di crescita, e arrestano la loro crescita).
Abbiamo linee cellulari continue, che sono immortalizzate o trasformate: capaci di resistere pi tempo in
coltura. Questi processi di trasformazione avvengono o per mutazioni spontanee che le cellule possono
subire oppure possono essere indotte da radiazioni, sostanze chimiche e virus; le linee continue possono

anche essere ottenute direttamente da tumori (cellule tumorali prese e messe in coltura: sono gi
trasformate in vivo). Le linee trasformate non hanno inibizione da contatto, quindi crescono anche
formando mucchietti nel substrato.
Abbiamo anche le linee cellulari clonali che derivano da singole cellule per mitosi: sono linee costituite da
cellule identiche dal punto di vista morfologico e genetico.
In ogni caso bisogna ricordarsi che le cellule mantenute in coltura vanno incontro a un cambiamento:
quando lavoriamo con le colture cellulari ogni tanto dovremo gettar via le cellule arrivate a un certo
numero di passaggi e ricominciare da una coltura pi fresca per eliminare i cambiamenti che subiscono le
cellule, che possono avvenire sia per meccanismi genetici (mutazioni o perdita di cromosomi) sia per
meccanismi epigenetici (metilazione del DNA, acetilazione degli istoni).
Tipi di colture cellulari.
Esistono colture a breve o lungo termine, in riferimento al tempo in cui le linee possono essere mantenute
in coltura: le prime si riproducono e poi muoiono, le seconde si dividono a lungo termine o
illimitatamente.
Abbiamo le colture in monostrato che si dividono fino ad occupare lo spazio disponibile quindi rallentano
per fenomeno di inibizione da contatto oppure si staccano.
Abbiamo anche colture in sospensione: cellule di origine emopoietica che crescono in mezzo fluido,
quindi anche in coltura devono essere mantenute in sospensione.
Le cellule aderenti invece si originano da tessuti solidi, come gli epatociti o i fibroblasti e per crescere
richiedono linterazione di recettori di membrana (integrine) e le proteine adesive sulla superficie delle
piastre da coltura (sia che ciano sup. semplici che trattate in modo da favorire questa interazione).
Si possono anche tenere in coltura 2 linee cellulari: le co-colture, che sono colture diverse coltivate nello
stesso recipiente per simulare un tessuto vero e proprio (cheratinociti e fibroblasti per simulare quello che
avviene in un tessuto).
Abbiamo colture istiotipiche che sono rare e simulano la tridimensionalit usando steroidi o supporti
porosi su cui le cellule si organizzano come in un tessuto. Spesso questo tipo di colture mantenuto in
continua agitazione.
Colture massive: usate quando occorre una gran quantit di cellule, superiore a 10 9, ad esempio per la
produzione di vaccini (ovviamente sono necessari recipienti e laboratori adatti a contenere un numero di
cellule adatto, che non sono coltivate in fiaschette ma in cisterne, i bioreattori).
Colture primarie.
Parliamo nel dettaglio delle colture primarie che originano direttamente da un tessuto. Queste presentano
le propriet differenziali dal tessuto in cui si originano: fibroblasti che producono collagene, cellule
muscolari striate che si fondono a formare fibre, cellule cardiache che si contraggono aritmicamente,
cellule nervose che formano assoni e sinapsi e cellule epiteliali che formano foglietti.
Come si ottiene una coltura primaria: da tessuti adulti, embrionali o da uova. La prima cosa che si fa
prelevare il tessuto di interesse. Si fa una dissezione del tessuto e poi una serie di passaggi per far disgregare
le cellule del tessuto, in quanto un organo ha molti tessuti che devo separare, poi separare i molti tipi
cellulari nel tessuto, sia meccanicamente che per digestione enzimatica, e poi si tratta lomogenato cellulare
ottenuto con tripsina e EDTA per disgregare i contatti tra le cellule e ottenere una coltura priva di tessuti
e priva delle componenti che non devono essere mantenute in coltura, dopodich si procede con la
crescita.

