Contaminazione

Contaminazione
Contaminazione
Contaminazione
Contaminazione
Contaminazione
Contaminazione
Pipetta
Pipetta
Contaminazione
Contaminazione
Contaminazione
 CONTAMINAZIONE
Sono possibili differenti tipi di contaminazione
• I principali tipi di contaminanti microbici :
• Batteri, funghi, micoplasma, virus
• La contaminazione può avvenire:
• Errore dell’operatore
• Terreni contaminati
• Cappa a flusso laminare non funzionante Incubatore contaminato
• Conservazione in azoto liquido contaminato
Prevenzione della contaminazione

• Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni

I terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili

Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari
Operare sempre sotto cappa a flusso laminare
Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica)
Utilizzare sempre pipettatori elettrici
Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro
Controllare periodicamente i filtri della cappa
Mantenere con attenzione ben pulito l’incubatore a 37°C
 Micoplasmi
Rappresentano un grande gruppo di
microorganismi caratterizzati tutti dalla
mancanza di una parete cellulare rigida

“ MINIMUM CELL”

Membrane Ribosomi Cromosoma

 Micoplasmi

• Dimensioni estremamente ridotte: 0.3-0.8um

• Filtrabili a 0.45um
• Morfologicamente polimorfici
• Alta richiesta metabolica di vitamine, precursori di
acidi nucleici, lipidi, acidi grassi ed aminoacidi
• Sono tutti commensali, parassiti oppure patogeni
Le infezioni sono spesso difficili da diagnosticare: la
presenza di tali agenti può passare del tutto
inosservata all’operatore e può provocare
cambiamenti profondi nel metabolismo e nelle
proprietà delle cellule
a) Mycoplasma
b) Escherichia coli
c) Mycobacterium tuberculosis
d) Acinetobacter
e) Vibrio cholera
f) Streptococcus pyogenes
g) Salmonella
h) Campylobacter
 Frequenza della Contaminazione

• 15-35% delle linee cellulari continue

• 5% delle colture cellulari a precoci
passaggi
• 1% delle colture cellulari primarie
 Comuni Specie Contaminanti
• M. Orale 20-40%
UOMO • M. Fermentans: 10-20%
• M. Hominis 10-20%

• M. Arginini 20-30%
BOVINO
• M. Laidlawii 5-20%

MAIALE • M. Hyorhinis 10-40%

Sorgenti di Contaminazione
• M. Arginini 20-30%
BOVINO
• M. Laidlawii 5-20%

• M. Hyorhinis 10-40% Maiale

SIERO
Sorgente di Contaminazione

• M. Orale
Uomo
• M. Fermentans
• M. Hominis

Personale del Laboratorio

 Linee Cellulari Continue

Diventano la fonte principale di contaminazione:

• generazione di minuscole gocciole durante la
manipolazione
• prolungata sopravvivenza del micoplasma in forma
essiccata
• contaminazione dei reagenti utilizzati, soprattutto dal
terreno di coltura
 Effetti della Contaminazione
• Alterati livelli di sintesi di proteine, RNA e DNA
• Alterazione del metabolismo cellulare
• Induzione di aberrazioni cromosomiche
• Alterazione del pattern immunofenotipico
• Alterazione della morfologia cellulare
• Induzione o soppressione di citochine
• Interferenza con saggi biochimici e biologici
• Influenza sulla trasduzione del segnale
•Alterazione del pattern di crescita e della vitalità

