METODI DELLA MICROBIOLOGIA METODI DELLA MICROBIOLOGIA

•Microscopia:
• LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI:
ottica
elettronica: a trasmissione, a scansione. ¾STRUMENTO INDISPENSABILE PER POTERLI
•Sterilizzazione e inibizione della crescita: IDENTIFICARE, STUDIARE, CARATTERIZZARE
metodi fisici:
calore
(umido, secco, incinerazione).
¾CI FORNISCE INFORMAZIONI SUI FLUSSI DI
radiazioni (UV; ionizzanti: X, gamma). MATERIA ED ENERGIA NECESSARI PER IL
filtrazione "MANTENIMENTO" E "RIPRODUZIONE"
metodi chimici DELL'ORGANISMO
•Coltivazione dei microrganismi:
terreni di coltura • RICHIEDE:
isolamento di microrganismi da ambienti naturali
colture pure
analisi della crescita batterica ¾SERILIZZAZIONE DEL MATERIALE
Riferimenti:
Laboratorio ¾FORMULAZIONE DEI TERRENI E DELLE
Brock, cap. 6, 14 CONDIZIONI DI COLTURA

Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

Metodi fisici: CALORE

incinerazione: bunsen, forni crematori…

calore secco: stufa: 160 °C/2h;

170 °C/1h
…

calore umido: autoclave (o pentola a pressione):

121 °C/15 min

per l'abbattimento della carica microbica:

bollitura: 100 °C/30 min
bollitura ripetuta 3 volte
pastorizzazione: 63 °C/30 min
oppure 72 °C/15 sec

1
Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

Metodi fisici: CALORE Metodi fisici: RADIAZIONI: UV: 220-300 nm

1
(lampade germicide)

tempo di

frazione di soprvviventi
radiazioni ionizzanti
riduzione
0.1 decimale
50 °C
Metodi fisici: FILTRAZIONE:
60 °C membrane filtranti 0.45 µm
70 °C
0.01 0.20 µm

0.001

tempo (min)

Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

Uso di COMPOSTI CHIMICI Uso di COMPOSTI CHIMICI

• -STATICI (batteriostatici,
fungistatici, • ANTISETTICI: Non (troppo) dannosi per pelle e mucose
virostatici…) • DISINFETTANTI: Danneggiano i tessuti animali.
• -CIDI (battericidi, fungicidi, • CONSERVANTI: (non dovrebbero essere tossici se ingeriti)
virocidi…)

• CHEMIOTERAPICI: tossicità selettiva

• -LITICI (batteriolitici) • ANTIBIOTICI: ne riparleremo

2
Antisettici e disinfettanti
Terreni di coltura
Agente uso modo di azione

ANTISETTICI
Organo mercuriali pelle si combinano coi gruppi –SH delle proteine
•LIQUIDI
Tintura di iodio pelle iodina le tirosine; agente ossidante
Alcol 70% pelle scioglie i lipidi, denatura le proteine
Difenoli (esaclorofene) saponi detergente, danneggia le membrane
Detergenti cationici saponi danneggiano le membrane
Acqua ossigenata pelle agente ossidante
……..

DISINFETTANTI
Cloro gassoso acqua potabile agente ossidante •SOLIDI
Composti di cloro industria alimentare agente ossidante
Composti fenolici superfici denatura le proteine capsule di Petri (piastre)
Ossido di etilene materiale di laboratorio agente alchilante
termosensibile (plastica…)
Ozono acqua potabile forte agente ossidante
…….

Beute, provette, piastre (capsule di Petri) Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi

.
.
. ..
. . .

. .
. .. .

Terreni di coltura liquidi e solidi

3
Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi

"striscio" con ansa per ottenere colonie isolate

Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi

PIASTRAMENTO CON AGAR MOLLE (TOP AGAR, SOFT AGAR)

- SPATOLAMENTO

- INCLUSIONE IN AGAR SCIOLTO

4
Terreni di coltura: composizione
COLTURA PURA

•Minimi • Campionamento da ambienti naturali.