Quindi si preleva il tessuto e viene sminuzzato con degli omogenizzatori (operazione che si fa in un
tampone per mantenere le condizioni osmotiche favorevoli affinch le cellule non vengano rotte); si
ottiene alla fine una sospensione cellulare seminata in un terreno: si ottiene la coltura primaria. Alcune di
queste cellule iniziano ad aderire alla piastra ricoprendola fino a formare un monostrato: le cellule devono
essere prelevate, rimosse, magari con tripsina, solo una piccola aliquota verr piastrata in un terreno fresco
effettuando una coltura secondaria.
Esistono diversi aspetti da tenere conto quando si effettua il prelievo di un tessuto: per prima cosa seguire
principi etici, quindi avere il consenso informato (specie se si tratta di tessuti umani); bisogna lavorare in
condizioni di sicurezza, specie con materiale potenzialmente infetto (quindi sicurezza sia per le cellule che
per loperatore), quindi bisogna lavorare in condizioni di sterilit: sterilizzare con alcool 70% il posto di
lavoro, infine se il prelievo avviene lontano dalla camera di coltura, tenere il tessuto su ghiaccio.
Come ottenere una coltura primaria? Le cellule si possono ottenere per migrazione da un espianto,
selezionando cellule in grado di migrare, oppure per disgregazione meccanica del tessuto, e quindi
selezioniamo le cellule in grado di sopravvivere alla disgregazione, infine per disgregazione enzimatica del
tessuto (di nuovo selezione di cellule sopravvissute alla disgregazione).
Quando si effettua la selezione delle cellule per migrazione? In genere quando i campioni sono molto
piccoli, ad esempio quando si lavora con le biopsie (tessuti molto piccoli), oppure quando si lavora con
tessuti poco adesivi, quindi cellule che sono in grado di migrare, oppure selezionare cellule con capacit
di migrazione come fibroblasti e mioblasti.
Per disgregazione meccanica si disaggrega meccanicamente il tessuto, si passa attraverso un filtro, o
attraverso lago di una siringa, oppure si pipetta ripetutamente, comunque leffetto disgregare al massimo
il tessuto per separare le cellule facilmente. Le caratteristiche di questo metodo che pi rapido, ma
pu causare danni, quindi buono per tessuti soffici come milza, cervello e tumori soffici.
Infine la disgregazione enzimatica, ottenuta per digestione enzimatica della ECM (matrice extra cell.): non
si ha selezione per migrazione, si ottiene una coltura di cellule che sono le pi rappresentative del tessuto
di origine. Si ottiene un numero di cellule elevato in poco tempo e la resa di questa tecnica diminuisce
con let del donatore del tessuto, perch avanzando con let aumenta il connettivo fibroso e saranno
necessari tempi di digestione maggiori che possono provocare problemi per l acquisizione delle cellule.
Gli enzimi usati per questa separazione sono la tripsina o la collagenasi o la pronasi batterica o la dispasi:
tutti hanno attivit di proteasi.
Tripsina.
Lenzima maggiormente usato la tripsina. uno dei primi enzimi usati, se nel caso specifico non
funziona si continua con altri. La tripsina usata in soluzione con EDTA, con temperature di utilizzo 4
o 37C. Il protocollo della tripsina a 4 permette una resa pi alta in cellule e maggiore tasso di
sopravvivenza, in quanto sono evitati danni da esposizione al calore; inoltre la bassa temperatura favorisce
la penetrazione dellenzima con la minima attivit enzimatica e consente la sopravvivenza di un maggior
numero di tipi cellulari, avendo quindi una variabilit nel tipo cellulare. Tripsina a 37: i tempi di
incubazione si accorciano, lazione pi rapida; funziona meglio con tessuti giovani sempre per il discorso
della ricchezza di connettivo che aumenta con let e quindi la probabilit di indurre dei danni aumenta
se uso tessuti pi vecchi perch per disgregare lenzima deve stare pi tempo.
Alcuni tessuti sono resistenti alla tripsina, come il connettivo fibroso, o possono essere danneggiate
(alcune cellule epiteliali) quindi si usano collagenasi per tessuto connettivo e muscolare (la coltura rallenta
ladesione x 48 ore), ialuronidaisi, pronasi e dispasi.
La tripsina ed altri enzimi vengono utilizzati con agenti che chelano il calcio come EDTA, EGTA o
magnesio e che favoriscono la rottura dei legami cellula-cellula e dei legami cellula-matrice.

Separazione di cellule non vitali: le cellule che non hanno resistito a questi passaggi sono morte, quindi
nel caso di cellule che crescono in adesione, al primo cambio di terreno insieme al terreno vecchio
verranno via le cellule che non si sono attaccate al substrato e quindi saranno rimosse; con cellule in
sospensione mano a mano, con i passaggi, le cellule morte si andranno a diluire e saranno ridotte in
numero rispetto alle cellule vitali che cominceranno a proliferare; pi velocemente le cellule morte
possono essere eliminate per centrifugazione ad una velocit che isola le cellule vitali che sono al fondo
della provetta e si elimina il supernatante di cellule morte.
I diversi tipi cellulari invece sono separati con mezzi di selezione: favoriscono la crescita solo di
determinati tipi cellulari, oppure si sfrutta la differenza nella variet di adesione, una aderisce pi
lentamente quindi eliminiamo subito il terreno e togliamo le cellule che non vogliamo (quelle che
aderiscono pi lentamente) utilizzo di diversi enzimi per la dissociazione di un tipo cellulare rispetto a un
altro, oppure utilizzare diversi terreni che favoriscono la crescita di un determinato tipo rispetto a un
altro.
Esistono regole fondamentali quando si lavora con le colture primarie: bisogna
rimuovere il tessuto adiposo e necrotico
spezzettare finemente il tessuto con il bisturi
rimuovere gli enzimi utilizzati per la disgregazione (centrifugazione)
seminare una concentrazione di cellule pi alta rispetto a quella utilizzata nelle sub-colture
utilizzare un terreno molto ricco di nutrienti e siero fetale di bovino
possono essere richiesti fattori di crescita e di adesione
i tessuti embrionali (sempre per la storia dei connettivi) si disgregano pi facilmente di quelli
adulti.
Se le cellule di interesse sono perse a questo stadio, la perdita non recuperabile. Si fanno una serie di
tentativi per individuare la tecnica giusta per isolare le cellule e il terreno da usare.
Monostrato.
Abbiamo detto che le cellule, tranne il caso di tumorali, sono in grado di crescere e ricoprire il substrato
su cui stanno crescendo fino a confluenza. La crescita delle cellule cessa perch arrivano dallambiente
segnali inibitori: sono esauriti i fattori di crescita che noi somministriamo e c' inibizione da contatto che
intervengono nel blocco della crescita delle cellule. Quello che si verifica che le cellule proliferano fino
al grado di confluenza, poi se aggiungiamo terreno fresco in una zona, nella zona in questione c
proliferazione delle cellule.
La crescita in monostrato vera per cellule con inibizione da contatto, ma non per le tumorali: queste
non rispondono all'inibizione e quando raggiungono il livello di monostrato crescono formando
mucchietti. Questa capacit di crescere tanto maggiore quanto la linea tumorale maligna: cellule con
grado di invasivit basso non fanno questo fenomeno, ma magari superano il monostrato di poco e poi
si staccano; cellule altamente trasformate crescono in maniera indefinita.
Riassumendo.
Le cellule in grado di sopravvivere alla disgregazione, di aderire al substrato e proliferare daranno origine
a coltura primaria. Le cellule discendono direttamente dal tessuto di origine, mantengono molte delle
caratteristiche funziona riscontrabili in vivo. Durante la crescita della coltura primaria:
aumentano le cellule attivamente proliferanti

