PRODUZIONE BIOTECNOLOGICHE IN AMBITO SANITARIO

I farmaci sono sostanze in grado di produrre modificazioni funzionali in un organismo vivente.

I FARMACI BIOTECNOLOGICI POSSONO ESSERE SUDDIVISI IN 8 CLASSI DIFFERENTI:

 Antibiotici

 Ormoni (insulina, ormone della crescita, somatostatina, eritropoietina)

 Citochine (interleuchina-2 e interferone)

 Enzimi (impiegati nelle bioconversioni in sostituzione dei processi chimici industriali, a volte
Impiegati anche in campo terapeutico: enzima alteplase: attivatore tessutale del plasminogeno, è
un enzima fibrinolitico che scioglie i coaguli in caso di crisi ischemiche)

 Vaccini (epatite B e pertosse)

 Anticorpi monoclonali

Più che nella produzione di antibiotici, le biotecnologie innovative sono state applicate con grande efficacia
nella produzione di molte altre molecole soprattutto proteiche.

Farmaci antimicrobici

Sono le molecole impiegate nella cura delle malattie infettive:

 Antibiotici naturali
 Antibiotici semisintetici (modifica della catena laterale)
 Farmaci di sintesi chimica (sulfamidici: bloccano sintesi di acido folico)

Teoricamente caratterizzate da tossicità selettiva:

 Strutture bersaglio solo microbiche

 Diffusione nell’ospite senza effetti nocivi

In pratica non prive di effetti collaterali:

 tossicità per l’ospite

 reazioni allergiche
 alterazioni del microbiota

Si parla quindi di Dose terapeutica e Dose tossica

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PRODUZIONE DI ANTIBIOTICI NATURALI E SEMISINTETICI

Gli antibiotici, fanno parte dei farmaci antimicrobici e sono molecole prodotte da microorganismi, attive nei
confronti di altri microorganismi di cui inibiscono lo sviluppo.

L’azione antimicrobica di un antibiotico può esprimersi come:

- eliminazione dei microorganismi con un EFFETTO MICROBICIDA

- blocco della loro riproduzione con EFFETTO MICROBIOSTATICO

La produzione di antibiotici, iniziata diversi anni dopo la scoperta della penicillina da parte di Fleming
(1928), ha avuto da allora uno sviluppo incessante, con la progressiva scoperta e messa a punto di nuove
molecole, più efficaci e contemporaneamente più tollerate dall’organismo. Le ricerche per nuovi farmaci
sono sempre k a causa dei fenomeni della resistenza microbica. Necessario sintetizzare nuove molecole
(ingegneria genetica: sforzo per selezionare ceppi alto produttori e ottenere molecole che aggirino la
resistenza batterica).
[ 2° g.m. purificazione penicillina -> svolta perché molti soldati morivano per setticemia]

I microrganismi più impiegati nella produzione di antibiotici sono:

- muffe (Aspergillus, Penicillium), 

- batteri filamentosi (Streptomyces) per la maggior parte di antib.
- batteri non filamentosi (Bacillus).

CARATTERISTICHE ANTIBIOTICI:

Hanno azione batteriostatica o

battericida e agiscono nei confronti di
un insieme di specie sensibili (ampio
spettro, spettro ristretto).
I Gram- sono meno sensibili agli
antibiotici per la membrana esterna.
Possono essere classificati in base alla
struttura chimica o ai bersagli cellulari
che danneggiano:

parete batterica
membrana plasmatica
sintesi proteica
sintesi degli acidi nucleici

FAMIGLIE (classificazione sulla base

chimica)

NOVOBIOCINA: inibisce la sintesi del DNA

bloccano la DNA girasi batterica

Polipeptidici: bacitracina e polimixina alterano la

funzione rispettivamente della parete e della
membrana cell

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 PRODUZIONE DI PENICILLINE (antibiotici beta-lattamici)

È prodotta da colture di Penicillium chrysogenum.

