Corso di Laurea in Scienze e Tecniche delle

Attività Motorie Preventive e Adattate

Analisi di laboratorio applicate allo sport

Microbiologia applicata
I ANNO

PROF.SSA FLORA DE CONTO

a.a. 2021-2022
1
 Microbiologia applicata

PROGRAMMA

Popolazione microbica residente dell’organismo umano.

Rapporti ospite-parassita.
Le difese dell’ospite nei confronti degli agenti eziologici di malattie da
infezione.
Immunità innata; Immunità adattativa.
Generalità sulle malattie da infezione.
Agenti eziologici di malattie da infezione: batteri, funghi, protozoi e
virus. Modalità di infezione, meccanismi di patogenicità.
Diagnosi di laboratorio delle malattie da infezione, principi e metodi.
Campioni biologici per la diagnosi di laboratorio delle infezioni da virus e
da microrganismi: modalità di raccolta, trasporto e conservazione.
Diagnosi diretta: esame microscopico, esame colturale, ricerca di
antigeni, ricerca di acidi nucleici.
Diagnosi indiretta: ricerca di anticorpi specifici.
2
  POPOLAZIONE MICROBICA
RESIDENTE NELL’ORGANISMO UMANO
4
L’organismo umano è
costituito da circa
1013 cellule eucariote
e alberga mediamente
1014 batteri, oltre a
miceti

5
Popolazione microbica residente
nel tratto gastroenterico

6
 Distretto
anatomico
Microrganismi

Staphylococcus, Corynebacterium,
Cute Acinetobacter, Pityrosporum (lievito),
Propionibacterium

Streptococcus, Lactobacillus,
Cavo orale Fusobacterium, Veillonella,
Corynebacterium, Neisseria, Actinomyces

Streptococcus, Staphylococcus,
Tratto respiratorio Corynebacterium, Neisseria

Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides,

Bifidobacterium, Eubacterium,
Tratto
Peptococcus, Peptostreptococcus,
gastrointestinale Ruminococcus, Clostridium, Escherichia,
Klebsiella, Proteus, Enterococcus

Escherichia, Klebsiella, Proteus,

Tratto urogenitale Neisseria, Lactobacillus (vagina in donne in
età fertile)
7
 Alcuni distretti anatomici sono sterili, mentre altri presentano
saltuariamente microrganismi in transito

 La composizione della popolazione microbica residente è frutto

di complesse interazioni tra i vari tipi di microrganismi e tra
microrganismi e “habitat”

8
Ruolo della popolazione microbica residente
• E’ importante per la produzione di vitamine (es.
Escherichia coli sintetizza la vitamina K)

• Ostacola, competendo per le stesse risorse

nutrizionali e i siti di adesione, l’attecchimento di
microrganismi patogeni

• Svolge un ruolo di stimolo per il sistema

immunitario

• Partecipa a reazioni chimiche di varia natura (es.

fermentazioni nell’intestino)

• Può occasionalmente diventare agente di infezione

(infezione endogena) in caso di alterazione delle
condizioni fisiologiche del soggetto 9
Ruolo biochimico/metabolico della popolazione
microbica residente dell’intestino

Sintesi di vitamine Tiamina, riboflavina, piridoxina, K

Produzione di gas CO2, CH4, H2

Produzione di vari composti H2S, NH3, ammine, indolo, acido butirrico

Produzione di acidi organici Acido acetico, propionico, butirrico

Enzimi: b-glucuronidasi, b-galactosidasi b-

Reazioni glicosidasiche glucosidasi, a-glucosidasi,
a-galactosidasi

Processi: esterificazione, deidrossilazione,

Metabolismo steroideo
ossidazione, riduzione 10
Popolazione microbica residente: 1° vantaggio

Conferisce una difesa di carattere biologico che si aggiunge a

quelle di carattere fisico (la continuità, il flusso mucociliare, la
peristalsi…) e chimico (i bassi valori di pH, gli acidi grassi, gli
enzimi digestivi…)

11
Popolazione microbica residente: 2° vantaggio

Deriva dallo stimolo che il nostro sistema immunitario riceve:

gli anticorpi prodotti possono rappresentare una difesa verso
batteri/miceti con potenziale di patogenicità.