restano stazionarie quelle in grado di sopravvivere ma non duplicarsi


mentre altri tipi di cellule sono incapaci di resistere in coltura

Questo comporta una evoluzione nel tempo delle proporzioni dei diversi tipi cellulari, fino a giungere ad
un equilibrio, notevolmente diverso dalla situazione di partenza. Quando la proliferazione ha ricoperto il
fondo della fiasca, necessario provvedere ad una subcultura in un nuovo recipiente con del terreno
fresco.
C una curva di crescita di cellule in coltura: quando le cellule sono seminate c una fase di latenza in cui
le cellule sono l, non proliferano: le cellule si stanno adattando alle nuove condizioni coltura. Col passare
delle settimane, le cellule proliferano in maniera esponenziale quindi a distanza di giorni dobbiamo fare
subculture della linea cellulare. La coltura primaria, dopo alcune settimane ha senescenza e morte, oppure
trasformazione e da questa coltura primaria possiamo ottenere una linea secondaria, pi stabile.
La senescenza cellulare quando le cellule cessano di proliferare a causa dellaccorciamento dei telomeri,
che sono sequenze ripetitive di DNA e proteine che incappucciano le estremit di ciascun cromosoma. I
telomeri vengono mantenuti grazie allenzima telomerasi: nella maggior parte delle cellule umane il gene
per la telomerasi spento, quindi i telomerasi si accorciano ad ogni divisione fino al punto in cui viene
generato un segnale di pericolo che arresta il ciclo cellulare; in cellule tumorali avviene lattivazione del
gene per la telomerasi e quindi proseguono la replicazione (oltre ad altri geni modificati, quelli del
controllo del ciclo cellulare).
Trasformazione.
Vediamo le linee stabili, le trasformate o immortalizzate, sono quelle usate maggiormente perch non
necessitano ogni volta di ricominciare da capo dal tessuto, con laccortezza di tornare alle cellule da cui si
partiti per evitare delle mutazioni spontanee e quindi anche risultati falsati da queste trasformazioni. La
trasformazione l'acquisizione da parte della linea cellulare della capacit di proliferare indefinitamente
(immortalizzazione) normalmente le mutazioni che portano una coltura cellulare alla trasformazione
riguardano una categoria di geni ben precisi:
della sopravvivenza cellulare
della proliferazione (come del ciclo cellulare, P53 arresto del ciclo cellulare quando il DNA non si
replicato in maniera corretta, o ha subito dei danni)
apoptosi (pro o anti apoptotici)
adesione ed invasivit
stabilit genomica (generalmente questi tipi di mutazioni compaiono abbastanza precocemente)
Quindi limmortalizzazione fa si che si passi da una coltura primaria alle linee cellulari, derivano da colture
secondarie che hanno subito modificazioni che conferiscono alla linea la capacit di replicarsi
indefinitamente. Limmortalizzazione comporta delle alterazioni:
nella morfologia (perdita di antigeni specifici)
nella fisiologia (minori esigenze nutrizionali, perdita di inibizione da contatto)
nel corredo cromosomico (aneuploidia, poliploidia, eteroploidia ecc)
quindi sono meno somiglianti alla linea di provenienza.
Le linee cellulari esistono ormai in numerose banche, come la American Tissue Colture Collection, da cui
possiamo comprare una linea di interesse e usarla per i nostri scopi.

Propriet di crescita delle normali e delle tumorali: le normali crescono in monostrato mentre le tumorali
o trasformate (tramite chimica o virus) crescono in masse a pi strati.
Le linee cellulari di origine emopoietica crescono in sospensione senza aderire alla piastra di coltura:
la sospensione pu avvenire in condizioni statiche o in continua agitazione
normalmente le cellule vengono fatte crescere in condizioni statiche in fiasche ( preferibile in
quanto il volume di crescita nelle fiasche maggiore)
il sistema in agitazione si usa per crescere maggiori volumi di cellule
anche in sospensione le cellule crescono fino ad una densit massima oltre la quale si arrestano (il
terreno di coltura di esaurisce quindi anche qui prendiamo un piccolo numero di cellule e lo
trasformiamo in una nuova fiasca)
per capire quando si raggiunta la densit massima necessario contare le cellule e capire quanto
la densit per ml di coltura cellulare provvedendo alla subcultura
lamplificazione si ottiene diluendo le cellule in terreno fresco (ed pi semplice per le cellule in
sospensione che per quelle in piastra, ovviamente)
Le colture di cellule aderenti che crescono fino a occupare tutta la superficie disponibile si dicono, a
questo stadio, confluenti. Il tempo necessario alle cellule per duplicarsi di circa 20-24 ore per le cellule
animali e 24-30 ore per le umane, questo un parametro di cui bisogna tenere conto: quando semino un
X cellule devo considerare quando si arriver alla confluenza, in cui la crescita si arresta e le cellule devono
essere staccate e trasferite in nuove piastre.
Il protocollo di trasferimento prevede lutilizzo di tripsina con chelanti (EDTA perch Ca2+ e Mg2+ sono
indispensabili per ladesione) avvenuto il distacco lazione dellEDTA e della tripsina viene bloccata
dallaggiunta di un nuovo mezzo di coltura che contiene cationi divalenti in eccesso ed inibitori della
tripsina (contenuti nel siero); le cellule vengono quindi contate e seminate in nuove piastre.
Sia per cellule in sospensione che in adesione pratica comune la conta cellulare, fondamentale sia perch
non bisogna seminare troppe cellule, ma anche perch le cellule non devono essere seminate sotto una
certa densit perch non crescono in maniera efficiente, e perch mancano segnali di interazione cellula
cellula che favoriscono la proliferazione; bisogna anche rendersi conto di quando bisogna staccare le
cellule e fare subcultura, perch le cellule arrivate a confluenza si staccano dal fondo e muoiono; bisogna
quindi staccare bene tutte le cellule e non fermarsi solo a quelle che si staccano subito per evitare di
selezionare una sottopopolazione di cellule meno aderenti; bisogna poi distribuire le cellule nella nuova
piastra in modo uniforme (si fanno degli spipettamenti in modo da seminarle uniformemente e evitare
linibizione da contatto di cellule che troppo raggruppate non prolifererebbero sullintera piastra) e evitare
di staccare contemporaneamente diverse linee cellulari (per evitare rischi di cross contaminazione).
Conta cellulare.
una metodica importante negli esperimenti e nel mantenimento della coltura. Per contare le cellule si
usa la camera di Neubauer, formata da un vetrino coprioggetto, una camera di conta e da un supporto che
la parte sottostante. Quello che si fa che quando si mette una aliquota di cellule nella camera, si contano
al microscopio e si osserva che la camera suddivisa in 9 quadranti pi grandi, ognuno suddiviso in 16
pi piccoli. Quello che si fa che si prende una aliquota delle cellule e si fa passare per capillarit, solo
appoggiando la punta sulla cameretta, allinterno della cameretta stessa. Le cellule una volta seminate nello
spazio tra il supporto sotto e il vetrino andranno a disseminarsi nei quadranti. Si procede allosservazione
al microscopio, si osserva il numero di cellule sparse nei quadranti.