Graduale Degenerazione PERDITA

Metodi di Sterilizzazione
• Sterilizzazione al calore rosso su fiamma
• Sterilizzazione al calore secco mediante l’utilizzo
di un forno ad una temperatura di circa 160°C per
almeno 2 h. Particolarmente indicata per la
vetreria di laboratorio
• Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo
dell’autoclave a 121 °C per almeno 15 min.
Particolarmente indicata per mezzi liquidi non
sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio
dopo l’uso
 Indicatori di sterilità
• Ci sono tre requisiti per gli indicatori di sterilità:
• (1) mostrare che un articolo è stato sottoposto alla procedura di
sterilizzazione
• (2) per dimostrare che l'articolo è stato alla temperatura, pressione e
umidità necessarie per garantire la sterilità
• (3) garantire la sterilità.
 Antibiotici e colture cellulari
• Gli antibiotici sono stati originariamente introdotti nei terreni di coltura per
ridurre la frequenza della contaminazione
• l'uso di cappe a flusso laminare, insieme a una rigorosa tecnica asettica, rende
superflui gli antibiotici.
• In effetti, gli antibiotici presentano una serie di svantaggi significativi:
1. Incoraggiano lo sviluppo di organismi resistenti agli antibiotici.
2. Nascondono la presenza di contaminanti criptici di basso livello che possono
diventare pienamente operativi se gli antibiotici vengono rimossi, le condizioni di
coltura cambiano o si sviluppano ceppi resistenti.
3. Possono nascondere infezioni da micoplasmi.
4. Hanno effetti antimetabolici che possono cross-reagire con le cellule di
mammifero.
5. Incoraggiano una tecnica asettica scadente.
 Tossicità selettiva
Proprietà del farmaco di agire selettivamente su strutture e
funzioni tipiche della cellula batterica

E' la capacità degli antibiotici di risultare tossici

esclusivamente nei confronti dei microrganismi e non nei
confronti delle cellule eucariotiche.

I disinfettanti non presentano tossicità selettiva, non

possono pertanto, essere impiegati nel trattamento
sistemico delle malattie infettive.
 Tossicità selettiva

Struttura Procarioti Eucarioti Farmaci

cellulare
Parete cellulare Peptidoglicano Assenza β-lattamine,
polipeptidi
Ribosomi 70S 80S macrolidi
cloramfenicolo
Membrana Pochi steroli Molti steroli polimixina
cellulare
Un certo numero di antibiotici
utilizzati nella coltura tissutale
sono moderatamente efficaci
nel controllare le infezioni
batteriche
 Meccanismo d’azione: BERSAGLI DEGLI ANTIBIOTICI
DNA GIRASI
SINTESI TOPOISOMERASI
PARETE CHINOLONI

GLICOPEPTIDI
BACITRACINA RNA POLIMERASI
PENICILLINE RIFAMPICINA
CEFALOSPORINE
MONOBATTAMI DNA
THF mRNA
CARBAPENEMI SINTESI PROTEICA
50 50 50 Inibitori 50S
DHF
30 30 30 MACROLIDI
CLORAMFENICOLO

METABOLISMO PABA
ACIDO FOLICO
SULFAMIDICI SINTESI PROTEICA
TRIMETOPRIM Inibitori 30S
TETRACICLINE
AMINOGLICOSIDI
CELL WALL
GRAM-POSITIVE
GRAM-NEGATIVE
39
 La scoperta della penicillina…..

Alexander Fleming Ernst Boris Chain

Howard Walter Florey
6 August 1881 – 11 March 1955
(1898-1968) (1906-1979)

1945 - Nobel Prize in Physiology or Medicine

1929, che osservo’ che la “for the discovery of penicillin and
contaminazione di una piastra di its therapeutic effects”
stafilococchi, da parte di una
muffa, il fungo Penicillium
notatum, era in grado di arrestare
la crescita del batterio…
penicillin culture
…per 10 anni il suo lavoro non fu at the Sir William Dunn School of Pathology
sfruttato. Oxford, England, 1940
 Dott. Vincenzo Tiberio, il vero scopritore della Penicillina

1895, dopo la laurea, pubblicò la sua ricerca "Sugli estratti di alcune muffe" negli Annali di Igiene sperimentale
 b-lattamine
Antibiotici a struttura b-lattamica:
• penicilline
• cefalosporine
• carbapenemi
• monobattami
Composti in grado di interferire con la biosintesi del peptidoglicano,
componente essenziale dela parete.
Con la scoperta della streptomicina nel 1943, da parte di S. A. Waksman, A. Schatz e E. Bugle gli aminoglucosidi
rimangono una fondamentale componente della odierna chemioterapia delle malattie infettive.
 AMINOGLUCOSIDI
Gli aminoglucosidi comprendono un vasto gruppo di antibiotici battericidi, che agiscono per
inibizione e deviazione della sintesi proteica batterica.

