CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE

ANNO ACCADEMICO 2007-2008

CORSO INTEGRATO DI BIOCHIMICA

MANUALE PRATICO
DI
LABORATORIO
 INDICE

1. SICUREZZA E NORME DI COMPORTAMENTO IN LABORATORIO pag. 4

1.1 Simboli e indicazioni di pericolo pag. 5

2. L’APPROCCIO SPERIMENTALE:
COME SI PROGETTA ED ESEGUE UN ESPERIMENTO pag. 7
2.1 Schema sintetico per progettare ed eseguire un esperimento pag. 7
2.2 L’uso di Internet nella ricerca biochimica pag. 8
2.3 Come effettuare una ricerca bibliografica pag. 8

3. PREPARAZIONE ED UTILIZZO DI SOLUZIONI pag. 10

3.1 Strumenti per lavorare con i liquidi pag. 10
3.2 Preparazione delle soluzioni pag. 14
3.3 Soluzioni “stock” e diluizioni pag. 16
3.4 Uso delle bilance pag. 16
3.5 Riscaldamento e raffreddamento dei campioni pag. 17

4. ESERCITAZIONI pag. 18

4.1 USO DEI MODELLI MOLECOLARI pag. 19

4.2 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE SU STRATO SOTTILE pag. 23

4.3 PURIFICAZIONE DELLA SERINA IDROSSIMETILTRASFERASI pag. 25

4.3.1 Lisi dei batteri, frazionamento con solfato di ammonio e dialisi pag. 25
4.3.2 Cromatografia a scambio cationico pag. 30
4.3.3 Determinazione quantitativa delle proteine pag. 34
4.3.4 Analisi elettroforetica delle proteine pag. 40
4.3.5 Saggi di attività enzimatica pag. 43
4.3.6 Tabella riassuntiva della purificazione pag 45

RINGRAZIAMENTI pag. 46

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INTRODUZIONE

Questo manuale non è stato pensato come un’alternativa ai libri di testo o come una ripetizione
dei concetti già spiegati a lezione, piuttosto come una loro integrazione che ha lo scopo di preparare
alle esercitazioni, in modo da trarre da queste il massimo beneficio. Le esperienze di laboratorio
serviranno ad illustrare alcune delle metodologie biochimiche fondamentali trattate durante le
lezioni e ad introdurre gli studenti al lavoro sperimentale. Per questo, il manuale si propone di dare
anche alcune informazioni essenziali a chi si avvicina per la prima volta alla ricerca biochimica,
quali quelle riguardanti le comuni pratiche di laboratorio e le norme di sicurezza, i principi della
corretta sperimentazione scientifica, l’utilizzo di Internet. Nei capitoli che riguardano ogni singola
esperienza di laboratorio sono forniti brevi richiami teorici sulle tecniche utilizzate ed un dettagliato
protocollo sperimentale. Gli studenti sono invitati a leggere il manuale prima di affrontare le prove
pratiche, in modo da essere preparati a quello che succederà in laboratorio e ben consapevoli dello
scopo dell’esercitazione. Questo non esclude che in caso di difficoltà, sia teorica che pratica, gli
studenti possano rivolgersi ai docenti presenti alle esercitazioni. È importante però che essi facciano
un tentativo autonomo per capire lo scopo dell’esperimento, i principi fisici e chimici che sono alla
base delle procedure usate, il significato dei risultati ottenuti. Queste semplici regole dovrebbero
essere sempre seguite per rendere utile il tempo impiegato negli esperimenti.

Roberto Contestabile

Dipartimento di Scienze Biochimiche

Università La Sapienza
Via degli Apuli, 9
00185 Roma, Italy
Tel: +39 06 49917569
Fax: +39 06 49917566
E-mail: roberto.contestabile@uniroma1.it

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1. SICUREZZA E NORME DI COMPORTAMENTO IN LABORATORIO

Lavorare in laboratorio può essere pericoloso a causa dell’utilizzo di sostanze chimiche nocive o
tossiche, di vetreria o oggetti taglienti, fiamme libere, solventi infiammabili, apparecchiature
elettriche etc. Le sostanze chimiche sono pericolose solo se assorbite dall’organismo attraverso la
cute, il sistema respiratorio e l’apparato digerente
(Fig 1). Di solito, la cute rappresenta una barriera
relativamente impermeabile. Tuttavia, essa in
alcuni punti può non essere integra e comunque
esistono zone della superficie del nostro corpo che
possono permettere facilmente l’ingresso di
Inalazione sostanze nocive, come i dotti sudoripari, i follicoli
Ingestione piliferi, gli occhi. Attraverso il sistema respiratorio
invece passano gas, vapori e polveri, mentre è
possibile l’assorbimento di sostanze chimiche
attraverso l’apparato digerente per cause
Inoculazione accidentali, come la deglutizione di saliva
Assorbimento inquinata (mani sporche in bocca o introduzione
nella bocca di polveri). E’ quindi di fondamentale
importanza che tutto il lavoro pratico venga svolto
Fig. 1 seguendo le norme di sicurezza ideate allo scopo di
minimizzare il rischio di danno a se stessi e agli
altri. La sicurezza in laboratorio dipende
soprattutto dalla consapevolezza e dal senso di responsabilità di tutte le persone che vi lavorano.
L’osservanza di semplici regole pratiche può minimizzare ogni rischio:

• non fumate, non mangiate, non bevete in laboratorio;

• indossate un camice (abbottonato!) e scarpe chiuse nell’ambiente di lavoro;
• proteggete le mani con guanti monouso quando maneggiate sostanze tossiche, corrosive o
irritanti e ricordatevi che i guanti sono una fonte di contaminazione (non uscite dal
laboratorio indossando i guanti). Quindi non toccate la faccia con i guanti né maniglie di
porte o altri arredi (scrivanie, PC, etc.);
• indossate occhiali o visiere di sicurezza quando eseguite operazioni potenzialmente
pericolose per gli occhi;
• indossate un’opportuna mascherina che copra naso e bocca quando maneggiate delle
polveri;
• non pipettate liquidi dannosi con la bocca, usate dei pipettatori;
• fate attenzione quando usate la vetreria;
• lavorate sotto una cappa aspirante se state usando solventi o composti che hanno un cattivo
odore;
• usate con prudenza strumenti quali centrifughe ed alimentatori per elettroforesi che possono
provocare incidenti potenzialmente gravi;
• pulite subito qualunque liquido rovesciato sul bancone o sul pavimento;

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 • marcate in modo chiaro i campioni, le bottiglie dei reagenti e le soluzioni preparate con
l’identità chimica dei contenuti, la data di preparazione e il vostro nome;
• leggete attentamente le etichette dei reagenti chimici, le quali presentano dei simboli che
indicano gli eventuali pericoli di natura chimica o fisica, prima di usarli (vedi § 1.1);
• eliminate correttamente i reagenti chimici: i prodotti corrosivi come acidi e basi devono
essere neutralizzati prima dello scarico nel lavandino; tutti i solventi organici devono essere
immagazzinati in fusti metallici, stoccando separatamente i solventi clorurati; tutti i tessuti,
cellule o colture microbiche utilizzati o contaminati devono essere sterilizzati in autoclave
prima dell’eliminazione. Esistono apposite ditte che si occupano dello smaltimento dei
rifiuti prodotti in laboratorio, con particolare attenzione a quelli radioattivi;
• fate attenzione alle fiamme libere quando lavorate con sostanze infiammabili;
• durante le esercitazioni non procedete ad esperienze non autorizzate;
• lavorate in modo ordinato e alla fine del lavoro pulite il bancone e lavatevi accuratamente le
mani. Toglietevi il camice, i guanti e qualsiasi altro indumento protettivo prima di uscire dal
laboratorio: possono essere fonte di contaminazione esterna.

1.1 Simboli e indicazioni di pericolo:

Pericoli di natura fisica:

Esplosivo: che può esplodere per effetto di una fiamma o che è sensibile agli attriti.

Comburente: che a contatto con altre sostanze, soprattutto se infiammabili, provoca

una forte reazione esotermica.

Facilmente infiammabile: che può facilmente infiammarsi per la rapida azione di

una sorgente di accensione o che a contatto con l’aria, a temperatura ambiente e
senza ulteriore apporto di energia, può riscaldarsi ed infiammarsi.

5
Pericoli di natura chimica:

Corrosivo: che a contatto con i tessuti vivi, può esercitare su di essi un’azione
distruttiva.

Irritante o nocivo: che, pur non essendo corrosivo, può produrre al contatto
immediato, prolungato o ripetuto con la pelle e le mucose una reazione
infiammatoria. Per inalazione, ingestione o penetrazione cutanea, può comportare
rischi di gravità limitata.

Tossico: che per inalazione, ingestione o penetrazione cutanea può comportare rischi
gravi, acuti o cronici, e anche la morte.

Radioattivo: che produce radiazioni ionizzanti le quali, assorbite dall’organismo,

provocano mutazioni del DNA. Le sostanze marcate con isotopi radioattivi possono
essere usate solo all’interno di zone sorvegliate e solo da personale autorizzato.

Pericoli di natura biologica:

Pericolo biologico (Biohazard): che può essere pericoloso in quanto costituito da

sangue, tessuti e cellule di origine umana, oppure da microrganismi geneticamente
modificati.

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2. L’APPROCCIO SPERIMENTALE: COME SI PROGETTA ED ESEGUE UN
ESPERIMENTO

La scienza è un insieme di conoscenze derivate da ipotesi teoriche ed esperimenti. Le ipotesi

sono gli strumenti del metodo scientifico. Esse solitamente nascono per spiegare le osservazioni
sperimentali (metodo deduttivo) ma possono anche essere prima formulate e quindi verificate
tramite la sperimentazione (metodo induttivo). Un’ipotesi, quindi, nasce ed è continuamente
sottoposta a verifica, modificata o scartata in base ai risultati sperimentali. Si può dimostrare che
un’ipotesi è sbagliata, ma non è possibile dimostrare con certezza assoluta che sia corretta, si può
solo sostenere che è in accordo con i dati sperimentali. Nella pratica della ricerca scientifica,
entrambi i metodi deduttivo ed induttivo vengono utilizzati: essi sono come “un cane che si morde
la coda”.
Un difetto, del tutto umano, del metodo scientifico è che ipotesi alternative ad una teoria
generalmente accettata o alla quale si è “affezionati” tendono ad essere ignorate. La ricerca
scientifica invece si prefigge lo scopo di comprendere il mondo che ci circonda cercando di scoprire
la verità e non di sostenere nozioni preconcette. Un altro difetto del metodo scientifico è che il
disegno dell’esperimento e la scelta del metodo di misurazione possono influenzare il risultato. E’
quindi importante considerare i risultati attesi, in senso qualitativo e quantitativo, al fine di
progettare in modo adeguato l’esperimento ed essere in grado di interpretarne i risultati senza
ambiguità. A tale scopo è necessario isolare o eliminare alcune variabili, ovvero l’esperimento deve
essere controllato. Un buon esperimento deve prevedere un controllo negativo ed uno positivo. Nel
controllo negativo si omette intenzionalmente il componente del sistema le cui proprietà vogliono
essere misurate. Ad esempio, in un saggio di attività enzimatica si omette l’enzima. In questo modo
si potrà misurare la conversione spontanea dei reagenti nei prodotti, che poi dovrà essere sottratta
all’attività misurata in presenza dell’enzima. Il controllo positivo viene effettuato per verificare il
corretto funzionamento del metodo di misura. Tornando all’esempio del saggio di attività
enzimatica, un controllo positivo consiste nell’utilizzo di un campione d’enzima ad attività nota. A
volte è impossibile eliminare o isolare alcune variabili. Per questo è desiderabile escogitare un
metodo indipendente per realizzare lo stesso esperimento e confrontare i risultati. In generale, tanto
più un esperimento è facile, quanto più questo sarà interpretabile senza ambiguità e sarà facilmente
ripetibile, consentendo una buona analisi statistica delle misurazioni.
Il ricercatore di successo è un abile osservatore. La ricerca non si svolge sempre come era stato
pianificato ed i risultati inattesi possono essere forieri di nuove ed importanti informazioni.

