Micro

ISTITUTO TECNICO PER ATTIVITÀ SOCIALI
“GIORDANO BRUNO”
PERUGIA
LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA
Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni
Febbraio 2008
REPERTORIO DEI MODULI
E DELLE UNITÀ DIDATTICHE
1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI

1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA pag. 3
1.2 L’UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI pag. 10
2. OSSERVARE I MICRORGANISMI
2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE pag. 13
2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA pag. 16
2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE pag. 18
2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA pag. 21
2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM pag. 23
3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE
TECNICHE DI SEMINA pag. 25
3.2 I BATTERI DELLO YOGURT pag. 31
3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA
CRESCITA DEI MICRORGANISMI pag. 33
4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA pag. 37
4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO pag. 40
4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA pag. 42
4 4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA
4.4 DELL ACQUA POTABILE pag 46
pag.
4.5 VALUTAZIONE DELL’AZIONE INIBENTE DI ALCUNI
DISINFETTANTI DI USO COMUNE pag. 52
4.6 ANTIBIOGRAMMA pag. 56
5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI
5.1 UTILIZZAZIONE DELL’AMIDO pag. 61
5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI pag. 64
5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE pag. 67
5 4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI
5.4 pag 70
pag.
5.5 ENTEROTUBE pag. 73
6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO
6.1 PROTEINA C REATTIVA pag. 77
6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO pag. 79
APPENDICE
TERRENI DI COLTURA pag. 81
BIBLIOGRAFIA pag. 90
1
2
1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI
U.D. 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA
• REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA
Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennarelli), non mangiare, bere e fumare in
laboratorio.
N sedersi
Non d i sopra i banconi
b i e non appoggiarsi
i i aglili strumenti.
t ti
Indossare il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose.
E’ compito di ciascuno mantenere i camici puliti e in buone condizioni.
I capelli devono essere raccolti in modo da evitare contatti con superfici sporche o con la
fiamma del bunsen.
Non lasciare mai senza controllo reazioni in corso o apparecchi in funzione.
Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone.
Non portare in tasca forbici, tubi di vetro o oggetti taglienti e appuntiti.
Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e, in particolare, alla fine dell’attività
lavorativa dopo la manipolazione di materiale biologico.
Le apparecchiature di laboratorio devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo
l’uso.
Sull’etichetta dei reagenti sono riportati:

nome del prodotto
composizione chimica
simboli di pericolosità
frasi di rischio e sicurezza
SIMBOLI DI PERICOLO
Tossico: sostanza chimica che Infiammabile: qualsiasi sostanza

può causare danni acuti o liquida, solida, vapore o gas che si
cronici all’organismo infiammi facilmente e bruci
rapidamente.
Materiale ossidante: sostanza in Esplosivo: materiale che produce un

grado di rilasciare ossigeno che istantaneo e improvviso rilascio di
può incrementare o accellerare la pressione, gas o calore quando sottoposto
combustione. ad un brusco shock, pressione o
temperatura.
Corrosivo: sostanza chimica Irritante: materiale non corrosivo che

che provoca distruzione visibile causa effetti infiammatori reversibili sui
o alterazione irreversibile dei tessuti viventi attraverso l’azione chimica
tessuti organici nel punto di nel punto di contatto in funzione della
contatto. concentrazione e del tempo di esposizione.
3
• TECNICHE DI ASETTICITA’
Le finalità di queste tecniche sono:

a) ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi
b) svolgere il lavoro in laboratorio di microbiologia con sicurezza
Una “coltura pura” è costituita solo da una specie di microrganismo.

La contaminazione delle colture è a rischio in qquanto i microbi si trovano ovunque,
q sulla
pelle, nell’aria, sulle superfici dei piani di lavoro.
Le regole fondamentali delle tecniche di asetticità sono:
- usare terreni e attrezzature sterili

- lavorare vicini alla fiamma del bunsen
- sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente
- tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone
- flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo
- arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l’intera lunghezza dell’astina
metallica, sia prima che dopo i prelievi
- la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm
- quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla
vedere facilmente
- sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati,
usati dopo ll’uso
uso dentro apposite buste
autoclavabili
- disinfettare il bancone di lavoro accuratamente
- sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto
INCUBAZIONE DELLE COLTURE

Scrivere sulla base della piastra Petri prima
dell’inoculo indicando il nome dell’operatore, la
data, il nome del microrganismo, in modo da
riconoscere la piastra e sapere ciò che contiene.
Le colture pure in piastra devono essere sigillate con
nastro adesivo.
4
• TECNICHE DI STERILIZZAZIONE
Sterilizzazione: trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita.
Può essere realizzata con:
a- calore secco
b- calore umido
c- filtrazione
CALORE SECCO
a) aria calda
La stufa a secco, utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria
messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio.
I parametri d’uso della stufa sono:
160° per 60’

150° per 120’
140° per 180’
b) flambatura
Alla fiamma del bunsen, si può sterilizzare la superficie esterna delle provette, o
delle beute.
La fiamma del bunsen esercita un’azione germicida nell’aria intorno alla fiamma per
un raggio di circa 10 cm, creando una zona sterile.
c) arroventamento
Alla fiamma del bunsen, è anche possibile sterilizzare l’ansa o l’ago prima e dopo i
prelievi.
Pinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla
fiamma.
TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN
5
CALORE UMIDO
a) tindallizzazione
La soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100°
100 C
con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento è indicato per terreni nei quali
possono crescere spore, le quali sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con
il secondo e il terzo.
b) vapore sotto pressione
Per questa tecnica si usa l’autoclave che unisce l’azione del calore alla pressione.
Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato.
La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121° per 15’
15’.
Tabella di sterilizzazione in autoclave:
Temperatura Pressione (atm) tempo (minuti)
110 0,5 150
115 0,75 50
120 1 15
125 1,35 6,5
FILTRAZIONE
a) filtri millipore
Si utilizza per le sostanze che non possono essere
sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri
porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di
grandezza superiore ai loro pori.
b) membrane filtranti
Per filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in
esso presenti, si utilizzano opportune membrane con
l’apposito apparato di filtrazione.
c) cappa a flusso laminare

Serve per eseguire al suo interno manipolazioni
microbiologiche per eliminare la contaminazione dei
prodotti ma anche dell’operatore e dell’ambiente.
6
• APPARECCHIATURA DA LABORATORIO
MICROSCOPIO
Strumento capace di fornire un'immagine ingrandita di un piccolo
oggetto osservato attraverso di esso.
Il microscopio è composto di:
- una parte meccanica detta stativo
- una parte ottica
USO DEL MICROSCOPIO

- accendere la luce
- porre il vetrino sul tavolino traslatore, sistemare il preparato rivolto verso l’alto e in prossimità
dell’apertura centrale del tavolino
- avvicinare il tavolino all’obiettivo più piccolo (4x) mediante la vite macrometrica
- mettere a fuoco
f con la
l vite
i micrometrica
i i
- regolare l’intensità della luce
- regolare l’apertura del diaframma considerando che con l’obiettivo 100x il diaframma deve avere la
massima apertura
- spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso
- individuare un buon campo e quindi ruotare l’obiettivo successivo (10x) e passare poi al 40x
mantenendo sempre il fuoco
- abbassare
bb l
leggermente il tavolino
li traslatore,
l mettere una gocciai di olio
li da
d immersione
i i all centro del
d l
vetrino, abbassare l’obiettivo 100x con cautela verso la goccia e mettere a fuoco
- descrivere quanto osservato
PRECAUZIONI D’USO DEL MICROSCOPIO

- non lasciare i vetrini sul tavolino traslatore
- togliere
t li l’olio
l’ li dall’obiettivo
d ll’ bi tti 100X ddopo averlo l usato
t utilizzando
tili d la
l carta
t imbevuta
i b t di alcool
l l
- non far toccare gli obiettivi al preparato
- non forzare alcuna manopola e non svitare gli obiettivi o gli oculari
CAPPA A FLUSSO LAMINARE

La cappa consente la protezione dell’operatore e dell’ambiente
dal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare in
condizioni di sterilità. Il flusso continuo di aria sterile, all’interno
della cabina, impedisce la fuoriuscita verso l’esterno, di microbi. La
sterilizzazione viene realizzata facendo passare l’aria attraverso dei
filtri. E’ opportuno accendere la cappa circa 20’ prima di iniziare a
lavorare per assicurare una completa sterilità all’interno della stessa.
7
AUTOCLAVE
L’autoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose e
colture
lt di rifiuto.
ifi t Nel
N l processo di sterilizzazione,
t ili i viene
i usato
t il vapore add alta
lt
pressione, di solito 121°C. I microbi si eliminano meglio con il caldo umido che
con quello secco della stufa, perché il vapore denatura le loro proteine.
Assicurarsi prima di tutto che ci sia acqua sufficiente che copra la serpentina di
rame in modo che non scaldi a secco durante il processo. Il coperchio deve essere
perfettamente chiuso prima di iniziare il ciclo di sterilizzazione, quando questo è
completato, si attende che l’autoclave sia raffreddata prima di aprirla. L’apertura
anticipata del coperchio può causare l’ebollizione dei liquidi nei recipienti.
PRECAUZIONI D’USO DELL’AUTOCLAVE
Esistono due fattori critici per la riuscita del processo:

- tutta l’aria deve fuoriuscire dall’autoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con la superficie di
ciò che deve essere sterilizzato. In caso contrario la temperatura resterebbe più bassa.
- i materiali
t i li non devono
d essere sigillati,
i ill ti tappi
t i e coperchihi devono
d essere appena avvitati.
it ti In
I tal
t l modo
d l’aria
l’ i
contenuta al loro interno può uscire liberamente.
- il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei contenitori.
TERMOSTATO
Apparecchio a circolazione d’aria calda, termoregolato, che permette
di mantenere costante la temperatura. Ha un intervallo di temperatura
compresa tra 20 e 80°C. Internamente ci sono dei ripiani forati per
favorire la circolazione dell’aria. Le colture batteriche, dopo la
semina nei terreni appositi, vengono poste ad incubare nei termostati
dove la temperatura è impostata a 37° in quanto ottimale per il loro
sviluppo.
BAGNOMARIA
Apparecchio che consente di mantenere terreni di colture a temperatura costante
in bagni di acqua. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 25 e 98°C.
All’i t
All’interno contiene
ti d i portaprovette,
dei t tt il coperchio
hi è a timpano
ti per permettere
tt
all’acqua di condensazione di ricadere all’interno. Il bagnomaria si usa per tenere
in incubazione test sierologici a 37°C e per l’agar fuso pronto per l’uso per le
semine in dispersione.
BILANCIA TECNICA
Strumento destinato alla misura dei pesi. Permette di pesare quantità fino
a 2000 g circa, con sensibilità di 0.01 g.
8
CENTRIFUGA
La centrifugazione è un metodo di separzione della fase liquida nelle sospensioni,
per mezzo della forza centrifuga.
centrifuga La centrifuga è costituita da un rotore parte
mobile e girevole, con logge fisse per la collocazione delle provette. Sul pannello
frontale sono inseriti un orologio per regolare la durata della centrifugazione, una
manopola per regolare la velocità, un freno automatico per abbreviare i tempi di
arresto. Prima di centrifugare è necessario che le provette nel rotore siano
equilibrati. Il rotore deve poi essere portato progressivamente alla velocità
desiderata.
CONTACOLONIE DIGITALE QUEBEC

Apparecchio per l’osservazione e il conteggio delle colonie cresciute in piastra
attraverso l’impiego di una lente di ingrandimento (x1,5), un piano d’appoggio
centimetrato e illuminato. Un contatore digitale registra automaticamente i dati
ottenuti esercitando una lieve ppressione,, con una ppenna,, sulla superficie
p della
piastra, in corrispondenza di ogni colonia.
STUFA
Apparecchio a circolazione d’aria calda utilizzabile sia
per asciugare che per sterilizzare la vetreria. La temperatura di
esercizio è compresa tra +50° e +290°C.
PHMETRO
Strumento che consente di misurare il valore del pH delle
soluzioni acide o basiche. Si basa sulla misura della differenza di
potenziale che si istaura fra due elettrodi immersi nella
soluzione da saggiare.
FRIGORIFERO
Apparecchio che serve a incubare a basse temperature e per la conservazione di
campioni t i l Il frigorifero
i i e materiale. f i if i f tti permette
infatti tt la
l batteriostasi,
b tt i t i cioè
i è l’assenza
l’
di crescita o di riproduzione della coltura. Gli aerobi possono essere conservati
per mesi in agar inclinato, gli anaerobi infissi in agar. La conservazione in frigo
ha degli svantaggi quali la breve durata di immagazzinamento, quindi l’obbligo di
trapianti frequenti e la facile inquinabilità delle colture.
9
U.D. 1.2 UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI
OBIETTIVO:
Scoprire che i microrganismi hanno la capacità di popolare qualsiasi ambiente ed osservare i
caratteri morfologici delle colonie che si sono sviluppate.
PRINCIPIO:
L’ubiquità dei microrganismi può essere messa in evidenza contaminando con diversi ambienti
(acqua, latte, polpastrelli, aria, terriccio…) piastre di Petri riempite con Nutrient agar per
contatto diretto o per esposizione.
Poiché il terreno Nutrient agar possiede i nutrienti capaci di far crescere un gran numero di
microrganismi,
i i i lal loro
l presenza in
i ambienti
bi ti diversi
di i saràà evidenziata
id i t dallo
d ll sviluppo
il di colonie
l i
visibili ad occhio nudo.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Acqua di pozzo (lago o fiume),
fiume) latte fresco o pastorizzato,
pastorizzato yogurt,
yogurt polpastrelli delle dita,
dita
aria di una stanza, terriccio o torba….
TERRENI DI COLTURA
Nutrient agar
VETRERIA, ...
Piastre sterili monouso, contenitori sterili, spatole sterili monouso, pipette pasteur
monouso, beuta, provette, bacchette vetro
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, bunsen, termostato, contacolonie o lente di ingrandimento
10
METODICA
(1a FASE) A CURA DELL’INSEGANTE
1 Preparare il terreno.
Distribuire in provettoni con tappo metallico

2 (18-20 ml per provettone).
3 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
4 Piastrare in ambiente sterile.
(2a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI

Seminare:
a) una piastra con 0,1ml di acqua, una con 0,1ml di

latte ed una con 0,1ml di yyogurt
g pper spatolamento
p
1 b) una piastra appoggiando delicatamente i

polpastrelli sul terreno per qualche secondo
c) una piastra lasciandola aperta per circa 20-30’

nella stanza prescelta
d) una piastra con 0,1 ml di sospensione di terriccio

preparata prelevando 2/3 spatolate di terriccio,
sciolto in 50 ml di acqua distillata sterile
- lasciare una piastra senza seminarla come prova in bianco

- siglare le piastre con il proprio nome e il tipo di
batteri seminati
2 Incubare le piastre capovolte a 37° C per 48 h.
11
(3a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI
1 Osservare le colonie formatesi e descriverle in relazione a:
a) numero
b) forma puntiforme rotonda lenticolare irregolare rizoide filamentosa
c) margine
intero ondulato
d) profilo
piatto convesso umbonato
e) superficie liscia rugosa lucida opaca
f) consistenza compatta sfaldabile pastosa mucosa
g) colore
Disegna ciò che hai osservato
12
2. OSSERVARE I MICRORGANISMI
U.D. 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE
OBIETTIVO:
Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice.
PRINCIPIO:
I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi
funzionali detti “cromofori” associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti
basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La
colorazione aumenta il contrasto con l’ambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri
sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il Blu di
metilene.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis
MATERIALI CHIMICI
Blu di metilene, olio da immersione
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
Blu di metilene 1%:

aggiungere, in una bottiglia con contagocce, ad 1 g di blu di metilene 99 ml di acqua
distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.
13
METODICA
(1a FASE) fissazione
1 Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale

batterico da una colonia isolata.
Distendere il materiale su un vetrino dove era stata

2 precedentemente messa una goccia di acqua
distillata.
Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura

ambiente fino a completa evaporazione dell’acqua.
3 Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con
una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco
b
bunsen, per almeno
l tre volte.
l
(2a FASE) colorazione
Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per

la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di
metilene.
Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua
mediante una spruzzetta.
Eliminare buona pparte dell’acqua q di lavaggio
gg
1 inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima
con carta da filtro, poi all’aria.
14
METODICA
(1a FASE) osservazione al microscopio
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,

pprocedendo pper ggradi,, dagli g obiettivi a secco a ppiccolo
1 ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.
I più comuni tipi morfologici dei batteri
cocchi streptococchi stafilococchi diplococchi
bastoncelli vibrioni spirilli
15
U.D. 2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA
OBIETTIVO:
Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione che, non richiedendo
fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.
PRINCIPIO:
La Nigrosina è un colorante acido che non è in grado di penetrare all’interno dei batteri e forma
dunque un deposito scuro attorno alle cellule che vengono evidenziate per contrasto.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus
MATERIALI CHIMICI
Nigrosina, olio da immersione
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto,
portaoggetto ansa,
ansa vaschetta per colorazione,
colorazione spruzzetta,
spruzzetta pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
Nigrosina 2%:
aggiungere, in una bottiglia con contagocce, a 2 g di nigrosina 99 ml di acqua
distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.
16
METODICA
(1a FASE) colorazione
1 Deporre una goccia di nigrosina su un vetrino

portaoggetti.
Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale

2 batterico da una colonia isolata e miscelarla con
la nigrosina.
Distendere uniformemente il materiale sul vetrino

