PRINCIPI E METODI PER LA DIAGNOSI DI

LABORATORIO DELLE MALATTIE

DA INFEZIONE

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OBIETTIVI DELLA DIAGNOSI DI
LABORATORIO DI INFEZIONE:

DIMOSTRAZIONE DELLA PRESENZA

NEL CAMPIONE BIOLOGICO DEL
MICRORGANISMO/VIRUS O DI SUOI
COMPONENTI E SUCCESSIVA
IDENTIFICAZIONE
(DIAGNOSI DIRETTA)

DIMOSTRAZIONE NEL SIERO/PLASMA

DI UNA REAZIONE ANTICORPALE
SPECIFICA NELL’ORGANISMO
(DIAGNOSI INDIRETTA)

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INDAGINI DIAGNOSTICHE CONVENZIONALI
PROCEDIMENTI CHE NON POSSONO ESSERE CONDOTTI NELLE
PRIME FASI DELLA MALATTIA POICHE’ COMPORTANO
UN’ESECUZIONE O UN COMPLETAMENTO DI DURATA SUPERIORE
ALLE 24 ORE

INDAGINI DIAGNOSTICHE RAPIDE

PROCEDIMENTI CHE POSSONO ESSERE CONDOTTI NELLE PRIME
FASI DELLA MALATTIA E CHE COMPORTANO UN’ESECUZIONE E UN
COMPLETAMENTO DI DURATA INFERIORE ALLE 24 ORE

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PERCORSO DIAGNOSTICO
 PERCORSO DIAGNOSTICO

Fase PRE-ANALITICA:
– prescrizione medica
– prelievo del campione biologico
– conservazione del campione
– trasporto del campione
– accettazione del campione
- eventuale preparazione del campione (es. centrifugazione)

Fase ANALITICA:
– esecuzione dell’esame diagnostico
– validazione dell’esito

Fase POST-ANALITICA:
– refertazione dell’esito
 PRESCRIZIONE MEDICA

 Dati anagrafici del paziente

(sesso, data di nascita, codice fiscale)
 Tipo di campione
(distretto anatomico del prelievo)
 Data e ora della raccolta del campione
 Quesito diagnostico
 Esame/i da eseguire sul campione
 Nome del medico richiedente
 Terapia antibiotica, dispositivi protesici,…
PRELIEVO DEL CAMPIONE BIOLOGICO

INVIO DEL MATERIALE GIUSTO PRELEVATO AL

MOMENTO GIUSTO!!!
- SOSPETTO CLINICO
- LOCALIZZAZIONE DELL’INFEZIONE
- PATOGENESI

IN CASO DI SOSPETTO DI INFEZIONE GENERALIZZATA, IL

MICRORGANISMO/VIRUS VA RICERCATO IN DIVERSI CAMPIONI
PRELEVATI DA DIFFERENTI SEDI ANATOMICHE

IN GENERE, LA MAGGIOR DENSITA’ DI MICRORGANISMI/VIRUS E’

RISCONTRABILE ALLA COMPARSA DEI SINTOMI
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PRELIEVO DEL CAMPIONE BIOLOGICO

Tracciabilità del campione e della prescrizione

(ETICHETTA CON CODICE A BARRE)

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 Il prelievo del campione biologico

 prima della terapia antibiotica

 durante e nella sede dell’infezione
 utilizzo di presidi sterili e di tecniche asettiche per
evitare le contaminazione
 quantità sufficiente!!!!
PRELIEVO DEL CAMPIONE BIOLOGICO

- Campioni raccolti direttamente dal paziente (es. urine,

feci..) che deve essere informato sulle modalità in base
a quanto riportato nelle linee guida

- Campioni prelevati da personale sanitario specializzato

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 Contenitori sterili per campioni biologici

N.B. IL CAMPIONE DEVE ESSERE CORRETTAMENTE IDENTIFICATO!!!

TIPOLOGIE DI CAMPIONE BIOLOGICO

- Campioni provenienti da sedi anatomiche sterili (es.

liquor, agoaspirato, materiale bioptico...)