•Completi
•Ricchi (brodi) • Inoculo in terreno solido o liquido appropriato (di
arricchimento, più o meno selettivo).
•Sintetici (chimicamente definiti)
•Complessi • Purificazione: normalmente per strisci successivi
(almeno 2-3) in terreno solido
•Di arricchimento
•Selettivi • Rinnovo e mantenimento di ceppi puri

Colonie batteriche e fungine Colonie batteriche

5
 Crescita di batteri su un terreno solido (colonie)
Formazione di una colonia (a)

(visti a occhio nudo dopo varie ore di incubazione)

http://www-micro.msb.le.ac.uk/Video/pneumo.mov

Studio della crescita Studio della crescita

Metodi per il conteggio dei microrganismi.
Misurare l’incremento di una popolazione microbica.
Curva di crescita.
Descrizione matematica della crescita. Crescita di una popolazione batterica in
Velocità di crescita, Tempo di generazione. coltura liquida
Crescita “in batch”, crescita in continuo, chemostato.
Resa di crescita. -coltura “a termine” (in “batch”, in lotto)
-coltura in continuo (chemostato)
Principi generali della nutrizione microbica
Gruppi metabolici

diversità e versatilità metabolica dei procarioti

6
Allestiamo una coltura batterica
Come "contare" i microrganismi
Inoculiamo 1 l di terreno di (o stimarne quantitativamente la presenza)
coltura appropriato con una
colonia batterica (circa 1
milione di cellule). Metodi di conteggio:
Es.: Escherichia coli in a. conta al microscopio
brodocoltura. Camera di Petroff- Hauser
b. Coulter Counter
Incubiamo il tutto in condizioni appropriate
c. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)
Es.: 37 °C, con aerazione.
d. misura del peso (biomassa)
Dopo neppure 24 ore vedremo che la coltura peso umido
è diventata molto torbida per la presenza di peso secco
nuove cellule batteriche identiche per forma, e. conteggio vitale in piastra (UFC)
struttura e composizione alle cellule iniziali.

Come monitorare la presenza e la crescita batterica?

a. conta al microscopio: Camera di Petroff- Hauser

c. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)

Griglia di 25 quadrati grandi (suddivisi in 16 quadratini) 1 mm2

Area di un quadrato grande 0.04 mm2
Distanza vetrino portaoggetto-coprioggetto 0.02 mm
Volume totale 0.02 mm3

numero medio di batteri/quadrato grande N/0.04 mm2 12

N/(0.04x0.02) [Nx25x50] = N/mm3 1.5x104
x 1000 = N/cm3 1.5x107

7
 “Conta vitale”: il metodo più sensibile e. conteggio vitale in piastra (UFC)

colonie visibili a occhio nudo dopo varie ore di incubazione

Calcolo del titolo

Campione (µl) 10 10 100 100

n colonie
titolo (ufc/ml) = ----------------------- × Fattore di diluizione
volume seminato

n colonie
titolo (ufc/ml) = ----------------------------------- Diluente (ml) 1 1 0.9 0.9
volume seminato × diluizione
Diluizione 10-2 10-2 10-1 10-1
Diluizione
complessiva 10-0 10-2 10-4 10-5 10-6
Fattore di diluizione: 1, 10, 100, 1000 ...
Fattore di
Diluizione: 1/1; 1/10; 1/100; 1/1000 ... diluizione 100 102 104 105 106

8
Allestiamo una coltura batterica
Curva di crescita di una coltura microbica
(X vs. t)
Inoculiamo 1 l di terreno di
coltura appropriato con una
colonia batterica (circa 1 t (h) OD600
milione di cellule). 0.0 0.014 4

Es.: Escherichia coli in 0.5 0.015 3.5

1.0 0.016
brodocoltura. 1.5 0.019 3
2.0 0.033 2.5
Incubiamo il tutto in condizioni appropriate

OD600
2.5 0.068
Es.: 37 °C, con aerazione. 3.0 0.13 2
3.5 0.26 1.5
4.0 0.52
Dopo neppure 24 ore vedremo che la coltura 4.5 1.1 1
è diventata molto torbida per la presenza di 5.0 2.2 0.5
5.5 2.8
nuove cellule batteriche identiche per forma, 0
6.0 3.1
struttura e composizione alle cellule iniziali. 6.5 3.3 0 1 2 3 4 5 6 7 8
7.0 3.4 tempo (ore)
7.5 3.4

Monitoriamo la concentrazione batterica a diversi tempi

Curva di crescita di una coltura microbica Curva di crescita di una coltura microbica
(logX vs. t)
(X vs. t su carta da grafico semilogaritmica)

t (h) OD600 log OD600 t (h) OD600 log OD600

1.00 10
0.0 0.014 -1.85 0.0 0.014 -1.85
0.5 0.015 -1.82 0.5 0.015 -1.82
0.50
1.0 0.016 -1.80 1.0 0.016 -1.80
1.5 0.019 -1.72 1.5 0.019 -1.72
0.00 1
2.0 0.033 -1.48 2.0 0.033 -1.48