Impiego in: 

- farmacologia umana e veterinaria

- le penicilline naturali (G e V) sono usate come molecole-base per ottenere le penicilline
semisintetiche

Diversi tipi:

- naturali (G: benzil-penicillina e V: fenossimetil-penicillina) (inefficaci contro i batteri Gram -, sono

idrolizzate da β-lattamasi, sono instabili a pH acido: non si possono somministrare per via orale) 
- semisintetiche ad ampio spettro, molto efficace su G-, sensibili alla β-lattamasi (ampicillina,
amoxicillina) 
- Semisintetiche resistenti alla β-lattamasi (meticillina, cloxacillina, oxacillina) 
- ampio spettro ma maggiormente attive su Gram- e attive anche su Pseudomonas
(carbenicillina, meziocillina, piperacillina).

Le penicilline sono caratterizzate dalla presenza di:

o anello beta-lattamico (attività antimicrobica)

o anello tiazolidinico (che deriva dagli aa valina
e cisteina)
o catena laterale che differenzia le varie
penicilline (influenza resistenza all’acidità,
spettro, sensibilità alla beta-lattamasi)

Anello beta-lattamico unito all’anello tiazolidinico

forma l’acido 6 aminopenicillanico(6APA) -> molecola
base delle penicilline sintetiche

Le penicilline sono prodotte per acilazione La sinetsi della penicillina origina

dell’acido 6aminopenicillanico (6-APA). dall’alfa-chetoglutarato (intermedio
La penicillina G si ottiene per acilazione del 6- del ciclo di Krebs)
APA usando l’acido fenilacetico come agente Inibizione del processo:
acilante. - lisina
Acido fenilacetico deve essere aggiunto al - eccesso di zuccheri determina una
substrato come precursore delle catene repressione della produzione
laterali della penicillinaG. Se si impiegano dell’antibiotico(catabolita)
precursori diversi si favorisce la penicillina
richiesta pag. 3
Produzione di penicillina

(penicillina G: benzil-penicillina, penicillinaV: fenossimetil-penicillina)(fg. 17.35 pag 458)

Prodotta da colture di Penicillium chrysogenum (no Penicillium notatum per basse rese)

T= 25-27°

pH=7 (non selettivo. Non inibisce le contaminazioni)

Coltura sommersa

Substrato: corn steep liquor, vitamine, aminoacidi, glucidi, sali minerali, acido fenilacetico (o acido
fenossiacetico) come precursore delle catene laterali (il substrato di crescita è molto ricco di nutrienti)

Bioreattori spesso sono di piccole dimensioni (30-200 m3) per minimizzare le contaminazioni visto che il
tempo di produzione è lungo (nella fase II di produzione), il pH non è selettivo e il substrato molto ricco.

necessità di aerazione e miscelazione (formazione di schiuma: agenti antischiuma)

Avviene in 2 fasi successive:

 fase I o di sviluppo (trofofase) (crescita esponenziale):

Finalità: produzione di massa microbica all’interno di reattori in modalità discontinua con
ossigenazione e miscelazione, aerobiosi è indispensabile per la crescita di penicilium, pH 6-7,
substrati: saccarosio e glucosio, oli vegetali come antischiuma, corn steep liquor e fattori di crescita.

 fase II o di produzione (idiofase) (fase stazionaria) (TEMPI LUNGHI)

sono aggiunti lattosio e glucosio lentamente in aerobiosi per evitare che la loro eccessiva
concentrazione determini una repressione catabolica del prodotto quindi Il bioreattore viene
impiegato in modalità semicontinua e la velocità di rifornimento è controllata (si regola immissione
di fonti di C sulla base dell’utilizzo da parte del m.o)), pH7, si aggiunge acido fenilacetico o
fenossiacetico come precursore della catena laterale. Si possono aggiungere fonti di C e N
complesse che sono metabolizzati lentamente.

Nel reattore si continua ad alimentare ossigeno. Purtroppo i microorganismi filamentosi aumentano la

viscosità del terreno di coltura, rallentando la diffusione dell’ossigeno

Il mantenimento di un’elevata concentrazione di ossigeno richiede un efficace sistema di miscelazione e

questo comporta schiuma.