2.1 Schema sintetico per progettare ed eseguire un esperimento

Preliminari:

• Leggere tutta la letteratura scientifica riguardante l’argomento di interesse;

• formulare una semplice ipotesi da verificare;
• decidere quali parametri misurare e con quale metodo;
• pensare ai controlli negativi e positivi da inserire;
• pianificare l’analisi (anche statistica) dei risultati;
• valutare le eventuali restrizioni all’esecuzione dell’esperimento: costi e disponibilità dei
materiali, spazio, tempo e attrezzature necessarie all’esecuzione.

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Esecuzione:

• Scrivere il protocollo dell’esperimento;

• registrare i risultati ottenuti;
• ripetere l’esperimento.

Analisi:

• Eseguire le analisi statistiche pianificate;

• mettere i dati in grafico e, se previsto dall’esperimento, confrontarli con curve teoriche;
• trarre le conclusioni dell’esperimento e, se necessario, formulare nuove ipotesi.

Lo schema descritto può, in alcuni casi, essere ciclico. Ad esempio, quando l’esecuzione di un
esperimento porta alla formulazione di nuove ipotesi, queste andranno poi verificate
sperimentalmente.

2.2 L’uso di Internet nella ricerca biochimica

Negli ultimi anni si è assistito al rapido sviluppo di un settore dell’informatica che si occupa del
trattamento e dell’analisi dei dati biologici: la bioinformatica. L’esplosione di questa disciplina
scientifica che è ormai divenuta uno strumento essenziale in qualsiasi laboratorio di ricerca, è
dovuta al rapido accumularsi di enormi quantità di dati biologici (basti pensare al recente
sequenziamento di interi genomi, tra cui quello umano) ed al concomitante sviluppo dei mezzi
informatici e di telecomunicazione. Le problematiche classiche di cui si occupa la bioinformatica
sono la gestione e la consultazione delle banche dati (collezioni di dati biologici relativi alla
sequenza, struttura e funzione di macromolecole, organizzati in modo da facilitarne l’accesso e la
ricerca), l’allineamento delle sequenze e lo studio dell’evoluzione molecolare, la predizione della
struttura tridimensionale delle proteine. Le principali banche dati e numerosissimi software
applicativi sono ormai alla portata di ogni laboratorio tramite la World Wide Web (WWW) e
vengono utilizzati quotidianamente da migliaia di ricercatori in tutto il mondo. Internet è uno
strumento eccezionale in quanto offre ai ricercatori la possibilità di comunicare tra loro in tempo
reale e di disporre di informazioni sempre aggiornate. Oltre che alle collezioni di dati biologici è
infatti possibile accedere a banche dati gratuite che contengono praticamente tutta la letteratura
scientifica pubblicata negli ultimi venti-trenta anni e che consentono di operare ricerche in base a
parole chiave.

2.3 Come effettuare una ricerca bibliografica

Se è ancora vero che molte delle idee che si trasformano in progetti di ricerca nascono dalla
consultazione della letteratura scientifica non è più vero che le ricerche bibliografiche si fanno in
biblioteca. Il facile accesso ad Internet ha infatti modificato irreversibilmente il modo di effettuare
una ricerca bibliografica. Riassunti e intere pubblicazioni di ricerca sono ottenibili consultando uno
dei motori di ricerca più utilizzati allo scopo, PubMed, disponibile liberamente all’interno di un
sito curato dal National Center for Biotechnology Information (NCBI). L’indirizzo di questo sito
è http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/. La pagina iniziale è costituita da una finestra al cui
interno vanno inseriti i parametri di ricerca quali una o più parole chiave, il nome di uno o più
8
autori, la rivista o una combinazione di questi parametri. Per evitare di ottenere dalla ricerca una
grande quantità di articoli scientifici, è bene impostare degli opportuni limiti nella pagina che
compare “cliccando” su “Limits”. In questo modo la ricerca può essere ristretta al titolo, al riassunto
o al testo delle pubblicazioni, ad una determinata rivista, ad un determinato periodo riguardante la
data di pubblicazione, ad un tipo particolare di pubblicazione (articolo di rivista, articolo originale,
sperimentazione clinica) etc. Il risultato della ricerca consisterà in un elenco di articoli, in ordine
cronologico a partire dalla pubblicazione più recente, indicante solo titolo, autori e riferimenti
bibliografici. Per approfondire il campo della ricerca è possibile “cliccare” sul titolo della
pubblicazione e si accederà al riassunto della pubblicazione o, se si è sottoscritto un abbonamento,
all’intera pubblicazione. Alcune riviste sono disponibili gratuitamente a tutti. Se potete disporre di
un computer collegato ad Internet, provate ad eseguire voi stessi una ricerca bibliografica su un
argomento di vostro interesse o di cui avete sentito parlare a lezione. Imparare ad usare un motore
di ricerca come PubMed può essere estremamente utile.

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3. PREPARAZIONE ED UTILIZZO DI SOLUZIONI

3.1 Strumenti per lavorare con i liquidi

Esistono una varietà di contenitori e strumenti che servono per conservare, prelevare e misurare
i liquidi. La forma ed il materiale di tali oggetti sono stati ideati per assolvere ad una determinata
funzione. E’ quindi indispensabile conoscere ed imparare ad usare al meglio questi strumenti per
poter lavorare agevolmente e con accuratezza in laboratorio. Essi possono essere di vetro o di
plastica; importanti sono le differenze tra i due materiali. I recipienti in plastica, infatti, presentano
con il tempo una tendenza alla deformazione e questo può comportare misure non accurate dei
volumi; inoltre la plastica si distorce a temperature relativamente basse, può essere infiammabile e
si può sciogliere a contatto con determinati solventi organici. A volte però può essere conveniente
utilizzare oggetti di plastica perché sono infrangibili e generalmente poco costosi. I recipienti in
vetro, invece, devono essere utilizzati con molta cautela essendo fragili e, una volta rotti, molto
taglienti. Il vetro Pyrex è molto utilizzato in laboratorio perché è più forte del vetro comune e può
resistere a temperature fino a 500°C. Naturalmente un adeguato utilizzo della strumentazione
comporta anche un’accurata pulizia degli strumenti per evitare il rischio di contaminazione dovuto
all’utilizzo precedente.

Di seguito vengono elencati alcuni strumenti utilizzati per lavorare con i liquidi (Fig. 2).

Contenitori per liquidi - Le soluzioni possono essere conservate utilizzando diversi contenitori
quali:

• Provette: sono utili ad esempio per reazioni su piccola scala, per la raccolta di frazioni
provenienti da una separazione cromatografia, per la conservazioni di piccoli volumi di
liquido;

• Beaker: si usano per scopi quali la preparazione di soluzioni (anche con riscaldamento) o
tamponi (e quindi anche per portare a pH le soluzioni), l’esecuzione di una titolazione, etc.
Possono convenientemente contenere delle barrette magnetiche che servono per il
mescolamento (vedi dopo). Solitamente presentano una scala graduata su un lato, che però è
poco accurata e non può essere usata per misure di volume;

• Beute: sono utili per la conservazione delle soluzioni data la loro forma slargata in basso e
con una piccola apertura facilmente sigillabile che diminuisce il rischio di evaporazione.
Vengono anche usate per la crescita di colture cellulari;

• Bottiglie e flaconi: si usano per mantenere le soluzioni sterili e sigillate; sono dotate di
tappo a vite che impedisce sia l’evaporazione che la contaminazione.

Strumenti usati per il prelievo e/o la misurazione del volume dei liquidi:

• Pipette Pasteur: pipette di vetro che ad un’estremità sono assottigliate a formare un

capillare. Ne esistono in una versione con capillare corto ed una con capillare lungo. Vanno
utilizzate tramite un bulbo di gomma (tettarella), che serve per aspirare e rilasciare il liquido.
Il giusto modo di mantenere una pipetta consiste nell’afferrarla con il dito medio
mantenendola in posizione verticale ed erogare il liquido premendo il bulbo con il pollice e
l’indice. Una pressione più tenue permetterà la fuoriuscita del liquido a gocce. È importante
ricordare di non mettere mai la pipetta sul fianco in modo da evitare qualsiasi risalita del
liquido fino al bulbo.
10
a) b) c)

d) e) f)

g)

Fig. 2

a) Beaker
b) Beute
c) Bottiglie e flaconi
d) Pipetta Pasteur
e) Cilindri
f) Palloni volumetrici
g) Burette
h) Pipette graduate
h) i) Pipette a bulbo

i)

11
• Cilindri: sono dei contenitori cilindrici graduati che esistono in vari formati e servono a
misurare con accuratezza il volume dei liquidi. E’ importante utilizzare il formato
opportuno per ottenere la massima accuratezza nella misura. Il liquido viene introdotto
all’interno di questi contenitori fin quasi al livello desiderato. A questo punto si procede
con piccole aggiunte, o attraverso l’uso di una pipetta Pasteur, facendo scorrere il liquido
lungo le pareti del recipiente fin quando il menisco non avrà raggiunto il livello
desiderato. È necessario lavorare su di una superficie ben livellata durante queste
operazioni in modo da non avere misure falsate.

• Palloni volumetrici: sono dei contenitori di vetro con una forma simile ad un fiasco,
costituiti da una base allargata ed un collo stretto e lungo, sul quale è presente una tacca
che indica il volume. Vengono usati per portare a volume e conservare le soluzioni.