•Streptomicina (1943) Streptomyces griseus

Il gruppo di Waksman
•Neomicina (1949) Streptomyces fradia
Il gruppo Waksman e Lechavalier
•Kanamicina (1957) Streptomyces kanamyceticus
Umezawa e collaboratori
•Tobramicina (1967) Streptomyces tenebrarius
Eli Lilly and Co.
 AMINOGLUCOSIDI

Penetrano per diffusione passiva nello spazio periplasmatico

attraverso i canali idrofili delle porine della membrana
esterna dei Gram-negativi.

Avviene quindi un trasporto attivo dell’aminoglicoside

all’interno della cellula batterica, ossigeno-dipendente, in
due fasi:
 AMINOGLUCOSIDI
a. la fase I energia-dipendente (energy-dependent phase I, EDP1), che
comporta il passaggio dell’antibiotico attraverso la membrana interna per la
differenza di potenziale elettrico transmembrana (negativo all’interno) e
che può essere bloccata da un basso pH extracellulare, dall’iperosmolarità,
dall’anaerobiosi e dai cationi bivalenti Ca2+ e Mg2+;

b. la fase II energia-dipendente (EDP2), che sembra essere legata ad

un’alterazione della permeabilità della membrana citoplasmatica ad opera
delle proteine anomale sintetizzate in seguito al legame dell’aminoglicoside
alla subunità ribosomiale 30S.
 AMINOGLUCOSIDI
Queste condizioni spiegano:

La diminuzione dell’attività antibatterica in ambiente acido e la resistenza

naturale della flora anaerobica agli aminoglicosidi;

Al contrario, la diffusione di questi antibiotici all’interno della cellula batterica

può essere notevolmente favorita dalla presenza di antibiotici che interferiscono
con la sintesi della parete cellulare come, ad esempio, i b-lattamici.

PENICILLINA+STRPTAMICINA
 AMINOGLUCOSIDI
All’interno della cellula batterica, gli aminoglicosidi si legano
a diversi siti proteici sulla subunità ribosomiale 30S ed
inibiscono la sintesi proteica in almeno due modi:
 AMINOGLUCOSIDI
a) Bloccano la trasmissione del messaggio genetico, interferendo con il processo
di iniziazione della sintesi proteica e determinando l’accumulo di monosomi
anomali e non funzionali;

b) Provocano una errata lettura del codone dell’mRNA, per alterazione

nell’accoppiamento della tripletta di mRNA (codone) con la tripletta di tRNA
(anticodone), inibendo in tal modo la completa o corretta incorporazione
degli aminoacidi nella catena peptidica in formazione, con produzione di
proteine incomplete o aberranti, non funzionali.
53
Tecniche centrifugative
 Scopo delle tecniche centrifugative

Le tecniche centrifugative si basano sul comportamento delle particelle in

soluzione quando esse vengono sottoposte a un campo centrifugo.

 In generale, molte particelle, se lasciate in condizioni di quiete, tenderanno a

sedimentare, ovvero a depositarsi sul fondo di un contenitore a causa della
gravità. Il tempo necessario per tali separazioni non è facilmente misurabile.

La forza gravitazionale della Terra è sufficiente per separare molti tipi di particelle
nel tempo. Per esempio, in presenza di un anticoagulante, il sangue intero
contenuto in una provetta lasciata su un bancone di laboratorio si separerà in
plasma, globuli rossi e frazioni di globuli bianchi, sebbene il tempo necessario
impedisca di usare questa separazione a scopo applicativo.
Scopo delle tecniche centrifugative
Altre particelle, di dimensioni estremamente ridotte, invece, non si
separano in soluzione, a meno che non siano sottoposte a un’elevata forza
centrifuga.