- Campioni che entrano in contatto con sedi anatomiche

dove risiede la popolazione microbica residente (es.
urina, espettorato...)

- Campioni provenienti da sedi colonizzate da

microrganismi (es. tampone faringeo, feci...)
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 TERRENO DI TRASPORTO PER
CAMPIONI BIOLOGICI

Conservazione e mantenimento della vitalità dei microorganismi/virus

Protezione da ESSICCAZIONE, CAMBIO DI PH, OSSIGENO,

EFFETTI TOSSICI DEL CAMPIONE SUL MICRORGANISMO…..

Terreno di Stuart
Terreno di Amies
Terreno Cary-Blair
 PRELIEVO DEL CAMPIONE BIOLOGICO:
la Microbiologia in fase liquida

SONDE FLOCCATE
• tecnologia che utilizza un sistema a spruzzo per la coesione delle fibre
di nylon in posizione perpendicolare all’asta
• migliora l’assorbimento dei campioni liquidi e il loro rilascio
• incremento della sensibilità dei saggi diagnostici
• massimo recupero del campione
• i campioni liquidi possono facilmente essere eluiti (almeno l’80% del
campione viene rilasciato nel terreno di trasporto liquido)

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 PRELIEVO DEL CAMPIONE BIOLOGICO
Le sonde floccate possono essere utilizzate a secco, oppure con terreni
di trasporto liquidi.
- Terreno di trasporto universale (UTM) che mantiene la vitalità di
molteplici microrganismi e agenti virali
- I campioni raccolti mediante sonda floccata ed eluiti in UTM possono
essere esaminati con procedure operative standard di laboratorio
- UTM è una soluzione di Hank’s Balanced Salts modificata. Una miscela
di antibiotici inibisce la crescita dei batteri competitori e dei lieviti. Il
terreno è isotonico e non tossico per le cellule di mammifero. Il
saccarosio agisce da crioprotettore, facilitando la conservazione di
virus e Chlamidia, se i campioni sono sottoposti a congelamento (-70°C)
per lunghi periodi.

Tampone faringeo, tampone nasale, tampone

cavo orale…

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 Provette per emocoltura (anaerobi e aerobi)
 Set di prelievo a circuito chiuso (vacutainer)
 Garza sterile
 Antisettico (clorexidina alcolica 0,5% o soluzione
alcolica 70% o soluzione iodata)
 Guanti
CAMPIONI PRELEVATI DALLE BASSE VIE
RESPIRATORIE
(lavaggio bronco-alveolare, broncoaspirato)
 PRELIEVO URINE

MODALITA’ DI PRELIEVO: mitto intermedio prima urina del

mattino

 lavare accuratamente le mani con acqua e sapone

 pulire accuratamente i genitali esterni con acqua e sapone
 risciacquare con acqua corrente
 urinare scartando il primo getto (circa 20 ml) e, senza
interrompere la minzione, raccogliere nel contenitore il mitto
intermedio
 riempire non oltre la metà avendo l’accortezza di non contaminare
 richiudere il contenitore
 Puntura lombare o rachicentesi, pratica chirurgica utilizzata per poter
estrarre il LCR contenuto nel canale midollare della colonna vertebrale
 Invio in provetta sterile a temperatura ambiente
 Se richiesta la ricerca di virus, inviare in ghiaccio
Deve essere inviato al Laboratorio il più rapidamente possibile affinché
possa essere processato entro le 2 ore dal prelievo.