3 asciugare all’aria non scaldare e non fissare alla
fiamma.
1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,

procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo
ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un
disegno.
17
U.D. 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE (secondo Shaeffer e Fulton)
OBIETTIVO:
Osservare la presenza di endospore e spore libere.
PRINCIPIO
PRINCIPIO:
Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il colorante
anche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore del
colorante di contrasto (safranina).
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Verde malachite 5%, safranina, olio da immersione
TERRENI DI COLTURA
Agar al manganese
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno, piastre
sterili, beuta, provette
STRUMENTI
Microscopio, autoclave, termostato, bilancia, bunsen
Agar al manganese:
- Nutrient broth 8g
- Agar
A 20 g
- MnCl2 1% 0,5 ml
- Acqua 1000 ml
Unire al brodo l’agar e scaldare, aggiungere poi 0,5 ml di MnCl2 1% in acqua.
Preparazione soluzione di safranina:

1 g di safranina sciolta in 10 cc di alcool, aggiungere acqua fino a 100 cc.
18
METODICA
(1a FASE) a cura dell’insegnante
1 Preparare delle provette con 16-18 ml di agar al

manganese.
3 Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare.
4 S
Seminare
i
esame.
per striscio
t i i un’ansata
’ t ddella
ll coltura
lt iin
Incubare a 35° per 18-24 h.

5
19
METODICA
(2a FASE) a cura dello studente
1 Allestire e fissare un vetrino con una delle colonie

ottenute nella 1a FASE.
Appoggiare
A i il vetrino
ti su un sostegno
t sopra una
vaschetta contenente acqua la quale verrà portata
all’ebollizione.
2 Colorare abbondantemente con verde malachite,
lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa
per 3-5’ e aggiungere ancora il colorante facendo
attenzione che il vetrino non rimanga a secco.
(per evitare che il vetrino cada nella vaschetta
(p
trattenerlo con una pinza di legno)
3 Lavare con acqua e colorare con safranina per 5’.

Dopo aver lavato abbondantemente con acqua
asciugare delicatamente.
1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,

20
U.D. 2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA
OBIETTIVO:
Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo
fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.
PRINCIPIO:
La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si fa
ricorso a colorazioni negative.
MATERIALI BIOLOGICI
Sospensione batterica (inoculo di terra)
MATERIALI CHIMICI
Inchiostro di china al 10%
VETRERIA, ...
V t i i portaoggetto,
Vetrini t tt vetrini
t i i coprioggetto,
i tt ansa, vaschetta
h tt per colorazione,
l i spruzzetta,
tt
pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
21
METODICA
(1a FASE)
1 Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al

10% su un vetrino portaoggetti.
Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale

2 batterico da una colonia isolata.
Sospendere il materiale sull’inchiostro di china e

3 coprire con un vetrino coprioggetto.

obiettivo
1 ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un
disegno.
22
U.D. 2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM
OBIETTIVO:
Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram+ e i Gram-.
PRINCIPIO:
L diversa
La di colorazione
l i che
h assumono i batteri
b tt i con questat tecnica
t i dipende
di d dalle
d ll differenze
diff
esistenti nella loro parete cellulare.
La parete dei Gram+ è costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che non
permette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante
basico cristal violetto) da parte del decolorante. I Gram+ rimangono dunque colorati in violetto.
I Gram- hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risulta
permeabile all’agente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante di
contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus e
Escherichia Coli
MATERIALI CHIMICI
Cristal violetto, liquido di Lugol, safranina, decolorante alcool-acetone, olio da
immersione
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
Le soluzioni coloranti vengono preparate come soluzioni idroalcooliche che si

allestiscono
ll ti sciogliendo
i li d nell’alcool
ll’ l l il colorante:
l t
Sostanza colorante in polvere g 10
Alcool etilico assoluto ml 100
Si lascia a contatto per qualche giorno ottenendo una soluzione satura. Queste
soluzioni necessarie a mantenere a lungo i coloranti, non sono adatte ad essere usate
direttamente nelle colorazioni. Pertanto, con una diluizione in acqua, si ottengono
soluzioni idroalcooliche:
Soluzione alcoolica madre del colorante ml 10
Acqua distillata ml 90
23
METODICA
(1a FASE) fissazione e colorazione
1 Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale

batterico da una colonia isolata.
Distendere il materiale su un vetrino dove era

2 stata pprecedentemente messa una ggoccia di
acqua distillata.
Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura

ambiente fino a completa evaporazione dell’acqua.
Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto
3 con una pinza,
pinza sulla zona più calda della fiamma del
becco bunsen, per almeno tre volte.
a) colorare il preparato depositando, mediante una
pipetta qualche goccia del 1° colorante (cristal
violetto), lasciare agire per 1’
b) lavare con acqua distillata e poi coprire con il
liquido di Lugol e lasciare agire per 1’, lavare ancora
4 con acqua
c) decolorare con soluzione alcool-acetone e
sciacquare immediatamente
d) colorare con la soluzione di contrasto (safranina)
per 1’, sciacquare accuratamente e asciugare il
vetrino.
Dopo aver lavato abbondantemente con acqua
asciugare
g delicatamente

1 procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo
24
3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI
U.D. 3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE
TECNICHE DI SEMINA
OBIETTIVO:
Acquisire la corretta manualità nelle varie tecniche di semina e la consapevolezza degli scopi
per i quali la semina viene effettuata.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche
TERRENI DI COLTURA
Terreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina)
VETRERIA, ...
Piastre Petri sterili, pipette graduate sterili, provettoni, provette, tamponi faringei sterili,
spatole sterili, anse, aghi, cilindri
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, bunsen
UTILIZZO DEI TERRENI DI COLTURA DISIDRATATI

Solubilizzazione:
pesare il terreno e porlo in una beuta e aggiungere la metà del volume di acqua
distillata richiesta. Agitare per solubilizzare poi aggiungere l’acqua rimanente lavando
le pareti della beuta. Utilizzare sempre beute di volume almeno 2 volte e mezzo quello
della sospensione. Riscaldare per ottenere una completa solubilizzazione agitando
continuamente fino ad arrivare all’ebollizione. La completa solubilizzazione dopo
alcuni minuti di ebollizione, è indicata dalla trasparenza della soluzione.
25
SEMINA IN TERRENO SOLIDO
1 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (a)
Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e,

dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica
da una piastra o da una provetta. Trasferire il materiale su
una piastra sterile strisciando l’ansa con movimenti ampi a
zig-zag senza incidere il terreno, non tornare sui punti già
seminati. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.
La crescita si manifesta con formazione di colonie

confluenti e isolate presenti sulla superficie dell’agar.
2 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (b)
Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa alla

fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di
patina batterica. Trasferire il materiale su una piastra sterile
3 strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il
2 terreno solo su metà ppiastra ((1).) Sterilizzare e raffreddare
l’ansa, ruotare la piastra e riprendendo dal punto interrotto,
1 strisciare l’altra metà della piastra (2); ripetere l’operazione
un’altra volta in modo da ottenere tre strisci in tre diverse
direzioni (3).
La crescita si manifesta con formazione di colonie

confluenti nella prima metà e isolate nella seconda metà
d ll piastra,
della i presentii sulla
ll superficie
fi i dell’agar.
d ll’
26
1 Tecnica di trasferimento pper striscio su ppiastra ((c))
Nel caso in cui si voglia ottenere una crescita compatta, si

può effettuare lo striscio con tamponi sterili che vengono
passati più volte e in più direzioni sul terreno. Immergere
un tampone in un brodo e trasferire il materiale su una
piastra sterile strisciando più volte sulla superficie. Ruotare
la piastra e strisciare ancora; sterilizzare
sterili are il tampone dopo
l’uso.
La crescita si manifesta con formazione di una patina più o

meno omogenea.
2 Tecnica dello spatolamento in piastra (d)
Operando sotto una cappa sterile o accanto alla fiamma

del bunsen, prelevare con una pipetta sterile 0,1 ml di
brodocoltura e trasferirlo al centro di una piastra con
agar nutrient. Con una spatola sterile distribuire
ll’inoculo
inoculo sulla superficie dell
dell’agar
agar in tutte le direzioni.
Rovesciare la piastra ed incubarla a 28°-32° per 24-
48h.
Deporre la spatola nell’apposito sacchetto per la
sterilizzazione.
La crescita si manifesta con lo sviluppo di una patina