In effetti, per separare la maggior parte delle particelle in un tempo

sufficientemente breve è necessaria una forza centrifuga aggiuntiva.

Inoltre, il potenziale degrado dei composti biologici durante lo stoccaggio

prolungato richiede necessariamente l’applicazione di tecniche di
separazione veloci.

 Pertanto, lo scopo delle tecniche centrifugative è quello di esercitare

sulle particelle una forza maggiore rispetto a quella esercitata dal campo
gravitazionale terrestre, in modo tale da aumentare la loro velocità di
sedimentazione.
Scopo delle tecniche centrifugative

La separazione di tutte le particelle dipende da numerosi

fattori:
• le dimensioni
• la densità
• la forma delle particelle stesse

Ai fini della centrifugazione, le particelle di interesse

sono risospese in un mezzo adatto e poste in provette
alloggiate all’interno di una centrifuga.
Cos’è una Centrifuga?

La centrifuga è un dispositivo azionato da un motore elettrico, per

esempio un rotore, che fa muovere un oggetto con moto rotatorio
attorno a un asse fisso.

Le centrifughe funzionano in base al principio della sedimentazione:

sotto l’influenza della forza di gravità (che determina un’accelerazione
di gravità, g), le sostanze si separano in base alla loro dimensione,
forma, densità, viscosità del mezzo e velocità del rotore.

Inoltre, ogni particella sedimenta con una velocità direttamente

proporzionale al campo centrifugo applicato. Questo processo viene
utilizzato anche per separare liquidi immiscibili: i componenti più
densi della miscela migrano lontano dall’asse della centrifuga, mentre
i componenti meno densi della miscela migrano verso l’asse.
Cos’è una Centrifuga?

È possibile aumentare la forza gravitazionale esercitata su una provetta in

modo da farla ruotare così rapidamente da causare la deposizione di un
precipitato (pellet) sul fondo della provetta.

La soluzione rimanente è propriamente

detta supernatante o surnatante liquido,
che solitamente viene rapidamente
decantato dalla provetta senza disturbare
il precipitato, o viene aspirato con
l’ausilio di una pipetta.
Si possono suddividere le tecniche centrifugative in:

• Preparative
• Analitiche

 La centrifugazione preparativa permette di separare e purificare

cellule intere, organelli subcellulari e macromolecole biologiche, come
acidi nucleici o proteine.

 La centrifugazione analitica permette di studiare le caratteristiche

di sedimentazione del campione e di determinarne il grado di purezza o
la massa molecolare
Principi generali della sedimentazione
Principi generali della sedimentazione

cv

cv

cv
Come regola generale, maggiore è la forza centrifuga,
minore è il tempo di separazione dei componenti di una
miscela. Inoltre, ogni centrifuga è provvista di un
nomogramma, che permette di trasformare gli rpm in RCF
conoscendo il valore del raggio del rotore.

La velocità di sedimentazione di una particella dipende non

solo dal campo centrifugo applicato, ma anche da massa,
densità e forma della particella stessa, oltre che dalla densità
e viscosità del mezzo in cui avviene la sedimentazione.
Le particelle di maggiore densità o di maggiori dimensioni
viaggiano tipicamente a una velocità maggiore e, a un certo
punto, vengono separate da particelle meno dense o più
piccole.
Tecniche di frazionamento cellulare
Principali metodi di separazione per centrifugazione

Esistono due tipi di tecniche centrifugative

per la separazione di particelle:

• centrifugazione differenziale

• Separazione in gradiente di densità.