È necessario quindi l’impiego di agenti antischiuma (la schiuma infatti rallenta il trasporto di O2)

La seconda fase prevede cicli produttivi piuttosto lunghi (ca. 2 settimane)

Fase di recupero (fig. 17.35 pag 458):

- Filtrazione della biomassa

- La penicillina nel filtrato colturale viene estratta con un solvente

- Evaporazione del solvente

- Si ottiene penicillina grezza che viene cristallizzata

- Sterilizzazione per filtrazione (no alte temperature)

Resa 50g/l

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PRODUZION DI PENICILLINE SINTETICHE

Le penicilline semisintetiche sono prodotte a partire soprattutto da penicillina G

(enzima penicillina-acilasi, prodotta da E.coli, stacca la

catena laterale formando acido 6 aminopenicillanico a cui
viene aggiunta per sintesi chimica la catena laterale
richiesta).

Le penicilline semisintetiche sono più stabili a pH acido

infatti possono essere somministrabili per via orale e sono
più resistenti alla beta-lattamasi.

Profili concentrazione-tempo di un metabolita primario e di un metabolita secondario.

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Profili concentrazione-tempo nel corso della pre-fermentazione e della fermentazione della penicillina.

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PRODUZIONE BIOTECNOLOGICA DI PROTEINE

Più che nella produzione di antibiotici, le biotecnologie innovative sono state applicate con grande efficacia
nella produzione di molte altre molecole soprattutto proteiche.

Sequenza operativa per la produzione di proteine con la tecnica del DNA

ricombinante:

1. Preparazione del DNA contenente il gene della proteina di interesse

2. Inserimento in un vettore di clonaggio

3. Espressione della proteina di interesse

4. Studio della funzionalità della proteina

5. Purificazione (massima purezza possibile) e caratterizzazione

IMPORTANTE -> Il
clonaggio di geni eucariotici nei batteri è problematico
a causa di introni. Quindi viene inserito il cDNA (DNA
complementare) cioè il DNA ottenuto partendo
dall’mRNA trascritto maturo (senza introni).

Sistemi di espressione (cellule ospite)

Batteri  lieviti e cell. animali (mammifero) 

Vantaggi: Vantaggi:

-Permettono la produzione di proteine a -adeguata modificazione post traduzionale (tagli proteolitici,

basso costo
-Permettono grandi produzioni
-Hanno bassi rischi di contaminazione
virale
-I rischi allergici sono molto contenuti
-Sono di semplice manipolazione
Svantaggi:
-Non sono introdotte le modifiche post
traduzionali (glicosilazione)
ripiegamenti, ponti disolfuro, glicosilazioni, aggiunta di
gruppi molecolari sugli aminoacidi come fosfati o acetati)
soprattutto con le cellule di mammifero.
- S.Cerevisiae 
- cellule animali di mammifero. Ad esempio  
cell. tumorali linfoblastoidi per l’interferone, 
        cell. di melanoma per l’attivatore di plasminogeno, 
        cell. tumorali ibridate per anticorpi monoclonali.
Svantaggi:
-contaminazioni  e spesso tempo di divisione alto
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Glicosilazione

Per glicosilazione si intende una modificazione post-traduzionale si intende una modificazione post-
traduzionale di una proteina, che vede l'aggiunta di zuccheri (una catena o singoli carboidrati) alla catena
peptidica.

La maggior parte delle proteine d'impiego farmacologico ottenute con la tecnologia del DNA ricombinante
sono glicoproteine, caratterizzate cioè dalla presenza di catene laterali oligosaccaridiche

La glicosilazione di una proteina è un processo enzimatico che avviene in una fase successiva alla sua
produzione (traduzione), dipendente in buona misura dall'ambiente cellulare in cui la proteina viene
sintetizzata. (le cellule di mammifero producono proteine bioattive)

Funzioni:

1) la glicosilazione protegge dall'attacco di proteasi (causa di degradazione delle proteine) ed aumenta la

solubilità della molecola proteica che viene dunque stabilizzata.

