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Vettore per il trasporto di materiale esogeno:

-Virali;
-Non virali o sintetici;

Vettori virali:Virus
Permettono di trasferire il materiale esogeno nelle cellule somatihe mediante l'elevata
capacità di trascrizione;
-Il capside,contenente il materiale genetico,protegge il materiale genetico dalle
endo/eso proteasi cellulari;
-Nel processo di infezione,il virus è adsorbito sulla superficie cellulare per la presenza di
specifici recettori;
-successivamente,mediante endocitosi ,viene internalizzato, e si forma l'endosoma che
in seguito dovrebbe fondere a livello lisosomiale;
Però il virus non arriva a livello lisosomiale perchè le proteine costituenti il capside
interagendo con le proteine della membrana dell'endosoma,vi interagiscono e lo
destabilizzano,e rilasciano il materiale genetico nel citoplasma,che siccome è circondato
da altre proteine formanti il capside è in grado di traslocare nel nucleo------>ESCAPE
ENDOSOMIALE;
CARATTERISTICHE NECESSARIE DEL VIRUS NELLA TERAPIA GENICA:
Il Genoma virale deve essere in grado di ospitare geni di diversa grandezza;
-IL virus deve essere difettivo nella replicazione,a differenza dei wild-type, al fine di
evitare la replicazione incontrollata in vivo!

Virus più impiegati:


-RETROVIRUS:

Vantaggi:il materiale genetico da essi trasportato è inserito nel cromosoma della


cellula ospite,per cui il genoma del virus non esiste come unità genica accessoria,per cui
non va persa in seguito alla replicazione della cellula dato che quest'ultima replicherà
anche i geni esogeni poichè saranno inclusi nel cromosoma;
-Non c'è risposta immunitaria,poichè i retrvirus usati,non hanno proteine
immunogene,perchè sennò verrebbe rimoso;

Svantaggi:
-Infetta tutte le cellule,non è specifico,per cui c'è una riduzione del trasferimento del
gene esogeno alla cellula target(per far produrre la proteina),oltre al fatto che infettando
tutte le cellule c'è un aumento degli effetti tossici;
-Sono in grado di infettare SOLO cellule in grado di replicarsi,infatti non è in grado di
veicolare un gene,ad esempio,a livello delle cellule neuronali;
-Inserimento casuale del gene nel cromosoma della cellula target:se l'inserimento di una
sequenza nucleotidica da parte del virus avviene a livello di una sequenza genomica
della cellula che esprime una proteina fondamentale per la sopravvivenza di
quest'ultima,porterà ad un'inespressione con consecutivi effetti collaterali OPPURE
L'ALTERAZIONE DEL GENOMA CELLULARE PUò FAR INSORGERE UN TUMORE!
-il retrovirus terapeutico può combinarsi ad un altro retrovirus gia presento,con
consecutiva produzione di virus infettivi;

AdenoVirus:Non molto infettivi


Vantaggi:Il genoma rimane come unità genica accessoria nel nucleo,sia sulla
cellulare proliferante che quiescente,replicandosi da soli;
-Trasportano geni esogeni di diversa grandezza;
-Possono agire per un periodo limitato di tempo poichè inducono una risposta
immunitaria,favorendo l'espressione temporanea di citochine infiammatorie,che
distruggono la cellula infetta;
-Impiegabili per tumori;

Svantaggi:Avendo un effetto limitato nel tempo non sono utili per patologie
ereditarie!;
-Assenza di specificita per il target infettando tutti tipi cellulari;
-Inducono risposta immunitaria,che per via delle cellule della memoria al secondo
contatto la risposta immunitaria è molto piu consistente!;

Adeno-Associati:
-Vantaggi: trasferiscono il gene sia a cellule proliferanti che quiescenti,e non presentano
risposta immunitaria;
-Svantaggi:essendo genomi molto piccoli non permettono il trasferimento di geni
esogeni di grandi dimensioni

Herpes-Virus:
-Vantaggi:Trasferimento di materiale genetico di grandi dimensioni;
Trasferiscono sia a cellule proliferanti che quiscenti;
Materiale genetico rimane nella cellula ospite per un lungo periodo di tempo rimanendo
sotto una forma quiescente come episoma stabile,non dando effetti infettivi
immediatamente
Altri virus:Alfavirus e Diproxovirus;

Le modalità di introduzione del materiale genetico sono 2:


-Attraverso procedure ex vivo(piu usato!!!!);
-Attraverso procedure in vivo(sconsigliato poichè MOLTE VOLTE i vantaggi sono molto
meno degli svantaggi,per cui meglio in ex vivo,controllando la trasformazione della
cellula per poi reinserirla dopo un accurato controllo nell'organismo);
Svantaggi e vantaggi dei carrier di materiale genetico:
Vantaggi:
-Maggiore efficienza di trascrizione(adenovirus infettano sia cellule proliferanti che
quiescenti,cosìcchè si possa trasferire il materiale genetico in qualunque tipo di cellula);
-Protezione del materiale esogeno dalle eso/endo proteasi;
-Trasportano i geni esogeni nel nucleo della cellula bersaglio(destabilizzano endosoma);
-Svantaggi:
-EFFETTI TOSSICI(collaterali),data la casualità di inserimento del genoma anche in cellule
diverse dal target,o nel caso dell'adeno virus la risposta immunitaria;
-Problema etico legato alla sicurezza nella produzione industriale dell'operatore,poichè
non facile da preparare;

Questi problemi legati al vettore virale possono


essere bypassati mediante la preparazione di un
vettore sintetico!
Vettore non virale e sintetico deve essere realizzato tenendo conto delle caratteristiche
dei virus:
a)Involucro simile al capside con la funzione di proteggere dalle eso/endo proteasi;
b)possedere molecole in grado di destabilizzare l'endosoma in seguito
all'internalizzazione;
c)Ligando (molecola direzionante)che permette di legare la cellula target che contiene il
recettore per il ligando;
Vantaggi:
-sicurezza di manipolazione e produzione;
-Minor costo di produzione;
-permette l'intrappolamento di materiale genetico esogeno di grandi dimensioni;
Vettori non Virali:
-Liposomi:Tra I vantaggi troviamo quelli classici del drug delivery system,quindi
targeting(accumulo specifico nel distretto target) che include una riduzione degli effetti
tossici ed il trasporto avviene mediante intrappolamento del corredo genetico nei
liposomi attraverso il legame tra corredo e vescicola sulla superficie del liposoma!;
-Polimeri;
-Peptidi;
-Lipopoliplessi;

Classificazione liposomi:
Anionici:Primi usati,poichè hanno una ridotta tossicità (approvati dall'FDA),MA poi
scartati:
Netta carica negativa--->fosfatidil serina,con la fusione della struttura vescicolare Calcio
indotta,che permette l'uso di macromolecole biologiche che vanno incontro al processo
di denaturazione--->esempio:plasmide!
Il legame con la cellula avviene col calcio nel terreno di coltura e l'avvenuta
trasformazione è stata constata con l'inserimentod i una proteina dotata di
bioluminescenza!
Svantaggi constatati:
-Bassa efficienza d'intrappolamento,per via della repulsione elettrostatica instaurata tra
il materiale genetico ed il liposoma entrambi carichi negativamente!
-Riduzione della trasfezione:Perchè?Perchè in seguito all'endocitosi il liposoma arriva a
livello lisosomiale perchè non è dotato di alcun meccanismo di ESCAPE!

LIPOSOMI pH-SENSIBILI:Viene rilasciato (il corredo genetico)a livello


citoplasmatico prima di arrivare nel lisosoma;
Costituito da fosfatidiletanolammina e da un lipide debolmente acido(carico
negativamente)che permette alla fosfatidiletanolammina di aggregarsi ai doppi strati
lipidic permettendogli di formare i liposomi,poichè la fosfatidiletanolammina a pH
fisiologico non è capace!;
Internalizzato per endocitosi,con acidificazione del pH che provoca la protonazione del
lipide debolmente acido,con repulsione tra fosfatidiletanolammina e lipide debolmente
acido con trasformazione dalla fase lamellare a quella esagonale;
Svantaggi:bassa efficienza dìintrappolamento per la repulsione tra lipidi debolmente
acidi(carichi negativamente) ed il corredo genetico;
Scarsa emivita e stabilità nel torrente circolatorio,poichè alcuni lipidi debolmente acidi
sono facilmente rimossi dalle albumine sieriche;
Scartati anche questi!
LIPOPOLIPLESSI:deriva dal legame tra corredo
genetico e liposoma svolto sulla superficie!
Sono costituiti dai liposomi e da lipidi carichi
positivamente con carica totale positiva;
Il più usato è la sterilammina;
Svantaggi:hanno una bassa efficienza di trasfezione rispetto ai liposomi
anionici,poiche risultano citotossici

Relazione struttura attività:


-Aumento dell'efficacia della trasfezione mediante un aumento dei gruppi
amminici(teste polari) ed un aumento della distanza tra gruppi amminici e porzione
idrofoba;
-Aumento della lunghezza della catena e riduzione del numero di doppi legami riducono
sia l'efficienza di trasfezione che le interazioni col DNA poichè riducono la flessibilità
vescicolare;
-è importante anche il tipo di legame tra lo spaziatore(nel caso sopra riportato è
-CH2) e la testa polare!
Preparazione lipoplessi:mescolamento tra liposomi cationici con vettore plasmidico,con
consecutiva riorganizzazione e sviluppo della carica positiva!