Si deve scegliere di contare le cellule presenti in una determinata area, di solito di 1mm2, che lo spessore
tra il supporto di base e il vetrino coprioggetti. Non si contano tutti e nove i quadranti, di solito tre
quadranti e si fa una media delle cellule che si contano. Normalmente il numero di cellule che si piastrano
per colture di routine sono 100-300 cellule/mm2, invece per esperimenti quantitativi sono tra 500-1000
cell/mm2. Ogni quadrante della camere delimitato da tre linee: le cellule posizionate sulle righe si sceglie
di includere nel conteggio quelle su due delle linee e escludere quelle fuori (solo su due facce del
quadrante).
C

n
v , che per definizione 10-4 ml, numero che

La concentrazione cellulare, dato da cell/ml, dato da


deriva dal fatto che lo spessore della cameretta 0,1 mm, larea contata 1,0 mm2, quindi larea 0,1 mm3
n
C 4
10 ml. Cos abbiamo il numero di cellule per ml, per sapere le cellule totali dobbiamo
quindi

moltiplicare il numero ottenuto per gli ml totali per la diluizione:


4
C

10

ml
totali

diluizione

Esempio: contare le cellule presenti in 10 ml di terreno.


Si prendono 20 microlitri di sospensione cellulare e si aggiungono 40 microlitri di terreno effettuando una
diluizione di 1 a 3. si contano le cellule presenti nei quadranti A, B, e C. Contiamo 471 cellule, facciamo
la media dividendo per tre e abbiamo 157 cellule. Quindi C dato da numero di cellule per ogni quadrante
quindi 157 104 10 ml che il volume di terreno da cui siamo partiti, che avevamo nella fiasca, 3
che il fattore di diluizione che abbiamo fatto inizialmente: si ottiene il numero di 47.1 milioni di cellule.
Quando si vanno a contare le cellule ci saranno cellule vive e cellule morte. Per discriminare tra cellule
vive e morte si usa il tripan blu, che viene assunto solo dalle cellule morte che hanno subito alterazioni
della permeabilit di membrana che ne permette lingresso. Per discriminare tra le vive e le morte quindi
nel terreno mettiamo il tripan blu: osserveremo una serie di cellule vitali non colorate e un certo numero
di cellule (che deve essere basso se la coltura in buone condizioni) assume il colorante blu intenso. A
questo punto il numero di cellule che contiamo deve essere solo quello delle vitali, le morte non si
contano.
La percentuale di vitalit la frazione tra le cellule vitali e le cellule totali, cos da avere una idea del tasso
di mortalit nella coltura.
Esistono ad oggi dispositivi automatici per la conta delle cellule, usati nei laboratori di analisi.
Protocollo:

pulire camera di Neubauer e vetrino coprioggetto con alcool 70%

inumidire i bordi del coprioggetto con un goccio dacqua per favorire ladesione del vetrino sul
supporto sottostante

spingere con fermezza il coprioggetto sulla camera per farlo aderire saldamente

tripsinizzare le cellule da esaminare e preparare una soluzione omogenea

trasferire unaliquota nella camera di Neubauer con una micropipetta con il colorante e fare in
modo che il fluido per capillarit riempia la camera

eliminare il fluido in eccesso

sistemare la camera sotto il microscopio (obiettivo 4-10x questo permette di visualizzare lintera
area di conta)

verificare che ci sia una distribuzione uniforme di cellule in tutta larea di conta

si contano le cellule in almeno 3 quadranti (si fa una doppia conta)

si fa la media.

Peso cellulare:
Non si tiene molto in considerazione nella conta delle cellule.
Ing. delle cellule animali