2) il meccanismo glicosidico permette lo svolgimento del controllo della qualità. Il controllo della qualità è
un processo operato dalla cellula per scartare le proteine che non sono correttamente ripiegate

Processi Fermentativi Industriali

In bioreattori:

 ad agitazione meccanica o pneumatica,

 a perfusione con fibre cave (anticorpi monoclonali)
 a letto fisso
 a tecnica continua, discontinua, semicontinua

Attento controllo dei parametri ambientali e nutrizionali che devono essere impiegati per ogni cellula
impiegata (più la cellula è complessa più è esigente)

Requisiti delle proteine ad impiego terapeutico

I farmaci contenenti proteine ricombinanti devono essere:

 efficaci, in grado di apportare reali benefici nel paziente

 caratterizzati da ridotti effetti collaterali
 puri, privati delle componenti molecolari presenti durante la loro preparazione; per esempio la
presenza di DNA cellulare o di proteine estranee che possono attivare il sistema immunitario
scatenando anche reazioni allergiche 
 sterili (senza contaminanti: virus, batteri)
 privi di pirogeni esogeni sostanze che inducono la febbre: pirogeni batterici cioè le endotossine
presenti nei G- (lipide A dello strato lipopolisaccaridico della membrana esterna dei G- )
 stabili in modo da mantenere la loro attività costante nel tempo (eccipienti)
 facilmente somministrabili

PURIFICAZIONE

Qualità di un farmaco si misura dalla purezza

Obiettivo: prodotto finale rispondente alle caratteristiche specifiche di registrazione e agli standard di
qualità propri del progetto. 

enti preposti alla vigilanza (EMA: European Medicines Agency, FDA: Food and Drug administration)
stabiliscono delle norme utili a garantire un alto grado di purezza.
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I limiti di tollerabilità di eventuali impurezze vengono indicati per ogni farmaco tenendo conto anche della
via di somministrazione

Le Good Manufactoring Practices (GMP) sono un insieme di regole da rispettare per la produzione, utili a
garantire lo standard di qualità appropriato

PROCESSI DI PURIFICAZIONE-OPERAZIONI FONDAMENTALI:

1. Eliminazione del particolato (cellule, detriti cellulari, virus):
Tecniche:
- centrifugazione 
- Separazione su membrana (filtrazione: microfiltrazione e ultrafiltrazione) le tecniche sono distinte
sulla base del diametro dei pori
- Cromatografia (a scambio ionico, cromatografia per filtrazione su gel, cromatografia ad affinità)
- precipitazione frazionata
2. Concentrazione
3. Sterilizzazione (filtrazione sterile o microfiltrazione) e formulazione
I passaggi di purificazione possono essere ripetuti più volte
STERILITA’ 

I farmaci proteici vanno somministrati per via parenterale devono essere sterili.
I farmaci proteici sono sensibili alle alte temperature (non si possono usare alte temp, o radiazioni
ionizzanti) quindi vanno preparati in ambiente asettico (camere con flussi laminari di aria filtrata con filtri
HEPA). 
Apparecchiature ed eccipienti sono sterilizzati separatamente con autoclave o raggi gamma.
La sterilizzazione finale è ottenuta con filtri con pori di diametro di 0,2 micron (filtrazione sterile)
ELIMINAZIONE DEI PIROGENI

(dette anche endotossine, sostanze che inducono un aumento di temperatura. Lipide A nella membrana
esterna dei G-).
Le endotossine sono inattivate dal calore secco a temperature superiori ai 160°C ⇒ I recipienti per
confezionare il farmaco sono trattati a 250°C per 30 min al calore secco
Anche gli eccipienti devono essere esenti da pirogeni e sono trattati con la distillazione se sono in soluzione
Acqua per le iniezioni: tecniche di osmosi inversa con membrane che bloccano le endotossine 
Per le proteine, per ridurne i pirogeni, viene usata la cromatografia a scambio ionico

FORMULAZIONE DEL FARMACO tramite disidratazione o liofilizzazione

VIE DI SOMMINISTRAZIONE

1. Somministrazione parenterale: tramite ago, iniezione endovenosa, sottocutanea, intramuscolare

2. Somministrazione per via orale:
svantaggi:
- L’attività degradativa dell'apparato gastrointestinale nei confronti delle proteine
- Non passano per diffusione l’epitelio intestinale perché sono sostanze ad alto peso
molecolare.

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PRODUZIONE DI VACCINI

Vaccini-> sostanze antigeniche che inducono nell’organismo in cui sono state introdotte una reazione
immunitaria specifica, che è in grado di prevenire le conseguenze di un’ulteriore aggressione da parte degli
stessi antigeni contro cui si è vaccinati: utilizzati quindi a scopo profilattico.