12
CAMBIAMENTO DI SEDE:
E. coli enterico nella vescica: cistite;
S.sanguis dalla cavità orale al sangue:
endocardite in un soggetto reumatico
DISMICROBISMO:
Causato da antibiotici (C.
difficile e colite
pseudomembranosa) o da
eccessivo consumo di saccarosio
(S.mutans e carie dentale)
13
 Occhi
• Lavaggio lacrimale
Cute

Barriere di
• Lisozima
• Barriera anatomica
• Secrezioni antimicrobiche
Apparato respiratorio
difesa del • Muco
• Epitelio ciliato

corpo umano • Macrofagi alveolari

Sistema genito- Apparato gastroenterico

urinario • Acidità gastrica
• Lavaggio urinario • popolazione batterica residente
• Acidità, urine e
vaginale
• Lisozima

14
  RAPPORTI
MICRORGANISMO/OSPITE

15
COMMENSALISMO
popolazione microbica residente

SIMBIOSI
Es. batteri del rumine dei bovini

PARASSITISMO
- parassiti facoltativi
- parassiti obbligati

16
17
MECCANISMI DI
PATOGENICITA’

18
19
 Un microrganismo viene definito
PATOGENO quando, dopo infezione
dell’ospite, determina l’insorgenza di una
malattia

20
La maggior parte delle infezioni si verifica attraverso le
mucose in competizione con i batteri commensali e i
meccanismi di detersione
21
Fattori determinanti la malattia infettiva

Trasmissibilità del patogeno

Adesione ai tessuti dell’ospite
Penetrazione
Crescita e moltiplicazione del patogeno
Tossigenicità
Elusione delle risposte immunitarie

22
LE DIFESE DELL’OSPITE NEI CONFRONTI
DEGLI AGENTI EZIOLOGICI DI MALATTIE
DA INFEZIONE

Immunità innata: prima linea di difesa antiinfettiva

Immunità adattativa o inducibile: agisce attraverso

la risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata nei
confronti di specifici antigeni di agenti infettanti

23
 Immunità innata

• I «sensori» dell’immunità innata sono recettori

cellulari e fattori solubili presenti nei liquidi
circolanti e nei liquidi interstiziali dei tessuti con
funzioni di:
- innesco di segnali di membrana  produzione di
citochine e altri fattori che modulano
l’infiammazione;
- innalzamento della temperatura;
- neutralizzazione degli agenti di infezione;
- attivazione della fagocitosi.

24
 Recettori cellulari

• «Toll-like receptors» (TLR) presenti in macrofagi,

mast-cellule, cellule dendritiche ed endoteliali.

- Componenti
superficiali di
batteri e miceti
- (TLR sulla
membrana
citoplasmatica);
- Acidi nucleici
virali (TLR sulle
membrane
intracellulari).

Sintesi di citochine
pro-infiammatorie
25
 Fattori solubili

• Lectine: proteine che si legano a glicoproteine virali inibendo

l’adsorbimento
• Interferone: prodotto in risposta a un’infezione virale
• Proteina C-reattiva: si lega all’antigene C di Streptococcus
pneumoniae
• Lisozima: enzima che depolimerizza il peptidoglicano
• Defensine: peptidi che inserendosi nella membrana esterna
dei Gram- formano pori con conseguente uccisione del
batterio
• Collectine: proteine del fegato con funzione di lectina

26
 Fagocitosi

• I fagociti sono: granulociti polimorfonucleati (leucociti del

sangue) per contrastare i microrganismi extracellulari e
macrofagi (presenti nei tessuti connettivi) per
microrganismi con moltiplicazione intracellulare.

27
 La fagocitosi

• Avviene previo riconoscimento dei recettori per il

frammento cristallizzabile (Fc) delle
immunoglobuline o il componente C3b del
complemento che si legano alla superficie del
microrganismo.
• L’adesione del microrganismo attiva l’estroflessione
di porzioni di citoplasma.
• La particella è inclusa in un fagosoma.
• Si formano composti ossidanti che
danneggiamo il microrganismo fagocitato,
con calo del pH che attiva le proteasi.