ppresente sulla superficie
p dell’agar.
g
27
1 Tecnica della inclusione o diffusione in piastra (e)
Nell’inclusione usiamo pipette sterili graduate per

trasferire volumi precisi di inoculi nelle piastre.
Successivamente si riempie la piastra con terreno di
coltura sterile mantenuto fuso a b.m. a 45°C. Se la
sospensione da seminare è concentrata, si procede ad
una diluizione come nella sezione 4.1.
La crescita si manifesta con lo sviluppo di colonie

isolate presenti sulla superficie dell’agar ma soprattutto
in profondità.
2 Dil i i
Diluizione ed
d iinclusione
l i (f)
Diluire la brodocoltura quando è particolarmente
concentrata procedendo ad una diluizione come nella
sezione 4.1. Predisporre 4 piastre nelle quali verserete
1 ml di ogni diluizione preparata mettendo nella prima
piastra l’inoculo concentrato (conc. 100). Versare il
terreno sterile, mantenuto fuso a b.m., nelle piastre
seminate, chiuderle e miscelare con un movimento
rotatorio lasciar solidificare.
rotatorio, solidificare
Le colonie crescono sia in superficie che in profondità

e se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno in
progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e più
piccole dove il numero è maggiore.
Contaminazione
Bassa (+) Media (++) Alta (+++) Altissima (++++)
28
1 Tecnica di isolamento e striscio su “slant”
Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e,

dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica
da una piastra. Aprire e flambare la provetta, trasferire il
materiale strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza
incidere il terreno ppartendo dal fondo della pprovetta.
Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.
La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o

patina di consistenza cremosa o secca.
2 Tecnica di trasferimento per striscio da slant a slant (o “becco di clarino”)
Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa alla

fiamma e raffreddarla. Impugnare le due provette con una
mano, togliere i tappi e flambare l’imboccatura alla fiamma.
Prelevare un po’ di patina batterica dalla prima provetta,
trasferire il materiale strisciando l’ansa con movimenti
mo imenti a
zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della
seconda provetta. Flambare e tappare le due provette.
Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.
Anche qui la crescita si manifesta attraverso la presenza di

veli o patina di consistenza cremosa o secca.
3 Tecnica per infissione in agar o gelatina
Si utilizza questa semina con un ago per inoculare terreni

solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule
lungo una linea verticale e in profondità, per permettere lo
sviluppo dei batteri anaerobi e favorire l’osservazione di
forme mobili che si diffondono a partire dalla linea
d ll’i
dell’inoculo.
l
29
SEMINA IN TERRENO LIQUIDO
1 Tecnica di trasferimento da “slant” a brodo
Disporre le provette con il ceppo di Escherichia

Coli e il brodo sterile da seminare vicino alla
fiamma. Sterilizzare e raffreddare l’ansa, togliere i
tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con
l’ansa un po’ di patina batterica dallo slant, inserire
l’ansa con l’inoculo nel brodo sterile e stemperare.
Flambare e tappare le provette. Sterilizzare l’ansa
dopo l’uso.
2 Tecnica di trasferimento mediante pipetta
Disporre le provette con l’inoculo in brodo e il

brodo sterile da seminare vicino alla fiamma,
togliere i tappi dalle provette e flambarle.
Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di inoculo
dalla prima provetta e trasferirla nella seconda.
Flambare e tappare le provette. Deporre la pipetta
nell’ apposito sacchetto per la sterilizzazione.
nell
La crescita in brodo si evidenzia a occhio nudo

attraverso:
- intorbidamento del terreno;
- formazione di un sedimento sul fondo della
provetta che agitato sale verso l’alto;
- formazione di fiocchi o granuli in sospensione.
3 Incubare i terreni seminati insieme ad alcuni non

seminari, come controllo, a 37° per 24-48h
30
U.D. 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT
OBIETTIVO:
Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurt
PRINCIPIO:
Nello yogurt sono generalmente presenti due gruppi batterici: il Lactobacillus bulgaricus e lo
Streptococcus thermophilus, che trasformano il lattosio presente nel latte in acido lattico.
Lo striscio, in MRS agar, permette l’isolamento dei lattobacilli, mentre l’M17 favorisce la
crescita degli streptococchi lattici e inibisce quella del Lactobacillus bulgaricus.
Pur essendo improbabile, per l’acidità dello yogurt e per le norme igieniche di produzione e
conservazione la presenza di microrganismi contaminananti,
conservazione, contaminananti è tuttavia possibile verificare
l’eventuale presenza di batteri coliformi Gram- seminando in Levine EMB Blue agar che
consente di differenziare le colonie di E. coli in base alla presenza di riflessi verdi metallici e
alla colorazione violacea con centro nero.
MATERIALI BIOLOGICI
Yogurt
MATERIALI CHIMICI
Sol. di Ringer, reattivi per anaerobiosi, cartina indicatrice
TERRENI DI COLTURA
g , M17 agar,
MRS agar, g , EMB blue agar
g
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, beuta da 100 ml, piastre sterili, ansa
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, bunsen
Soluzione di Ringer
Sodio cloruro 9 g, Potassio cloruro 0,42 g, Calcio cloruro anidro 0,24 g, Sodio
bicarbonato 0,2 g, acqua distillata 1 litro. Viene impiegata nella diluizione di 1:4 con
acqua distillata.
distillata
In alternativa soluzione di Ringer in tavolette
Sciogliere 1 tavoletta in 500 ml di acqua distillata sterile.
31
METODICA
1 Preparere i terreni e la sol. di Ringer, sterilizzare dopo

aver controllato il pH dei terreni (pH 6,2) con la cartina
indicatrice.
2 Piastrare i tre diversi terreni e raffreddare.
Prelevare 10 g di yogurt sterilmente, diluirlo in 100 ml

3 di Ringer sterile omogenizzando bene.
Per striscio seminare 3 piastre dei terreni diversi.

4 anaerobiosi
Poiché i lattobacilli crescono bene in anaerobiosi,
aggiungere sopra lo striscio un altro strato di MRS e
solidificare. In alternativa usare la giara come all’unità
3.3
Mettere in termostato a 37 37° per 2 o 3 giorni.

giorni
5 Controllare la crescita e la presenza di colonie isolate,
confermare il tipo di microrganismo per mezzo della
colorazione di gram.
Coltura mista di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus

thermophilus dello yogurt al microscopio elettronico
32
U.D. 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI
SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI
OBIETTIVO:
Verificare l’adattamento di alcune specie microbiche a condizioni differenti di
ossigenazione e di pH del mezzo di crescita.
PRINCIPIO:
Ogni specie microbica presenta esigenze nutrizionali e colturali diverse. Variando in
modo controllato alcuni fattori ambientali si può valutare la risposta di ciascuna specie
microbica in esame attraverso l’osservazione della crescita in coltura.
MATERIALI BIOLOGICI
Brodocolture di Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae
MATERIALI CHIMICI
Reattivi per anaerobiosi (catalizzatori, indicatori), cartina indicatrice (test a)
Soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e
NaOH 0,1 M (100 ml) (test b)
TERRENI DI COLTURA
Glucose agar (test a)
TSB (test b)
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, beker 100 ml, piastre sterili con setto,
ansa, piastre sterili, pipette sterili da 1 ml
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, phmetro, bunsen
33
METODICA
test a) Influenza dell’ossigeno atmosferico sulla crescita
Ri
Ricerca di aerobi,
bi anaerobi
bi e anaerobi
bi facoltativi
f lt ti i
(1a FASE 1° parte)
1 Sciogliere il terreno per una prova in doppio, più il controllo.
2 Distribuire in provette, controllare il pH con la cartina

indicatrice e autoclavare.
3 Piastrare e raffreddare il terreno.
(1a FASE 2° parte)
Seminare in ciascuna metà della piastra, in maniera

1 sterile, mediante striscio, l’inoculo dei due ceppi
batterici. Una piastra va messa in termostato e l’altra
in giara.
34
Giara:
sistemare le piastre capovolte nella giara, inserire
l’indicatore per anaerobiosi e il reattivo per eliminare
l’ossigeno (il reattivo va attivato aggiungendo 10 ml
di acqua nella bustina operando lontano dalla
fiamma per la presenza di idrogeno altamente
i fi
infiammabile);
bil ) la
l reazione
i viene
i portata
t t a termine
t i in
i
circa 60’, dopodiché controllare la pressione nel
manometro (1 atm. circa). Dopo 2-3 ore controllare
se l’indicatore per l’anaerobiosi è virato al rosso.
Riporre la giara e la seconda serie di piastre in termostato a 37° per 48 h. Dopo incubazione
aprire la giara sotto cappa,
cappa controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondo
la seguente scala:
- = assenza di crescita
+ = crescita scarsa
++ = crescita normale
+++ = crescita abbondante
NB: il catalizzatore è situato nell’apposita sede posta sotto il

coperchio della giara; tra un impiego e l’altro va asciugato
riscaldandolo in stufa a 160° per 90’.
35
METODICA
test b) Influenza del pH del mezzo sulla crescita
Si verifica l’influenza del pH sulla crescita coltivando i batteri in terreni in cui
viene variato il pH per aggiunta di acidi o di basi.
(1a FASE 1° parte)
1 Sciogliere il terreno, distribuirlo in 4 beute.
2 Preparare le soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M