Quest’ultima può, inoltre, essere suddivisa

in:
- centrifugazione zonale
- isopicnica.
 Centrifugazione differenziale
La forma più semplice di separazione per centrifugazione è quella differenziale,
anche denominata pellet differenziale.

Per esempio, una sospensione di cellule sottoposte a una serie di cicli con forza
centrifuga crescente (centrifugazioni successive), per un tempo determinato,
produrrà una serie di frazioni cellulari (sedimento o pellet) con velocità di
sedimentazione decrescente

La centrifugazione differenziale
viene comunemente utilizzata per
la raccolta di cellule o la
produzione di frazioni
subcellulari grezze, a partire da
un omogenato di tessuto.
Per esempio da un omogenato di fegato di ratto contenente nuclei, mitocondri,
lisosomi e vescicole di membrana, dopo centrifugazione a bassa velocità, per un
determinato periodo di tempo, precipiteranno principalmente i nuclei più grandi e
più densi. Una successiva centrifugazione a una forza centrifuga più elevata farà
precipitare le particelle di grandezza inferiore (per esempio, i mitocondri) e così via.
Centrifugazione differenziale

A causa dell’eterogeneità delle particelle biologiche, la centrifugazione

differenziale può creare fenomeni di contaminazione e di recuperi scarsi. La
contaminazione da parte di diversi tipi di particelle può essere risolta mediante
risospensione del pellet e successiva ripetizione delle fasi di centrifugazione
(lavaggio del pellet).

La centrifugazione differenziale produce frazioni arricchite, anziché frazioni

purificate; per esempio, il pellet nucleare ottenuto mediante centrifugazione
differenziale contiene quasi sempre materiale mitocondriale cosedimentato con i
nuclei. Allo stesso modo, il pellet mitocondriale contiene sempre materiale
proveniente da lisosomi e perossisomi. Di conseguenza, la centrifugazione
differenziale viene solitamente effettuata in una fase iniziale della purificazione
dei componenti subcellulari, spesso prima di un’ulteriore purificazione che
prevede l’uso di una centrifugazione a gradiente zonale o, più frequentemente,
isopicnica.
 Centrifugazione in gradiente di densità:
centrifugazione zonale e isopicnica

La centrifugazione in gradiente di densità è il metodo ideale per purificare gli

orgaanelli subcellulari e le macromolecole.

I gradienti di densità possono essere generati posizionando uno strato dopo l’altro
di un materiale, come il saccarosio, in un tubo con lo strato più pesante nella parte
inferiore e il più leggero nella parte superiore, con una modalità discontinua (per
esempio, dal 20 al 70%).

La frazione cellulare da separare viene posta sopra lo strato superiore e, quindi,

viene centrifugata.
Centrifugazione zonale

Nella centrifugazione zonale (basata sulla dimensione) il problema della contaminazione

di particelle aventi velocità di sedimentazione diverse può essere risolto stratificando il
campione sotto forma di una banda stretta sopra un gradiente di densità. In questo modo
le particelle che sedimentano più velocemente non vengono contaminate dalle particelle
più lente, come avviene invece nella centrifugazione differenziale.

Tuttavia, la zona di carico, normalmente ristretta,

limita il volume del campione (tipicamente al
10% del totale) che può essere adattato al
gradiente di densità. Sotto l’azione della forza
centrifuga, le particelle si muoveranno a velocità
diverse a seconda della loro massa, depositandosi
principalmente in base alla loro dimensione e alla
massa, invece che in base alla densità.
Centrifugazione isopicnica

Nella separazione isopicnica basata sulla densità e denominata anche galleggiamento o

separazione all’equilibrio, le particelle sono separate unicamente in base alla loro
densità. La dimensione influisce solo sulla velocità con cui le particelle si muovono, fino
a quando la loro densità non è uguale a quella del mezzo circostante.