• Burette: sono colonne di vetro graduate montate verticalmente su un supporto con pinza
e dotate di un rubinetto mediante il quale è possibile regolare la fuoriuscita del liquido. Il
loro utilizzo consiste nel riempire la colonna con il liquido e osservare l’altezza del
menisco. A questo punto si procede aprendo il rubinetto e erogando il liquido fin quando
necessario e misurando il nuovo livello del menisco. La differenza tra i due volumi
osservati rappresenterà il volume erogato. Vengono usate soprattutto nelle titolazioni.

• Pipette: si dividono in pipette graduate e pipette a bulbo. Le prime corrispondono a

pipette in plastica o in vetro graduate da zero al volume massimo e dal volume massimo
a zero, mentre le seconde mostrano il volume totale sul bulbo. Prima di procedere al
prelevamento è importante quindi fare attenzione alla scala graduata dello strumento. È
inoltre buona norma non pipettare con la bocca per ragioni di sicurezza ed utilizzare
invece appositi strumenti (pompette aspiranti) che permettono di prelevare ed erogare il
volume di liquido desiderato.

• Micropipettatori: servono per prelevare e dispensare piccoli volumi di liquido. Ne

esistono di varie marche e modelli, più o meno accurati e costosi. Per garantire la
massima accuratezza sono disponibili micropipettatori che operano in intervalli di
volume diversi. In laboratorio bisogna quindi disporre di una serie di micropipettatori. Il
volume massimo prelevabile dallo strumento è indicato sul bottone all’estremità dello
stantuffo (Fig. 3), da cui prende il nome il modello: ad esempio una serie completa è
costituita dai modelli SL2, SL10, SL20, SL200, SL1000, SL5000. Per ogni modello
esiste anche un volume minimo prelevabile con un’accuratezza accettabile. Ad esempio,
per il modello SL 200 questo volume corrisponde a circa 20 microlitri. Se si devono
prelevare15 microlitri si userà il modello SL20.
Le operazioni che devono essere eseguite per usare un micropipettatore sono:
Taratura: per impostare il volume che si vuole prelevare, si utilizza la ghiera di
regolazione. Ruotando questo anello è possibile cambiare i tre numeri della scala, o
volumetro, che letti dall’alto al basso indicano il volume desiderato. Per una corretta
lettura dei numeri del volumetro considerate il pipettatore che state usando; ad esempio
la lettura 100 su una SL200 indica un volume di 100 µl; la lettura 100 su una SL1000
indica invece un volume di 1000 µl!
Aspirazione: si inserisce un puntale in polipropilene monouso all’estremità della canna
premendo su di esso con un leggero movimento di torsione; è necessario infatti
assicurarsi che il puntale sia inserito correttamente per evitare eventuali fuoriuscite di
liquido dalla punta o il distacco del puntale. Esistono puntali diversi per i vari modelli di
micropipettatori; in particolare si distinguono puntali per SL2 e SL10 (di colore bianco)
per SL20, SL100 e SL200 (di colore giallo) e per la SL1000 (di colore blu). Vengono
forniti in buste o in scatole; possono essere sterilizzati in autoclave.
12
 Bottone dello
stantuffo
Pulsante per
1 Ghiera per la
regolazione del l’espulsione
del puntale
volume

Indicatore del
0 volume

0
Se questi sono i numeri Canna
Espulsore del
segnati dal volumetro, il puntale

volume prelevato sarà 10,0 µl

nel caso di un modello SL20,
100 µl se usiamo un SL200 o Puntale in
polipropilene
1000 µl nel caso di un SL1000
Fig. 3

Tenendo il pipettatore verticale, si preme con il pollice il bottone dello stantuffo fino a
incontrare una prima resistenza (stop a molla), quindi si inserisce (non troppo)
l’estremità del puntale nel liquido da prelevare e si rilascia lentamente lo stantuffo.
Osservate il liquido che sale nel puntale e controllate che non ci siano bolle d’aria.
Attendete un paio di secondi per confermare che il liquido è stato aspirato quindi ritirate
il puntale dal liquido. Fate poi un rapido controllo visivo del liquido nel puntale: ad
esempio un volume di 100 µl dovrebbe occupare approssimativamente metà del volume
di un puntale giallo. Se il liquido da prelevare è molto viscoso si possono incontrare
problemi nella fase di aspirazione (è molto lenta, bisogna perciò rilasciare lo stantuffo
molto dolcemente) e nel fatto che, dopo aver estratto il puntale dal liquido, resterà una
goccia di liquido sull’estremità del puntale. E’ importante asciugare questa goccia per
evitare che il volume dispensato sia maggiore di quello desiderato.
Erogazione: mettete l’estremità del puntale contro la parete del recipiente con un piccolo
angolo di inclinazione (10-20°) e premete lo stantuffo lentamente questa volta oltre la
prima resistenza fino allo stop finale facendo uscire tutto il liquido. Rimuovete il puntale
dal recipiente con lo stantuffo ancora premuto. Espellete il puntale premendo l’apposito
pulsante per l’espulsione; i puntali vanno scartati in opportuni contenitori di raccolta.

• Siringhe: si usano immergendo la punta dell’ago nella soluzione e sollevando

lentamente lo stantuffo fino al punto desiderato sulla scala graduata. Assicurarsi di non
aver aspirato bolle d’aria. Le microsiringhe devo essere pulite prima e dopo l’uso
aspirando ed espellendo ripetutamente solvente puro.

13
3.2 Preparazione delle soluzioni

Aver chiaro il concetto di concentrazione è di estrema importanza nella preparazione delle

soluzioni. Per concentrazione si intende di solito la quantità di una determinata sostanza disciolta in
un’unità di volume. La quantità viene comunemente espressa in moli o in unità di massa. Nel primo
caso, la concentrazione ha le dimensioni di moli/L e viene detta concentrazione molare (o molarità,
che viene abbreviata con M). Nel secondo caso la concentrazione ha le dimensioni di g/L. Si usano
anche altre unità di misura della concentrazione, quali la percentuale di peso/volume, peso/peso o
volume/volume. La % peso/volume si riferisce ai grammi di soluto disciolti in 100 ml di soluzione;
la % peso/peso ai grammi di soluto disciolti in 100 g di soluzione; la % volume/volume, che si usa
per miscele di liquidi, indica gli ml di un liquido disciolti in 100 ml di soluzione (ad esempio una
soluzione di etanolo in acqua al 30% è costituita da 30 ml di etanolo e 70 ml di acqua).
Nella preparazione di una soluzione acquosa il primo aspetto da tener presente è il tipo di acqua da
utilizzare, ovvero il grado di purezza dell’acqua necessario. L’acqua che proviene dalla rete idrica
normalmente contiene alte concentrazioni di sali (carbonato di calcio) e quindi non può essere usata
per preparare soluzioni a composizione controllata. Normalmente viene utilizzata acqua distillata o
deionizzata (acqua dalla quale sono stati eliminati la maggior parte degli ioni disciolti, tramite il
passaggio attraverso colonne cromatografiche a scambio ionico). Nei casi in cui si renda necessario
un grado di purezza maggiore, si può usare acqua bidistillata o acqua che proviene da sistemi di
purificazione molto efficienti che si trovano in commercio.
Nel momento in cui si scioglie un composto in un liquido è necessario assicurarsi che questo si sia
completamente disciolto. Si possono usare diversi dispositivi:

• L’agitatore magnetico (Fig. 4) è il mezzo più conveniente per ottenere soluzioni omogenee.
Questo apparecchio è costituito da una piastra sotto la quale un motorino elettrico fa girare
un magnete, con velocità che può essere regolata. Esistono versioni di questo apparecchio in
cui la piastra, di metallo, contiene una resistenza elettrica che può fornire calore. Alcuni
soluti infatti si sciolgono meglio se il solvente è caldo. Il soluto che deve esser disciolto
viene versato all’interno di un beaker, in cui si inserisce anche una barretta magnetica; il
contenitore viene quindi posto al centro del piatto agitante e si aumenta gradualmente la
velocità di agitazione. Quando il composto da sciogliere mostra resistenza è necessario unire
all’agitazione la somministrazione di calore. Si deve però deve tener conto della natura della
soluzione, che potrebbe danneggiarsi ad alte temperature. Al termine del procedimento
spegnere l’agitatore e prelevare il magnete utilizzando un altro magnete, facendo molta
attenzione a non contaminare la soluzione. Infine sciacquare i magneti con acqua distillata.

• I mescolatori a vortice (vortex; Fig. 5) consentono un mescolamento vigoroso di piccoli

volumi di soluzione. Il soluto ed il solvente vengono posti in un tubo che va poi appoggiato
su un apposito alloggiamento di gomma. I vortex posseggono un interruttore che ha tre
posizioni: in una lo strumento è spento, nella seconda è acceso ma l’alloggiamento di
gomma incomincia a ruotare solo in seguito ad una pressione decisa esercitata sul tubo, nella
terza l’alloggiamento di gomma è in continuo movimento. L’uso di questo strumento
prevede una regolazione attenta della velocità di vibrazione per evitare che la soluzione esca
dal tubo.

• I bagni agitanti sono delle vasche d’acqua termostatata che consentono un mescolamento
controllato della soluzione ad una data temperatura.

Nota Bene. Alcune macromolecole biologiche, come proteine o lunghe molecole di DNA, sotto
agitazione, vibrazione o riscaldamento possono essere danneggiate. Durante la preparazione di una
soluzione ricordate inoltre di etichettare le vostre provette con il nome dei soluti, la loro

14
concentrazione e il pH misurato, la data di preparazione, il vostro nome ed eventuali note sulla
pericolosità del prodotto.

Una volta disciolti i soluti nel beaker (avendo utilizzato un volume di solvente inferiore al volume
finale della soluzione che si vuole preparare), se necessario si porta a pH la soluzione aggiungendo
un acido o una base e misurando il pH tramite un pHmetro (vedi dopo), quindi la si trasferisce in un
cilindro e si aggiunge ancora solvente fino a raggiungere il volume desiderato.