Condizioni di sterilit e contaminazioni

Lezione 3 del 18.04.08

La sterilit un prerequisito in tutte le fasi di una coltura e per ogni tipo di coltura. I terreni che si
utilizzano quando si lavora con le colture cellulari costituiscono un substrato ottimale non solo per le
cellule ma anche per i microrganismi che contaminano le colture cellulari. Bisogna quindi prevenire le
contaminazioni o, nel caso in cui si verificano, cercare di eliminarle.
I rischi di contaminazione per le colture cellulari li troviamo a vari livelli. Nelle colture primarie i campioni
che derivano da soggetti umani o animali sono di per se a rischio di contaminazione proprio perch
derivano da un organismo intero e quindi possono portare con se eventuali agenti patogeni o infettanti
gi presenti nei campioni di partenza. Altre fonti di contaminazione sono le modalit con cui allestiamo
una coltura cellulare: in tutte la fasi bisogna stare attenti ad evitare di portarsi dietro agenti contaminanti.
Molti reagenti che si usano per lavorare con le colture sono di origine animale e quindi possono essere
veicolo di contaminazioni (es. il siero). I laboratori spesso non sono idonei per la coltivazione delle colture
cellulari perch anche se esistono delle regole generali frequentemente si hanno difficolt di natura pratica.
Si cerca quindi di mantenere le condizioni sine qua non ma spesso bisogna scendere a compromessi dovuti
dalla struttura e dal personale che ci lavora. Il personale spesso poco addestrato dato che certe volte
l'accesso consentito anche ad altre persone come tirocinanti o tesisti. Infine abbiamo l'uso sistematico
di antibiotici per le colture cellulari. Quando per si fa un uso troppo vasto di antibiotici si selezionano
ceppi resistenti che, quando si verifica la contaminazione, non sono facili da radicare: quindi l'uso degli
antibiotici deve essere limitato solo per colture cellulari delicate, importanti o difficilmente reperibili.
Le contaminazioni possono essere:
Di tipo chimico, come residui di detergenti e disinfettanti o anche la presenza di impurit o tossine
presenti nell'acqua che si usa nelle normali procedure di laboratorio.
Di tipo biologico, come contaminazioni derivanti da microrganismi che vanno a contaminare la
coltura o anche contaminazioni derivata da altre cellule come nel caso delle cellule Hela che hanno
una velocit di duplicazione molto elevata rispetto alle altre cellule. Quello che deve essere tenuto
presente che nessuna di queste due contaminazioni pu essere eliminata al 100% ma si pu
tenere sotto controllo.
I microrganismi contaminanti possono essere batteri, che sono la contaminazione pi diffusa; i miceti
(muffe o lieviti); i virus, anche se in questo caso la contaminazione abbastanza rara; infine possiamo
avere contaminazioni da micoplasma, una delle pi frequenti contaminazioni che si hanno quando si
lavora con le cellule.
I rischi di contaminazione derivano quindi sia dal donatore (nel caso delle colture primarie) sia
dall'operatore e dal laboratorio.
Norme precauzionali per la riduzione ed eliminazione delle contaminazioni.
Al momento del prelievo bisogna stare attenti a lavorare in condizioni di sterilit perch il primo passo
di possibile fonte di contaminazione; durante la preparazione delle cellule stesse; anche nella coltivazione
bisogna sempre e comunque mantenere condizioni che tengano sotto controllo le contaminazioni.

Contaminanti.
I virus sono una contaminazione rara e sono contaminazioni difficilmente riconoscibili (tranne se
determinano effetto citopatico, ovvero le cellule vanno incontro a lisi). I virus possono anche integrarsi
nel genoma dell'ospite e possono quindi trasmettersi alle cellule figlie sempre senza dar segno di ci. Virus
di derivazione umana o animale, come i retrovirus ed il virus di SV40, non sono considerati dei
contaminanti perch convivono all'interno delle cellule senza dare alcun problema, quindi senza alterare
morfologia e metabolismo delle cellule. Talvolta possono essere usati per la trasformazione di cellule di
colture primarie in colture stabilizzate.
I batteri invece sono facilmente individuabili e visualizzabili in una coltura cellulare. Una contaminazione
di tipo batterico alla fine porta alla morte delle cellule. I pi comuni batteri che possiamo ritrovare come
contaminanti delle colture cellulari sono soprattutto gram positivi come vari tipi di staphylococcus che
sono naturalmente presenti nell'epidermide, nell'apparato digerente, nelle mucose. Anche gli
streptococchi sono spesso presenti nelle colture soprattutto quelli di tipo emolitici. Quando ci
accorgiamo di una contaminazione batterica bisogna disfarsi della coltura e buttar via tutto ricominciando
da capo.
Anche i funghi sono facilmente visualizzabili e riconoscibili tramite osservazione al microscopio, possono
essere unicellulari come i lieviti o pluricellulari come le muffe. La candida albicans uno dei funghi che
pi spesso infetta le colture cellulari. I funghi possono essere eliminati dalle coltura utilizzando specifici
farmaci antimicotici, ma se la coltura non preziosa meglio ricominciare da capo l'esperimento.
Infine abbiamo i micoplasmi che sono uno dei problemi pi grandi. Effettuano una contaminazione
insidiosa con effetti a lungo termine. Tutti i risultati che si ottengono con una coltura cellulare infettata
dai micoplasmi vanificano ogni risultato sperimentale.
Gli effetti che i micoplasmi provocano sulle cellule sono:
Le cellule cominciano a crescere meno, la loro capacit di proliferazione rallenta (primo segnale
che qualcosa non va).
Alterazioni morfologiche nelle cellule.
Aberrazioni cromosomiche (come anche taglio del DNA in vari frammenti).
Alterazioni metaboliche sia a livello del metabolismo degli AA che degli acidi nucleici.
Tutte modificazioni che falsificano la sperimentazione.
Le contaminazioni inter-cellulari si hanno soprattutto con le cellule Hela che sono cellule particolari.
Questa contaminazione abbastanza frequente e subdola. Necessita di test di tipo cariotipico per
identificare la contaminazione di un'altra linea cellulare.
Contaminazioni da parte di batteri e micoplasmi.
La contaminazione da parte di batteri e micoplasmi quella che causa pi problemi ai biologi cellulari.
Essa probabile che avvenga ma non deve essere frequente. E' importante identificare l'origine ed il tipo
di contaminazione con cui abbiamo a che fare per poter arginare una eventuale epidemia. I batteri
effettuano una contaminazione visibile e, nell'arco di 24-48, subito uno se ne accorge. In presenza di
moltissime contaminazioni di vari tipi di batteri si ha una variazione del pH dei terreni di coltura. Come
abbiamo gi visto, nel terreno di coltura si aggiunge una sostanza in grado di virare di colore a seconda
del pH del mezzo. Nel caso di una infezione da batteri si ha un forte abbassamento del pH ed il colore
del terreno di coltura diventa completamente giallo. Se la fiasca completamente gialla qualcosa non
andata bene. La variazione di pH si ha anche con contaminazioni da parte di lieviti ma non marcata come
nel caso dei batteri. A volte avviene invece un innalzamento del pH in presenza di funghi. Accanto alla
variazione del pH si pu osservare anche una torbidit del terreno, un aspetto granulare e sabbioso che