Con questo metodo, le particelle non si depositano mai

sul fondo del tubo, indipendentemente dalla durata del
tempo di centrifugazione, bensì si fermano nel loro
punto isopicnico. Poiché la densità delle particelle
biologiche è sensibile alla pressione osmotica del
gradiente, la separazione isopicnica può variare
significativamente a seconda del mezzo di gradiente
utilizzato.
Esistono cinque classi principali di mezzi per gradienti di densità: alcoli polivalenti
(zuccheri), polisaccaridi, sali inorganici, composti iodati, silice colloidale
Strumentazione utilizzata nelle tecniche centrifugative

Le centrifughe possono essere classificate in quattro categorie

principali:

• piccole centrifughe da banco;

• centrifughe refrigerate a grande capacità;
• centrifughe refrigerate ad alta velocità;
• ultracentrifughe

Queste ultime vengono ulteriormente classificate in due tipi:

ultracentrifughe preparative e ultracentrifughe analitiche
 Piccole centrifughe da banco
Le piccole centrifughe da banco,
denominate anche
microcentrifughe, sono il tipo più
semplice di centrifuga, utilizzato
in molti laboratori per un lavoro
di routine a temperatura ambiente;
in particolare, per la
sedimentazione di cellule di
lievito, cellule del sangue o
particelle grossolane e medie.

La velocità massima di questo

tipo di centrifuga è tra 4000 e
6000 rpm con un valore di RCF
da 3000 a 7000 g
Centrifughe refrigerate a grande capacità

Le centrifughe refrigerate a grande capacità (100 mL) possono raggiungere una

velocità massima di 6000 rpm pari a 6500 g. Sono dotate di camere del rotore
refrigerate e possono impiegare una varietà di rotori intercambiabili.

Centrifughe refrigerate ad alta velocità

Le centrifughe refrigerate ad alta velocità vengono utilizzate per isolare gli

organelli, per purificare e isolare proteine solubili e microrganismi. Raggiungono
una velocità massima di circa 25 000 rpm con un valore di RCF pari a 60 000 g.
Ultracentrifughe preparative

Le ultracentrifughe preparative sono strumenti che permettono di purificare

macro- molecole od organelli cellulari. Funzionano in condizioni refrigerate
sottovuoto, per evitare la resistenza di attrito del rotore causata dall’aria
circostante.
Si tratta di apparati sofisticati, con un sistema di monitoraggio continuo della
temperatura del rotore (sensore di temperatura). Possono raggiungere una
velocità massima di 80 000 rpm e produrre un campo centrifugo di 600 000
g.
Cura dell’attrezzatura per la centrifugazione

Uno dei maggiori problemi nell’uso delle centrifughe è la corrosione dei rotori, in
particolare di quelli in lega di alluminio. Questi ultimi sono soggetti alla
corrosione anche se lasciati a bagno in acqua durante la notte.
Infatti, le soluzioni lasciate nei rotori in alluminio possono causare la corrosione
interna della lega metallica.

Dopo l’uso, occorre sciacquare sempre, scolare e asciugare i rotori per evitare la
corrosione e l’accumulo di materiale residuo contaminante. È importante seguire
sempre le raccomandazioni del produttore relative alla cura dei rotori delle
centrifughe. In alternativa è possibile utilizzare rotori in titanio o carbonio
composito, che non sono influenzati dalla corrosione da parte di soluzioni
acquose.
1. scelta del modello e lisi cellulare

(nuclei per FISH)

2. tecnica di frazionamento
Centrifugazione differenziale

Il metodo più usato per il frazionamento dei componenti

cellulari è la centrifugazione differenziale che separa
rapidamente i grossi organelli cellulari dai più piccoli.
Questo metodo si basa sulle differenti velocità alle quali i
vari organelli sedimentano sul fondo del tubo. La scelta
della velocità e durata dipende dal peso, densità e forma
degli organelli che si vogliono studiare.
Centrifugazione su gradiente