In caso di ritardo, si potrebbero verificare le seguenti situazioni:

 riduzione della vitalità dei microrganismi;
 Aumento della crescita di microrganismi contaminanti;
 Aumento della crescita dei microrganismi patogeni, falsando
l’interpretazione di saggi quantitativi;
 Esposizione dei microrganismi a sostanze che potrebbero avere
attività antibatterica.
Qualora fosse impossibile inviare il campione in tempi rapidi, la
conservazione (max 24 ore) deve rispettare criteri di carattere fisico
(temperatura) e chimico (terreno di trasporto), che variano a seconda
della tipologia di campione
 DIAGNOSI DIRETTA

ESAME MICROSCOPICO
PER LA RICERCA DI BATTERI

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IL MICROSCOPIO OTTICO
Presenta due lenti:
Obiettivo = ingrandisce e capovolge
l’immagine
Oculare = produce un ulteriore
ingrandimento

Ingrandimento = rapporto fra le

dimensioni dell’immagine e quelle
dell’oggetto. Si moltiplica il potere
d’ingrandimento dell’oculare e
dell’obiettivo (massimo=1500 volte).

Potere di risoluzione: capacità di

distinguere due punti molto vicini; è
l’inverso della distanza minima alla
quale i due punti appaiono separati
(limite di risoluzione). E’ pari a 0,2 µm.

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 ESAME MICROSCOPICO A FRESCO

 Una goccia della sospensione

microbica allestita in soluzione
fisiologica viene posta tra
vetrino portaoggetto e
coprioggetto e
immediatamente osservata

 Si evidenzia con difficoltà la

dimensione, la forma e il
raggruppamento di batteri

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 ESAME MICROSCOPICO
PREVIA COLORAZIONE

 I campioni da osservare vengono fissati con calore

o chimicamente e poi colorati con colorazioni
semplici o differenziali

 Scopo: aumentare il contrasto e facilitare lo

studio morfologico dei batteri

 Limiti: non è possibile l’identificazione di genere e

specie (es. Staphylococcus aureus) ma solo in
certi casi del genere

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 COLORANTI

Coloranti basici (es. blu di

metilene, cristal violetto,
safranina): hanno affinità per acidi
nucleici, proteine e la superficie
delle cellule batteriche

Coloranti acidi (es. eosina, fucsina

acida): hanno affinità per
strutture cellulari a carica positiva

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 COLORAZIONE SEMPLICE:
impiego di un solo colorante

Flambaggio
Cristalvioletto

Dispensazione del
campione
Lavaggio

Asciugatura

Asciugatura
Fissazione

Osservazione
microscopica
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 COLORAZIONE SEMPLICE
impiego di un solo colorante (es. BLU DI METILENE)

LIEVITI

BATTERI

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 COLORAZIONE
DIFFERENZIALE

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30
31
32
33
34
Lactobacillus spp.

Streptococcus 35
 Famiglia: Mycobacteriaceae

Sono bacilli aerobi, asporigeni, immobili, lunghi da 2 a 4 µm, molto

sottili.

Presentano caratteristiche tintoriali specifiche legate alla natura

della parete cellulare (sono Gram-positivi, ma tale colorazione non è
efficace per evidenziare questi batteri).

Immagine al microscopio elettronico a scansione

 La parete cellulare
dei micobatteri

-membrana citoplasmatica (A)

-peptidoglicano (B)
-arabinogalattani (C)
-lipo-arabino-mannani (D)
-proteine associate alla membrana
citoplasmatica e alla parete (E)
-ACIDI MICOLICI: acidi grassi saturi a lunga
catena (da 83 a 93 atomi di C)(F)
-MICOSIDI: acidi grassi a lunga catena
esterificati con zuccheri (glicoplipidi) e
glicoproteine (glicopeptidolipidi) – Ex.
dimicolil-trealoso (FATTORE CORDALE) (G)
Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i quali gli
acidi micolici) ed alcoli.

La cera D, un glicopeptidolipide, è nota per le

proprietà adiuvanti; infatti, se inoculata in
emulsione idro-oleosa associata ad un antigene
proteico, potenzia la risposta immune umorale
e cellulare del soggetto ricevente verso
l’antigene.
 Il contenuto lipidico (25% della cellula batterica, superiore di 10-50
I FOSFATIDI: glicerolo esterificato con
volte agli altri batteri) raggiunge a livello della parete valori
acidi grassi (palmitico, oleico) e con acido
elevatissimi (oltre il 60% del peso secco).
fosforico. Sono capaci di evocare una reazione
cellulare granulomatosa caratteristica e
 Gran parte delle proprietà che caratterizzano il genere
sovrapponibile a quella che si osserva
Mycobacterium sono legate alla struttura della parete cellulare.
nell’infezione tubercolare
 PARETE CELLULARE DEI MICOBATTERI