indica la presenza di agenti esterni. Non appena abbiamo rilevato una eventuale contaminazione grazie
alle osservazioni viste prime, possiamo osservare al microscopio la nostra coltura per avere una eventuale
conferma di contaminazione. Al microscopio, nel caso dei batteri, si possono vedere forme a cocchi o
bastoncelli mobili; i lieviti appaiono come particelle rotonde ed ovali mentre i funghi come filamenti che
possono presentare anche spore. La morfologia dei contaminanti quindi regolare e spesso essi sono
mobili.
La contaminazione da micoplasmi una delle principali. Essi sono i pi piccoli microrganismi in grado
di autoreplicarsi. Essi sono molto piccoli e al microscopio non si vedono. Non hanno parete cellulare e
quindi sono ultrafiltrabili, cio passano attraverso i filtri. Sono correlati ai gram negativi ed hanno limitate
capacit biosintetiche cosa che altera il metabolismo della cellule per alimentarsi. Essi spesso passano
inosservati al microscopio ottico, non rendono i terreni torbidi quando sono liquidi e non si rilevano con
test di sterilit routinari. Essi sono ultrafiltrabili con filtri da 0,22 micron.
Sulla coltura cellulare gli effetti sono una riduzione del tasso di proliferazione cellulare perch sfruttano
le risorse delle cellule per sopravvivere: quindi impoverimento di AA essenziali soprattutto arginina dal
terreno di coltura. Essi provocano alterazioni dal punto di vista morfologico ed anche il distacco delle
cellule ma solo per contaminazioni avanzate. Provocano un'alterazione della sintesi di DNA, RNA e
proteine, provocano aberrazioni cromosomiche ed alterazioni della composizione della membrana. Tutti
questi effetti sono incompatibili con la possibilit di continuare a lavorare con una coltura infettata.
Si stima che circa il 10-85% delle colture cellulari sono infettate da micoplasmi. Bisogna fare quindi dei
test per analizzare la contaminazione. Alcuni micoplasmi sono difficilmente eliminabili dato che non
esiste una cura specifica contro i micoplasmi. La maggior parte dei micoplasmi di origine umana ma
anche di origine bovina e suina (terreni e sieri di origine animale). Nell'uomo abbiamo quattro specie
principali che sono caratteristiche di vari apparati come quello urogenitale e respiratorio. Alcuni di questi
hanno un certo grado di patogenicit mentre altri sono solo commensali. Le specie di origine bovina e
suina sono invece legata all'uso del siero che pu essere contaminato. Per quando riguarda al
contaminazione derivata dai suini questa contaminazione non stata accertata ma si pensa che in realt
derivi dal fatto che bovini e suini sono allevati insieme dato che dai suini si prende solo la tripsina.
Metodi di ricerca dei micoplasmi contaminanti:
Metodi morfologici con microscopio elettronico dato che sono molto piccoli.
Metodi di colorazione specifica degli acidi nucleici con dei fluorocromi che sono l'Hoechst ed il
DAPI che permettono di rilevare agenti contaminanti riconducibili ai micoplasma perch si rileva
materiale genetico fuori dal nucleo, nel citoplasma. Si vede subito che in cellule contaminate dal
micoplasma il colorante, oltre che nel nucleo, si trova anche nel citoplasma. Questo metodo
poco sensibile.
Metodi immunologici: test elisa immunospecifici che sono pi lunghi e pi costosi.
Metodi di biologia molecolare tramite pcr con primer specifici con DNA ribosomale 16S. Questa
tecnica ci permette di individuare meglio il tipo di contaminazione con facilit.
Quando il test risulta positivo si tenta, per cellule importanti, di curarle mentre nel caso si tratta di cellule
che abbiamo acquistato o di cui abbiamo riserva conviene sostituirle. La cura quindi difficile nel caso di
batteri e funghi mentre nel caso dei micoplasmi si pu effettuare un trattamento con farmaci appropriati.
Per i virus bisogna disfarsi delle cellule.
Esistono tre gruppi di molecole per curare le contaminazioni dei micoplasmi:
Macrolidi e tetracicline che agiscono sulla sintesi proteica inibendola legandosi alle subunit ribosomali.
Queste sostanza fanno parte del prodotto BM ciclina. Abbiamo poi i chinoloni che inibiscono la
replicazione del DNA agendo sulle DNA girasi.