• Un pHmetro (Fig. 6) è uno strumento costituito da un elettrodo da pH accoppiato ad un

potenziometro. L’elettrodo da pH è in realtà formato da due sistemi separati: un elettrodo di
vetro sensibile ai protoni ed un elettrodo di riferimento insensibile ai protoni. Immergendo
l’elettrodo da pH in una soluzione si può misurare la differenza di potenziale tra i due
elettrodi, la quale dipende dalla concentrazione di protoni e quindi consente di risalire,
tarando opportunamente lo strumento, al pH. I pHmetri moderni convertono
automaticamente la differenza di potenziale in pH e mostrano tale valore su un apposito
schermo. Se si usa un pHmetro per la prima volta è molto importante leggere il manuale
dello strumento per conoscere il modo in cui va usato, al fine di ottenere delle misure
accurate e evitare di danneggiare l’elettrodo. Quest’ultimo va mantenuto in un’apposita
soluzione e va lavato con acqua distillata prima e dopo ogni immersione nelle soluzioni.
Quando si vuole misurare il pH di una soluzione bisogna tener conto della concentrazione
dei sali in essa contenuti. Se tale concentrazione è molto elevata l’utilizzo di un pHmetro
non sarà possibile in quanto i sali interferiranno con la misura della differenza di potenziale
dovuta solo ai protoni. Prima di utilizzare un pHmetro si deve calibrare lo strumento.
Molti pHmetri correggono automaticamente l’effetto della temperatura sul pH. In questi
strumenti bisogna regolare un’apposita manopola sulla temperatura della soluzione. Quindi
si immerge l’elettrodo in una soluzione di riferimento a pH 7 e si regola il controllo di
calibrazione fino a che sullo schermo non viene mostrato il valore corrispondente. Questa è
una calibrazione “a singolo punto”. Molti strumenti consentono di effettuare calibrazioni a
doppio punto, utilizzando oltre che una soluzione di riferimento a pH 7 anche una seconda a
pH 4 o 9, a seconda dell’intervallo di pH in cui lo strumento dovrà operare.

Fig. 6 pHmetro
Fig. 4 Agitatore magnetico

Fig. 5 Vortex

15
3.3 Soluzioni “stock” e diluizioni

Quando si ha la necessità di preparare spesso una soluzione dello stesso composto (a volte
anche a concentrazioni differenti) è utile partire da una soluzione “stock”, cioè una soluzione più
concentrata di quelle da preparare. Normalmente le soluzioni “stock” vengono preparate in volumi
sufficienti per molte diluizioni, come nel caso delle soluzioni tampone, utilizzando palloni
volumetrici per raggiungere l’esatto volume (assicurandosi che il menisco della soluzione sia a
livello del segno di calibrazione del pallone) e agitatori magnetici per disciogliere il soluto. Una
soluzione così concentrata viene utilizzata effettuando delle diluizioni. Supponiamo di avere una
soluzione di NaCl 3M come soluzione “stock” e di voler preparare 50 ml di una soluzione di NaCl
0,1M. Il calcolo da fare si basa sulla proporzione V1 x C1=V2 x C2, in cui V1 è il volume da
prelevare dalla soluzione stock e rappresenta nel nostro caso l’incognita di questa equazione, C1 è il
valore della concentrazione della soluzione stock, V2 è il volume di soluzione che intendiamo
preparare e C2 è il valore della sua concentrazione. Nel caso del nostro esempio, V1 x 3M=50mL x
0,1M. Si ottiene così che il volume da prelevare dalla soluzione stock è di 1,7 ml. Bisogna infine
portare la soluzione al volume stabilito, che è di 50 ml, aggiungendo 48,3mL (50mL – 1,7mL =
48,3mL) di acqua distillata.
In alcuni casi è necessario preparare una serie di soluzioni dello stesso soluto a concentrazione
diversa. In questo caso è utile, al fine di garantire la massima accuratezza, effettuare delle diluizioni
seriali. Le diluizioni seriali prevedono la preparazione di soluzioni a concentrazione decrescente e
separate da un rapporto di diluizione costante a partire da un'unica soluzione “stock”. Il valore del
rapporto di diluizione si ottiene facilmente dal rapporto C2 / C1. Per esempio, se dobbiamo preparare
50 ml di una soluzione 10mM a partire da una soluzione 100mM il rapporto di diluizione sarà 0.1,
cioè di 1 a 10. Quindi preleveremo 5 ml dalla soluzione stock (50mL x 0.1) portando a volume con
45 ml di acqua distillata. Se vogliamo diluire di dieci volte la soluzione appena preparata dobbiamo
usare lo stesso procedimento, prelevando 5 ml e aggiungendo 45 ml di acqua distillata. In questo
modo è possibile arrivare a diluizioni molto grandi mantenendo un’accuratezza molto elevata.

3.4 Uso delle bilance

Le bilance ormai in uso in tutti i laboratori sono a lettura digitale, offrendo il vantaggio di una
facile lettura dei valori e la possibilità di effettuare la tara automaticamente.
Di solito in un laboratorio ben attrezzato sono presenti sia una bilancia analitica che una bilancia
tecnica. Il primo tipo di bilancia offre un’accuratezza di circa un milligrammo in un intervallo che
va fino a 100 g. Una bilancia tecnica è accurata al decimo di grammo e può pesare fino a 3 Kg.

Per un corretto uso della bilancia occorre:

• controllare che la bilancia sia in piano e non esposta a correnti d’aria;

• porre un recipiente vuoto sulla bilancia (se si usa una bilancia analitica usare un foglio di
carta o alluminio e comunque evitare di usare recipienti pesanti più di pochi grammi) e
lasciare che la lettura si stabilizzi. Per portare la lettura a zero premere il tasto della tara;
• deporre nel recipiente la sostanza da pesare utilizzando una spatola pulita di dimensioni
adatte, facendo molta attenzione a non lasciar cadere parti al di fuori del recipiente;
• lasciare che la lettura si stabilizzi per prendere nota del valore. Se il prodotto aggiunto è in
eccesso prestare molta cura nel rimuoverlo;
• evitare di urtare in qualsiasi modo il piatto della bilancia;
• al termine della misura spegnere lo strumento e pulire eventuale materiale versato
accidentalmente sul piatto della bilancia.

Un uso errato della bilancia può compromettere la riuscita della preparazione di una soluzione.
16
3.5 Riscaldamento e raffreddamento dei campioni

Quando si rende necessario riscaldare dei materiali organici bisogna prestare molta attenzione al
pericolo di incendio o di ustioni dovuto a liquidi riscaldati o vetri incandescenti. Il riscaldamento di
un campione può avvenire mediante un blocchetto elettrico riscaldante termostato oppure con un
becco Bunsen. L’uso del Bunsen richiede molta attenzione: bisogna stare lontano dalla fiamma,
legare eventuali capelli lunghi sulla nuca e spegnerlo sempre quando non serve. Per accendere il
Bunsen bisogna chiudere il foro dell’aria e avvicinare un accendino acceso al becco, per regolare la
fiamma utilizzare la manopola d’apertura del foro dell’aria.
I frigoriferi e i congelatori consentono di conservare soluzioni stock e sostanze che si
degraderebbero o verrebbero contaminate a temperatura ambiente. Le temperature normali dei
frigoriferi e congelatori sono rispettivamente circa 4 °C e –15 °C (-20 °C). Con un congelatore a –
70 °C si possono conservare campioni a lungo termine. Alcuni campioni biologici possono essere
conservati in azoto liquido alla temperatura di circa –150 °C. Durante l’esecuzione di un
esperimento può capitare di dover conservare sul bancone dei campioni a basse temperature. Allo
scopo si può usare un bagno di acqua e ghiaccio che consente di mantenere la temperatura dei
campioni vicino a 0 °C o anche un bagno di etanolo e ghiaccio secco.

17
4. ESERCITAZIONI

18
 4.1 USO DEI MODELLI MOLECOLARI

Modello a pallina e bastoncino Modello spaziale

La costruzione e l’analisi di modelli in scala di strutture molecolari risulta un approccio

sperimentale molto utile all’analisi delle relazioni tra struttura e funzione di composti organici di
interesse biologico. Lo scopo di questa esercitazione è quello di:

• conoscere le principali strategie per la costruzione di modelli molecolari, mediante la

realizzazione di modelli di aminoacidi e peptidi;

• analizzare i concetti di stereoisomeria ed effettuare considerazioni sulla configurazione degli

aminoacidi e dei peptidi, ricorrendo a modelli molecolari tridimensionali;

• analizzare gli aspetti conformazionali di catene polipeptidiche ed effettuare considerazioni

sulla correlazione struttura-funzione.

PRIMA PARTE: “Costruzione dei modelli molecolari degli aminoacidi Glicina, Alanina, Prolina,
Treonina, Cisteina ed Istidina”.

Si consiglia di procedere nel seguente modo:

1. calcolare le lunghezze dei legami presenti nelle strutture degli aminoacidi da costruire
nella nuova scala 1 : 2 x 108 (vedi allegato n.1);

2. definire il tipo e il numero delle "palline" e "bastoncini" da utilizzare per una reale
rappresentazione in scala 2 x 108 della struttura degli aminoacidi richiesti (allegato n.1);

3. costruire i modelli molecolari richiesti.

N.B. prima di procedere, far verificare i modelli ai docenti coordinatori;

4. infine utilizzare i modelli molecolari costruiti per rispondere alle domande proposte in
allegato n. 3.
N.B. far verificare le risposte ai docenti coordinatori.

19
SECONDA PARTE: “Costruzione dei modelli molecolari di un esapeptide di composizione LGly,
LAla, LPro, LCys, LThr, LHis”

Si consiglia di procedere nel seguente modo:

1. dopo aver effettuato e concluso la prima parte, costruire l’esapeptide, per “allungamento”
della catena polipeptidica dall’N-terminale al C-terminale.

2. infine, utilizzare il modello molecolare costruito per rispondere alle domande proposte in
allegato n.4.
N.B. far verificare le risposte ai docenti coordinatori.

ALLEGATO N.1

legame (---) lunghezza reale (in Å) lunghezza (in

cm) nel
modello in
scala 1:2x108
Csp3 --- Csp3 1.54
Csp3 --- O 1.43
3 3
Csp --- Nsp 1.47
3
Csp --- S 1.82
Csp3 --- H 1.07
3
Nsp --- H 0.99
O --- H 0.97
S --- H 1.03
2 2
Csp --- Csp 1.33
Csp2 --- O (legame peptidico) 1.22
2
Csp --- O (gruppo carbossile) 1.25
2
Csp --- H 1.08
Csp2 --- Nsp2 (legame peptidico) 1.32
3 2
Csp --- Csp 1.50

20
 ALLEGATO N.2

Nome Abbr. Struttura lineare

Glicina gly, G NH2-CH2-COOH

Alanina ala, A CH3-CH(NH2)-COOH

Treonina thr, T CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH

Prolina pro, P NH-(CH2)3-CH-COOH

|_________|

Istidina his, H N=C-NH-C=C-CH2-CH(NH2)-COOH

|_________|

Cisteina cys, C HS-CH2-CH(NH2)-COOH

ALLEGATO N.3
1. Quanti centri chirali ci sono nella struttura degli aminoacidi costruiti?

Glicina

Alanina

Treonina

Istidina

Cisteina

Prolina

21
Dopo aver attentamente verificato la stereoisomeria dei modelli molecolari costruiti, indicare la
configurazione, secondo il sistema RS, dei carboni chirali.