OD600
log OD600

2.5 0.068 -1.17 2.5 0.068 -1.17

3.0 0.13 -0.89 -0.50 3.0 0.13 -0.89
3.5 0.26 -0.59 3.5 0.26 -0.59
0.1
4.0 0.52 -0.28 -1.00 4.0 0.52 -0.28
4.5 1.1 0.04 4.5 1.1 0.04
5.0 2.2 0.34 -1.50 5.0 2.2 0.34
5.5 2.8 0.45 5.5 2.8 0.45
0.01
6.0 3.1 0.49 -2.00 6.0 3.1 0.49
0 1 2 3 4 5 6 7 8
6.5 3.3 0.52 0 2 4 6 8 6.5 3.3 0.52
7.0 3.4 0.53 7.0 3.4 0.53 tempo (ore)
7.5 3.4 0.53 tem po (ore) 7.5 3.4 0.53

9
 La crescita esponenziale riflette il meccanismo di divisione
Grafici in scala lineare e semilogaritmica a confronto binaria in una popolazione in crescita bilanciata
1.E+09

4 10

3.5 FASI:
3
1 • adattamento (“lag”) 1.E+08
2.5
• crescita esponenziale

OD600

titolo (ufc/ml)
OD600

1.5
• fase stazionaria
0.1
1
….
0.5 • morte
1.E+07
0 0.01
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore) tempo (ore)

1.E+06
0 2 4 6 8 10 12
tempo (ore)

Crescita DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA

(moltiplicazione)
ESPONENZIALE
batterica

10

dX

OD600
----- = kX 0.1
dt

0.01

0.001
0 1 2 3 4 5 6 7
tempo (ore)

10
 DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA
ESPONENZIALE ESPONENZIALE
dX
----- = kX k = costante di crescita (t-1) (es.: h-1, min-1)
X = qualsiasi parametro relativo alle cellule: dt
torbidità (OD),
biomassa, integrando: X2 = X1 ek (t2-t1)
numero di cellule,
lnX2-lnX1 logX2-logX1
ufc,
lnX2 = lnX1 + k(t2-t1) k = -------------- k = 2.3 --------------
n di ribosomi,
t2-t1 t2-t1
quantità di proteine, di DNA, di peptidoglicano, etc…
tempo di generazione g (= t2-t1 quando X2=2X1)
/unità di volume di coltura
ln2 0.693
k= g=
g k

Numero di generazioni e tempo di generazione

Crescita esponenziale Esempio con g = 30 min (0.5h)
numero di generazioni n avvenute in un lasso di tempo t2-t1
t (h) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ... 5.0 10
n 0 1 2 3 4 5 ... 10 20
X 1 2 4 8 16 32 ... 1024 106 X2/X1 = 2n log(X2/X1)= n log2
X exp2 20 21 22 23 24 25 ... 210 220
log2 X 0 1 2 3 4 5 ... 10 20 log(X2/X1) log(X2/X1)
log10 X 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 ... 3 6
n = ------------------ = ------------------
log2 0.3
X = numero di cellule
n = numero di generazoni tempo di generazione g
g = tempo di generazione
(t2-t1) ln2
X2/X1 = 2n X2 = X1 × 2n g = --------- g=
n k

11
 Parametri che caratterizzano la fase di crescita Fase stazionaria e substrato limitante
esponenziale: ricavare graficamente
10
1.4
10

1.2
64x
1

OD600 massima
1

1 16x

OD600
0.8
0

0
0.1 4x
6

0.6
D

O
1x
0.01 0.4
0.1
0.2

0.001
0
0 2 4 6 8 10 12
0 20 40 60 80
g
0.01
tempo (h) [substrato limitante]
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore)

Chemostato
- la coltura cresce in uno stato
di equilibrio permanente
(steady state)
- il tasso di crescita
può essere regolato variando
il flusso del terreno
- la biomassa prodotta può
essere regolata variando la
concentrazione del fattore di
crescita limitante

12
 OSSIGENO

Alcuni fattori che influenzano la crescita Crescita in Ambiente

batterica Gruppo Aerobio Anaerobio Effetto/ruolo
dell’ O2

OSSIGENO Aerobi obbligati + - respirazione aerobia

TEMPERATURA
Microaerofili (<0.2 atm) + - idem
pH
Anaerobi obbligati - + Tossico
"Attività" H2O
Anaerobi facoltativi + + utilizzato, non
(Aerobi facoltativi) indispensabile