28
 Il complemento

• E’ presente nel siero e nei liquidi interstiziali; è composto da

proteine, soprattutto enzimi, che si attivano a «cascata»
• E’ formato da 9 componenti

29
Il complemento: attivazione

Via classica: legame di C1 a Fc

di due IgG o una IgM legate ad
antigeni di un microrganismo

Via alternativa: si attiva in

presenza di componenti non-
self

30
 Risposta immunitaria umorale

• Nel caso di antigeni esogeni (extracellulari), i linfociti B

interagiscono con l’antigene attraverso la mediazione di
anticorpi

31
 Risposta immunitaria umorale

• Un antigene esogeno è
contemporaneamente in
contatto con i linfociti B dotati
dello specifico recettore al
quale si lega, selezionando quelli
in grado di produrre specifici
anticorpi, e una cellula (es.
cellula dendritica) dotata di
potere fagocitario in grado di
«presentare l’antigene» (APC) ai
linfociti TCD4+.

• I linfociti T che interagiscono

con tale antigene determinano la
conversione dei linfociti B a
plasmacellule con produzione di
anticorpi.
32
 Immunoglobuline

• Proteine con specificità di legame per l’antigene.

33
 Immunoglobuline IgG

• Formata da 4 catene polipeptidiche.

• Fc: frammento cristallizzabile
• Fab: frammento che si lega
all’antigene, porzione variabile
• Hanno proprietà opsonizzanti, possono
neutralizzare tossine e virus e fissano
il complemento
• Diffondono negli spazi extravascolari

34
 Immunoglobuline IgM

• Sono i primi prodotti nel corso di

un’infezione
• Sono efficaci nella fissazione del
complemento e nell’attività
opsonizzante

35
 Immunoglobuline IgA

• Si trovano nei fluidi intestinali, nelle

secrezioni nasali, nella saliva, nelle
lacrime e in altre secrezioni mucose.
• Neutralizzano gli antigeni di superficie
dell’agente infettante impedendone
l’adesione alla mucosa.

36
 Immunoglobuline IgE

• Si legano in maniera specifica a

plasmacellule stimolando il rilascio di
di mediatori dell’infiammazione

37
 Risposta immunitaria cellulo-mediata

• Nel caso di antigeni endogeni (intracellulari), i linfociti T

distruggono la cellula infettata.
• La presenza sulla superficie di linfociti T di
co-recettori (CD4 o CD8) in grado di legarsi a
molecole del complesso maggiore di
istocompatibilità (MHC di classe I o II)
aumenta l’avidità del legame.
• I linfociti T helper (CD4+) legati all’antigene
producono citochine.

38
 Risposta immunitaria cellulo-mediata

• Le cellule «natural killer» si trovano nel sangue, negli

organi linfoidi e nella milza e riconoscono cellule che
presentano antigeni non-self, uccidendole.
• Producono interferone- g

39
 La risposta immunitaria nelle infezioni
batteriche
• Nelle infezioni extra-cellulari gli anticorpi sono
fondamentali:
- si legano alla superficie del batterio impedendo la
colonizzazione;
- favoriscono l’attivazione del complemento;
- favoriscono la reazione infiammatoria e il richiamo di
fagociti;
- neutralizzano le tossine.

Per batteri a localizzazione intracellulare è importante

l’immunità cellulo-mediata, in particolare con l’attivazione dei
macrofagi.

40
 La risposta immunitaria nelle infezioni
fungine
• Viene attivata sia la produzione di anticorpi, sia l’immunità
cellulo-mediata, in particolare con l’attivazione dei
macrofagi.

41
 La risposta immunitaria nelle infezioni
protozoarie
• Si osservano entrambe le tipologie di risposta immunitaria.

42
 La risposta immunitaria nelle infezioni
virali
• La produzione di anticorpi ha un ruolo fondamentale nei
confronti di virioni extracellulari, eliminandone l’infettività,
e nella distruzione di cellule infettate, attivando il
complemento.

• Un ruolo fondamentale è svolto dall’immunità cellulo-mediata

e in particolare dai linfociti citotossici.