Per la preparazione di un vaccino fondamentale annullamento del suo potere patogeno, cioè della virulenza
(capacità di provocare nell’organismo che li ospita manifestazioni patologiche di varia entità) propria
dell’antigene da cui deriva, mantenendo intatta la capacità immunogena, cioè la capacità di indurre
nell’organismo una risposta immunitaria.

I VACCINI POSSONO ESSERE: 

  microrganismi vivi ma attenuati prodotti attraverso ripetuti

passaggi in vitro (svantaggio: il ritorno alla forma patogena)
(morbillo, rosolia, parotite, varicella, febbre gialla,
tubercolosi)

  microrganismi uccisi o inattivati prodotti attraverso

trattamento al calore o trattamento chimico (svantaggio:
possibile attenuazione della risposta immunitaria)
(poliomielite)

 Tossoidi o anatossine derivati dalle tossine privandole del

potere patogeno con un trattamento con formaldeide
(difterite e tetano) 

  vaccini polisaccaridici o coniugati: i polisaccaridi sono

estratti dalla capsula batterica e coniugati con una proteina
vettore che migliora la risposta immunitaria anticorpale,
(Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis
sierogruppi A, C, W, Y, Haemophilus influenzae tipo B)

  vaccini a subunità costituiti da frammenti di antigeni

batterici (proteine immunogene) preparati partendo dal
microrganismo intero oppure creati con le tecniche
dell’ingegneria genetica (vaccino ricombinante: epatite B)
(vaccino Covid 19)

 Vaccini con vettori ricombinanti (vettori virali) (vaccino

influenza, Covid 19)

 Vaccini VLP (virus like particles): particelle simili al virus

senza genoma che hanno un’alta capacità immunogena (papilloma virus)

 Vaccini mRNA (Covid 19)

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Oggi le strategie vaccinali tendono a:

 Individuare nel patogeno le molecole che possiedono i caratteri antigene più idonei(stabilità e
risposta anticorpale)
 Clonare il gene responsabile della produzione dell’antigene
 Far esprimere il gene in un contenitore batterico o eucariotico
 Purificare l’antigene molecolare e preparare il vaccino

Vantaggio: no attività patogena

I vaccini biotecnologici(ricombinanti) prodotti sono:

- Vaccino anti HBV (virus) (1986)

- Vaccino anti Bordetella Pertussis (batterio) (1993)
- Vaccino contro la malattia di Lyme (infezione da Borrelia burgdorferi)

Grazie all’ingegneria genetica è possibile ottenere proteine immunogene in forma pura e prive di attività
patogena. DIVERSE TECNICHE

VACCINO CONTRO EPATITE

B: 1° VACCINO
RICOMBINANTE
AUTORIZZATO

Virus HBV (virus dell’epatite

B: famiglia Hepadnaviridae) a
dsDNA circolare con envelope

Il virione contiene due antigeni associati al guscio proteico

interno (core) e un antigene di superficie (sull’envelope) HBsAg(Hepatitis B surface Antigene)

HBsAg risulta la molecola di scelta per allestire il vaccino

VACCINO CONTRO EPATITE B(Engerix B)

 Il gene virale che codifica per HBsAg è stato clonato in un vettore plasmidico e quindi trasferito ed
espresso in un lievito S. Cerevisiae.

 L’antigene prodotto dal lievito presenta tutte le caratteristiche della proteina HBsAg nativa
(glicosilazione e altre modifiche post traduzionali)

 Antigene viene purificato per ultracentrifugazione, cromatografia e precipitazione frazionata

(purezza>98%) viene adsorbito su Al(OH)3 che funziona da adiuvante

VACCINO CONTRO LA PERTOSSE (Bordetella

pertussis: cocco-bacillo Gram- con capsula)

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Il m.o. produce una tossina formata da 5 subunità. Ogni subunità è regolata da un gene
Tali geni sono stati sostituiti nel m.o. modificati (privi di tossicità ma con immunogenicità) ottenendo un
batterio ricombinante.
La tossina prodotta è quindi un tossoide

Vaccini acellulari ricombinanti

modificati attraverso tecniche di ingegneria genetica. Nel

gene che codifica per la tossina della pertosse vengono
introdotte, mediante mutagenesi sito-diretta, due
sostituzioni amminoacidiche (Arg9→Lys e Glu129→Gly)
nel sito attivo (catalitico) dell’enzima che rendono
atossica la tossina e il gene viene reintrodotto nel
batterio 

PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

Anticorpi prodotti da un singolo linfocita sensibilizzato, reso immortale dalla fusione con una cellula
tumorale (ibridoma).

Gli ibridomi si riproducono in modo illimitato e secernono anticorpi monoclonali del linfocita impiegato

IMPIEGHI:

Gli anticorpi si legano in modo selettivo e specifico ai corrispondenti antigeni

La reazione fra antigene e anticorpo offre molte possibilità di applicazione:

 diagnostica clinica per individuare uno dei due componenti quando è noto il complementare: gli
anticorpi monoclonali sono marcati con sostanze che sviluppano luminescenza, reazioni cromatiche
o radioattività: 
- test immunoenzimatici: ELISA (identificazione di antigeni virali o batterici)
- Identificazione di cellule tumorali 

 come vettori di farmaci

 come sistemi di separazione dei componenti di una miscela (immunoseparazione)

APPLICAZIONE ATTUALE come farmaco

 Diagnosi di neoplasie (pazienti con carcinoma mammario)

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 Farmaco Trastuzumab: anticorpo monoclonale IgG1 contro il recettore HER 2, bloccando tale
recettore viene inibita la proliferazione di cellule tumorali che possiedono tale recettore 
Utilizzato nel carcinoma mammario HER2 positivo
 Covid 19

PROCEDURA PER PRODURRE ANTICORPI MONOCLONALI

1. Immunizzazione del topo con l’antigene di interesse o con più antigeni

2. Isolamento dei linfociti B dalla milza del topo immunizzato verso il

determinato antigene

3. Fusione dei linfociti B, prelevati, con cellule tumorali di mieloma che

sono incapaci di crescere in terreno HAT, attraverso campi elettrici o
sostanze tipo polietilenglicole (PEG)

4. Si ottengono miscele di cellule fuse (ibridomi)che si riproducono

indefinitamente e che producono anticorpi, e cellule non fuse

5. Selezione degli ibridomi attraverso semina in terreno selettivo HAT

6. Una volta messi in coltura gli ibridomi si riproducono e le cellule non

fuse muoiono (i linfociti muoiono perché hanno un ciclo vitale più
breve, le cellule di mieloma perché non riescono a sintetizzare il DNA
a causa del terreno selettivo)

7. Riproduzione dell’ibridoma

COLTIVAZIONE DEGLI IBRIDOMI:

Condizioni di Coltivazione:
T= 37° pH=7.2-7.4 

ossigeno e pressione osmotica controllate

Il terreno di coltura (liquido) deve quindi contenere in precise concentrazioni aminoacidi, glucosio vitamine,
sali minerali e siero, antibiotici per evitare possibili infezioni.

Dove si effettua: bioreattore a fibre cave 

Cilindro in materiale plastico attraversato da capillari (detti fibre cave) di alcuni millimetri di spessore, I
capillari sono di materiale microporoso che fungono da supporto semipermeabile per le cellule (che si
trovano negli spazi extracapillari), mentre il terreno liquido di coltura viene inviato e fatto circolare
all'interno dei capillari (spazi intracapillari).
La permeabilità dei capillari permette il passaggio dei nutrienti e dei
cataboliti (sistema a perfusione) (processo a membrana):
-aumentando la pressione del terreno di coltura liquido negli spazi
intracapillari, le sostanze nutritive attraversano le fibre cave e vengono
inviate alle cellule;

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-diminuendo la pressione il liquido rientra all'interno delle fibre portando con sé i cataboliti di rifiuto.
L’aria viene inviata nelle fibre
e passa attraverso i pori alle cellule.
A intervalli prefissati si preleva il terreno extracapillare contenente il prodotto desiderato, che viene
recuperato e purificato (30 giorni).

PRODUZIONE DI ORMONI

Sostanze prodotte dalle ghiandole endocrine, che riversano il loro prodotto direttamente nel sangue. Gli
ormoni raggiungono gli organi-bersaglio dove esercitano la loro azione regolatrice su molte funzioni
fisiologiche

- Ormoni polipeptidici
- Ormoni steroidei: ormoni di natura lipidica e derivano da un precursore comune che è il colesterolo

ORMONI POLIPEPTIDICI
I più importanti ormoni proteici prodotti industrialmente:
o insulina,
o  somatostatina, (1977)
o eritropoietina, 
o ormone della crescita o somatotropina (HGH) 
 
Produzione:

- bioreattori di tipo STR con agitazione meccanica e sistema di insufflazione d'aria.

- separazione del prodotto di interesse dalla biomassa richiede tecniche quali la cromatografia
HPLC(High Performance Liquid Chromatography) su resine a scambio ionico. 
- eluizione con adatto solvente, la concentrazione e la cristallizzazione, da cui si ottiene il prodotto
purificato.

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PRODUZIONE DI INSULINA (1982approvata l’insulina ricombinante)

Ormone ipoglicemizzante, secreto dalle cellule β delle isole di Langerhans della frazione endocrina del
pancreas. Funzione: permettere il trasferimento del glucosio dal sangue all'interno delle cellule, dove viene
utilizzato per produrre energia. Carenza di insulina: innalzamento della glicemia, diabete 

Costituita da due catene polipeptidiche, denominate A (21 aminoacidi) e B (30 aminoacidi), unite da ponti
disolfuro. L'ormone viene secreto come pro-insulina, forma che comprende anche una terza catena
proteica (catena C) che non ha alcuna attività nei confronti del glucosio ma che serve a connettere fra di
loro le altre due catene, da cui in seguito si separa.

L'insulina è stata per lungo tempo estratta dal pancreas di bovini e suini (svantaggio: non è uguale a quella
umano⇒allergie o intolleranze) prima di essere prodotta da microrganismi geneticamente modificati
(simile a quella umano)

L’INSULINA RICOMBINANTE PUÒ ESSERE PRODOTTA IN E.COLI O IN EUCARIOTI

a. Delle due catene 
Nei procarioti la sintesi dell’insulina può essere ottenuta con le
b. Della proinsulina
metodologie:

In entrambi i casi viene prodotta a livello intracellulare

a. METODOLOGUE DELLE DUE CATENE:

 Partendo dalle due sequenze amminoacidiche si è ottenuto prima mRNA e poi per retrotrascrizione
cDNA

 I due cDNA sono inseriti in due plasmidi diversi in corrispondenza del gene codificante la β-
galattosidasi e della corrispondente regione di controllo (LacZ)

 La vicinanza con il gene della β-galattosidasi permette

la sintesi di una molecola in fusione con la β-
galattosidasi che protegge la catena dalla proteolisi
batterica

 I due tipi di plasmidi sono inseriti in ospiti distinti 

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  Le cellule ospite producono in modo indipendente l’una dall’altra β-galattosidasi -catena insulinica
A e β-galattosidasi-catena insulinica B (si usano 2 bioreattori distinti)
insulina
 Le proteine sono raccolte e purificate

 Vengono separate da β-galattosidasi con bromuro di cianogeno

 Il bromuro di cianogeno ha la proprietà di tagliare il legame peptidico a valle della

metionina che si trova nella catena della β-galattosidasi e nel punto di collegamento tra la β-
galattosidasi e la catena insulinica: questo produce catene insuliniche integre (le catene insuliniche
non hanno metionine)

 Le due catene sono riunite chimicamente con la formazione di ponti disolfuro

b. METODOLOGIA DELLA PROINSULINA

Viene prodotto il cDNA della proinsulina che verrà legato al gene per la β-galattosidasi e alla regione di
controllo ed inserito in vettore di espressione e in E.coli. La proinsulina viene separata dalla β-galattosidasi.
La catena viene fatta ripiegare per formare i due ponti disolfuro -> quindi viene tagliato il peptide c di
collegamento

PRODUZIONE DI INSULINA IN Saccharomyces cerevisiae (lieviti)

Il microrganismo produce l’insulina a livello extracellulare inducendo operazioni post traduzionali che
portano alla formazione di insulina matura (ripiegamento, formazione di ponti disolfuro e taglio del peptide
C). Il plasmide ricombinante si integra nel genoma del lievito che quindi può produrre proinsulina

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