Anaerobi Aerotolleranti + + non richiesto,

non utilizzato

Forme tossiche (reattive) dell’ossigeno Formazione di specie reattive dell’ossigeno

radiazioni ionizzanti
ossigeno [O2] radiazioni UV
respirazione (sottoprodotto)
anione superossido [.O2-] reazioni dedicate (neutrofili, macrofagi)
composti chimici, antibiotici (adriamicina, bleomicina)

radicale ossidrile [.OH] ione ossidrile [OH-]

perossido di idrogeno [H2O2]

13
Formazione di specie reattive dell’ossigeno nel processo di respirazione
STRESS OSSIDATIVO

O2 + e- [.O2-] superossido
Le specie reattive dell’ossigeno
[.O2-] + e- + 2H+ H2O2 perossido di H
son forti ossidanti
H2O2 + e- + H+ H2O + .OH radicale ossidrile inducono la formazione a catena di radicali liberi
.OH danneggiano molecole (lipidi, DNA) della cellula
+ e- + H+ H2O acqua

O2 + 4e- + 4H+ 4H2O

Gli organismi aerobi o aerotolleranti hanno sviluppato sistemi

diversi di detossificazione, che difendono la cellula dagli effetti
dannosi delle specie reattive dell'ossigeno.

Brock-F.5.23

Detossificazione di radicali dell’Ossigeno

Saggio della catalasi
superossido dismutasi
(SOD)
2[.O2-] +2 H+ O2 + H2O2

catalasi
2H2O2 2H2O + O2

perossidasi
H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+

catalasi
H2O2 H2O + 1/2 O2

Brock-F.5.25

14
Temperatura
Temperatura: psicrofili, mesofili, termofili

Temperatura -filo
-trofo Temperatura minima, massima, ottimale (°C)
-tollerante

Temperature di crescita
Batterio Minima Ottimale Massima
minima ottimale massima Listeria monocytogenes 1 30-37 45
Vibrio marinus 4 15 30
Psicrofili ≤0 ≤ 15 20 Pseudomonas maltophilia 4 35 41
Mesofili > 15 20-40 45 Thiobacillus novellus 5 25-30 42
Termofili > 45 Staphylococcus aureus 10 30-37 45
Ipertermofili > 70 Escherichia coli 10 37 45
Clostridium kluyveri 19 35 37
Psicrotrofi < 15 > 15 >20 Streptococcus pyogenes 20 37 40
Termotolleranti: sopravvivono alla pastorizzazione Streptococcus pneumoniae 25 37 42
Bacillus flavothermus 30 60 72
Thermus aquaticus 40 70-72 79
Methanococcus jannaschii 60 85 90
Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90
Pyrobacterium brockii 80 102-105 115

15
 pH:
acidofili, pH minimo, massimo e ottimale.
neutrofili,
alcalofili pH
Organismo Minimo Ottimale Massimo

Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0 - 2.8 4.0- 6.0

Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.0-3.0 5.0
Bacillus acidocaldarius 2.0 4.0 6.0
Zymomonas lindneri 3.5 5.5- 6.0 7.5
Lactobacillus acidophilus 4.0 -4.6 5.8- 6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0- 7.5 9.3
Escherichia coli 4.4 6.0- 7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.0 -5.8 6.0-7.6 8.5- 9.0
Erwinia carotovora 5.6 7.1 9.3
Pseudomonas aeruginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Thiobacillus novellus 5.7 7.0 9.0
Streptococcus pneumoniae 6.5 7.8 8.3
Nitrobacter spp 6.6 7.6-8.6 10.0

Disponibilità di acqua (Aw - osmolarità-salinità) Disponibilità di acqua (Aw - osmolarità-salinità)

Aw minima
Organismo
alofili deboli NaCl 1- 6 % per crescere
moderati NaCl 6-15 %
estremi NaCl 15-30 % Caulobacter 1.00
alotolleranti Spirillum 1.00
Pseudomonas 0.91
osmofili Salmonella/E. coli 0.91
osmotolleranti
Lactobacillus 0.90
Bacillus 0.90
xerofili Staphylococcus 0.85
Halobacterium 0.75

16
Disponibilità di acqua (osmolarità-salinità)

a: non alofilo
b: alotollerante (es.: Stafilococus aureus)
c: alofilo estremo (Halococcus)

17