43
Generalità sulle malattie da infezione

44
 Epidemiologia delle infezioni

 E’ lo studio della distribuzione e dei fattori che

determinano le malattie infettive.

 Nei paesi industrializzati le malattie da infezione

continuano a rappresentare una quota rilevante della
patologia umana, mentre in paesi in via di sviluppo sono
ancora la prima causa di mortalità.

 Globalmente, le malattie da infezione sono ancora

oggi una delle principali cause di mortalità.

45
 Epidemiologia delle infezioni
 Secondo recenti stime dell’OMS, su un totale di ≈52
milioni di morti all’anno quasi 1/3 (17 milioni) è dovuto
a malattie da infezione.

46
 Epidemiologia delle infezioni

 Le malattie da infezione incidono in particolar modo

nella prima infanzia e nei giovani.

 Alcune cause del fenomeno sono:

- difficoltà nella prevenzione delle infezioni endogene;

- mancanza di farmaci e vaccini per gran parte delle

infezioni da virus;

47
 Epidemiologia delle infezioni

- diffusione della farmaco-resistenza tra batteri

patogeni (con conseguenze gravi nel caso di
pneumococchi multi-resistenti, enterococchi
resistenti alla vancomicina, batteri produttori di
carbapenemasi…).

48
 L’importanza delle malattie da infezione…

Condizioni favorevoli per infezioni da microrganismi a

scarsa patogenicità (opportunisti) e infezioni
nosocomiali:
1. uso estensivo di terapie immunosoppressive;
2. impiego diffuso di impianti protesici temporanei
(cateteri venosi, vescicali,..) o permanenti (valvole
cardiache, protesi vascolari,..);
3. notevole incremento di pratiche endoscopiche a
scopo diagnostico o terapeutico.

49
 L’importanza delle malattie da infezione…

Altre cause:
 modificazioni dei costumi che negli ultimi decenni hanno portato
ad un incremento delle infezioni a trasmissione sessuale;
 continue scoperte di nuovi agenti che hanno «spostato» nel
settore della “patologia da infezione” patologie in passato
considerate di natura degenerativa, disendocrina, dismetabolica;
 emergenza di agenti in passato non ritenuti patogeni oppure
ritenuti non rilevanti (es. Cryptosporidium spp, Microsporidium
spp., Pneumocystis carinii, citomegalovirus), specialmente negli
immunocompromessi;
 ri-emergenza di patologie erroneamente considerate
“definitivamente sotto controllo” (es. infezione da virus West
Nile).

50
 L’importanza delle malattie da infezione…

Una malattia infettiva è definita emergente se la sua

incidenza è aumentata nelle ultime due decadi e/o se
presenta rapida crescita.

Potrebbe riguardare un nuovo patogeno (es. SARS-

CoV-2), oppure un «vecchio patogeno» (es.
Mycobacterium tubercolosis).

51
52
 Virus emergenti

Virus che “saltano” la specificità d’ospite:

virus Ebola, coronavirus SARS, virus
influenza aviare, hantavirus….

SARS CoV-1 e SARS CoV-2

Ebola Hantavirus
53
 COVID-19

 31 dicembre 2019: le autorità sanitarie cinesi hanno riferito che

nella città di Wuhan (provincia di Hubei, Cina centro-orientale) si
era sviluppato un focolaio epidemico di casi di polmonite atipica a
eziologia non nota.

 Molti dei casi iniziali riferivano la frequentazione del mercato

all’ingrosso del pesce di Wuhan, dove sono in vendita anche
animali selvatici di specie disparate, utilizzati a scopo
alimentare.

54
COVID-19
55
COVID-19

56
COVID-19
57
 COVID-19

 9 gennaio 2020: il Center for Disease

Control cinese ha comunicato di aver
identificato l’agente causale: un nuovo
coronavirus, denominato in via provvisoria
2019-nCoV poi ufficialmente SARS-CoV-2
(International Committee on Taxonomy of
Viruses, 11 febbraio 2020), che è stato
sequenziato;

 Successivamente è stata confermata la

possibilità di trasmissione interumana del
virus. 58
 SARS-CoV-2

HCoV-NL63
HCoV-229E
HCoV-OC43, HCoV-HKU1, MERS-CoV,
SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 59
SARS-CoV-2

- Dimensioni medie
- Genoma RNA+
- Pericapside
- Presenza di peplomeri
(proteina spike) che
fungono da antirecettori
- In grado di infettare
cellule delle alte e basse
vie respiratorie

60
 SARS-CoV-2

• Il genoma codifica per 5 proteine:

• S – spike: consente il legame al recettore

• M – proteina di membrana; regola l’assemblaggio

• N – proteina nucleocapsidica; regola la sintesi di RNA virale,

interagisce con la proteina M durante la fuoriuscita

• E – piccolo proteina del pericapside a funzione non nota

• HE – glicoproteina emoagglutinina-esterase: favorisce

l’ancoraggio alle mucose

61
 SARS-CoV-2

Si lega al recettore ACE-2 con un’affinità 10-20 volte superiore a

quella di SARS-Cov-1 (…cellule alveolari tipo 2, epitelio bronchiale,
epitelio buccale, epitelio intestinale, cellule del miocardio, cellule
tubuli renali…)

62
SARS-CoV-2

63
 SARS-CoV-2

• Incubazione 2-14 gg

• Insorgenza sintomi 5-6 gg dall’esposizione

• Elevata produzione di particelle virali in fasi precoci della

malattia, anche in soggetti con sintomi lievi

• Trasmissione mediante aerosol

• Trasmissione mediante mani a contatto con mucose

• Resiste 3 gg su superfici solide, 3 ore in aerosol

• Via oro-fecale? È comune la presenza di virus nelle feci

64
Co-morbidità e fattori di rischio

• Età

• Ipertensione

• Diabete

• Malattia coronarica

• Epatite B

• Malattie cerebrovascolari

• Malattia cronica ostruttiva polmonare

• Cancro
65
• I parametri variano in base
alla densità di popolazione e
ai fattori di esposizione

• Probabilmente SARS-CoV-2
ha capacità duplicata di
trasmissione, rispetto
all’influenza

66
SARS-CoV-2 infection diagnosed only by cell culture isolation before the
local outbreak in an Italian seven-week-old suckling baby

Calderaro et al. Int J Infect Dis. 2020 Jul;96:387-389

67
SARS-CoV-2 infection diagnosed only by cell culture isolation before the
local outbreak in an Italian seven-week-old suckling baby

Calderaro et al. Int J Infect Dis. 2020 Jul;96:387-389

controllo infezione

Cellule VERO

Cellule LLC-MK2
68
Non esiste evidenza scientifica che supporti l’idea che
SARS-CoV-2 sia un virus artificiale

Il coronavirus RaTG13 di pipistrello condivide la più alta

omologia di sequenza (96%), ma si diversifica per circa 1000
nucleotidi

E’ verosimile l’origine naturale del virus in animali

69
Molti mammiferi (visoni, zibetti, gatti, pangolini, conigli,
furetti, volpi, cervi..) possono essere infettati da SARS-
CoV-2

Salto della barriera di specie animale/uomo nel mondo?

Necessità di studi retrospettivi sulla diffusione del virus

nel mondo

70
71
Il Virus West Nile, un flavivirus che infetta varie specie di
uccelli, utilizzando come vettore insetti ematofagi (zanzare),
occasionalmente può essere trasmesso all’uomo con comparsa di
forme febbrili, che possono evolvere a encefaliti, talora
accompagnate da paralisi flaccida.

72
L’infezione da virus West Nile, endemica in Africa, Asia
occidentale, Medio Oriente e Paesi Europei della parte orientale del
bacino del Mediterraneo, è comparsa nel 1999 a New York, da cui è
progressivamente diffusa verso gli Stati occidentali, insediandosi
nella popolazione aviare indigena (Ghiandaia azzurra americana);
ogni estate con la comparsa delle nuove zanzare si presentano nuovi
focolai (picco nel 2003 con >9.000 casi).

73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
Coronaviridae SARS-CoV-2 COVID19 83