Carbonio alfa Carbonio beta

Glicina

Alanina

Treonina

Istidina

Cisteina

Prolina

2. Un legame peptidico si forma per condensazione del gruppo aminico di un aminoacido e il

gruppo carbossilico di un secondo aminoacido, con perdita di una molecola di acqua.
Costruire, sulla base di questa informazione, il modello molecolare di un dipeptide
utilizzando due dei sei aminoacidi costruiti.

3. L’analisi di strutture di cristalli di molecole contenenti 1 o più legami peptidici ha rilevato

che la distanza tra gli atomi dell’N e del C di un legame peptidico risulta 0.15 Å (10%) più
breve del legame azoto-carbonio alfa (N-Calfa) e 0.7 Å più lungo di un normale legame
carbonio carbonilico-azoto (C=N).

Questo è stato interpretato considerando il legame peptidico un ibrido di risonanza tra un

legame singolo ed un legame doppio. A causa di questo parziale carattere di doppio legame, il
legame peptidico è planare. Utilizzando questa informazione, imporre la planarità al legame
peptidico costruito, chiedendo ai docenti gli appositi dispositivi previsti dalla modellistica in
uso.

4. Osservando il dipeptide costruito e così perfezionato, indicare quale dei due stereoisomeri
geometrici è stato costruito.

5. Effettuare considerazioni sulle interazioni steriche dell’Ossigeno carbonilico, dell’Idrogeno

e delle catene laterali, che influenzano la stabilità delle diverse configurazioni del dipeptide
realizzato.

ALLEGATO N.4
1. Indicare la sequenza aminoacidica del peptide costruito

2. Far adottare all’esapeptide un andamento ad alfa-elica, richiedendo ai docenti gli appositi

dispositivi previsti dalla modellistica in uso per imporre un legame idrogeno.

22
 4. 2 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE SU STRATO SOTTILE

Breve introduzione teorica

La cromatografia è una metodologia basata sulla separazione di molecole in base alle loro
specifiche proprietà chimiche e fisiche come ad esempio la capacità di formare legami deboli, la
massa molecolare, la carica o la solubilità.
Questa tecnica richiede l’uso di due componenti:

1. un supporto solido, un gel o un liquido che costituisce la fase stazionaria;

2. una fase mobile, ovvero un liquido o un gas in cui sono disciolti i composti che si vogliono
separare e che si fa passare attraverso la fase stazionaria.

In questo modo le molecole disciolte nella fase mobile saranno ripartite in modo differenziale tra le
due fasi e quindi separate durante la corsa cromatografica in base alle loro proprietà chimiche e
fisiche.

Nella cromatografia su strato sottile, la fase stazionaria è costituita da una pellicola d’acqua
adsorbita su uno strato di gel di silice o di cellulosa, il quale viene deposto su una lastra di vetro o di
alluminio. Il campione (una piccola aliquota) viene applicato in prossimità dell’estremità inferiore
della lastra, ad una distanza opportuna (Fig. 7). A questo punto, la lastra viene trasferita in un
recipiente chiuso contenente la fase mobile, cioè una opportuna miscela di solventi, compresa
dell’acqua, e fatta eluire. Lo strato di silice, per capillarità, aspirerà la miscela verso l’alto con la
contemporanea stratificazione della pellicola d’acqua e la separazione delle diverse componenti del
campione. I composti polari migreranno più lentamente di quelli apolari. Una volta che il solvente
ha raggiunto circa l’80% della lunghezza della lastra, questa può essere rimossa, asciugata e i
composti separati possono essere rivelati con vari sistemi. I valori della mobilità relativa dei diversi
composti possono essere determinati in base al rapporto

distanza percorsa dalla sostanza

Rf =
distanza percorsa dal solvente

Questo valore è per ciascun composto una costante e dipende strettamente dal suo coefficiente di
distribuzione tra fase stazionaria e fase mobile, ovvero dal rapporto delle concentrazioni del
composto in queste due fasi.

Fig.7 Componenti di un sistema di cromatografia su strato sottile

23
Protocollo

Scopo dell’esercitazione è quello di separare una miscela di aminoacidi a composizione ignota ed

identificarne le componenti per confronto con degli aminoacidi standard.

1. Si prende la lastrina di gel di silice e si traccia una riga con la matita (senza pigiare troppo
per evitare di scrostare lo strato sottile) ad 1 cm dal bordo inferiore. Quindi si depongono
con un capillare 2-3 µl dei campioni standard (alanina 2 mM, istidina 2 mM, leucina 2 mM)
e 2-3 µl della miscela a composizione ignota. Prima contrassegnare con una matita il punto
di applicazione di ciascun campione. Si lasciano asciugare i campioni.

2. Si mette poi la lastrina nella vaschetta cromatografica (in cui sono stati versati 100 ml di una
miscela di butanolo : acqua : acido acetico 3:1:1), immergendola dal lato dove sono stati
deposti i campioni. Il solvente sale per capillarità; quando è arrivato a circa 1 cm dal bordo
superiore, si estrae la lastrina, si segna con la matita la posizione del fronte del solvente e si
asciuga molto bene con aria calda.

3. Si spruzza quindi la lastrina con una soluzione di ninidrina 0,5% (p/v) in acetone e si
asciuga immediatamente con aria calda.

4. Una volta rivelati gli aminoacidi, si calcola per ognuno il valore di Rf. Si procede alla
identificazione dei componenti della miscela tramite il confronto dei valori di mobilità
relativa (Fig. 8).

Fronte

B1
B2
B3
Linea di deposizione dei campioni
1 2 3 MIX

Fig. 8 In questo esempio, i campioni 1, 2 e 3 rappresentano gli aminoacidi standard ed il MIX è una
loro miscela. Si intuisce dalla figura come la composizione della miscela possa essere
identificata tramite il confronto con gli aminoacidi standard. I valori di Rf si calcolano
facendo i rapporti B1/A, B2/A e B3/A.

24
 4. 3 PURIFICAZIONE DELLA SERINA IDROSSIMETILTRASFERASI (SHMT)

4.3.1 Lisi dei batteri, frazionamento con solfato di ammonio e dialisi

Breve introduzione teorica

Lo studio delle molecole biologiche richiede innanzi tutto la loro separazione dal materiale di
partenza (cellule e tessuti) mediante tecniche di distruzione cellulare. La difficoltà di questo
processo di separazione dipende dalla complessità del sistema cellulare con il quale si sta operando.
I batteri ad esempio sono circondati da una parete cellulare rigida mentre le cellule animali possono
essere distrutte con tecniche più blande, non essendo circondate da alcuna parete. La rottura delle
cellule deve avvenire in una soluzione tampone che mantenga l’integrità delle macromolecole
biologiche rilasciate e che quindi, oltre ad avere un opportuno pH ed una forza ionica adeguata,
contenga almeno un antiossidante, un agente chelante per evitare la formazione di mercapturi e, se
si vuole purificare una proteina, degli inibitori delle proteasi.

Le tecniche di distruzione di tessuti e cellule possono avvalersi di metodi meccanici e non

meccanici.

Metodi non meccanici:

• congelamento e scongelamento in cui la membrana cellulare o la parete cellulare vengono

danneggiate con il rilascio dei componenti intracellulari nell’ambiente;
• uso di enzimi litici che degradano la parete cellulare o le membrane cellulari facilitando la
rottura delle cellule per shock osmotico o mediante trattamenti meccanici blandi;
• shock osmotico in cui le cellule vengono poste inizialmente in una soluzione ipertonica con
conseguente fuoriuscita di acqua dalla cellula e in un secondo momento in una soluzione
ipotonica, ad esempio mediante diluizione della stessa soluzione, permettendo l’ingresso
dell’acqua nella cellula fino a farla scoppiare.

Metodi meccanici:

• mulino a sfere: utilizzato per batteri e funghi, è uno strumento costituito da sfere di vetro
che per vibrazione collidono con le cellule e le distruggono;
• omogenizzatori: sono costituiti da 2 componenti, un pestello di vetro smerigliato e un tubo
di vetro (Fig. 9). Durante la rotazione in modo alternato del pestello le cellule vengono
spinte sulle pareti del tubo e a causa della forza loro impressa sono costrette a rilasciare il
loro contenuto. In alcuni casi l’omogeneizzazione viene ottenuta tramite l’utilizzo di
speciali frullatori;
• sonicatori: sfruttano l’azione di onde ultrasoniche prodotte mediante l’uso di una sonda
metallica immersa in una soluzione acquosa di cellule.

I metodi meccanici comportano accorgimenti particolari a causa della contemporanea produzione di

calore che potrebbe denaturare le proteine e che quindi deve essere dissipato facendo in modo che
sia il materiale di partenza che il mezzo di omogeneizzazione siano raffreddati, ad esempio
mediante l’uso di ghiaccio o direttamente in camera fredda.

Una volta ottenuta la rottura delle cellule, le proteine possono essere precipitate mediante aggiunta
di sali, attraverso un fenomeno detto “salting out”. Questo è dovuto al fatto che gli ioni di alcuni
sali, aggiunti alla soluzione, sono causa di una riduzione delle interazioni tra le proteine ed il
25
solvente e quindi favoriscono l‘aggregazione e la precipitazione. Inoltre, differenti proteine
precipitano a concentrazioni diverse di sali e quindi la tecnica può essere utilizzata per frazionare
una miscela proteica. Uno dei sali più utilizzati per via della sua elevata solubilità è il solfato di
ammonio (NH4)2SO4. Le proteine precipitate vengono poi sedimentate tramite centrifugazione,
ridisciolte in un opportuno tampone e quindi dializzate per eliminare il sale (Fig. 10).

Fig. 9 Vari modelli di omogeneizzatore.

Fig. 10 Funzionamento della dialisi. Il sacchetto da dialisi è costituito da un materiale permeabile

agli ioni (molecole piccole) ma non alle proteine (molecole grandi). Una volta stabilito
l’equilibrio tra l’interno e l’esterno del sacchetto, la concentrazione del sale si è ridotta in
misura del rapporto tra volume del sacchetto e volume del recipiente. Si può quindi
trasferire il sacchetto in un tampone nuovo e ripetere la dialisi per ridurre ulteriormente la
concentrazione del sale.
26
Protocollo

Materiale a disposizione:

1 portatubi;
3 tubi graduati da 50 ml con tappo a vite marcati con il numero del gruppo di lavoro;
1 tubo da 50 ml contenente tampone potassio fosfato (KPi) 20 mM, pH 6,8;
1 tubo da 1,5 ml marcato con il numero del gruppo di lavoro;
1 tubo da 1,5 ml contenente una soluzione di streptomicina al 21% p/v;
2 pipette di plastica;
1 tratto di tubo da dialisi;
1 calcolatrice.

1) Lisi batterica (già effettuata dagli esercitatori).