I lipidi di superficie, peptidoglicolipidi, oligoliposaccaridi,

fosfoglicolipidi e il fattore cordale sono:

-responsabili dell’acido-resistenza

-responsabili della lenta crescita

-responsabili della resistenza ai detergenti, ai comuni antibiotici

-altamente antigenici

-responsabili della risposta cellulo-mediata dell’ospite

 MICOBATTERI DI INTERESSE MEDICO

 La maggior parte dei micobatteri sono saprofiti (si possono ritrovare

nelle acque e nel suolo).

 Alcuni sono in grado di colonizzare l’organismo umano come

commensali.

 Numerose specie sono agenti eziologici di varie patologie nell’uomo.

M. tuberculosis – agente eziologico della tubercolosi umana

M. bovis – agente eziologico della tubercolosi bovina –
trasmissibile all’uomo generalmente per via alimentare attraverso
M.tuberculosis latte non pastorizzato.
complex M. bovis BCG (Bacillo di Calmette e Guerin (BCG) ceppo
attenuato di M. bovis usato per la vaccinazione antitubercolare ed
immunoterapia del cancro vescicale).
M. africanum – variante di M. tuberculosis
 LABORATORIO DI MICOBATTERIOLOGIA

NORME DI SICUREZZA

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS È CLASSIFICATO NEL

GRUPPO 3 PER RISCHIO DERIVANTE DALL’ ESPOSIZIONE;
ESSO È CONSIDERATO COME AGENTE INFETTIVO IN GRADO
DI CAUSARE MALATTIA GRAVE E DI COSTITUIRE UN SERIO
RISCHIO PER LA SALUTE DEI LAVORATORI.
Livello di biosicurezza 3
Livello di biosicurezza 3
 DIAGNOSI DI LABORATORIO DI INFEZIONE DA
MICOBATTERI

I campioni biologici si suddividono in:

• contaminati dalla popolazione microbica residente, quali, ad esempio,

espettorato, espettorato indotto, aspirato gastrico, tampone laringeo, lavaggio
bronco-alveolare, aspirato bronchiale, spazzolatura bronchiale, urine, feci, prelievi
autoptici, sangue mestruale;

• non contaminati perché provenienti da siti sterili quali, ad esempio, sangue,

aspirato midollare, liquidi cavitari, liquido cefalo-rachidiano, urine ottenute mediante
puntura sovrapubica, aspirati da puntura trans-tracheale.

La maggior parte dei materiali richiede un processo di decontaminazione prima

di processarli (quelli provenienti da distretti respiratori devono anche essere
fluidificati perché ricchi di muco).
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 Decontaminazione

Numerose sostanze possono essere utilizzate per la decontaminazione:

•Idrato di sodio
•Acido ossalico
•Acido solforico
•Ecc.

Il metodo di riferimento segnalato dal CDC che permette di

effettuare sia la semina su terreni agarizzati e liquidi, sia la ricerca
degli acidi nucleici impiega N-acetil-L-cisteina (NALC) e idrato di
sodio al 4%
DIAGNOSI DI LABORATORIO DI INFEZIONE DA MICOBATTERI
L’esame microscopico è il test diagnostico più rapido ed economico utilizzato in
micobatteriologia. Il clinico non deve attendere i tempi dell’esame colturale per
l’individuazione dei soggetti che necessitino di isolamento e per la dimissione dei pazienti in
terapia non più contagiosi. I limiti principali del metodo sono costituiti dalla scarsa
sensibilità, risulta infatti positivo solo in presenza di un numero elevato di micobatteri nel
campione, e la scarsa specificità.

L’esame microscopio assume una rilevanza

diagnostica che non trova riscontro in altri
Kinyoun settori della batteriologia e permette di
appurare con certezza quasi assoluta se i
microorganismi evidenziati in un
determinato campione appartengono o meno
al genere

Auramina-rodamina
Colorazione di Ziehl-Neelsen (carbolfucsina a caldo)
 ESAME MICROSCOPICO DIRETTO

Ziehl Neelsen
Impiega la fucsina basica fenicata di
Ziehl la cui penetrazione è facilitata
dal riscaldamento.
I micobatteri appaiono come
bastoncini colorati in rosso su sfondo
blu, dovuto al colorante di contrasto
(blu di metilene).

Una metodica alternativa è la

colorazione di Kinyoun che permette
di evitare la fase del riscaldamento.
 Colorazione di KINYOUN (carbolfucsina a freddo)

Materiale:
 Fucsina basica fenicata (carbolfucsina) di Kinyoun: preparare una soluzione contenente 4 g
di fucsina basica in 20 mL di etanolo al 95%; aggiungere 100 mL di acqua distillata in cui
siano stati sciolti a caldo 9 g di fenolo in cristalli. Stabile a temperatura ambiente per
almeno tre mesi.
 Decolorante: aggiungere lentamente 3 mL di acido cloridrico concentrato a 97 mL di
etanolo al 95%. Stabile a temperatura ambiente per almeno tre mesi
 Colorante di contrasto: sciogliere 0,3 g di blu di metilene cloruro in 100 mL di acqua
distillata. Stabile a temperatura ambiente per almeno tre mesi.

Procedimento:
 coprire il vetrino con carbolfucsina di Kinyoun. Colorare per cinque minuti
 lavare con acqua di fonte
 decolorare con la miscela acido-alcol effettuando due o più passaggi della durata di 30
secondi, fino a quando nel liquido di lavaggio non vi sia più traccia di colorante
 lavare con acqua di fonte
 colorare con blu di metilene per almeno 30 secondi
 lavare con acqua di fonte e scolare i vetrini
 asciugare all'aria
 osservare al microscopio con obiettivo 100 x, ad immersione.
 I microrganismi alcol-acido resistenti appaiono di colore rosso, gli altri batteri e lo
sfondo, di colore azzurro-blu.
 COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN
o
COLORAZIONE KYNIOUN (variante a freddo)

proprietà: alcol-acido resistenza

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 Altre colorazioni per micobatteri
Colorazione con auramina
(o con auramina-rodamina)

Procedura di colorazione

1. Termofissare il vetrino contenente lo striscio di campione

2. Applicare la colorazione auramina e lasciare in posa per 1 minuto

3. Sciacquare delicatamente lo striscio con acqua deionizzata o di rubinetto,

quindi lasciarlo sgocciolare

4. Applicare il decolorante/colorante di contrasto (permanganato di

potassio) sul vetrino e lasciare in posa per 1 minuto

5. Sciacquare delicatamente lo striscio con acqua deionizzata o di rubinetto,

quindi lasciarlo sgocciolare. Far asciugare il vetrino

6. Esaminare il vetrino in microscopia a fluorescenza

 Colorazione di micobatteri con auramina
(osservazione al microscopio a fluorescenza a piccolo ingrandimento >> 20x, 40X)

Questa colorazione è più sensibile rispetto a quella di Ziehl-Nielsen o Kynioun,

ma è meno specifica in quanto anche altri microrganismi possono legare l’auramina (o
auramina-rodamina) ai complessi lipidici della parete
 DIAGNOSI DIRETTA
ESAME MICROSCOPICO
PER LA RICERCA DI MICETI

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54
PREPARATO MICROSCOPICO A FRESCO
Lieviti e muffe

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 PREPARATO MICROSCOPICO A FRESCO
Saggio di germinazione: dimorfismo fungino

Candida albicans è un lievito

caratterizzato da dimorfismo. Si presenta
sotto forma di blastospora nella condizione
di saprofita, ma produce ife nei tessuti
parassitati ed a 37° C in particolari
condizioni ambientali (es. presenza di siero
animale); il saggio di germinazione in siero
mette in evidenza questa caratteristica

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 Esame microscopico diretto in soluzione KOH

La soluzione di KOH (10-30%) è utilizzata come agente chiarificante

per la visualizzazione rapida di elementi fungini nei campioni.
Le sostanze organiche, che spesso possono simulare una morfologia
fungina all’osservazione microscopica a fresco, vengono chiarificate
dal trattamento con la soluzione alcalina.
(Un colorante eventualmente aggiunto alla soluzione di KOH colora gli
elementi fungini e ne aiuta il rilevamento).