Poiché gli organelli di una cellula hanno differenti densità

(mg/ml) risulta facile separarli in un medium che rallenti gli
organelli con una certa densità, ma permetta a quelli con densità
maggiore di pelletare
In genere la frazione omogenata è adagiata su un medium a
gradiente di densità.
Esistono due diversi protocolli che includono gradienti continui
lineari e gradienti discontinui.
terzo passo: riconoscimento e conferma della frazione
ottenuta
PubMed hits «stem cells»
 “In the beginning was the Word”…not a discovery

Ernest Haeckel 1863 “Stammbäume” and “Stammzelle”

August Weismann 1885
Theodor Boveri 1892
Valentin Häcker 1892

Edmund Wilson 1896 “The Cell in Development and Inheritance”

Weismann’s illustration of the Boveri’s first cell-stem tree showing two
development of the fore-limb of Triton. consecutive germ lines and somatic lines (
(From Weismann 1893, p. 136) (From Boveri 1892, p. 118)
 Pappenheim’s blood cell stem tree
(From Pappenheim 1905, p. 347).

The big circle in the center of the

graph with a thick black line
represents the stem cell of blood
formation, the ‘big lymphocyte’ from
which all other cell types originate.

This type of graphical representation may need revision….new imaginary is needed

A life story…
Human development starts with just 1 cell – the fertilized egg

This cell divides to produce 2 ‘daughter cells’.

These daughters divide, and their daughters divide again, and so on.
Along the way, lots of different types of cells must be made.

A) Increasing number of cells

B) Differentiation
The fertilized egg and the cells that immediately arise in the first few divisions are
“totipotent.” This means that, under the right conditions, they can generate a viable
embryo (including support tissues such as the placenta). Within a matter of days,
however, these cells transition to become pluripotent.

None of the currently studied embryonic stem cell lines are alone capable of generating
a viable embryo (i.e., they are pluripotent, not totipotent).
 What are stem cells?

• the body is made up of about 200 different kinds of specialised cells

such as muscle cells, nerve cells, fat cells and skin cells

• all cells in the body come from stem cells

• a stem cell is a cell that is not yet specialised

• the process of specialisation is called differentiation

• once the differentiation pathway of a stem cell has been decided, it can
no longer become another type of cell on its own
Why are stem cells special?

Stem cells can:

• self-renew to make more
stem cells
• differentiate into a specialized
cell type

Stem cells that can become many Stem cells that can become only a
types of cells in the body are called few types of cells are called
pluripotent multipotent

Embryonic stem cells (pluripotent) Tissue stem cells (multipotent)

A homeostatic process involved in the maintenance of an internal
steady state within a defined tissue of an organism, including control of
cellular proliferation and death and control of metabolic function.

The ability to regulate internal conditions, usually by a

system of feedback controls. Stabilize health and
functioning, regardless of the outside changing
conditions.

One piece of homeostasis is the constant or periodic

generation of new cells to replace old, damaged, and
dying cells

Adult stem cells fulfill this role through the process

of regeneration
 How Regeneration Works

• Adult stem cells normally remain quiescent (non-dividing) for relatively long periods of time
until they are activated by signals to maintain tissues

• When activated they divide through a process called asymmetric cell division

• Through this process they are able to maintain their populations and differentiate into the
desired cell types by the creation of a progenitor cell

• A progenitor cell, in contrast to stem cells, is already far more specific: they are pushed to
differentiate into their "target" cell.
 Why self-renew AND differentiate?
1 stem cell

1 stem cell 4 specialized cells

Self renewal - maintains Differentiation - replaces dead or damaged
the stem cell pool cells throughout your life

100,000 million new blood cells every day

 Tissue stem cells
• often known as adult stem cells
• also includes stem cells isolated from fetal and cord blood
• reside in most tissues of the body where they are involved in repair and
replacement

Bone marrow Kidney Lung

• generally very difficult to isolate

• already used to treat patients (haematological malignancies, diseases of
the immune system)
Tissue-specific stem cells have been found in several organs that need to continuously
replenish themselves, such as the blood, skin and gut and
have even been found in other, less regenerative, organs such as the brain. These types of
stem cells represent a very small population and are often buried deep within a given tissue,
making them difficult to identify, isolate and grow in a laboratory setting.
 Location of Adult Stem Cells

• Adult stem cells and progenitor cells reside through out your body

• These stem cells reside in a specific area of each tissue called the “stem cell niche”

• This niche is a particular microenvironment that fosters the growth of resident stem cells

• Mutations in cells, signals they receive, and changes in the microenvironment can activate a
stem cell
 Stem cell niches
Niche stem cell
Microenvironment around stem cells that provides
support and signals regulating self-renewal and
differentiation niche

Direct contact Soluble factors Intermediate cell

 Stem Cell Niches

testis skin intestine

germline stem cell niche epidermal stem cell niche gut stem cell niche
APPLICATIONS…short list of the approved ones

After more than 50 years of research and clinical use, hematopoietic stem
cells have become the best-studied stem cells and, more importantly,
hematopoietic stem cells have seen widespread clinical use.
Intestine Stem Cells
Crypt–villus structure and continuous proliferation enable the intestine to act as
an absorptive organ and a protective barrier.

Tissue replenishment is fuelled by adult stem cells that divide continuously and
reside sequestered away from the intestinal lumen at the bottom of crypts.

Stem cells are protected by their niche (Paneth cells and the surrounding
mesenchyme) through crypt shape, antimicrobial products, a specialized
metabolic environment and neutral competition for limited space.

Stemness is a state that is lost when cells leave the stem cell zone, but can
also be regained when differentiated cells re-enter the niche.

Together with interleukins, Hippo signalling and metabolic cues, WNT, NOTCH,
EGF and bone morphogenetic protein signalling regulates stem cell
maintenance, regeneration and differentiation.

The same signalling cascades involved in stem cell maintenance are key
regulators of intestinal differentiation and cooperate to guide cells to one of six
mature cell fates.
Liver Stem Cells
 Skeletal muscle Stem Cells

In addition to satellite cells, several cell types contribute to muscle growth,

homoeostasis and regeneration, including pericytes, mesenchymal stromal cells
(e.g. Pw1+ Interstitial Cells, FibroAdipogenic Progenitors, Twist2+ cells), immune
cells as well as connective tissue cells.
These interactions are remodelled during ageing, notably with increased FGF2
production from muscle fibres and decreased expression of FGFR1 in satellite cells,
driving satellite cells to break quiescence, and decreased levels of fibronectin,
which weakens satellite cell adhesion capacity and increases their susceptibility to
apoptosis by anoikis
Kidney Stem Cells
Pancreatic Islet Stem Cells
Neural Stem Cells
 Adipose Tissue-derived Stem Cells

make not only fat

Cardiac Stem Cells

a
1) self-renewal, i.e., stem cells give rise to at least one
daughter stem cell at each division;
2) clonogenicity, i.e. single founder stem cells give rise to
multicellular clones composed of identical primitive cells;
3) multilineage commitment and differentiation, i.e.,
stem cells give rise to differentiated progenitors, precursors
and terminally differentiated cells;
in vivo repopulation, i.e. stem cells regenerate the
functionally competent cells of a given tissue.
 The excitement about stem cells is understable.

Safety and efficacy of the use of stem cells from periferal blood and bone
marrow are well established.
 BALOON in the news

Forecasting the future

Kalina Kamenova and Timothy Caulfield Sci Transl Med

2015;7:278ps4
“An orthopedic clinic, for example, says on its
website, “Stem cells actually restore
degenerated tissue while providing pain relief.”
Another clinic seeks patients with neurological
diseases, asserting, “The regenerative nature of
the fatty adult stem cells that are extracted from
the patient can help improve the degeneration
and ease the symptoms associated with the
disease.””
Quality control examples: From Fibroblast to Retinal Transplant.

Daley GQ. N Engl J Med 2017;376:1075-1077.