La cellule batteriche sono state accresciute in un terreno di coltura Luria-Bertani. In fase di

crescita esponenziale l’espressione della proteina ricombinante è stata indotta tramite aggiunta di
IPTG (isopropiltiogalattopiranoside). Le cellule sono state sedimentate tramite centrifugazione e poi
sospese in un tampone Tris-HCl 50 mM pH 7,5, contenente EDTA. Alla sospensione cellulare è
stato aggiunto il lisozima e dopo 30 minuti il campione è stato congelato. Dopo lo scongelamento la
lisi cellulare appare evidente dalla viscosità del campione, dovuta ai lunghi filamenti di DNA.

2) Precipitazione del DNA con streptomicina.

Ad ogni gruppo vengono dati 20 ml di lisato batterico in un tubo graduato da 50 ml.

Aggiungere 1 ml della soluzione di streptomicina (l’intero contenuto del tubo in dotazione). La
concentrazione finale della streptomicina sarà pari all’1% p/v. Tappare il tubo e mescolare
ripetutamente e delicatamente per inversione. Attendere 10 minuti continuando a mescolare di tanto
in tanto. Si osserverà una diminuzione di viscosità e l’eventuale formazione di grumi biancastri,
dovute alla precipitazione del DNA. Centrifugare il campione per 10 minuti a 9000 g per eliminare i
detriti cellulari ed il DNA precipitato. Durante la centrifugazione, pesare il solfato di ammonio
necessario al passaggio successivo (punto 3) in un tubo da 50 ml pulito. Trasferire 15 ml del
supernatante in un tubo pulito. Prelevare inoltre 1-1,5 ml di supernatante e deporlo nella provetta da
1,5 ml marcata con il numero del gruppo di lavoro. Questo campione verrà conservato ed utilizzato
successivamente per l’analisi elettroforetica ed i saggi di attività enzimatica.

3) Frazionamenti con solfato di ammonio

Aggiungere al campione di 15 ml una quantità di solfato di ammonio tale da raggiungere il

25% di saturazione (vedi tabella). Tappare ed agitare delicatamente fino a che il sale è
completamente disciolto. La soluzione, precedentemente limpida, diventerà torbida, dato che una
frazione delle proteine è precipitata. Questa frazione viene rimossa mediante una centrifugazione di
10 minuti a 9000 g. Trasferire 15 ml del supernatante in un tubo pulito utilizzando una pipetta e
facendo attenzione a non toccare il precipitato.

27
 Aggiungere al campione di 15 ml una quantità di solfato di ammonio tale da raggiungere il
60% di saturazione, utilizzando sempre la tabella per fare i calcoli e ricordando che la soluzione è
già al 25% di saturazione. Agitare delicatamente fino a che il sale è completamente disciolto.
Ancora una volta la soluzione diventerà torbida a causa della precipitazione di un’altra frazione di
proteine, tra cui l’SHMT. Centrifugare per 10 minuti a 9000 rpm.

Rimuovere il supernatante aiutandosi con una pipetta. Il precipitato così ottenuto rappresenta
la frazione di proteine che sono solubili in solfato di ammonio al 25% ma non al 60%. Sciogliere
delicatamente con una pipetta il precipitato utilizzando 10 ml di tampone KPi 20mM pH 6,8.

4) Dialisi

Il materiale ottenuto contiene SHMT in concentrazione maggiore rispetto alla miscela proteica
di partenza e potrà essere utilizzato per il successivo passaggio di purificazione (cromatografia a
scambio cationico). Tuttavia esso contiene un’elevata concentrazione di sale (il solfato di ammonio
utilizzato per i frazionamenti) che va rimossa. La soluzione viene quindi dializzata in un sacchetto
costituito da una membrana permeabile ai sali ma non alle proteine. Prendere un tratto di tubo da
dialisi e chiuderne un’estremità mediante un paio di nodi. Trasferire la soluzione proteica nel
sacchetto così ottenuto mediante una pipetta e quindi chiuderlo con un paio di nodi. Il sacchetto
viene messo in 5 litri di tampone KPi 20 mM pH 6,8. In questo modo i sali presenti nella soluzione
proteica tenderanno ad uscire dal sacchetto fino a raggiungere l’equilibrio. Quindi, la dialisi viene
ripetuta in alri 5 litri di tampone, in modo da diluire ulteriormente il solfato di ammonio. Il tampone
di dialisi è lo stesso con cui verrà equilibrata la colonna cromatografia a scambio cationico.

28
Tabella. Relazione tra grammi di solfato di ammonio aggiunti a una soluzione e percentuale di
saturazione a 25 ºC.
Concentrazione iniziale di solfato di ammonio, percentuale di saturazione

29
 4.3 PUFICAZIONE DELLA SERINA IDROSSIMETILTRASFERASI (SHMT)

4.3.2 Cromatografia a scambio cationico

Breve introduzione teorica

La cromatografia a scambio ionico, che viene di solito eseguita su colonna, sfrutta le

interazioni elettrostatiche tra molecole con carica opposta presenti nella fase mobile e nella fase
stazionaria. Quest’ultima è costituita da una matrice solida di varia natura (cellulosa o altri
polisaccaridi, polistirene) alla quale sono legati covalentemente degli scambiatori ionici (Fig. 11),
ovvero dei gruppi ionizzabili in grado di scambiare cationi o anioni in base alla loro carica positiva
o negativa. Per questo è possibile distinguere una cromatografia a scambio anionico in cui la fase
solida ha una carica positiva e lo ione scambiabile è un anione e una cromatografia a cambio
cationico in cui la fase stazionaria ha una carica negativa e lo ione scambiabile è un catione.
Un’accortezza particolare deve essere rivolta alla scelta del tampone che si usa per equilibrare la
colonna cromatografica, che poi è lo stesso in cui deve essere disciolta la miscela proteica che si
vuole separare, e che deve inizialmente avere un pH ed una forza ionica tali da permettere il legame
delle molecole di interesse allo scambiatore. Nell’eluizione bisognerà invece permettere il distacco
dalla colonna delle molecole precedentemente legate e ciò è possibile cambiando il pH o
aumentando la concentrazione del controione che si lega allo scambiatore ionico (tramite la
formazione di un gradiente; Fig. 12). Se si varia il pH in modo da far cambiare la carica netta delle
proteine, queste si staccheranno dalla fase stazionaria in modo frazionato. Il controione invece
compete con le proteine per legarsi allo scambiatore ionico della fase stazionaria e quindi
aumentanto la sua concentrazione si determina l’eluizione delle proteine.

- - - -
+
RA + B R+ B + A

R+ è uno scambiatore di ANIONI (B-)

Le proteine (polielettroliti) si legano a scambiatori anionici

o cationici, a seconda della loro carica netta.

La forza del legame dipende:

• dalle caratteristiche strutturali delle proteine

• dal pH
• dalla concentrazione di altri ioni che competono per il legame

Fig. 11

30
 Concentrazione (o pH)
Volume di eluente

Fig. 12 Schema rappresentante un formatore di gradiente e la relazione lineare tra

concentrazione e volume della soluzione che giunge alla colonna cromatografica.

Protocollo

Materiale a disposizione:

1 portatubi;
1 portaprovette;
1 colonna cromatografica;
1 tubo da 50 ml contenente tampone KPi 20 mM pH 6,8;
1 tubo da 50 ml contenente tampone KPi 300 mM pH 7,2;
3 tubi graduati da 50 ml marcati con il numero del gruppo di lavoro;
1 tubo da 1,5 ml marcato con il numero del gruppo di lavoro;
10 provette di plastica;
2 pipette di plastica;
1 beaker contenente una sospensione di carbossimetil (CM) -sefarosio in KPi 20 mM pH 6,8;
1 beaker vuoto;
1 pennarello;
1 matita;
1 foglio di carta millimetrata.

1) Preparazione della colonna cromatografica

In questa esercitazione verrà impiegata per la cromatografia a scambio cationico una matrice
di sefarosio, un polisaccaride insolubile, modificata chimicamente con dei gruppi carbossimetilici
(CM-sefarosio). Per eseguire la separazione cromatografica il CM-sefarosio, precedentemente
equilibrato con tampone KPi 20 mM pH 6,8, deve essere messo nella colonna cromatografica.

Chiudere il rubinetto in uscita della colonna cromatografica e con una pipetta di plastica
riempire la colonna con la sospensione di CM-sefarosio (prima di prelevare la resina sospenderla
bene agitando il beaker in cui vi è stata fornita). Aprire il rubinetto e far fluire il tampone nel beaker
vuoto, continuando ad aggiungere la sospensione fino a quando il CM-sefarosio sedimentato nella
colonna ha raggiunto un volume di circa 10-15 ml. Chiudere il rubinetto quando il livello del
tampone nella colonna è di poco superiore a quello del CM-sefarosio sedimentato.

31
 2) Preparazione del campione

Il materiale risultante dalla precedente esercitazione può presentare una certa torbidità dovuta
alla presenza di proteine precipitate. Queste possono essere rimosse mediante centrifugazione.

Aprire il sacchetto della dialisi con un paio di forbici e versarne il contenuto in un tubo da 50
ml. Centrifugare il campione per 10 minuti a 9000 g. Prelevare e porre in una provetta da 1,5 ml una
aliquota di 1-1,5 ml del supernatante, che verrà utilizzata successivamente per l’analisi
elettroforetica e per i saggi di attività enzimatica.

3) Cromatografia

Aprire la colonna. Far defluire il tampone fino a quando la superficie del CM-sefarosio è
esposta all’aria. Chiudere la colonna, quindi caricare il campione stratificandolo delicatamente sulla
superficie del CM-sefarosio; aprire la colonna e continuare a caricare il campione. Una volta che si
è caricato tutto il campione, aspettare che la superficie della resina sia nuovamente esposta all’aria.
Chiudere la colonna e stratificare sopra la superficie della resina del tampone 20 mM KPi pH 6,8.
Aprire la colonna e continuare ad aggiungere tampone, raccogliendo la soluzione che esce nel
beaker vuoto, fino ad utilizzare tutto il tampone a disposizione. Chiudere la colonna quando la
superficie è esposta all’aria.

Le proteine che nel tampone KPi 20 mM pH 6,8 presentano una carica positiva, tra cui
l’SHMT, si sono legate ai gruppi carichi negativamente del CM-sefarosio e sono ancora presenti
nella colonna. Le proteine con carica netta neutra o negativa sono state lavate via.

Stratificare sulla superficie del CM-sefarosio il tampone 300 mM KPi pH 7,2. Aprire la
colonna e continuare ad aggiungere il tampone, raccogliendo l’eluato nelle provette, in misura di
circa 2,5 ml per frazione. Il tampone a forza ionica elevata e pH più alto fa staccare dai gruppi
carbossimetile l’SHMT (insieme a poche altre proteine). La presenza dell’SHMT nelle frazioni
raccolte può essere verificata misurando l’assorbimento della luce a 280 nm e 420 nm.
L’assorbimento a 280 nm è dovuto alla presenza di residui aminoacidici contenenti gruppi aromatici
(triptofano, fenilanina e tirosina), mentre quello a 420 nm è dovuto alla presenza del cofattore
dell’SHMT, il piridossale 5’-fosfato.