Procedura:
Porre una porzione del materiale da esaminare su un vetrino
portaoggetto in una goccia di KOH e ricoprirlo con un vetrino
coprioggetto (un leggero riscaldamento può abbreviare il tempo
necessario per l’azione chiarificante della soluzione).
Esaminare il vetrino al microscopio in contrasto di fase a 400
ingrandimenti.
Preparato a fresco da squame cutanee

preparazione in KOH 10% e blu Parker

Preparato a fresco da squame cutanee

preparazione in KOH 10% e blu Parker

Parassitismo pilare di tipo ectothrix
Parassitismo pilare di tipo endothrix (a sinistra) e
favoso (a destra)
 Esame microscopico diretto in inchiostro di China

L’inchiostro di China è utilizzato come mezzo di contrasto per

evidenziare la presenza di microrganismi capsulati (Cryptococcus
neoformans) in campioni di liquor, urine, altri fluidi biologici o da
colture.

Procedura:
Porre su un vetrino portaoggetto una goccia del materiale o delle
sospensioni cellulari da esaminare e una goccia di inchiostro (diluito
1:3 con soluzione fisiologica).
Collocare un vetrino coprioggetto sulle due gocce evitando di
imprigionare bolle d’aria. Le due sospensioni si mescolano formando
vari gradi di concentrazione delle particelle di carbone. Esaminare il
vetrino al microscopio in contrasto di fase a basso ingrandimento
cercando l’area a densità ottimale di inchiostro. La capsula appare
come un alone chiaro intorno alla cellula fungina.
Esame microscopico diretto in inchiostro di China
 Esame microscopico a fresco o da coltura per
l’identificazione di miceti
mediante lattofenolo cotton blue

cristalli di fenolo (o fenolo concentrato 20 ml) 20 gr

acido lattico 20 ml

glicerina 40 ml

cotton blue (blue di Poirrier o blue di anilina) 0.05 gr

acqua distillata 20 ml

Il lattofenolo cotton blue è utilizzato come fluido di montaggio e colorante. L’acido

lattico funge da agente chiarificante e aiuta a preservare le strutture fungine, il
fenolo uccide i microrganismi, la glicerina previene l’essiccamento e il cotton blue
funge da colorante.
Osservazione microscopica di muffe

Colorazione con blu lattofenolo

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Osservazione microscopica di muffe

Colorazione con blu lattofenolo

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 Esame microscopico previa colorazione con fluorescenza

Il Calcofluor white è un colorante fluorescente per il rilevamento di

funghi nei campioni.
Il colorante si lega ai polisaccaridi che presentano legami beta 1-3 e 1-4
come cellulosa e chitina, quest’ultima presente nella parete cellulare
fungina, e fluoresce quando esposto a radiazioni UV.

Procedura:
Porre su un vetrino il materiale da esaminare. Il campione può essere
colorato immediatamente o lasciato asciugare e fissato al calore.
Aggiungere una goccia di Calcofluor white.
Coprire con un vetrino coprioggetto e lasciare a temperatura ambiente
per circa tre minuti. Esaminare il vetrino al microscopio a fluorescenza
con un lampada ai vapori di mercurio. A lunghezza d’onda tra 340 e 380
nm e con un filtro a 430 nm il materiale fluorescente sarà blu (con
sfondo rosso se si utilizza un colorante di contrasto), mentre a lunghezza
d’onda tra 420 e 490 nm con un filtro a 515 nm il materiale fluorescente
sarà verde.
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