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Calendario del corso

Mese Giorno 8.30-10.30 8.30-11.30 14.00-17.00


Ottobre LUN 1 Lezione
Ottobre VEN 5 Lab A
Ottobre LUN 8 Lezione Lab A
Ottobre VEN 12 Lab B
Ottobre LUN 15 Lezione Lab B
Ottobre VEN 19 Lab A
Ottobre LUN 22 Lezione Lab A
Ottobre VEN 26 Lab B
Ottobre LUN 29 Lezione Lab B
Novembre VEN 2 Lab A
Novembre LUN 5 Lezione Lab A
Novembre VEN 9 Lab A
Novembre LUN 12 Lezione Lab B
Novembre VEN 16 Lab B
Novembre LUN 19 Lezione
ATTENZIONE – Le esercitazioni si svolgeranno presso i Laboratori Didattici di Viale
Morgagni. Gli studenti lavorano a gruppi di 3 persone: portare camice, un pennarello
indelebile a punta fine e un righello.
Scopo del corso

Fornire una preparazione teorica e


pratica (esperienze di laboratorio)
delle:

 tecniche di base del


laboratorio microbiologico.

 problematiche riguardanti
l’isolamento, la caratterizzazione
e la classificazione di
microrganismi.
Ricevimento studenti, per appuntamento:

E-mail: enrico.casalone@unifi.it
Telefono: 055 22 88 245

Testi consigliati:

 Madigan, Martinko, Parker – BROCK. BIOLOGIA DEI


MICRORGANISMI – Casa Editrice Ambrosiana 2003

 Perry, Staley, Lory – MICROBIOLOGIA - Zanichelli 2004

 Seeley, Vandemark, Lee – LABORATORIO DI


MICROBIOLOGIA - Zanichelli 1995
Argomenti dei laboratori

Laboratorio 1a. Preparazione piastre terreno solido.


Analisi microbiologica di un campione di suolo:
procedure di isolamento su piastra e conteggio cellule vitali,
utilizzo di condizioni selettive.

Laboratorio 1b. Valutazione risultati Laboratorio 1a.

Laboratorio 2a. Colorazione di Gram, colorazione spore.


Incrocio di lievito Saccharomyces cerevisiae.

Laboratorio 2b. Valutazione risultati dell’incrocio.


Ciclo vitale del lievito S. cerevisiae: osservazioni microscopiche
di lieviti in differenti fasi del ciclo.

Laboratorio 3a. Antibiogramma.


Misurazione della crescita microbica mediante determinazione
della densità ottica.

Laboratorio 3b. Valutazione risultati antibiogramma. Costruzione della curva di


crescita.
Particolarità dei microrganismi

Per la maggior parte degli organismi


animali e vegetali è possibile (e spesso
semplice) lo studio in situ.

I microrganismi difficilmente possono


essere studiati nel loro ambiente naturale;
la coltivazione in laboratorio è perlopiù la
norma.
Studio microrganismi in laboratorio

 Isolare il microrganismo d’interesse da tutti gli


altri che sono presenti nello stesso sito.

 Coltivare i microrganismi in laboratorio:


trovare condizioni favorevoli.
La coltivazione avviene come coltura pura. Cosa
è una coltura pura? Come la otteniamo?

 Infine, è necessario caratterizzare (dal punto


di vista morfologico, genetico, metabolico,
fisiologico, ecologico, molecolare, ecc.) il
microrganismo.
Il processo di caratterizzazione porta anche
alla identificazione del microrganismo.
Lavorare con i microrganismi in
laboratorio: norme generiche

 pulizia: prima di iniziare a lavorare bisogna


lavarsi le mani (con saponi particolari) e
disinfettare il banco di lavoro;

 evitare la formazione di correnti d’aria;

 evitare di parlare, tossire, starnutire mentre si


trasferiscono batteri da un terreno ad un altro.
La manipolazione dei microrganismi:
cappe sterili

TIPO DI
PROTEZIONE IMPIEGHI
CAPPA

Flusso preparazioni
laminare sterili, es.
orizzontale campione
terreni per
microbiologia

operatore materiale non


Flusso
patogeno,
laminare
colture
verticale campione cellulari
Lavorare con i microrganismi in
laboratorio: norme particolari

La manipolazione dei microrganismi avviene


utilizzando la cosiddetta tecnica asettica,
asettica che
prevede tre fasi:

• sterilizzare i terreni e gli strumenti con


cui i microrganismi vengono in contatto;
• prelevare sterilmente il microrganismo;
• trasferire sterilmente il microrganismo.
La sterilizzazione di terreni in autoclave

L'autoclave  ci  permette  di  sterilizzare  mediante  calore  umido  a 


temperature  superiori  a  100  °C  .  Il  vapore  è  il  vettore  di  calore, 
quindi il vapore deve circolare liberamente dentro l’autoclave.

P•V=R•T
P = 1.1 kg/cm2;
T = 121ºC
tempo necessario circa 15 min

Assicura  l'uccisione  di  tutte  le  forme  viventi,  incluse  le 


endospore. 
Impiegata perlopiù per sterilizzare contenitori in vetro vuoti o
contenenti acqua, soluzioni e terreni di coltura in brodo o
agarizzati, purchè privi di sostanze deperibili ad alte temperature
(siero).
La sterilizzazione degli strumenti di lavoro
L’ansa oppure l’ago per prelievi vengono passati sopra la fiamma di
un becco Bunsen, inclinati a circa 60°, fino a che l’intero filamento
diventa incandescente (arancione). Fino al suo utilizzo, l’ansa sterile
non deve essere né toccata né poggiata sul piano per non contaminarla,
ma prima di usarla va raffreddata.

Anse e aghi per inoculi Becco Bunsen Sterilizzazione


dell’ansa

Sempre più spesso si utilizzano strumenti sterili monouso.


Il prelievo dei microrganismi.

• Da una piastra di coltura (capsula di Petri)

• Da un brodo di coltura (in provetta o beuta)


a. Prelievo da una piastra di coltura e trasferimento
in una provetta

1 2

1. Sterilizza l’ansa.

3. - Solleva il coperchio quanto basta per inserire l’ansa all’interno


della piastra con il microrganismo,
- raffredda l’ansa affondando la punta incandescente nell’agar,
lontano dalle zone di crescita batterica,
- asporta con l’ansa un piccola quantità di massa batterica.
- chiudi il coperchio della piastra e poi……………
….trasferisci le cellule del microrganismo nella provetta con
il terreno di coltura sterile.

Prendi il contenitore Flamba brevemente il


contenente il terreno liquido, bordo della provetta.
togli il tappo senza
poggiarlo.

3 4

Inocula il
terreno di Rimetti il tappo e ….
coltura con le Flamba nuovamente il
cellule del bordo della provetta.
microrganismo
.
….sterilizza
l’ansa!

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b. Prelievo da un brodo di coltura e trasferimento in
piastra
1. La provetta con la coltura in una mano, nell’altra, come se fosse una penna, l’ansa sterile. Rimuovi il tappo
dalla provetta tenendolo con la stessa mano che tiene l’ansa. Passa brevemente il bordo della provetta sulla
fiamma (flambare). Questo crea una corrente convettiva che forza l’aria fuori dalla stessa e previene l’entrata di
contaminanti.
B A Sterilizza l’ansa

(1) Riscalda
il filamento 2
2. Inclina la nella
fiamma fino
provetta, inserisci a che
diventa
rosso e
l’ansa e preleva un 1 (2) lascia
piccolo volume di 1 raffreddare.

coltura.

3. Flamba il bordo 3
della provetta.

4. Alza il coperchio 2
della piastra e striscia
l’ansa sulla superficie 5. Risterilizza l’ansa.
dell’agar per trasferire
il microrganismo.
4
VIDEO
AscepticTransfers.mov
Coltura pura
Definizione di coltura pura, coltura
clonale e ceppo

Una coltura pura è formata da cellule di un


microrganismo tutte identiche tra loro.

Una coltura clonale, o clone, è ottenuta dalla


moltiplicazione di una singola cellula del
microrganismo, ed è perciò sicuramente una coltura
pura.

Quando ad una coltura pura viene assegnato un codice


identificativo si parla di ceppo.
Un ceppo viene conservato in laboratorio e/o
depositato in una banca di microrganismi (ceppoteca).
Come si ottengono colture pure
La procedura di isolamento

Per ottenere una coltura pura bisogna separare


l’una dall’altra singole cellule (procedura di
isolamento).

Soltanto se otteniamo colture che sono generate


dalla crescita di una singola cellula abbiamo la
certezza che queste siano colture pure.
Coltura monocitogenetica

I microrganismi sono molto piccoli


ed è quindi molto difficile
“maneggiarli”, ma è comunque
possibile con l’ausilio di un
microscopio e di un
micromanipolatore.

Se prendiamo fisicamente una


singola cellula, la separiamo da
altre cellule vicine e la trasferiamo
in un terreno di coltura libero da
altre forme viventi, dalla sua
crescita otteniamo una coltura
monocitogenetica.
Micromanipolatore al laser
Un raggio laser esercita sulla cellula delle forze radianti che permettono
di trascinarla in una qualunque direzione.
Isolamento di coltura pura su piastra

scopo: separare da una sorgente di microflora mista


(per es., campione ambientale) colonie pure di
microrganismi (cioè provenienti dalla
riproduzione di singole cellule).

• Metodo dello striscio su piastra (o per


spandimento con ansa - streak-plate method).

• Metodo di diffusione su piastra (o piastramento


di superficie).

• Metodo di inclusione in piastra.


1. Isolamento mediante striscio su piastra
2. Metodo di diffusione su piastra (piastramento)
Una piccola quantità del campione (in genere 0,1 ml) viene posta sulla superficie della piastra e
poi distribuita uniformemente mediante un’ansa sterile o palline di vetro o plastica sterili.
Se sufficientemente diluite le cellule cresceranno in colonie ben isolate.
3. Metodo di inclusione in piastra
Il terreno viene inoculato mischiando insieme il campione e il terreno agarificato mentre è ancora
liquido (45 °C). Dopo aver mischiato bene si versa il contenuto della provetta in piastra.
Le colonie si sviluppano all’interno del terreno, e non sulla superficie.

POUR PLATING

AGAR “OVERLAY”
Poiché lo scopo di queste procedure è di ottenere colonie
isolate (colture pure o clonali) di un dato microrganismo, è
bene notare che:
 Su piastre ricche di colonie queste tendono ad essere molto
piccole e si distinguono male perché le crescite convergono.

 Le colonie ben isolate sono di solito più grandi con forma,


configurazione, colore e trama ben definite.

 Le colonie che crescono in superficie sono più grandi e


usualmente circolari, mentre quelle che si sviluppano in profondità
sono più piccole e la loro forma è limitata dall’agar.

 In popolazioni batteriche miste alcune specie sono presenti con


un numero limitato di individui, con il rischio che su piastre
diluite non siano rappresentate.
Particolari tecniche d’isolamento possono risolvere, almeno in
parte, questo problema.
VIDEO
Streaking - Filmato streaking.mov