Misurare l’assorbanza a 280 nm e 420 nm delle varie frazioni raccolte utilizzando lo

spettrofotometro. Segnare i valori dell’assorbanza nell’apposita tabella (vedi pagina successiva) e
quindi costruire un profilo di eluizione utilizzando la carta millimetrata; individuare l’intervallo di
frazioni che comprende un massimo dell’assorbanza a 280 nm coincidente con il massimo
dell’assorbanza a 420 nm.

Riunire il contenuto delle frazioni scelte in un tubo da 50 ml. Per avere una stima
approssimativa della concentrazione proteica misurare l’assorbanza a 280 nm della soluzione
assumendo un coefficiente di estinzione di 1 OD per una soluzione 1 mg/ml.

32
Frazione n°° A280 A420

33
 4.3 PURIFICAZIONE DELLA SERINA IDROSSIMETILTRASFERASI (SHMT)

4.3.3 Determinazione quantitativa delle proteine

Breve introduzione teorica

Durante la purificazione di una proteina è molto importante conoscere la concentrazione

proteica dei campioni che da questa derivano. I metodi colorimetrici e spettrofotometrici
rappresentano le tecniche più utilizzate per stimare la concentrazione delle proteine. Questi metodi
sfruttano l’assorbimento della luce da parte delle proteine o di complessi che queste formano con
dei cromofori.

L’assorbanza è definita come:

I0
A = log , dove I0 è l’intensità della luce incidente sul campione ed I l’intensità della luce
I
trasmessa dal campione.

L’assorbimento della luce è proporzionale alla lunghezza percorsa da questa attraverso il campione
(cammino ottico) ed alla concentrazione del cromoforo assorbente, secondo la legge di Lambert-
Beer:

A = εlC , in cui ε è il coefficiente di estinzione molare ed è una costante per la sostanza assorbente,
l è la lunghezza del cammino ottico espressa in cm (di solito pari ad 1 cm) e C è la concentrazione
misurata di solito in moli per litro.

Lo strumento mediante il quale è possibile effettuare misurazioni dell’assorbanza si chiama

spettrofotometro (fig. 13) ed è costituito da:

Fig.13

• una sorgente luminosa;

• un’apparecchiatura (monocromatore) che selezione lunghezze d’onda specifiche;
• una camera che contiene il campione da analizzare (cuvetta);
• un rivelatore di luce;

34
 • un sistema di lettura.

Il monocromatore può essere costituito o da una griglia o da un prisma che vengono fatti
ruotare in modo da selezionare la lunghezza d’onda desiderata facendola uscire da una piccola
fessura mentre tutte le altre vengono bloccate e non raggiungono il campione. Gli spettrofotometri
possono essere distinti in spettrofotometri a singolo o a doppio raggio. I primi sono costituiti in
modo tale che sia presente un singolo percorso luminoso e in cui la taratura dello strumento viene
effettuata utilizzando una soluzione standard che fa da riferimento o “bianco”. I secondi invece
sono costituiti da due raggi separati di cui uno attraversa la soluzione che fa da riferimento e l’altro
la soluzione da testare. L’assorbanza viene poi misurata dallo stesso strumento mediante un
confronto tra i due valori registrati.

Saggio di Bradford

Se si dispone di un campione proteico puro e se ne conosce la sequenza o la composizione

aminoacidica è possibile un calcolo teorico del coefficiente di estinzione molare a 280 nm che,
tramite la misura dell’assorbanza, consente di risalire applicando la legge di Lambert-Beer alla
concentrazione. Molto spesso però non si dispone di un campione puro e quindi questo metodo non
è applicabile. Si usano allora dei metodi colorimetrici. In questa esercitazione useremo il metodo
di Bradford. Questo metodo sfrutta la capacità del colorante blu di Coomassie (G-250) di legarsi in
modo specifico ai residui di arginina, triptofano, tirosina, fenilalanina e istidina delle proteine.

Comassie brilliant blue (G250)

Il colorante libero in soluzione esiste in due forme, una cationica che ha un massimo di
assorbimento a 470 nm (colore rosso) ed una anionica, in grado di legarsi alle proteine, che ha
invece un massimo di assorbimento a 595 nm (colore blu). Il legame con le proteine fa quindi
aumentare la concentrazione della forma che assorbe nel blu, determinando una variazione di
colore. Gli spettri di assorbimento delle due forme si sovrappongono nella regione in cui si misura
l’assorbanza nel saggio (595 nm) e questo determina una mancanza di linearità tra assorbanza e
concentrazione proteica, molto marcata a concentrazioni basse di proteina. Per superare questo
problema, si utilizzano quantità note di una proteina standard, come l’albumina, per generare una
curva di taratura. Il campione da saggiare viene quindi fatto reagire con il colorante di Bradford e la
sua concentrazione proteica estrapolata dall’assorbanza a 595 nm utilizzando la curva di taratura.
Dato che il colorante si lega con maggiore affinità ai residui di arginina (otto volte maggiore
rispetto agli altri residui) è importante la scelta della proteina standard, che deve contenere una
composizione in residui di arginina simile a quella della proteina da saggiare.

35
36
Protocollo

Materiale a disposizione:

1 portaprovette;
21 provette di plastica;
2 tubi contenenti ognuno 40 ml di reagente di Bradford;
1 tubo da 50 ml contenente tampone KPi 300 mM pH 7,3;
1 provetta contenente 7 ml della soluzione standard di albumina (1 mg/ml);
1 propipetta di gomma;
2 pipette graduate da 1 ml;
2 pipette graduate da 5 ml;
1 pipettatore automatico da 200 µl;
8 puntali gialli per il pipettatore automatico;
1 foglio di carta millimetrata;
1 pennarello;
1 matita;
1 calcolatrice;
campioni relativi alle precedenti esercitazioni:
A lisato batterico dopo precipitazione del DNA con streptomicina;
B campione dopo frazionamento con solfato di ammonio e dialisi;
C frazioni riunite dalla cromatografia su CM-sefarosio.

Procedimento:

I campioni relativi alla purificazione non possono essere usati come tali per la colorazione con
il reagente di Bradford, ma devono essere diluiti con del tampone. Allo stesso modo devono essere
preparate delle soluzioni di albumina a varie concentrazioni, partendo dalla soluzione di cui si
dispone. Le diluizioni che devono essere effettuate sono riportate in tabella; si utilizzano a tale
scopo delle provette vuote, che si marcano con il pennarello. La colorazione con il reagente di
Bradford viene condotta in duplicato per ogni campione. Si prelevano quindi 100 µl di ogni
campione, si depongono in duplicato in provette vuote, su cui si scrive il nome del campione; solo
quando sono stati preparati tutti i campioni (compresi quelli per la curva di calibrazione), vengono
aggiunti 5 ml del colorante di Bradford ad ogni provetta contenente le aliquote di 100 µl. I campioni
così preparati vengono mescolati con un vortex. Dopo 2 minuti, l’assorbanza a 595 nm dei
campioni viene letta allo spettrofotometro, contro il bianco che è stato appositamente preparato, e
segnata nell’apposita tabella. I valori registrati in duplicato vengono mediati. Si riportano su carta
millimetrata (asse Y = assorbanza a 595 nm, asse X = quantità di proteina) i valori medi di
assorbanza dei campioni standard e si traccia la curva di calibrazione che deve passare per l’origine
(0,0) e approssimare il più possibile i vari punti di misura.

Si calcola quindi la concentrazione delle proteine presenti in ciascun campione relativo alla
purificazione in base all’assorbanza a 595 nm e alla curva di calibrazione. La quantità di proteine
presenti nelle tre frazioni (A, B e C) si ottiene tenendo presente le diluizioni impiegate nella
preparazione dei campioni usati per la colorazione ed i volumi originari delle tre frazioni (A, 15 ml;
B, 10 ml; C, da misurare) .

37
 CURVA DI CALIBRAZIONE

Campione Albumina Tampone KPi Colorazione A595

(1 mg/ml) 300 mM Ph 7,3 con Bradford

100 µl tampone 0
BIANCO - -
+ 5 ml Bradford

………………..
100 µl campione
Albumina
- - + 5 ml Bradford ……………….
(1 mg/ml)
(× 2)
media………..……

………………..
100 µl campione
Albumina 3 ml 1 ml + 5 ml Bradford ……………….
(0,75 mg/ml) (× 2)
media………..……

………………..
100 µl campione
Albumina
2 ml 2 ml + 5 ml Bradford ……………….
(0,5 mg/ml)
(× 2)
media………..……

………………..
100 µl campione
Albumina
1 ml 3 ml + 5 ml Bradford ……………….
0,25 mg/ml)
(× 2)
media………..……

38
 ANALISI DEI CAMPIONI

Concentr. Quantità
Colorazione
Campione Preparazione A595 proteine proteine
con Bradford
(mg/ml) (mg)

………..
100 µl
0,9 ml tampone campione
A (diluito
100 µl + 5 ml ………. ……….… ……….…
1:10)
campione Bradford
(× 2) media……….

100 µl ………..
0,9 ml tampone campione
B (diluito ……….… ……….…
100 µl + 5 ml ……….
1:10)
campione Bradford
(× 2) media..……

100 µl ………..
0,8 ml tampone campione
…………. ………….
C (diluito 1:5) 200 µl + 5 ml ……….
campione Bradford
(× 2) media..……

39
 4. 3 PURIFICAZIONE DELLA SERINA IDROSSIMETILTRASFERASI (SHMT)

4.3.4 Analisi elettroforetica delle proteine

Lo scopo di questa esercitazione è quello di analizzare la composizione proteica dei campioni

relativi ai passaggi di purificazione effettuati nelle esercitazioni precedenti, mediante elettroforesi
su gel di poliacrilamide in presenza di sodio dodecil-solfato (SDS-PAGE).

Brevi cenni teorici

L’elettroforesi è la tecnica mediante la quale è possibile ottenere la separazione di molecole in

un campo elettrico in base alla loro mobilità. Quest’ultima è influenzata da:

• Forza del campo elettrico che promuove il movimento ionico;

• carica netta della molecola per cui molecole cariche positivamente migrano verso l’anodo
mentre quelle cariche negativamente verso il catodo;
• l’attrito generato dal mezzo di supporto;
• la struttura della molecola.