Efficienza trasfezione:
-Grandezza;
-Carica superficiale;
-Stabilita colloidale;
Fattori responsabili delle caratteristiche chimico fisiche dei lipoplessi:
-Forza ionica del mezzo di reazione;
-Temperatura di reazione;
-Velocità di mescolamento dei componenti;
Rapporto tra il lipide e materiale Genetico:
-Influenza la stabilità e la grandezza del lipoplesso:
a)Tra i 100 e 400 nm con la concentrazione di DNA maggiore di quella lipidica----> il
lipoplesso è Carico Negativamente;
b)Tra 300 e 1200 nm con un rapporto DNA-lipide di 1:1---->Il lipoplesso è neutro;
c)Tra 100 e 400 nm con una concentrazione del lipide maggiore di quella del DNA-----
>Carica netta del lipoplesso:Positiva;
Quelli carichi negativamente e positivamente sono quelli più stabili,poichè i
neutri,essendo più grandi,presentano il DNA esposto e quindi soggetto alle
endonucleasi,Per cui si ha una variazione legata all'efficienza di trasfezione per via
dell'etereogeneità dimensionale;
Inoltre il lipoplesso carico + protegge il DNA dalle endonucleasi a differenza di quello
carico negativamente;

IL LIPOPLESSO DA USARE è QUINDI QUELLO CON


CARICA NETTA POSITIVA!
Com'è fatto!?
Studi di microscopia elettronica dimostrano che la struttura è una struttura a
"SANDWICH",con all'esterno i liposomi(proteggono dna) ed all'interno il DNA---
>MACROSCOPICAMENTE!!!
Tra i sistemi che si formano all'interno della struttura a "sandwich",che sono
tantissimi,c'è quella a "spaghetti e polpette"-->microscopicamente!!!
In questa struttura il DNA è disteso come fosse lo spaghetto sul quale sono adesi alcuni
lipidi cationici,mentre a distanza vi erano i liposomi cationici rappresentanti "le
polpettine";
Inoltre si ipotizzò un'alternanza di fasi esagonali dove i lipidi cationici erano responsabili
della fusione dei liposomi,con una struttura simile ad un grappolo d'uva,coi liposomi
rappresentanti gli acini(è possibile osservare questa struttura a BASSO ingrandimento);

Tra Gli altri fattori influenzanti le caratteristiche chimico fisiche,legate quindi alla capacità
di trasfezione di tali complessi:

-La forza ionica:


a)alta:NON si forma il lipoplesso poichè quest'ultima impedirebbe l'interazione
elettrostatica tra le componenti provocando la precipitazione di uno dei 2;
b)bassa:permette l'aumento delle forze elettrostatiche instaurate tra le 2 componenti;
-Temperatura:NON INFLUISCE SU FORMAZIONE E CARATTERISTICHE;

-Velocità di mescolamento:
a)alta:piccoli lipoplessi;
b)bassa:precipitazione dei complessi;

L'ATTIVITà DEL LIPOPLESSO DIPENDE DAL PROCESSO DI


INTERNALIZZAZIONE:
a)Entrata del lipoplesso nella cellula;
b)Metodo di rilascio nel citoplasma:
meccanismo anionico:
La carica positiva del lipoplesso interagisce con la carica negativa delle
proteine membranali,dato che i fosfolipidi,carichi negativamente si
trovano all'interno della cellula;A questo punto,in seguito all'interazione
tra proteine e lipoplesso si ha la formazione dell'endosoma,caratterizzato
da un monostrato esterno che è costituito dai fosfolipidi membranali
carichi negativamente(quindi,lo strato interno della membrana di
partenza) che a questo punto interagiscono con il lipide
cationico,provocando il "flip-flup" dei lipidi anionici da cui ne consegue
una neutralizzazione delle cariche positive del lipoplesso,che a questo
punto,incapaci di interagire col DNA,permettono il rilascio di quest'ultimo
nel citoplasma!

c)Entrata del corredo genetico nel nucleo:


Mediante oligonucletotidi fluorescenti è stato constatato che la
penetrazione della membrana non avviene per il vettore plasmidico poichè
troppo grande,ragion per cui avviene per:
-trasporto attivo o passivo;
-destabilizzazione della membrana tramite le cariche positive dei lipidi
cationici che rimanendo associati al vettore plasmidico espletano
un'azione detergente;

2 ipotesi ambo accettate!!!