Se le cellule sono importanti e devono per forza essere mantenute, seppure infettate, si pu quindi
effettuare un trattamento con chinolone o BM ciclina (per un paio di settimane). Poi si fanno dei test (es.
PCR) per vedere se la cura riuscita. Se il test risulta positivo (quindi c' ancora contaminazione) si vede
a cosa resistente il micoplasma per sostituire l'antibiotico. La percentuale di successo abbastanza alta.
Le fonti di contaminazioni sono quindi: operatori; aria ambientale; recipienti; liquidi per colture;
trasmissione della contaminazione per aerosol da una coltura ad un'altra.
Come prevenire la contaminazione.
- Evitare di aggiungere antibiotici di routine per evitare di selezionare ceppi resistenti.
- Non pipettare mai a bocca (ormai ci sono i pipettatori automatici).
- Non mangiare, bere, fumare in laboratorio e non parlare durante la manipolazione della coltura su cappa.
- Accurata pulizia delle manie e delle superfici.
- Tenere in quarantena qualsiasi materiale sospetto ed eliminare quello infetto per evitare di contaminare
anche altre colture.
- Utilizzare materiale monouso sterile e strumenti sterilizzati.
- Utilizzo di soluzioni e terreni sterili.
- Manipolare tutto nella cappe a flusso laminare.
- Saggiare il funzionamento delle attrezzature come autoclavi, stufe e distillatori.
- Monitorare i terreni di coltura, la tripsina ed i sieri. Quando si fa lo stoccaggio del siero, se non lo si fa
in condizioni di assoluta sterilit, chiunque va ad utilizzare quella aliquota avr una coltura contaminata.
- Non fare entrare in laboratorio estranei e non addetti al lavoro.
Metodi per sterilizzare.
La sterilizzazione in grado di uccidere la maggior parte dei germi, sia quelli patogeni che quelli non
patogeni, anche agenti che possono fare spore resistenti.
Abbiamo una sterilizzazione per filtrazione con vari filtri come quelli a siringhe, per sterilizzare volumi
piccoli da 1 a 100 ml, o filtri a caffettiera per sterilizzare volumi che arrivano fino ad un litro. La
sterilizzazione si pu fare anche con raggi UV efficaci per le superfici esposte agli UV dato che
danneggiano il DNA. Altra sterilizzazione quella mediante calore che altera la struttura delle
macromolecole inibendo le funzioni essenziali dei microrganismi. Alcune specie per non sono
eliminabili da queste metodiche come quelli che producono spore. Il calore viene utilizzato in
concomitanza ad un ambiente umido sotto forma di vapore saturo sotto pressione che quello migliore.
La sterilizzazione pu essere effettuata tramite autoclavi per materiali che non sopportano temperature
maggiori di 160 gradi (es. plastiche e terreni). La durata generalmente di 15-20 minuti. Sopra il materiale
da sterilizzare si mette del nastro adesivo che a temperature superiori ai 120 gradi cambia di colore
permettendoci di avere una conferma della sterilizzazione. La sterilizzazione a secco si usa invece per la
vetreria per temperature superiori di 160 gradi per 2 ore circa o pi. Anche qui si usa un nastro specifico
di rilevazione. Infine abbiamo i detergenti e disinfettanti per le mani che hanno una attivit germicida per
lungo tempo e ad ampio spettro oltre a non essere tossici o irritanti per l'operatore.
Norme di sicurezza nel laboratorio di colture cellulari.
Definizione di agente biologico: qualsiasi microrganismo, anche geneticamente modificato, una coltura
cellulare o un endoparassita umano che potrebbero provocare infezioni, allergie o anche intossicazioni.
Per microrganismo si intende un'entit microbiologica, cellulare o meno, in grado di riprodursi e trasferire
materiale genetico.
Coltura cellulare: il risultato di una crescita in vitro di cellule derivate da organismi pluricellulari.

Valutazione della pericolosit di un agente biologico:


- Infettivit: ovvero la capacit di resistere alle difese dell'ospite per replicarsi nell'organismo stesso.
- Patogenicit: capacit di produrre malattia.
- Trasmissibilit: ovvero la capacit di essere trasmesso da un soggetto infetto ad un soggetto sano.
- Neutralizzabilit: disponibilit di misure per contrastare la proliferazione dei microrganismi e quindi
misure profilattiche per prevenire o curare un'infezione.
I fattori di rischio a cui siamo esposti possono essere cellule intere che sono fonte di rischio perch spesso
le colture cellulari sono di natura umana. Spesso pu verificarsi un'infezione da parte di cellule. Agenti
causali come batteri e funghi possono contaminare le colture e poi infettare l'operatore. Retrovirus ed
agenti nucleici possono essere fattori di rischio per l'operatore. Contaminanti microbici, endotossine
batteriche, proteine, antibiotici, solventi (che possono essere tossici), composti di lavaggio, induttori e
nutrienti presente nei terreni di coltura.
Aerosol.
Una delle possibili fonti di contaminazione per le cellule e gli operatori l'aerosol. Esso un importante
veicolo di infezione che si origina per via area per quei microrganismi che sono capaci di trasmettersi per
via area e possono colonizzare l'apparato respiratorio sia come fonte di ingresso che come fonte di
passaggio: ad esempio streptococchi, agenti eziologici della rabbia e della mononucleosi. Il materiale che
si allontana dalle vie respiratorie forma delle goccioline di diametro variabile fino a mille micron sotto
forma di aerosol che si disperde con l'aria; questo materiale pu rimanere in sospensione anche per molto
tempo. Queste goccioline vengono anche dette dropplet o nuclei. Il tempo di sopravvivenza dei
microrganismi presenti nelle goccioline importante soprattutto per quei microrganismi che hanno un
meccanismo di trasmissione tramite aerosol. Alcuni microrganismi non sopravvivono con questa
trasmissione (E. coli ad esempio sopravvive solo per il 10% quando passa all'interno di queste goccioline)
mentre un altro agente, come il M. tubercolosis, essendo dotato di una protezione cerosa, molto pi
resistente e circa il 90% di questi microrganismi pu sopravvivere nella fase di dropplet. Questi
microrganismi possono quindi disperdersi nell'aria e, una volta che entrano a far parte del nucleo della
gocciolina, se sono posizionati in condizioni di assenza luce e con certe condizioni di temperatura e di
umidit possono sopravvivere per molti mesi. Alla luce invece questi tipi di microrganismi vengono
facilmente debellati.
Un'altra modalit di trasmissione sempre per via aerea legata alla sospensione di materiale essiccato e
quindi di polveri. Le goccioline, una volta essiccate, possono sedimentare sul pavimento e poi essere
rimesse in sospensione da varie cause. Queste polveri prendono il nome di particelle aerogene secondarie.
Il tipo di infezione dipendente da queste particelle varia in base alla resistenza all'essiccamento degli agenti
contaminanti stessi.
Le fonti di contaminazione area sono quindi la trasmissione diretta tramite aria da un individuo infetto
ad uno sano tramite contatto di goccioline umide; la trasmissione indiretta attraverso le goccioline tramite
aerosol che consente una diffusione anche a distanza; infine la trasmissione tramite risospensione di
polveri che possono depositarsi sulle superfici e sui pavimenti.
Il bioaerosol si pu formare durante tutte le operazioni comuni in laboratorio ed una delle cause
principali di contaminazione ambientale dei laboratori, soprattutto quando si lavora con agenti che si
diffondono bene per via aerea. Le operazioni che possono generare bioaerosol possono essere: l'apertura
di contenitori, l'utilizzo di agitatori, scuotitori, frantumatori di cellule, centrifughe, pipettamento e
siringhe. La flambatura di anse e aghi (tramite becchi bunsen) pu provocare anche la diffusione a distanza
di germi che possono sopravvivere al calore. Quando si manipolano colture batteriche, le finestre possono
favore la dispersione di microrganismi ad alta distanza.

Prevenzione.
Per evitare quindi la dispersione dell'aerosol bisogna lavorare in una cabina di sicurezza (cappa di adeguato
livello di sicurezza). Quando si sotto cappa bisogna usare gli strumenti come centrifughe e sonicatori
mettendoli sul fondo della cappa per non far fuoriuscire dalla cappa particelle di varia natura. Usare delle
bottiglie dotate di tappo a vite o chiusura ermetica. Gli strumenti che sono utilizzati in laboratorio devono
essere progettati per evitare perdite. Evitare di far fuoriuscire liquidi o sostanze dai supporti o dalle fiasche
in maniera da non provocare la fuoriuscita di questi bioaerosol. Eliminare i rifiuti in bidoni a chiusura
ermetica. Decontaminare le superficie usate e non lasciare aperti sacchetti con materiale da sterilizzare.
Usare dispositivi di sicurezza come mascherine, cuffie per capelli, visiere, guanti ed occhiali protettivi per
gli occhi.
Norme comportamentali.
Sono semplici ma non sempre adottate. Bisogna lavarsi le mani sia quando si entra che quando si esce.
Usare guanti di protezione. E' obbligo l'uso di camici o grembiuli di protezione: ci sono camici riutilizzabili
e camici monouso. Maschere, occhiali e coprifaccia vengono indossati quando si effettuano procedure
che espongono la mucosa orale, il naso o la congiuntiva a determinate sostanze.
Altre precauzioni sono l'usare le cappe biologiche sia per le colture cellulari che per sostanze chimiche.
Usare materiale monouso. Per la vetreria essa deve essere ogni volta decontaminata prima di essere
sterilizzata. I piani di lavoro, come cappe o banconi di laboratorio, devono essere disinfettati con sostanze
a base di cloro e puliti accuratamente. Le attrezzature anche loro vanno pulite e decontaminate dopo ogni
uso. Esistono in ogni laboratorio dei contenitori per lo smaltimento di rifiuti speciali. Ci sono contenitori
di piccolo taglio (es. eliminare aghi e siringhe) e contenitori di grande capacit in cui vanno messi tutti i
rifiuti speciali di laboratorio soprattutto quelli delle colture cellulari che poi vengono smaltiti da una ditta
apposita.
Esistono anche delle norme di pulizia generale. Si usano dei saponi che permettono di eliminare gli agenti
biologici ed effettuare un'azione detersiva e sgrassante ottenendo l'allontanamento di microrganismi dalle
superfici e dalla pelle. La detersione si effettua con detergenti usati manualmente. In certi casi esistono
anche apparecchiature automatiche. Tutto il materiale pulito va poi asciugato. Gli strumenti usati devono
essere lavati e disinfettati e si lavano spesso con sostanze a base di cloro. Alcuni disinfettanti che si
utilizzano per la pulizia di banconi a materiale hanno un'azione anche battericida ma la maggior parte
per non li elimina tutti. Il cloro quello pi usato ed attivo contro tutti i microrganismi.
Quando c' una esposizione accidentale con materiale biologico (es. puntura con un ago o un taglio)
bisogna aumentare il sanguinamento e lavare abbondantemente con acqua e sapone, procedere con la
disinfezione della ferita con un preparato a base di cloro. Nel caso del cavo orale si fanno sciacqui a base
di cloro. Per le congiuntive si sciacqua abbondantemente con acqua. Eventualmente ci si reca al pronto
soccorso per accertamenti.
Molte delle apparecchiature che si usano in laboratorio hanno delle buone norme di utilizzo. Per le
centrifughe bisogna minimizzare al massimo l'uso del freno. Usare se possibile provette con tappo a vite
per evitare fuoriuscita di materiale nel corso della centrifugazione. Non riempire le provette fino all'orlo.
Bisogna ispezionare di routine i rotori e controllare se c' sporcizia o vetri rotti. Non mettere mai le
centrifughe sotto le cappe a flusso laminare perch potrebbero provocare dei rischi. Quando ci si accorge
che nelle centrifughe c' stato uno sversamento di materiale cellulare bisogna usare dei guanti resistenti
ed il camice, rimuovere i residui di vetro ed eliminarli, assorbire tutto il materiale uscito tramite carta
assorbente ed eliminarlo in bidoni speciali. Pulire con detergente, disinfettare e infine asciugare la
centrifuga. Anche i frigoriferi devono essere tenuti sotto controllo. Devono essere sbrinati
periodicamente, bisogna identificare i contenitori con delle etichette e far sempre riferimento alla data di
scadenza del prodotto. Non bisogna mischiare dei campioni biologici con reattivi di varia natura. Non
conservare cibi e bevande insieme a materiale di lavoro.

I rifiuti considerati speciali sono sicuramente i solventi, sia acidi che basi e coloranti, tutte le sostanze che
contengono agenti biologici sia infettivi che non. I materiali radioattivi che hanno contenitori appositi e
contenitori per la raccolta differenziata (es. per il vetro). Soprattutto nei laboratori sanitari ci sono rifiuti
pericolosi che contengono materiale infettivo che vanno gettati in contenitori speciali come anche
materiali medici diagnostici. Nel trattamento degli animali stessi essi vanno smaltiti a parte, sia per i
cadaveri che per parti anatomiche.
Vediamo quali sono i divieti: non bisogna mescolare rifiuti speciali e tossici con rifiuti normali; non
bisogna stoccare i rifiuti al di fuori dei depositi appositi; non bisogna mescolare sostanze di vetro o
materiale cartaceo con sostanze chimiche o sostanze venute in contatto con liquidi biologici.