Una delle tecniche che meglio si adattano ad una rapida valutazione dello stato di purezza di una
preparazione proteica è l'elettroforesi su gel di poliacrilamide (PAGE). In questo tipo di
elettroforesi, le proteine migrano attraverso le maglie del polimero, ottenuto dalla
copolimerizzazione di acrilamide e N,N'-metilen-bis-acrilamide, quest'ultima utilizzata come
reticolante della catene lineari. La reazione di polimerizzazione è una addizione vinilica di tipo
radicalico. L'anione persolfato, o meglio il radicale libero che da questo si forma per via della sua
decomposizione spontanea, viene utilizzato come "iniziatore della reazione a catena". Della N,N'-
tetrametiletilendiamina (TEMED) viene aggiunta alla miscela di reazione in quanto agisce come
stabilizzatore di radicali liberi. Catene polimeriche lineari sono legate trasversalmente da molecole
di bis-acrilamide; le maglie formatesi in tal modo sono caratterizzate da una porosità dipendente
dalla concentrazione del monomero, dal rapporto monomero-reticolante e dalle condizioni di
reazione.
La corsa elettroforetica che utilizza come supporto un gel di poliacrilammide può sfruttare
condizioni denaturanti in cui mediante l’uso di un detergente anionico, come il sodio dodecil
solfato (Na+ CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-; SDS).), si ottiene la separazione delle proteine nelle loro
catene polipeptidiche. Il campione proteico a cui è stato aggiunto SDS e 2-mercaptoetanolo viene
riscaldato fino ad una temperatura di 100 °C e quindi sottoposto ad elettroforesi. In presenza di un
campo elettrico, le proteine, precedentemente denaturate e solubilizzate in SDS, sono in grado di
migrare attraverso le maglie del polimero di poliacrilamide in base alla loro massa. Ciò è possibile
in quanto l’SDS si lega alle proteine denaturate secondo una stechiometria fissa, ricoprendole di
uno strato di cariche negative e conferendogli una forma simile. Le proteine ricoperte dall’SDS
hanno tutte lo stesso rapporto tra carica e massa e quindi nell’elettroforesi su gel di poliacrilammide
si separano in base alle loro dimensioni.
Una versione dell'SDS-PAGE con elevato potere di risoluzione, e quindi di generale applicazione
nell'ambito delle proteine, è rappresentato da un sistema di tipo discontinuo (Fig. 14), con un gel di
focalizzazione approssimativamente al 5% di acrilamide (pH 6,8) ed un gel di sviluppo di
percentuale opportuna (10-20%; pH 8,8), in dipendenza dei pesi molecolari delle proteine da
separare. Al termine dell'elettroforesi, che viene condotta in tampone a pH 8,3 contenente glicina, le
proteine vengono innanzitutto denaturate e "fissate", per evitarne la diffusione nel gel, per
precipitazione in acido acetico. La loro presenza all'interno della matrice porosa è messa in
40
evidenza mediante delle reazioni colorimetriche. L'intensità di queste "bande" puo' essere utilizzata
per una stima approssimata della quantità di proteina caricata sul gel. Uno dei coloranti più utilizzati
è rappresentato da una soluzione di Coomassie Brilliant Blue. Questo reagente è in grado di legarsi
alle catene proteiche mediante i gruppi cationici presenti sulla loro superficie. Eventuali catene
oligosaccaridiche possono interferire, diminuendo la resa colorimetrica. Il colorante in eccesso
viene infine rimosso mediante numerosi lavaggi del gel con soluzioni acide (Fig. 15).

Fig. 14

Fig. 15 Fotografia di un gel ottenuto tramite SDS PAGE a pH discontinuo e

successiva colorazione con Coomassie Brilliant Blue.

41
Protocollo

1. Con un micropipettatore prelevare 5 µl di ogni campione (lisato batterico, campione dopo

frazionamento con (NH4)2SO4 e dialisi, frazioni riunite della cromatografia su CM-
sefarosio) e trasferirli in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 15 µl del tampone di
solubilizzazione (allegato n.1). Chiudere la provetta , vorticare e bollire per due minuti
circa.

2. Trasferire l'apparato elettroforetico nella camera elettroforetica. Aggiungere il tampone di

elettroforesi fino a copertura degli elettrodi.

3. Con un micropipettatore caricare il campione nel pozzetto preformato nel gel

dell'elettroforesi, facendo attenzione a non trasbordare nel pozzetto successivo.

4. Chiudere l'apparato e attaccare i morsetti all'apparato elettroforetico facendo attenzione ai

poli. Attaccare l'altra estremità dei morsetti all'alimentatore e impostare il voltaggio a 200
mV. Attivare il potenziale elettrico e attendere lo sviluppo dell'elettroforesi fino a quando il
marcatore colorato non abbia raggiunto l'estremità della lastra di poliacrilamide.

5. Spegnere l'alimentatore. Disassemblare l'apparato di elettroforesi e staccare il gel di

poliacrilamide dalle due lastre di vetro. Immergere il gel nel colorante e attendere circa 20
min. Trasferire il gel nel decolorante e attendere lo sviluppo del gel.

Allegato n.1

L'elettroforesi sarà realizzata utilizzando "minigel", ovvero gel preformati tra due lastre di vetro da
8 x 8 cm, con uno spaziatore di 0,75 mm, utilizzando tipici apparati elettroforetici (BioRad, mod.
Protean II).
Il gel di focalizzazione (gel superiore) è costituito da acrilamide al 5% in tampone Tris-HCl 125
mM, pH 6,8 e contenente SDS 0,1% (p/v). Il gel di sviluppo (gel inferiore) è costituito da
acrilamide al 15% in tampone Tris-HCl 375 mM, pH 8,8 e contenente SDS 0,1% (p/v). La
polimerizzazione dei gel è ottenuta chimicamente in presenza di persolfato di ammonio (0,08% p/v
finale) e TEMED (0,1% finale).
Circa 4 µg di campione proteico sono sciolte in un tampone Tris-HCl 25 mM, pH 6,8, contenente
SDS 2% (w/v), 2-mercaptoetanolo 5%, glicerolo 10%, e Blue di bromofenolo (Serva) 0,05% (w/v)
come marcatore colorato. La solubilizzazione viene completata bollendo il campione a circa 100 °C
per pochi minuti. Le soluzioni proteiche sono quindi deposte in pozzetti preformati nel gel
superiore.
L'apparato elettroforetico così allestito è immerso in una soluzione elettrolitica contenente Tris-HCl
25 mM, pH 8,6, Glicina 192 mM e SDS 0,1% (w/v). Infine l'elettroforesi viene sviluppata a 200 V
per circa 30 min.
Alla fine della elettroforesi il gel viene rimosso dalla lastra di vetro e immerso in una soluzione di
Blue Coomassie R 250 (Merk) 0,25% (w/v) in metanolo 50% e acido acetico 10%. Dopo circa 20
minuti di incubazione il colorante in eccesso viene allontanato dal gel per successivi lavaggi in una
soluzione di metanolo 25% e acido acetico 7%.
Tutti i reagenti utilizzati sono del tipo "electrophoresis grade" (BioRad).

42
 4. 3 PURIFICAZIONE DELLA SERINA IDROSSIMETILTRASFERASI (SHMT)

4.3.5 Saggi di attività enzimatica.

Brevi cenni teorici

La serina idrossimetiltrasferasi (SHMT) catalizza il trasferimento del Cβ della serina al

tetraidrofolato per formare glicina e 5,10-metilen tetraidrofolato. Questa reazione costituisce, in
molti organismi, la fonte principale di unità monocarboniose. In vitro, in assenza di tetraidrofolato,
l’enzima è tuttavia in grado di catalizzare anche reazioni di decarbossilazione, transaminazione,
taglio retroaldolico e racemizzazione. In questa esercitazione sfrutteremo la capacità dell’SHMT di
catalizzare la scissione dell’L-allo-treonina in glicina e acetaldeide. La velocità di formazione dei
prodotti può essere misurata accoppiando questa reazione alla riduzione dell’acetaldeide ad alcol
etilico da parte del NADH, catalizzata dall’alcol deidrogenasi (Fig. 16). Lo spettro di assorbimento
del NADH presenta una banda con un massimo a 340 nm, assente nel NAD+ (Fig. 17). La velocità
della reazione viene quindi calcolata in base alla variazione dell’assorbanza a 340 nm nel tempo,
utilizzando il coefficiente di estinzione molare dell’NADH a 340 nm, pari a 6220 cm  ¹· M  ¹.

Figura 16. Reazioni accoppiate nel saggio di attività dell’SHMT.

Figura 17. Spettri di assorbimento del NAD+ e del NADH.

43
Protocollo sperimentale

Materiale a disposizione

6 cuvette “UV grade” per misure nell’ultravioletto;

1 pipetta da 1 ml;
1 propipetta di gomma;
1 provetta contenente la miscela di reazione per il saggio di attività:
1 calcolatrice;
1 matita.

Procedimento:

Deporre 1 ml della miscela di reazione (contenente L-allo-treonina 12 mM, alcol deidrogenasi

0,06 mg/ml, NADH 0,12 mg/ml) in ogni cuvetta, utilizzando la pipetta e la propipetta. Andare allo
spettrofotometro. Aggiungere 50 µl di campione alla soluzione contenuta nella cuvetta; tappare la
cuvetta con del parafilm, agitare per inversione ed avviare la misura. Ogni misura viene effettuata in
duplicato. Appuntare sulla tabella le velocità iniziali misurate in variazione di assorbenza a 340 nm
al minuto. Convertire questa velocità in µM min-1 utilizzando il coefficiente di estinzione molare
del NADH (coefficiente estinzione molare = 6,22 L/(mol*cm).

Campione ∆A340 min-1)

Velocità iniziale (∆ µM min-1)
Velocità iniziale (µ

44
 4.3.6 Tabella riassuntiva della purificazione

FRAZIONE Volume Concentrazione Proteine Attività Attività Attività Fattore di Resa

(ml) di proteine totali misurata totale specifica purificazione (Attività
(mg/ml) (mg) con 50 µl (attività (attività (attività totale
misurata × totale / mg di specifica della frazione /
della attività totale
volume proteine frazione /
frazione frazione in totali) attività campione di
(µM min-1) µl/50 µl ) specifica del partenza ×
campione di 100)
partenza)

Lisato
batterico 15 ml 1 100 %
(campione A)

Campione
dopo
precipitazioni 10 ml
con (NH4)2SO4
e dialisi
(campione B)

Frazioni CM-
sefarosio
riunite ……..ml
(campione C)
RINGRAZIAMENTI

La realizzazione di questo manuale è stata possibile grazie all’aiuto di due studenti borsisti,
Carmine Mancone e Alessandra Vettraino, ai quali il Dipartimento di Scienze Biochimiche ha
affidato, ai sensi dell’art.13 L. 390/91, l’incarico di collaborare allo svolgimento delle esercitazioni.
Si ringraziano i professori M. Eugenia Schininà e Stefano Pascarella per aver contribuito alla
stesura del manuale, consentendo di riportare in versione integrale le loro esercitazioni sui modelli
molecolari e l’elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS.