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Anno Accademico 2012-2013

MEDICINA DI LABORATORIO:
MICROBIOLOGIA CLINICA
Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara

Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello


tel 0871 355 4812
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)
tel 0871 541509

e-mail: gdibonaventura@unich.it
FASE ANALITICA

Principi di diagnostica batteriologica


DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

• DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza


dell’agente patogeno.

• DIAGNOSI INDIRETTA = tesa a rilevare la risposta


immunitaria dell’ospite all’agente infettivo.
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

 DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agente


patogeno mediante:
A. Esame microscopico (batterioscopico)
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico
• Fornisce informazioni utili per:
– stabilire la idoneità del campione (espettorato: valutazione secondo Bartlett per
numero e % neutrofili)
– porre diagnosi presuntiva, a seguito di positività per microrganismi
(caratteristiche tintoriali, morfologia, disposizione)

Nel caso in cui l’esame batterioscopico risulti NEGATIVO, è importante ricordare


la scarsa sensibilità di questa metodica (circa 104 cellule/ml di materiale)

• Il campione può essere osservato “a fresco” oppure previa fissazione (calore/chimica)


• La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno eventualmente presente:
– microscopia in campo oscuro: il condensatore illumina obliquamente l’oggetto in
modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso l’occhio dell’operatore, a
differenza dell’ambiente circostante (microrganismi circondati da alone luminoso)
• ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide
– microscopia in fluorescenza: antigene rilevato da molecola fluorescente
(cromoforo/fluoroforo) che, eccitato da una sorgente laser, assorbe luce ad una λ
per riemetterla ad una λ più lunga. Tale differenza viene rilevata da filtri.
• identificazione di virus, batteri e funghi
• Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate”, per la ricerca “mirata” di gruppi di
microrganismi o di specifici patogeni (Gram, Ziehl Nielsen)
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico “a fresco”

Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente


colorabili (o coltivabili) con le tecniche disponibili, evidenziabili
invece in campo oscuro:
– ricerca di Spirochete (Borrelia spp., Treponema spp.)
– ricerca di Leptospire

Osservazione in campo oscuro: Borrelia burgdorferi (sn), Treponema pallidum (dx)


Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico in fluorescenza
Fluorescenza: capacità di assorbire radiazioni
elettromagnetiche di una certa λ e di emettere una frazione
dell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche a λ
superiore a quella assorbita.
Microscopia a fluorescenza: usa la luce UV; ad una λ pari
a 200-400 nm le strutture sono analizzate in base alla
fluorescenza che emettono nello spettro visibile.
Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi
difficilmente coltivabili con le tecniche disponibili:
– patogeni della alte vie respiratorie: virus influenzali (A e B)
e parainfluenzali (1,2 e 3), Virus Respiratorio Sinciziale
RSV, Adenovirus e Coronavirus
– Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi

Coronavirus Adenovirus
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico previa colorazione
• Campioni fissati (al calore o chimicamente)
• Fornisce indicazioni riguardo:
– idoneità del campione (nell’espettorato: numero di cellule squamose,
cellule colonnari ciliate, polimorfonucleati neutrofili, cellule mononucleate)
– presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)
• Colorazione del campione con tecnica di Gram:
– morfologia (cocchi, bastoncelli, cocco-bacilli, lanceolata)
– disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)
– quantità assoluta di batteri presenti
– percentuale relativa di Gram+ e Gram-
– localizzazione intra/extra-cellulare del microrganismo
• Specifiche colorazioni:
– colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)
– verde malachite (endospore batteriche in Bacillus spp. e Clostridium spp.)
– colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina in Corynebacterium)
– colorazione di Leifson (flagelli)
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico previa colorazione

Colorazioni SEMPLICI: che prevedono l’impiego di un solo


colorante:
– cristalvioletto
– fucsina basica
– blu di metilene
Colorazioni DIFFERENZIALI: che prevedono l’impiego di
più di un colorante:
– colorazione di Gram
– colorazione di Ziehl-Neelsen
Le colorazioni in microbiologia
Allestimento di un preparato (fissazione) (1 di 2)

La fissazione garantisce che: i) il materiale venga


disteso ed essiccato non venga rimosso dal vetrino
nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule vengano
uccise per coagulazione (sicurezza biologica e
maggiore penetrazione ai coloranti)

 Partendo da una sospensione


batterica (brodocoltura) centro
di un vetrino pulito
 Se si preleva il materiale
(colonie) da terreno agarizzato,
aggiungere una goccia di
soluzione tampone (PBS) al
campione
Le colorazioni in microbiologia
Allestimento di un preparato (fissazione) (2 di 2)

 Aiutandosi con un’ansa,


stemperare il campione nel
tampone/brodo e stenderlo fino
a coprire circa la metà della
superficie del vetrino
(preparazione dello smear)
 Lasciare essiccare il preparato
all’aria o forzatamente
(bunsen).
 Fissare il preparato esponendo
il vetrino (lato non contenente il
campione) per 4-5 volte
direttamente alla fiamma
Hans Christian Joachim Gram

 Nato a Copenhagen il
13 Settembre1853.
 Batteriologo danese.
Inventò la colorazione
omonima nel tentativo di
differenziare Klebsiella
pneumoniae dagli
pneumococchi
Colorazione di Gram
Tecnica
1. Fissare gli strisci al calore
2. Coprire con cristalvioletto per
1-2 min
3. Lavare con acqua. Non
asciugare
4. Coprire con la soluzione
iodio-iodurata di Lugol per 1-
2 min
5. Lavare con acqua. Non
asciugare
6. Decolorare per 10 sec con
alcool-acetone
7. Lavare con acqua. Non
asciugare
8. Coprire con safranina (2.5%
in alcool 95%) per 1-2 min
9. Lavare con acqua e lasciare
asciugare
Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale
Colorazione di Gram
Principio
 Nei batteri Gram+ il cristalvioletto
e lo iodio si combinano a formare
un complesso (CV-I) di grosse
dimensioni che precipita
all’interno della cellula.
Il decolorante condensa, per
disidratazione, la struttura
peptidoglicanica. In questo modo,
il complesso CV-I viene
“catturato” dalla parete cellulare.
 Nei batteri Gram- il decolorante
agisce come solvente lipidico,
dissolvendo la membrana esterna
della parete cellulare,
permettendo così il rilascio del
complesso CV-I e, quindi, la
decolorazione della cellula
batterica.
Colorazione di Gram
Osservazione microscopica
 I batteri Gram+ (Staphylococcus
spp, Streptococcus spp, etc)
appaiono colorati in blu

(Staphylococcus epidermidis)

 I batteri Gram- (E. coli, P.


aeruginosa, Neisseriaceae, etc.)
appaiono colorati in rosso

(Escherichia coli)
Colorazione di Gram
Casi particolari
 Trichomonas vaginalis (protozoo)
è Gram+

 Candida albicans (lievito),


Aspergillus fumigatus (muffa) sono
Gram+

 Occasionalmente, anche
Mycobacterium tuberculosis è
Gram+ (oppure Gram-variabile)
Colorazione di Gram
Utilità clinica (1 di 2)

 Idoneità del campione da sottoporre a coltura


 Es. nell’espettorato: numero di cellule epiteliali ed infiammatorie
 Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)
 meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni
piogene
 Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione
“non routinarie”
 ricerca di anaerobi, funghi
 Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale
 angina di Vincent (spirochete - Borrelia vincentii, fusobatteri -
Fusobacterium fusiforme)
 nel paziente antibiotizzato
 Informazioni sulla natura dell’infezione
 infezioni poli/mono-microbiche
Colorazione di Gram
Utilità clinica (2 di 2)

Quindi:
La conoscenza del risultato di una colorazione
di Gram può salvare una vita !
Tuttavia:
 La colorazione di Gram non deve essere effettuata su
campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena
non può essere differenziata da quella commensale
 La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:
 Legionella spp. (immunofluorescenza)
 bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-
Neelsen)
Colorazione di Gram
L’eccezione

 La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i


batteri.
 Mycobacterium tuberculosis, M. leprae
 incapacità di colorare la cellula per la natura
“cerosa” dell’involucro esterno, altamente
impermeabile ai coloranti
 colorazione di Ziehl-Nielsen
Mycobacterium spp.
Parete cellulare
 Composizione:
 Grosse quantità di glicolipidi:
 acido micolico (60%)
 complessi lipidi-arabinogalattani
 lipoarabinomannani
 Scarso petidoglicano
 Funzioni:
 Condiziona la forma e previene la lisi osmotica
(peptidoglicano)
 Inibisce ingresso composti chimici
 crescita lenta
 maggiore resistenza agli agenti chimici
 maggiore resistenza alla fagocitosi
 Mediante l’acido micolico, induce la sintesi di citochine
(TNF-α)
 Colorazioni:
 Ziehl-Neelsen, Kinyoun
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica (1 di 2)

Step 1:
 versare la fucsina fenicata
(fucsina basica in acqua, alcool e
fenolo)

Step 2:
 fare evaporare il colorante
alla fiamma per 5 min
 lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica (2 di 2)

Step 3:
 Decolorare (2 min, circa) con
alcool-acido fino alla scomparsa
del colorante
 Lavare con acqua

Step 4:
 Contrastare con blu di metilene
per 1-2 min
 Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Osservazione microscopica

 Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono


colorati in rosso
 Gli organismi non acido-resistenti risulteranno
colorati in blu
Le colorazioni in Microbiologia
Colorazioni speciali
La colorazione negativa consiste nella
colorazione di sottofondo con un colorante
acido (nero nigrosina). Viene usata quando
un organismo od una sua struttura non viene
colorata facilmente (esempio, la capsula).
La colorazione delle spore richiede calore
per facilitare la penetrazione del colorante
(verde di malachite, fucsina fenicata)
attraverso gli involucri sporali.
La colorazione dei flagelli impiega un
mordenzante (precipitazione dei sali
dell’acido tannico) per evidenziare la struttura
flagellare altrimenti invisibile (d: 12-30 nm)
Le colorazioni in Microbiologia
Colorazione di flagelli

Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori


(da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico: significato diagnostico

Le informazioni desunte dall’esame microscopico possono


consentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultano
importanti per orientare l’iter diagnostico (es. scelta dei terreni
colturali per l’isolamento).
TUTTAVIA:
L’esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche
qualora si esamini:
– un materiale normalmente sterile o comunque proveniente
da zone non comunicanti con l’esterno (liquido cefalo-
rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale
purulento proveniente da raccolte chiuse);
– un materiale nella cui popolazione batterica “normale” non
siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o
tintoriali del batterio osservato.
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

 DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agente


patogeno mediante:
A. Esame microscopico (batterioscopico)
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento): terreni
L’isolamento colturale prevede l’impiego di adeguati mezzi (terreni) di coltura.
Essi si distinguono in base allo stato fisico:

LIQUIDI (brodi), utilizzati soprattutto nei casi di campioni per i quali si prevede una
bassa carica microbica (liquidi biologici, aspirati, etc.)
Terreno liquido “classico“ (brodo normale o nutritivo)
 peptone (derivato dalla digestione parziale di proteine animali) 0,5%
 estratto di carne 0,3%
 NaCl (per rendere isotonico il terreno)
 tampone fosfato (PBS; pH 7,0)
 H2O

SOLIDI (agarizzati) in cui il brodo normale viene solidificato con agar (1.5-2%),
polisaccaride acido estratto da alghe rosse tropicali del genere Gelidium.
Vantaggi:
 l’agar non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri
 liquidi a temperature > 80°C, gelificano a temperatura compresa tra 42-47°C
 consentono un esame qualitativo (aspetti coloniali macroscopici) e quantitativo
(stima della carica batterica) dell’isolamento
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento): terreni
L’isolamento colturale prevede l’impiego di adeguati mezzi (terreni) di coltura.
Essi si distinguono in base allo stato chimico:

A composizione chimicamente definita: molto costosi, utilizzati esclusivamente per


l’identificazione di batteri con particolari esigenze nutrizionali.
A composizione indefinita: contenenti sostanze naturali (peptone, siero, liquido
ascitico, sangue, estratto di lievito etc.).
Terreni minimi: utilizzati di rado, contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto
forma di sali inorganici, aggiunti a concentrazione nota.
Terreni di arricchimento: più frequentemente utilizzati, contengono sangue, siero,
estratto di lievito, infuso di cuore e cervello, carboidrati e amminoacidi per facilitare la
crescita di microrganismi patogeni particolarmente “esigenti” dal punto di vista
nutritivo.
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento): terreni
L’isolamento colturale prevede l’impiego di adeguati mezzi (terreni) di coltura.
Essi si distinguono in base alla tipologia di informazioni che forniscono:

Terreni NON SELETTIVI

Terreni SELETTIVI

Terreni DIFFERENZIALI
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento): terreni non selettivi
Privi di inibitori, consentono la crescita della maggior parte delle specie microbiche:
 Agar sangue: contiene il 5% sangue montone/cavallo, per evidenziare attività
emolitica:
– α-emolisi = emolisi parziale, dà luogo alla formazione di un alone verde
intorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina
– β-emolisi = emolisi completa, dà luogo alla formazione di un alone trasparente
intorno alla colonia
– γ-emolisi = mancanza di emolisi

 Agar cioccolato: contiene emoglobina (emina o fattore X), NAD (fattore V) e


vitamine, per l’isolamento di germi “esigenti” dal punto di vista nutritivo
(Haemophilus spp, Neisseria spp., S. pneumoniae). Il caratteristico color
cioccolato deriva dal trattamento termico del sangue che ne causa la emolisi e,
quindi, il rilascio dei fattori di crescita.

Agar sangue:
Agar sangue Agar cioccolato
α-, β-, γ-emolisi
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento): terreni selettivi
A differenza dei terreni non selettivi, questi terreni contengono agenti selettivi:
 coloranti: cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica
 antibiotici: con attività batteriostatica/battericida vs “contaminanti”

Vengono utilizzati per l’isolamento di microrganismi patogeni presenti in campioni


prelevati da siti caratterizzati (“contaminati”) da una da flora microbica
residente (cute, faringe, naso, intestino, vagina).

 Thayer-Martin agar (agar cioccolato addizionato di vancomicina, colistina,


trimethoprim lattato e nistatina), selettivo per Neisseriaceae patogene
 MacConkey agar (sali biliari, cristalvioletto, lattosio, rosso neutro), selettivo per
Enterobacteriaceae
 Mannitol Salt Agar (7.5% NaCl, mannitolo, rosso fenolo), selettivo per
stafilococchi
 SS agar (sodio citrato, sali biliari, verde brillante) selettivo per Salmonella spp. e
Shigella spp.
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento): terreni differenziali
Contengono ingredienti in grado di differenziare particolari specie microbiche sulla
base di caratteristiche generalmente biochimiche:
• carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH (rosso fenolo, rosso neutro, blu di
bromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado di
fermentare specifici carboidrati. La fermentazione del carboidrato causa il
rilascio di prodotti acidi della via fermentativa causando una acidificazione del
terreno, prontamente indicata dal viraggio dell’indicatore di pH (e della colorazione
delle colonie) (agar sale-mannite, MacConkey agar, etc.)
• sangue (5% di montone oppure cavallo) per evidenziare la capacità di emolisi dei
batteri: α-emolisi, β-emolisi, γ-emolisi

Agar MacConkey: terreno


selettivo/differenziale per
Enterobacteriaceae lattosio-fermentanti
(E. coli) e non- (Salmonella spp., Shigella
spp., Proteus spp.)

Agar sale-mannite (Chapman agar):


terreno selettivo/differenziale. 1) S. aureus
(mannite-fermentante), 2) Staphylococcus
spp coagulasi-negativi, non fermentanti, 3)
terreno non seminato.
Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica
R. Cevenini, V.Sambri
Piccin
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA

TEMPERATURA

• Psicrofili -10°C a +20°C ( L. monocytogenes, 5-8°C)

• Mesofili +10 a +50°C (la quasi totalità dei batteri patogeni)

• Termofili +40 a +70°C


FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA
Aerobi Aerobi Anaerobi Anaerobi
Microaerofili
obbligati facoltativi obbligati facoltativi

OSSIGENO

Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di O2 atmosferico (Micrococcus spp.)


Aerobi facoltativi: crescono meglio in condizioni aerobie che anaerobie
(Staphylococcus spp., Bacillus spp., Escherichia coli, Enterococcus spp.)
Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di O2 atmosferico (Clostridium
tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium spp., Bacteroides spp.)
Anaerobi facoltativi: crescono meglio in condizioni anaerobie che aerobie
(Corynebacterium spp., Streptococcus spp.)
Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di O2; crescono
bene in atmosfera addizionata di CO2 (H. pylori, Neisseria spp.)
CRESCITA IN ANAEROBIOSI

I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,


depositandosi sul fondo come sedimento.

Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali.

Terreni riducenti: sono terreni che contengono dei composti chimici


(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno
atmosferico fino ad esaurirlo.

Incubatori speciali: a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche


(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono
umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa
dell’ossigeno.
Crescita in anaerobiosi

Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara per anaerobiosi


FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA

pH
– Acidofili:
• crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)
• funghi e lieviti (pH 5 - 6)
– Neutrofili:
• crescono tra pH 6 – 8
• maggior parte dei batteri
– Alcalofili:
• crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA
PRESSIONE OSMOTICA

In generale, i microrganismi replicano meglio in un terreno con


concentrazione osmotica più bassa della propria, in quanto
questa condizione permette la penetrazione dell’acqua all’interno
della cellula.

La pressione osmotica del terreno può essere modificata in base


alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio

Alofili: crescono ad elevate [saline]


(generalmente ≥ 1 M), tollerando elevate
pressioni osmotiche (es. stafilococchi)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA

TEMPO DI INCUBAZIONE

Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione


nell’ordine dei 40-60 min. In particolare:
• Escherichia coli (in vitro) 20-30 min
• Escherichia coli (in vivo) 12 h
• Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 h
• Treponema pallidum (in vitro) 33 h
ISOLAMENTO BATTERICO
Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidi
opportuni, la crescita di colonie batteriche, si procede all’isolamento
dei morfotipi coloniali di interesse

E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del campione. In


particolar modo:
 pus
 liquido cefalo rachidiano
 sangue
ossia materiali fisiologicamente sterili, generalmente contengono un solo
tipo di microrganismo;

• materiale fecale
• tamponi oro-faringei
• altri materiali biologici
ossia materiali fisiologicamente contaminati da flora commensale,
generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al patogeno
o ai patogeni responsabili dell’infezione.
ISOLAMENTO COLTURALE:
TECNICA DI DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE

• Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri

• Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare


al margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo
con soluzione fisiologica o brodo sterile)

• Mediante l’utilizzo di una spatola o di un’ansa, distribuire il


materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la
formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e
colonie isolate nell’ultimo tratto

• Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una colonia


isolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed
allestire una coltura pura
Tecnica di semina per isolamento
Tecnica di semina per isolamento
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

 DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni


solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si
procede alla identificazione:

• ID PRESUNTIVA
– caratteri microscopici
» colorazioni (forma, organizzazione)
– caratteri macroscopici
» aspetto coloniale

• ID FINALE (DEFINITIVA)
– biochimica
– immunologica
– molecolare
ID “presuntiva” dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)

Forma Rilievo

puntiforme d < 1 mm effuso sottile, allungato

circolare piatto

irregolare, a filo
filamentosa intrecciato
sopraelevato

rizoide irregolare, ramificata


convesso

irregolare umbonato
ID “presuntiva” dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)

Superficie Margine

liscia intero

rilevata ondulata
ondulato

radiata eroso

concentrica anelli concentrici


filamentoso

rugosa raggrinzita
arricciato
Aspetto macroscopico coloniale:
variabilità fenotipica
DIAGNOSI DIRETTA
Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)


 Colorazione di Gram
 Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali)
 tipo (aspetto) coloniale
 emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
 crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Identificazione molecolare
IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
La determinazione di “specie” si basa sulla capacità del
microrganismo in esame di:

– metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per via


fermentativa (via anaerobica)

– produrre specifici enzimi

– produrre specifici prodotti metabolici

Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.


Identificazione possibile in tempi rapidi (sistemi automatizzati: 4 - 6 h)
oppure previa incubazione o/night (sistemi “manuali”, 16-20 h).
ID BIOCHIMICA
Metodo manuale: API (BioMérieux) Identification System
Anaerobes (Rapid ID 32 A)
Enterobacteriaceae (ID 32 E)
Gram Negative Rods (ID32 GN)
Staphylococci (ID32 STAPH )
Streptococci (Rapid ID32 STREP)
Yeasts (ID32 C)

La fermentazione degli zuccheri e/o l’utilizzazione di altri substrati (ureasi,


indolo, gelatina, citocromo, etc.) viene rivelata dal viraggio di un indicatore di pH
Identificazione batterica:
Flow charts generate sulla base delle caratteristiche
tintoriali (Gram) e biochimiche
ID BIOCHIMICA
Metodo automatizzato: VITEK (BioMérieux)

Gram-positives (GP)
Gram-negatives (GN)
Yeasts (YST)
Bacillus spp. (BCL)
Anaerobes, Corynebacterium (ANC)
Neisseria, Haemophilus (NH)

 Due tipologie di card: una per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati
biochimici in forma disidratata), l’altra per l’antibiogramma.
 Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di omissione o di errore.
 Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale.
 Possibilità di generare reports epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze)
Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)


 Colorazione di Gram
 Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali)
 tipo (aspetto) coloniale
 emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
 crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Identificazione molecolare
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
Ha come obiettivo finale la ricerca di ANTIGENI specie-specifici,
direttamente nel campione biologico esaminato.

Le tecniche di identificazione sierologica che prevedono l’impiego di


anticorpi comprendono:
A. Reazione di agglutinazione
B. Reazione di immunofluorescenza
C. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA)
D. Western blot
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
A. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE

Agglutinazione su vetrino
Prevede l’impiego di anticorpi, ottenuti in un animale immunizzato,
messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni solubili.

Agglutinazione al lattice (AL)


Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della capsula
batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in grado di legare
gli anticorpi in più punti (antigeni polivalenti). Per il test si utilizzano
anticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in fase
solida).
Tecniche immunologiche rapide vengono frequentemente utilizzate per
la ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H. influenzae, E. coli, N.
meningitidis, C. neoformans) nel liquor (o nel suo centrifugato).
Ricerca di Haemophilus influenzae in un campione di liquor. Il campione viene mescolato con
una sospensione di particelle di lattice ricoperte di Abs specifici, diretti contro la capsula di H.
influenzae. L’interazione tra Ag e Abs causa un’immediata agglutinazione di particelle
(epifenomeno) visibile ad occhio nudo.

negativo positivo
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

Il fluorocromo (es. Alexa Fluor) viene eccitato da una luce ad


una certa lunghezza d’onda (UV), quindi ri-emette una luce ad
una lunghezza d’onda maggiore (nel visibile).
I fluorocromi possono essere legati ad anticorpi modificando la
loro capacità di legarsi ad uno specifico antigene:
• Anticorpi monoclonali (MAb)
– prodotti da cellule di ibridoma
– riconoscono un singolo epitopo
• Due tipi di immunofluorescenza: diretta vs indiretta

Tale tecnica è caratterizzata da:


 moderata sensibilità
 costi non moderati (attrezzatura)
 richiedere personale ad elevata qualifica
 rapidità di esecuzione
 elevata specificità (se si utilizzano Abs monoclonali)
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, che


sia specifico per l’antigene in esame.

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma non


coniugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugato
e diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della specie
in cui è stato prodotto il primo anticorpo.
Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpi
diretti contro entrambi. Nel test diretto, l’anticorpo marcato con colorante fluorescente è applicato su una
sezione di tessuto contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in eccesso viene lavato e l’anticorpo rimasto
legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto, l’antigene è rilevato
mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con una
sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è umano, il secondo anticorpo sarà un
anticorpo contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana).
Diagnosi di sifilide: IF diretta
IMMUNOFLUORESCENZA

A B D

C E

A) Treponema pallidum; B) Chlamydia trachomatis; C) Helicobacter pylori; D) Bordetella


pertussis; E) Neisseria gonhorroeae
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
C. TEST IMMUNOENZIMATICO
(ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay)

La presenza di un antigene viene rivelata dall’utilizzo di un anticorpo legato ad un


enzima in grado di catalizzare una reazione cromogenica.

Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specifici


contro l’antigene (immobilizzazione degli antigeni su fase solida).

Si aggiunge l’antigene (presente nel campione). Esso viene legato dapprima da Ab


immobilizzato, quindi – a seguito di lavaggio – da un secondo anticorpo, diretto
anch’esso contro l’antigene ricercato, legato covalentemente ad un enzima
(perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi) (sandwich ELISA)

La quantificazione avviene mediante tecniche spettrofotometriche, attraverso la


valutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversione
enzimatica del relativo substrato cromogeno: [antigene] = k [intensità viraggio].

La reale concentrazione dell’antigene viene determinata per confronto con


diluizioni standard dell’antigene stesso.
ELISA-test:
diretto (sandwich) vs indiretto
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
D. WESTERN BLOT

Tra i tests sierologici più specifici, il WB prevede la separazione delle molecole


antigeniche del microrganismo, la loro fissazione su supporto solido, ed incubazione
con anticorpi marcati.

1. Separazione degli antigeni su gel di


poliacrilammide in base al peso
molecolare (elettroforesi)
2. Trasferimento degli antigeni (bande
elettroforetiche) su membrana di
nitrocellulosa
3. Incubazione degli antigeni con l’anticorpo
specifico
4. Esposizione ad un anticorpo secondario
(anti-anticorpo primario) marcato con un
enzima (perossidasi)
5. La formazione di immunocomplessi (e
quindi la presenza dell’antigene ricercato)
viene evidenziata dall’aggiunta di un
substrato sul quale agisce l’enzima, che
provoca la precipitazione di colorante
Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)


 colorazione di Gram
 colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali)
 tipo (aspetto) coloniale
 emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
 crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Identificazione molecolare
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE

• Le biotecnologie hanno fornito strumenti diagnostici molto


potenti, in quanto ci consentono:

– la ricerca e la identificazione rapida di patogeni umani


– l’indagine diagnostica su campioni negativi all’esame colturale:
• ricerca di microrganismi a lenta crescita oppure non
coltivabili
– la tipizzazione dei microrganismi a fini epidemiologici
– la determinazione dell’antibiotico-sensibilità
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
 Si basa sulla capacità della DNA-polimerasi
di copiare un singolo filamento di DNA previo
appaiamento dei primers, sequenze
oligonucleotidiche fiancheggianti la sequenza
bersaglio.
 Ciascun ciclo consiste delle seguenti fasi:
 denaturazione a caldo: separazione
delle due eliche di DNA
 annealing: DNA dei primers si appaia al
filamento complementare
 estensione: DNA-pol copia il DNA
bersaglio compreso tra i due primers
 Alla fine di ciascun ciclo, il numero delle
sequenze di DNA bersaglio è raddoppiato.
25-40 cicli sono sufficienti per ottenere una
quantità di DNA bersaglio evidenziabile a
mezzo di migrazione elettroforetica.
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:
PCR-BASED ASSAYS

 Multiplex-PCR: presenza di diverse coppie di


primers per la ricerca simultanea di più patogeni
nello stesso campione
 Nested-PCR: permette di aumentare la
specificità (e/o sensibilità) della reazione. Una
aliquota della reazione originale è utilizzata come
stampo per una seconda reazione (nested)
utilizzando una coppia di primers complementari
a regioni presenti all’interno del primo prodotto
amplificato.
 Ligase Chain Reaction (LCR): amplificazione
della sonda utilizzata per rivelare la sequenza
genica di interesse.
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:
PCR-BASED ASSAYS
 Strand Displacement Amplification (SDA): amplificazione isotermica
(52.5°C), in cui al taglio (per restrizione) del DNA se gue la sintesi del filamento
da parte di DNA-pol, rimuovendo lungo il percorso il filamento che viene
trascritto, mentre il filamento restante serve successivamente da stampo per
nuove amplificazioni. Le fasi di taglio e di polimerizzazione/rimozione si
ripetono ciclicamente producendo copie complementari a singolo filamento del
DNA target. Infine, la ibridizzazione del probe specifico con il prodotto di
amplificazione ne modifica la conformazione sterica consentendo l’emissione
di un segnale fluorescente.

Tecnica impiegata per la


identificazione di:
 Micobatteri, appartenenti ai
complessi “tubercolare” e
“avium-intracellulare”
 Legionella pneumoniae
 Mycoplasma pneumoniae
 Neisseria gonorrhoeae
 Chlamydiaceae
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:
SONDE MOLECOLARI
 Sonda molecolare: sequenza di acido nucleico a singolo filamento [RNA
(rRNA)/DNA] complementare rispetto ad una sequenza caratteristica di uno
specifico patogeno (reazione di ibridazione).
 La sonda può essere marcata con enzimi, molecole chemiluminescenti,
radioisotopi, consentendo in tal modo la rivelazione dell’ibrido da parte di sistemi
automatizzati.
 Tre tipologie di ibridazione:
 In fase solida: sonda adsorbita su substrato (dot-blot, northern-blot, southern-blot)
 In fase liquida: sonda in soluzione (molto rapida vs fase solida)
 In situ: utilizzo di sonde marcate con fluocromo
 Elevata specificità
 Buona sensibilità (sebbene minore vs tecniche di amplificazione): consente di
rivelare la presenza di 104-106 copie (a seconda della tipologia di campione) della
sequenza in esame.
 La reazione di ibridazione può essere applicata su diverse tipologie di campioni:
colonie batteriche, preparazioni di DNA purificato, campioni clinici.
 L’impiego di sonde molecolare è piuttosto diffuso per la ricerca di patogeni
difficilmente coltivabili e/o identificabili con altre tecniche: Micobatteri, Chlamydia,
Legionella, Mycoplasma; genotipizzazione di HPV (DNA-Hybrid Capture).
Restriction fragment length polymorphism
(RFLP): la digestione del DNA per mezzo di enzimi
<
di restrizione, seguita da ibridazione con differenti
sonde geniche genera patterns specie-specifici
(ossia caratteristici di una specie microbica).
Principali tecniche di ibridazione
degli acidi nucleici

Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un


supporto solido (es. membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica sonda a
DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot).
In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separati
attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti su membrane per
l’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si utilizzano molecole di
RNA separate mediante elettroforesi, si parla di Northern blot.
IBRIDAZIONE IN FASE SOLIDA
Dot blot
IBRIDAZIONE IN FASE SOLIDA
Southern blot
IBRIDAZIONE IN FASE SOLIDA
Northern blot
IBRIDAZIONE IN SITU

• DNA denaturato senza alterare la


morfologia cellulare o tessutale
• Frequentemente utilizzate in sezioni
incluse in formalina/paraffina
• Sensibilità influenzata dalla capacità
della sonda di penetrare nella cellula
(meglio se di piccole dimensioni, < 500
basi)
• Partciolare e frequente applicazione:
Fluorescent In Situ Hybridization –
FISH)
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:
LIMITI TECNICI

• Facile contaminazione dei campioni negativi con DNA stampo,


controllo o proveniente da altri campioni (cross-contaminazione)
• Amplificazione di DNA di batteri morti a seguito di terapia
antibiotica
• Possibile cross-reattività con altri microrganismi (scarsa
specificità)
• False negatività, per la presenza nel campione di inibitori degli
enzimi utilizzati nella reazione
• Necessità di utilizzare una coppia di primers specifica per ogni
specie microbica
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

 DIAGNOSI DIRETTA: ANTIBIOGRAMMA

Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, si


procede alla determinazione della sensibilità/resistenza
dell’isolato agli antibiotici (antibiogramma).
Tests di antibiotico-sensibilità
Obiettivo

Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è di


predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.
I tests vengono effettuati in vitro e misurano la risposta (crescita) di
un microrganismo isolato verso un particolare
antibiotico/antibiotici.
I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la
riproducibilità dei risultati.
I risultati di questi tests debbono essere adeguatamente interpretati
per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare. A tal fine
contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza
professionale.
Tests di antibiotico-sensibilità
Definizioni

• MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura


quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato
batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico
in grado di inibire la crescita batterica visibile.
• CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), già NCCLS
(National Committee for Clinical Laboratory Standards) pubblica
i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità
(categorie interpretative).
• Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza)
individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)
• Breakpoints: valori di concentrazione stabiliti sulla base di:
– Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti) dall’antibiotico
– Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in vivo (risoluzione del
caso clinico)
Categorie terapeutiche: definizione
Per un dato antibiotico, in accordo con le linee guida CLSI, un ceppo batterico
viene definito sensibile, intermedio o resistente se:

Sensibile
Il ceppo viene inibito nella crescita da concentrazioni di antibiotico raggiungibili in vivo (sierici,
tessutali). Un’infezione sostenuta da un ceppo batterico isolato può essere trattata
appropriatamente (elevata probabilità di successo) con il dosaggio usuale dell’antibiotico testato e
raccomandato per il tipo di infezione clinica.

Intermedio (a sensibilità intermedia)


Il ceppo mostra una MIC borderline vs livelli raggiungibili in vivo (sierici e tessutali) di antibiotico la cui
efficacia potrebbe dunque essere minore di quella registrata per gli isolati sensibili (effetto
terapeutico incerto). Questa categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici
sono fisiologicamente concentrati (chinolonici e β-lattamici nelle urine) o quando l’antibiotico può
essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali in assenza di significativi effetti collaterali
(β-lattamici). Rappresenta una “buffer zone” che dovrebbe evitare/ridurre errori interpretativi di
natura tecnica, soprattutto nel caso di molecole con un ristretto margine di farmacotossicità.

Resistente
Il ceppo non viene inibito nella crescita dalle normali concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo
(sieriche e tessutali) dall’antibiotico in seguito a somministrazione di dosi normali. Questa categoria
predice una elevata probabilità di fallimento terapeutico.
Tecniche per la determinazione
in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)


• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)
• Agar diluizione
• Sistemi Automatizzati
ANTIBIOGRAMMA
Metodo della brodo diluizione

• Preparare una soluzione madre di antibiotico

• Allestire diluizioni seriali 2-fold dell’antibiotico in brodo Mueller-


Hinton

• Preparare un inoculo a DO uguale a 0.125 (0.5 McFarland)

• Seminare ogni diluizione di antibiotico con l’inoculo


standardizzato

• Incubare a 37°C per 16-18 ore

• Seminare un pozzetto “controllo” (senza antibiotico)


MC-FARLAND
STANDARDS

• La scala degli standards di Mc-Farland è rappresentata da una serie


di fiale contenenti BaSO4, di opacità differenti, che permettono la
valutazione della densità delle sospensioni batteriche

• La densità di una sospensione batterica è valutata per confronto con


una sospensione di opacità nota contenuta in una fiala dello stesso
diametro
MC-FARLAND
STANDARD

Concentrazione Densità ottica


Standard batterica 1 teorica 2
x 106 a 550 nm

0.5 150 0.125


1 300 0.25
2 600 0.50
3 900 0.75
4 1200 1.00
5 1500 1.25
1 La concentrazione batterica varia secondo le dimensioni dei
microrganismi
2 I valori corrispondono alle densità ottiche delle sospensioni batteriche
e non a quelle delle particelle di BaSO4
Minima Concentrazione Inibente (MIC)

Minima Concentrazione Battericida (MBC).


Brodo diluizione
NCCLS-breakpoints
ANTIBIOTICO S I R
Piperacillina ≤16 32-64 ≥128
Cefazolina ≤8 16 ≥32
Cefotaxime ≤8 16-32 ≥64
Cefpodoxime ≤2 4 ≥8
Imipenem ≤4 8 ≥16
Vancomicina ≤4 8-16 ≥32
Gentamicina ≤4 8 ≥16
S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza
Tecniche per la determinazione
in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)


• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)
• Agar diluizione
• Sistemi Automatizzati
ANTIBIOGRAMMA
Tecnica di Kirby-Bauer
• Sospendere 4-5 colonie in 4 ml di brodo

• Incubare a 37°C per 18 ore

• Immergere un tampone nella brodocoltura e scaricarlo contro la parete


della provetta

• Strisciare il tampone sulla piastra in modo uniforme ruotando la piastra


di 60°

• Applicare i dischi a distanza maggiore di 25 mm dal bordo della piastra


e ad distanza tra i centri dei dischi non inferiore a 24 mm

• Capovolgere la piastra ed incubarla a 37°C per 16-18 ore

• Misurare gli aloni di inibizione


1
Diffusione in agar
(Kirby-Bauer)
1. Allestimento brodocoltura
2 da coltura pura
2. Semina brodocoltura

3 3. Apposizione dischetti
antibiotizzati

4 4. Incubazione (37°C, 18-24h)


5. Misurazione diametro alone
5 di inibizione
Diffusione in agar
Risultati
Attività battericida di un antibiotico
E’ necessario considerare la attività battericida di un antibiotico,
SOPRATTUTTO in questi casi particolari:
• Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi
• Focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente
accessibili all’antibiotico

• Concentrazione Minima Battericida (MBC): La più bassa


concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica
di almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude l’azione antibiotica)
della popolazione iniziale.
MIC/MBC test
(Brodo diluizione)
MBC/MIC – killing quotient

 Tasso di uccisione = MBC / MIC

1-4 per antibiotici battericidi


(beta-lattamici, aminoglicosidi, chinolonici,
glicopeptidi, cotrimossazolo, etc.)

>4 per antibiotici batteriostatici


(macrolidi, sulfamidici, trimethoprim,
tetracicline, cloramfenicolo, etc.)
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

 DIAGNOSI INDIRETTA = volta a rilevare una risposta immune


umorale specifica dell’ospite all’agente infettivo:
A. Reazione di fissazione del Complemento
B. Reazione di agglutinazione
C. Test immunoenzimatico (ELISA)
D. Saggio in immunofluorescenza
E. Saggio radioimmunologico
Diagnosi INDIRETTA
• La diagnosi INDIRETTA di una infezione batterica mira a rivelare una
risposta immunitaria umorale specifica dell’ospite all’agente eziologico
• E’ più tardiva di quella DIRETTA in quanto si può ricorrere ad essa
soltanto quando si sia sviluppata la reattività immunitaria dell’ospite:
– IgM, normalmente transitorie ed indicative di una infezione primaria e recente.
In alcuni casi possono persistere a lungo.
– IgG, compaiono più tardivamente, raggiungendo un picco dopo 4-6 settimane
dall’infezione. Per questo è buona norma ricercarle in campioni successivi
(primo: entro 5-10 giorni dall’infezione; secondo: 3-4 settimane dopo). Spesso
persistono per tempi prolungati. Sono indicative di una infezione pregressa od
attiva (se titolo anticorpale è aumentato di almeno 4 vv nei due campioni
successivi)
• Non è sempre possibile porre diagnosi indiretta (es. in pazienti anergici).
• Pertanto, le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico soltanto
quando l’isolamento del microrganismo sia
difficoltoso, fallito, o non possibile.
• L’accertamento indiretto, non comportando
l’isolamento del germe, preclude la possibilità
di saggiare la sensibilità dell’agente
etiologico verso i farmaci antimicrobici.
Sieroconversione

 Presenza di anticorpi specifici IgM o IgG (con un test precedente negativo!)


 Presenza di IgM specifiche nelle infezioni acute o nella fase acuta di infezioni
persistenti
 Aumento di IgG in assenza o lieve aumento di IgM nelle reinfezioni
 Presenza di IgA sieriche specifiche nelle infezioni subacute o croniche

• Positività IgM: deve essere associata a sintomi clinici compatibili e/o a un


test positivo per IgG specifiche a bassa avidità.
• Aumento delle IgG: un aumento del titolo di IgG di almeno 4 volte rispetto
al titolo del campione precedente:
– primo campione: prelevato entro 7-10 giorni dalla presunta data di
esposizione (contatto con un soggetto infetto) o dalla comparsa della
sintomatologia dell’infezione acuta (esantema) (fase acuta).
– secondo campione: prelevato dopo circa 2 settimane (fase
convalescente)
– i due campioni devono essere esaminati nel corso della stessa seduta
analitica per dimostrare l’aumento del titolo anticorpale.
Diagnosi INDIRETTA
A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
 PRINCIPIO: capacità del Complemento di legarsi agli immunocomplessi
 METODICA:
- il siero del paziente viene “scomplementato” (privato del Complemento) (30
min, 56°C)
- diluizioni del siero inattivato vengono cimentate con l’antigene, in presenza
di Complemento “fresco” (di coniglio) aggiunto in quantità nota
- se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano
all’antigene ed il Complemento si lega all’immunocomplesso
- si aggiunge un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-
eritrociti di montone):
• se il siero del paziente è positivo (cioè contiene anticorpi contro
l’antigene) gli eritrociti rimangono integri, in quanto il Complemento si
è legato al primo immunocomplesso
• se il siero del paziente è negativo (cioè non contiene anticorpi contro
l’antigene) gli eritrociti vengono lisati, in quanto il Complemento si lega
all’immunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita. La reazione si
evidenzia con liberazione di emoglobina.

Un classico esempio applicativo della FC è la reazione di Wassermann,


per la diagnosi di sifilide (antigene lipidico o cardiolipina)
Diagnosi INDIRETTA
A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
Diagnosi INDIRETTA
A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
Titolo anticorpale = reciproco della più alta
diluizione positiva alla fissazione

Nella reazione FC la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa, mentre l’assenza di
lisi è indice di positività per la presenza di anticorpi.
In figura è riportata una reazione FC per evidenziare anticorpi verso Coxiella burnetii (agente
eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase acuta, il
Complemento e’ stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dell’anticorpo e’ 1/32), mentre con il
siero convalescente nella seconda linea non c’e’ lisi dei globuli rossi per tutte le diluizioni di siero e
quindi il titolo dell’anticorpo e’ maggiore di 1/512. Questo dimostra che un aumento di 4 volte nel
titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza e’ indicativo dell’infezione da Coxiella burnetii.
Diagnosi INDIRETTA
B. TEST DI AGGLUTINAZIONE
• L’antigene corpuscolato consiste di una Titolo anticorpale = reciproco della più alta
sospensione di microrganismi, cellule diluizione positiva all’agglutinazione
(emazie) o particelle uniformi (lattice) sulle
quali sono adsorbiti gli antigeni
• Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono
cimentate con una quantità fissa di antigene
• In presenza di siero positivo, ossia
contenente gli anticorpi specifici, la
formazione di immunocomplessi si appalesa
con la formazione di aggregati
(agglutinazione)

Classici esempi applicativi del test di agglutinazione sono le reazioni di


Widal (diagnosi di salmonellosi) e di Wright (diagnosi di brucellosi)
Diagnosi INDIRETTA
C. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IF DIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto marcato con un


fluorocromo (isotiocianato di fluorescina) ed il siero, opportunamente
diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.

IF INDIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto ed il siero,


opportunamente diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.
Successivamente si aggiungono anticorpi anti-immunoglobuline umane,
prodotti in animali e coniugati con isotiocianato di fluoresceina.

Se il campione è positivo, all’osservazione al microscopia a fluorescenza


esso risulterà fluorescente grazie alla formazione dell’immunocomplesso
marcato (fluorocromo associato all’antigene).
Indirect fluorescent antibody (IFA) test. The
fluorescence indicates that the patient serum
being tested contains antibodies that are
reacting with the antigen preparation (here,
Plasmodium falciparum parasites).

Today, the indirect fluorescent antibody test (IFA)


provides the only means by which an infection by
Elrichiosis can be confirmed. The IFA is useful
because it identifies the presence of host
antibodies directed against the invading pathogen.
However, false negatives may arise due to a
prolonged delay of a host's immune response.
Diagnosi INDIRETTA
D. Test immunoenzimatico
(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)

 Si impiega l’antigene fissato su una superficie di plastica (piastra) per


catturare e separare l’anticorpo specifico dagli altri anticorpi presenti nel
siero del paziente.
 L’anticorpo fissato viene quindi evidenziato da un anticorpo anti-IgG
umano legato covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi
alcalina, β-galattosidasi).
 La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso
la valutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversione
enzimatica del relativo substrato cromogeno.

 La reale concentrazione
dell’anticorpo viene determinata per
confronto con diluizioni standard
dell’anticorpo stesso.
Diagnosi INDIRETTA
E. SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO
(Radioimmunoassay, RIA)

• Marcatura dell’antigene (anticorpo) mediante radioisotopi


• Rivelazione del corrispondente anticorpo (antigene)
• Competizione tra molecole marcate e non-
– un anticorpo purificato marcato con un radioisotopo compete con
un anticorpo standard non marcato per il legame con l’antigene
• Misurazione della quantità di radioattività associata all’anticorpo
• Il rischio associato all’utilizzo di radioisotopi ne ha limitato la
diffusione a vantaggio dei saggi ELISA
Bibliografia

• Principi di Microbiologia Medica. Antonelli G,


Clementi M, Pozzi G, Rossolini GM. 2012 (II
edizione). CEA ed.
• Microbiologia clinica. Cevenini. 2010. PICCIN ed.