(100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) e
correggere il pH in ognuna delle beute con i valori 3,0-4,5-
7,0-9,0 controllandole con il phmetro.
METODICA
PHMETRO
Accendere il pHmetro almeno 10’ prima dell’uso ed effettuare
la calibrazione. Selezionare il tasto pH e automatico, inserire
l’elettrodo nel campione a pH 7. Pigiare il tasto cal e attendere
che lo strumento si stabilizzi. Lavare e asciugare l’elettrodo e
ripetere
i t l’operazione
l’ i con il campione
i a pH
H 4 o 10.
10 Effettuare
Eff tt l
la
lettura dei vari campioni pigiando il tasto read o = lavando
accuratamente l’elettrodo tra una lettura e l’altra.
3 Distribuire 10 ml in ogni provetta in modo da ottenere 4

provette per ogni prova.
prova Sterilizzare a 121° per 15
15’ e
ricontrollare infine il pH.
(1a FASE 2° parte)
Seminare 1 ml delle due brodocolture in ogni provetta,

4 incubare sia i tubi seminati che quelli non seminati a 36°
per 24-48 h.
Controllare la crescita nei tubi e registrare i risultati secondo la seguente scala:
- = assenza di crescita
+ = crescita scarsa
++ = crescita normale
+++ = crescita abbondante
36
4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI
MICRORGANISMI
U.D. 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA
OBIETTIVO:
Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione
(carica microbica totale): analisi quantitativa.
PRINCIPIO:
Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione e incubata, si riproduce
formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si può risalire al
numero di microrganismi presenti in un volume noto del campione.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture batteriche
TERRENI DI COLTURA
N t i t agar
Nutrient
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, piastre sterili, ansa, pipette sterili da 1 ml
STRUMENTI
37
METODICA
Conta dei batteri mediante semina per inclusione in piastra (previa diluizione in serie)
1 Preparare il terreno agar nutrient e sterilizzarlo.
Partendo dalla sospensione in esame, preparare

2 diluizioni scalari 1:10, 1:100, 1:1000 come segue:
prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml del
campione in esame e porlo in una provetta
contenente 9 mll di soluzione
l i fi i l i sterile.
fisiologica il
Ripetere l’operazione per le successive diluizioni
cambiando opportunamente la pipetta ogni volta.
Numerare 4 piastre
3 10° campione non diluito
10-11 fattore
f tt di diluizione
dil i i 1:10
1 10
-2
10 fattore di diluizione 1:100
10-3 fattore di diluizione 1:1000
quindi seminarci 0,1 ml di ogni diluizione.
Versare il terreno sterile mantenuto fuso a b.m.

4 nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con
un movimento rotatorio, lasciar solidificare.
Incubare a 37° per 48h poi contare al contacolonie,

le colonie ben isolate quando sono comprese tra 100
e 300.
5 Le colonie crescono sia in superficie che in
pprofondità e se la semina è stata fatta bene, le
colonie saranno in progressiva diminuzione, di
aspetto uniforme e più piccole dove il numero è
maggiore.
38
Predisporre una tabella per i risultati
n. colonie n. colonie n. colonie n. colonie
10° 10-1 10-2 10-3
Campione 1
Campione
p 2
Campione 3
Dalla conta si risale al numero di batteri/ml nelle sospensione in esame mediante la

seguente formula:
N= n*1/d*1/V
N= numero di germi/ml del campione puro

n= numero di colonie nella piastra
1/d= reciproco della diluizione dell’inoculo in quella piastra
1/V= reciproco della frazione di volume considerato (1ml) utilizzato per l’inoculo1/10
di ml
39
U.D. 4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO
OBIETTIVO:
(carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica classica)
PRINCIPIO:
La crescita in terreni liquidi viene rivelata dall’intorbidamento del terreno e/o sviluppo di gas. Il
numero dei batteri presenti nel campione viene calcolato mediante una stima su base
probabilistica basata sulla determinazione dell’indice MPN (Most probable number) che
rappresenta il numero più probabile di microrganismi presenti in un volume noto di campione di
acqua.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture batteriche
TERRENI DI COLTURA
Brodo lattosato
VETRERIA, ...
Beuta, cilindri, bacchette, provettoni, pipette sterili da 10, 1, 0,1 ml
STRUMENTI
40
METODICA
Conta dei batteri su terreno liquido (es: ricerca dei batteri coliformi)
1 P
Preparare e sterilizzare
ili 3 serie
i di 3 provettonii con 10 mll di terreno.
10 ml di Brodo lattosato 10 ml di Brodo lattosato 10 ml di Brodo lattosato

concentrazione doppia concentrazione normale concentrazione normale
con campanella di durham con campanella di durham con campanella di durham
2 Seminare.
Campione
10 ml 1 ml 0,1 ml
3
Incubare a 37° per 24-48 ore.
RISULTATI
Prova negativa Prova positiva
Assenza di gas nella campanella Presenza di gas nella campanella
Per il calcolo dell’MPN si rileva il numero di prove positive per ogni serie di provette seminate
(3 per serie) e, sulla base della sequenza ottenuta, si risale al numero più probabile tramite
apposita tabella (vedi tabella su U.D. 4.4)
41
U.D. 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA
OBIETTIVO:
(carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica delle membrane filtranti)
PRINCIPIO:
Filtrando volumi determinati di liquidi attraverso membrane sterili, con una porosità inferiore a
1 m, e ponendo tali filtri sulla superficie di terreni agarizzati in piastra, dopo incubazione, si
otterranno colonie isolate che possono venire contate.
STRUMENTI
TERRENI DI COLTURA
PCA, ENDO broth MF, Faecal coliform broth, Azide maltose agar
VETRERIA, ...
Pipette
p sterili da 1-10ml,, pprovette,, pprovettoni,, beute,, campanelle
p di Durham,, ppiastre
sterili, filtri sterili con membrana da 0,2 m
STRUMENTI
Apparato per la filtrazione, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, cappa sterile,
pompa da vuoto, bunsen
42
METODICA
Procedimento A (Conta batterica totale)
(1a FASE)
Sterilizzare dentro una busta per autoclave l’apparato

di filtrazione (composto dall’imbuto, il porta filtro, la
1 beuta codata), pinze di metallo, un cilindro da 100
ml, 5 matracci da 100 ml, pipette graduate da 10 ml.
Sterilizzare e piastrare 6 piastre con il terreno PCA.

2 Sterilizzare una beuta contenente 500 ml di acqua
distillata per le diluizioni del campione.
Sotto la cappa sterile preparare le diluizioni del campione di acqua.
3 (2 campioni 1:10) Prelevare 10 ml di campione e metterlo in tre matracci da 100

ml, portare a volume con acqua sterile. Un matraccio servirà per la diluizione
successiva .
(2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo in
due matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile.
Montare l’apparato di filtrazione inserendo tra

l’imbuto e il porta filtro l’apposito filtro sterile,
collegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare i
campioni di acqua partendo da quelli più diluiti. Dopo
4 la prima filtrazione si toglie il filtro e lo si depone
sulla superficie della piastra di PCA. Si procede così
per tutti e sei i campioni (campioni 100 –10-1- 10-2).
Mettere le piastre capovolte in termostato per 24h; una

5 piastra a 22° e l’altra a 37° per ogni diluizione.
43
METODICA
Procedimento B (Individuazione coliformi totali)
Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Endo broth

1 agarizzato.
Incubare a 36° per 24h.
Procedimento C (Identificazione coliformi fecali)
Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Faecal

1 coliform broth agarizzato.
Incubare a 44° per 24h.
Procedimento D (Individuazione Streptococchi fecali)
Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Azide

1 maltose agar.
Incubare a 36° pper 48h.
Valutazione:
a) Per la conta batterica totale si prendono in considerazione tutte le colonie presenti
sulla membrana dopo incubazione. Riportare il valore alle diluizioni eseguite. (valori
guida: 10 colonie a 36
36°CC, 100 colonie a 22°C/1
22 C/1 ml)
b) Per i coliformi totali contare le colonie rosse e tutte le colonie che presentano riflesso
metallico (fucsina); queste ultime possono essere presumibilmente classificate come
colonie di Escherichia coli. Altre colonie eventualmente presenti non vanno
conteggiate. Riportare il valore a 100 ml di campione.
c) Per i coliformi fecali contare le colonie in grigio, grigio-blu e blu. Altri tipi di colonie
eventualmente
l presentii non sii contano. Riportare
Ri il valore
l a 100 mll di campione.
i
d) Per gli streptococchi fecali contare solo le colonie rosso, rosso-scuro, puntiformi
(diametro max 1 mm) con contorni netti e cupoliformi. Ogni altro tipo di colonia non
deve essere conteggiato. Riportare il valore a 100 ml di campione.
44
METODICA
Risultati: 22°C 36°C 44°C
Carica batterica totale 100 ………./ml ………./ml
10-2 ………./ml ………./ml
10-1 ………./ml ………./ml
C lif
Coliformi
i totali
t t li ………./100ml
/100ml
Coliformi fecali ………./100ml
Streptococchi fecali ………./100ml
45
U.D. 4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA POTABILE
OBIETTIVO:
Valutare se il campione in esame corrisponde ai requisiti di potabilità dal punto di vista
microbiologico.
PRINCIPIO:
Ricerca e quantificazione delle varie specie che rappresentano indicatori batterici di
inquinamento e più precisamente:
• carica microbica totale
• coliformi
lif i totali
t t li e fecali
f li
• streptococchi fecali
MATERIALI CHIMICI
Cartine indicatrici
TERRENI DI COLTURA
PCA, Lactose broth, Brillant green bile broth, Azide dextrose broth, Ethyl violet azide
broth
VETRERIA, ...
Pipette sterili da 10-1-0,1 ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre
sterili
STRUMENTI
Centrifuga, bagnomaria, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, bunsen
PRELIEVO DEI CAMPIONI

Il prelievo viene effettuato con bottiglie sterili in vetro o in plastica con tappo a vite,
chiusi da fogli di carta di alluminio.
Il prelievo sarà effettuato dopo aver fatto defluire l’acqua per alcuni minuti.
I campioni vanno sottoposti all’esame quanto prima, in ogni caso l’intervallo di
tempo fra il prelievo e l’analisi non dovrà superare le 24h.
46
ANALISI MICROBIOLOGICA ACQUA POTABILE
CARICA MICROBICA TOTALE
Semina in PCA per inclusione con

eventuali diluizioni scalari
Incubare a 36°C per 48h Incubare a 22°C per 72h
Osservare e contare Osservare e contare

le colonie, ricavare le colonie, ricavare
il valore medio il valore medio
delle piastre alla delle piastre alla
stessa diluizione stessa diluizione
COLIFORMI TOTALI E FECALI STREPTOCOCCHI
Test presuntivo in Lactose broth Test presuntivo in Azide dextrose broth
Incubare a 36°C per 24/48h Incubare a 37°C per 48h
SCHEMA DI
no
LAVORO no
Test Intorbidamento Test
Produzione di gas?
negativo del brodo? negativo
si si
Test Test
positivo positivo
Inoculo in Brillant green

Inoculo in EVA broth
Bile broth
Incubare a 36°C per 24/48h Incubare a 44°C per 24h Incubare a 37°C per 48h
Intorbidamento
Test no no Test no Test
Produzione di gas? Produzione di gas? e precipitato
negativo negativo negativo
color porpora?
si si si
Test Test Test

positivo positivo positivo
Conta con metodo MPN Conta con metodo MPN Conta con metodo MPN
dei coliformi totali dei coliformi fecali degli streptococchi
47
METODICA
(1a FASE)
a) CARICA MICROBICA TOTALE a 36°

36 e 22
22°
1 Trasferire con pipette sterili, 1 ml del campione di acqua

in 4 piastre, se il campione è molto contaminato
procedere a diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000) con acqua
dist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2).
Piastrare con PCA mantenuto fuso in b.m.

2 ruotare delicatamente le piastre
omogenizzare il campione nel terreno.
per
3 Incubare 2 piastre a 36° per 48h e le altre 2 a 22° per 72h.
Osservare le colonie cresciute con il contacolonie, ricavare il valore medio su ogni

coppia di piastre, esprimere il risultato come colonie su agar/ml a 36° e 22°C.
48
METODICA
b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test presuntivo)
c) STREPTOCOCCHI FECALI (test presuntivo)
Preparare e sterilizzare (per i coliformi):

1 3 provettoni con campanella di durham contenenti
ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione
doppia.
6 provettoni con campanella di durham contenenti
ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione
normale.
normale
Preparare e sterilizzare (per gli streptococchi):

2 ognuno
g
doppia.
10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione

ognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione
normale.
Seminare 10 ml di campione nei 3 provettoni contenenti

3 il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a
concentrazione doppia.
Seminare 1 ml di campione nei 3 provettoni contenenti

il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a
concentrazione normale.
Seminare 0,1 ml di campione nei 3 provettoni

contenenti il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose
broth a concentrazione normale.
Incubare a 36° per 24-48 h tutti i test, leggere dopo 24

h considerando positive solo le colture che hanno
4 crescita con sviluppo di gas e intorbidamento del
terreno. Incubare
I b di nuovo solo l i tubibi negativi
i i per altre
l
24 h.
49
METODICA
b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test di conferma)
c) STREPTOCOCCHI FECALI (test di conferma)
Preparare e sterilizzare:
tanti provettoni con campanella di durham quante
1 sono le prove positive con 4 ml di Brillant green bile
broth (per i coliformi) e altrettante con 5 ml di EVA
broth (per gli streptococchi).
Seminare 1 ansata di ogni brodocoltura positiva

2 delle prove presuntive nei tubi contenenti il Brillant
green e 3 ansate in quelli contenenti EVA broth.
Incubare a 36° per 24h i coliformi totali,

3 a 44° per 24h i coliformi fecali,
a 36° per 48h gli streptococchi.
Osservare i risultati, la determinazione numerica dei batteri ricercati viene espressa rispetto al numero
di tubi positivi (intorbidamento e produzione di gas per i coliformi, sedimento color porpora per gli
streptococchi)
hi) e esprimere
i l concentrazione
la i d i batteri
dei b i come MPN/ml
MPN/ l di campione,
i cioè
i è di numero
più probabile.
50
Tabella MPN
Numero tubi positivi su MPN Limiti fiduciari
per 100 ml
3 da 10 ml 3 da 1 ml 3 da 0,1 ml inferiori superiori
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13
1 0 0 4 <0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 38 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
Parametri microbiologici
dalla Gazzetta Ufficiale – maggio 1985
Caratteristiche di qualità delle acque destinate al consumo umano
Parametro ed unità di misura Valore guida Valore limite osservazioni
Coliformi fecali/100 ml - 0 Non più del 5% dei campioni

esaminati nell’arco dell’anno e non più
Coliformi totali/100 ml - 0 di 2 campioni prelevati nello stesso
punto possono eccedere tale limite.
Comunque mai superiore a 5/100 ml.
C t i colonie
Conteggio l i su agar/1
/1 mll a 36°C 10 - Alte cariche
Alt i h bbatteriche
tt i h richiedono
i hi d
a 22°C 100 - indagini e accertamenti appropriati.
Streptococchi fecali/100 ml - 0
51
U.D. 4.5 VALUTAZIONE DELL’AZIONE INIBENTE DI ALCUNI
DISINFETTANTI DI USO COMUNE
OBIETTIVO:
Confrontare l’attività inibente di alcuni disinfettanti utilizzati comunemente per usi sanitari e
domestici.
PRINCIPIO:
Il potere antibiotico di alcuni composti chimici può essere valutato indagando la loro capacità
di inibire la crescita di microrganismi. Il metodo utilizzato è quello della diffusione in agar
basato sull’uso di dischetti di carta da filtro sterili imbevuti del composto da saggiare. I
dischetti, disposti sulla superficie del terreno agarizzato, seminato con un ceppo microbico
standardizzato, permettono la diffusione del disinfettante nel terreno. Dopo incubazione si
osserveràà intorno
i t all dischetto
di h tt un alone
l di inibizione
i ibi i d ll crescita
della it che
h avràà un diametro
di t tanto
t t
più grande quanto più efficace sarà il disinfettante.
MATERIALI BIOLOGICI
Ceppi di Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Alcool denaturato, tintura di iodio, acqua ossigenata 10 volumi, amuchina, ammoniaca
e candeggina di uso commerciale.
TERRENI DI COLTURA
TSB, TSA
VETRERIA ...
VETRERIA,
Beute, cilindri, bacchette, provette 16x100, piastre sterili, beker, dischi di carta da filtro
sterili con diametro di 6 mm, tamponi sterili, pinze, ansa
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, contacolonie, bunsen
52
METODICA
(1a FASE 1° parte)
1 Preparare delle provette contenenti 5 ml di TSB,

sterilizzarlo per gli inoculi dei ceppi batterici.
preparare, sterilizzare e piastrare il TSA

2 doppio volume (40 ml a piastra).
(1a FASE 2° parte)
Seminare i brodi prelevando circa 4-5 ansate

1 di ogni ceppo batterico.
2 Incubare per 18 h a 37° C.
53
METODICA
(2a FASE 1° parte)
Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità

della brodocoltura con quella dello standard
1 MacFarland, (tale standard corrisponde circa a 108
batteri/ml) usare brodo sterile per eventuali
diluizioni della brodocoltura.
(2a FASE 2° parte)
Seminare, con un tampone sterile in maniera

1 uniforme, ripetendo l’operazione più volte
ruotando la piastra di 60°, i ceppi batterici.
3
Segnare sul fondo delle piastre la posizione in cui
2
2
deporre i dischi imbevuti indicando con un numero il
4 composto da saggiare. Testare, per ogni ceppo batterico,
1 i disinfettanti più un dischetto imbevuto con acqua
sterile come controllo. Con le ppinze sterili deporre
p i
dischi sulla superficie dell’agar dopo averli imbevuti dei
campioni di disinfettante.
Incubare le piastre a 37° per 24 h.

3
54
METODICA
(3a FASE)
La misura degli aloni di inibizione viene fatta su un contacolonie o su fondo scuro, con
un millimetro, compilare poi una tabella con i risultati segnando con + o con – la
presenza o l’assenza di alone.
C
Ceppo 1 C
Ceppo 2
1 alcool denaturato
2 tintura di iodio
3 acqua ossigenata 10 volumi
4 amuchina
5 ammoniaca
6 candeggina
55
U.D. 4.6 ANTIBIOGRAMMA
OBIETTIVO:
Stabilire lo spettro di sensibilità di un determinato ceppo microbico a diversi antibiotici.
PRINCIPIO:
Come nella precedente esperienza (U.D. 4.5), la valutazione della sensibilità del ceppo
microbico in esame a diversi antibiotici, si effettua misurando il diametro dell’alone di
inibizione che si è formato intorno a dischetti contenenti quantità prestabilite e controllate di
antibiotico (tecnica di Kirby-Bauer). L’interpretazione dei risultati la si ottiene consultando
apposite tabelle che permettono di stabilire se il ceppo microbico è resistente, intermedio o
sensibile ad un determinato antibiotico.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia Coli, Enterobacter aerogenes
MATERIALI CHIMICI
Standard MacFarland, dischi di antibiotici
TERRENI DI COLTURA
Trypticase Soy broth, Mueller Hinton agar
VETRERIA, ...
Piastre sterili, ansa, provette 16x100, tamponi sterili, pinze mettalliche, beker 100 ml,
righello
STRUMENTI
Bilancia autoclave,
Bilancia, autoclave termostato,
termostato bunsen
Standard MacFarland:
0,5 ml di Bario cloruro 0,048M + 99,5 ml di Acido Solforico 0,35 N (0,99 ml/100ml
di acido solforico, 0,117 g/10 ml di Bario Cloruro).
Tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml). La soluzione è stabile per circa 6
mesi. Agitare prima dell’uso.
56
METODICA
(1a FASE)
1 Preparare il brodo.
Distribuire 4-5 ml di brodo in ogni provetta.

2
3 Preparare il terreno Mueller Hinton agar

a doppio volume.
Distribuire in provettoni con tappo metallico

4 (40 ml per provettone).
57
METODICA
(2a FASE 1°
1 parte)
1 Piastrare il terreno Mueller Hinton agar in ambiente

sterile.
(2a FASE 2° parte)
1 Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico in ogni

provetta contenente il brodo TSB.
2 Incubare le provette a 37° per 18h.
58
METODICA
(3a FASE 1°
1 parte)
Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità della

brodocoltura con quella dello standard MacFarland, (tale
1 standard corrisponde circa a 108 batteri/ml) usare brodo
sterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.
(3a FASE 2° parte)
Immergere un tampone sterile nella brodocoltura

1 e seminare sulla superficie del terreno in
maniera uniforme, ripetendo l’operazione più
volte ruotando la piastra di 60°.
Entro 15’ applicare sulla piastra seminata i dischi

2 di antibiotici mediante pinze sterili (selezionare
gli antibiotici in relazione al tipo di batteri).
Disporre i dischi ad una analoga distanza tra
loro.
Incubare le piastre a 37° per 16-18 h.

3
59
METODICA
(4a FASE)
Misurare con un centimetro il diametro degli

1 aloni di inibizione sul fondo della piastra posta
sopra una superficie luminosa. Interpretare i
risultati in base allo schema di lettura.
2
Diametro alone di inibizione
Antibiotico Resistente Moderat. sensibile Sensibile
Ampicillina (AM) (enterococchi, <11 12-13 >14
enterobatteri)
t b tt i)
Ampicillina (AM) (stafilicocchi) <20 21-28 >29
Amikacina <14 15-16 >14
Amoxicillina (Gram-) <11 12-13 >14
Amixicillina (Gram+) <20 21-28 >29
Acido nalidixico (NA) <13 14 18
14-18 >19
Eritromicina (E) <13 14-17 >18
Fosfomicina (FFL) <10 11-14 >15
Gentamicina (GM) <12 ------- >13
Neomicina <12 13-16 >17
Rifampicina <11 12-18 >19
Penicillina G (P) (Stafilococchi) <20 21-28 >29
Penicillina G (P) <11 12-21 >22
(Altri microrganismi)
60
5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI
U.D. 5.1 UTILIZZAZIONE DELL’AMIDO
OBIETTIVO:
Verificare la capacità dei microrganismi di utilizzare l’amido quale fonte di glucosio per il
proprio metabolismo
PRINCIPIO:
La capacità dei batteri di idrolizzare l’amido, trasformandolo in destrine, maltosio e glucosio,
dipende da una proprietà genetica dei batteri stessi: quella di produrre l’enzima amilasi
Utilizzando un terreno di coltura in cui è presente amido, è possibile rilevarne la presenza, dopo
semina e incubazione, con il reattivo di Lugol, che si colora in blu. Non danno invece
colorazione blu i prodotti di idrolisi dell’amido.
L’aggiunta del Lugol sulla coltura determinerà una colorazione blu se il batterio in esame non
possiede l’amilasi, giallo-bruna o rossa se il batterio è amilasi +
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Liquido di Lugol
TERRENI DI COLTURA
Starch agar (Nutrient agar, Amido solubile)
VETRERIA ...
VETRERIA,
Beuta, treppiede, piastre sterili monouso, ansa, provette, portaprovette
STRUMENTI
Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen
Liquido di Lugol:
((soluzione iodo-iodurata)) composto
p da 1 g di Iodio,, 2 g di ioduro di ppotassio e 200 ml
di acqua. La soluzione deve essere fresca perché con il tempo si decolora e acidifica
per alterazione dello iodio.
61
METODICA
(1a FASE)
Preparare il terreno: soluzione al 10% di amido solubile in

Nutrient agar fuso in ragione di 20ml di soluzione per 100ml
1 di Nutrient agar.
Distribuire in 2 provettoni con tappo metallico

2 (18-20 ml per provettone).
(2a FASE)
1 Piastrare in ambiente sterile.
Seminare solo metà di 2 piastre, una piastra con

2 Escherichia coli e l’altra piastra con Bacillus
subtilis.
3 Incubare a 37° per 48 h.
62
METODICA
(3a FASE)
Aggiungere una goccia di Lugol sulla metà piastra

1 seminata e una goccia sulla metà non seminata.
Una colorazione chiara denota che l’amido è stato

idrolizzato, mentre la colorazione blu-azzurro rivela
2 ancora presenza di amido.
id
63
U.D. 5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI
OBIETTIVO:
Saggiare la capacità dei microrganismi di utilizzare carboidrati diversi (Glucosio, Lattosio,
Saccarosio) a scopi fermentativi.
PRINCIPIO:
I microrganismi metabolizzano diversi carboidrati attraverso processi fermentativi che portano
alla produzione di acidi e/o gas.
La produzione di acidi si può rilevare utilizzando un terreno come il Phenol red broth base che
contiene un indicatore di pH, il rosso fenolo, che è rosso in ambiente alcalino, arancio in
ambiente
bi neutro e giallo
i ll in
i ambiente
bi acido.
id
La produzione di gas può essere rilevata con le campanelle di Durhan.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis
MATERIALI CHIMICI
Soluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio
TERRENI DI COLTURA
Phenol red broth base
VETRERIA, ...
Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provettoni, portaprovettoni, palloncini tarati, siringhe e
filtri sterili,
sterili campanelle di Durham
STRUMENTI
64
METODICA
(1a FASE)
Distribuire in pprovette con tappo

pp a vite ((10 ml pper pprovetta;;
3 provette per ogni microrganismo in esame più una provetta
2 di controllo che non verrà inoculata).
3 Mettere in ogni provetta una campanella di Durhan.
(2a FASE)
Aggiungere
i add ognii provetta 1mll di soluzione
l i di carboidrato,
b id
utilizzando una siringa munita di filtro sterile (3 provette
1 per i 3 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).
Con ll’ansa
ansa, inoculare con lo stesso ceppo microbico le 3 provette
2 con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in esame.
Incubare a 37°. Dopo 4h fare la prima lettura;

3 la seconda dopo 24h.
65
(3a FASE)
1 Osservare il colore del terreno e la presenza di gas all’interno delle campanelle

(dopo 4 e 24 ore) e riportare i risultati nella seguente tabella:
glucosio saccarosio lattosio

microrganismo
i i
gas pH gas pH gas pH
E. coli
A. faecalis
2 Caratteristiche colturali dei due batteri
glucosio saccarosio l tt i
lattosio
microrganismo
gas pH gas pH gas pH
E. coli + + - - + +
A. faecalis
- - - - - -
66
U.D. 5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE
OBIETTIVO:
Saggiare la capacità dei microrganismi di metabolizzare i diversi carboidrati (Glucosio,
Lattosio, Saccarosio) mediante due processi: la fermentazione e l’ossidazione aerobia.
PRINCIPIO:
I processi per metabolizzare i carboidrati sono due: la fermentazione, che avviene in condizioni
di anaerobiosi, e l’ossidazione aerobia.
I microrganismi che fermentano, producono una reazione acida (colorazione gialla) in entrambe
le condizioni, quelli che ossidano producono una reazione acida solo in condizione di aerobiosi.
I microrganismi non fermentanti e non ossidanti danno reazione alcalina (colorazione blu) in
aerobiosi e nessuna modificazione di pH in anaerobiosi.
anaerobiosi
Il terreno contiene blu di bromotimolo come indicatore di pH; con la degradazione del
carboidrato si ha una variazione del pH verso l’acidità e il conseguente viraggio del terreno da
verde a giallo.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis
MATERIALI CHIMICI
Soluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio
olio di vasellina o paraffina
TERRENI DI COLTURA
O/F agar
VETRERIA, ...
Bunsen, beuta, treppiede, ago per infissione, provette, portaprovette, palloncini tarati,
siringhe e filtri sterili
STRUMENTI
67
METODICA
(1a FASE)
Distribuire in provette con tappo a vite (5 ml per provetta;

2 6 provette per ogni microrganismo in esame:2 per il glucosio,
2 per il saccarosio
i e 2 per il lattosio).
l i )
3 Preparare una beuta con della paraffina o dell’olio di vasellina.
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’ sia il terreno che la

4 paraffina.
(2a FASE)
Aggiungere ad ogni provetta 0,5ml di soluzione di carboidrato,

utilizzando una siringa munita di filtro sterile (2 provette per i 3
1 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).
Seminare per infissione con lo stesso ceppo microbico le 2

provette con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in
2 esame.
Coprire il terreno (una sola provetta per ogni zucchero)

3 con 2 ml di paraffina liquida, infine tappare.
4 Incubare a 32°-35° per 48h esaminando le provette ogni giorno.
68
(3a FASE)
1 O
Osservare lla colorazione
l i in
i ciascuna
i coppia
i di provette e riportare
i i dati
d i in
i tabella.
b ll

microrganismo
aperta chiusa aperta chiusa aperta chiusa
E coli
E.
A. faecalis
2 Caratteristiche
Ca atte st c e colturali
co tu a dei
de due batteri
batte

microrganismo
aperta chiusa aperta chiusa aperta chiusa
E. coli AG AG - - AG AG
A. faecalis - - - - - -
A = reazione acida
AG = reazione acida e produzione di gas
- = nessuna reazione o reazione alcalina
La produzione di gas si evidenzia con il distacco dal

terreno e lo spostamento verso l’alto della paraffina.
69
U.D. 5.4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI
OBIETTIVO:
Saggiare la capacità dei microrganismi di degradare un amminoacido il triptofano, dalla cui
demolizione si ottiene indolo e altri composti.
PRINCIPIO:
Il test dell’indolo serve a caratterizzare alcuni microrganismi appartenenti agli Enterobatteri, la
cui presenza in un campione può o meno indicare contaminazione fecale.
L’indolo è un composto contenente azoto che si forma dalla degradazione del triptofano da parte
di certi batteri.
L degradazione
La d d i add indolo
i d l è svelabile
l bil con il reattivo
i di Kovacs
K cha
h dà luogo
l add un composto
colorato di rosso.
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Enterobacter aerogenes
MATERIALI CHIMICI
Reattivo di Kovacs
TERRENI DI COLTURA
Acqua triptonata o peptonata
VETRERIA, ...
Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provette, portaprovette
STRUMENTI
70
METODICA
(1a FASE)
1 Preparare l’acqua triptonata.
Distribuire in 2 provette con tappo a vite (5 ml per

2 provetta).
(2a FASE)
1 Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico per ogni provetta.
2 Incubare a 32°-35° per 24-48h.
71
(3a FASE)
Aggiungere a ciascuna provetta alcune gocce del reattivo di Kovacs

e agitare delicatamente. Dopo alcuni minuti la formazione di una
1 colorazione rossa sulla superficie del terreno costituisce una prova positiva.
2 Riportare i dati ottenuti nella tabella.
microrganismo Indolo
E. coli
l
E. aerogenes
Caratteristiche culturali dei due batteri.
microrganismo Indolo
E. coli +
E. aerogenes -
+ = reazione positiva
- = nessuna reazione
72
U.D. 5.5 ENTEROTUBE
OBIETTIVO:
L’enterotube è un sistema pronto all’impiego per l’identificazione rapida delle
Enterobacteriacae che consente l’esame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimiche
dei batteri.
PRINCIPIO:
Gli enterobatteri vengono identificati in base alla valutazione dei risultati
di diverse prove biochimiche:
- fermentazione del destrosio e produzione di gas
- decarbossilazione della lisina in
- decarbossilazione dell’ornitina anaerobiosi
- fermentazione del triptofano e produzione di H2S
- fermentazione dell’adonitolo
- fermentazione del lattosio
- fermentazione dell
dell’arabinosio
arabinosio
- fermentazione del sorbitolo in
- fermentazione del glucosio (Voges-Proskauer) aerobiosi
- fermentazione del dulcitolo e della fenilalanina
- idrolisi dell’urea
- utilizzazione del citrato
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli, Proteus, Enterobacter aerogenes, ...
MATERIALI CHIMICI
Rreattivo di Kovacs, -naftolo (6% in alcool etilico), idrato di potassio (40g in 60ml di
acqua)
TERRENI DI COLTURA
Kit enterotube
VETRERIA, ...
Portaprovette, siringhe sterili
STRUMENTI
Termostato, bunsen
73
METODICA
(1a FASE)
Accanto alla fiamma del bunsen svitare i cappucci

1 dell’enterotube e con la punta dell’ago prelevare
una colonia isolata.
2
Inoculare l’enterotube ruotando ed estraendo l’ago
attraverso tutti gli scomparti del tubo.
tubo
3
Reinserire l’ago fino alla tacca e poi spezzarlo
piegandolo. La parte di ago che rimane all’interno
assicura ll’anaerobiosi
anaerobiosi.
Con lo spezzone dell’ago perforare la pellicola di

4 plastica in corrispondenza dei fori degli ultimi 8
scomparti al fine di creare un ambiente aerobio.
Riavvitare i tappi.
Incubare a 35-37°C per 20-24 h possibilmente in

posizione verticale su un portaprovette con lo
5 scomparto del destrosio rivolto verso l’alto.
74
(2a FASE)
1 Registrare le reazioni (+ o -)
e riportarle nella tabella:
fenilalaanina
arabinoosio
adonittolo
destroosio
dulcitoolo
sorbitoolo
ornitiina
Vogess-P
lattossio
citratto
indollo
lisinna
ureaa
H2S
gas
reazione
Eseguire il test dell’indolo iniettando con una siringa 4

2 gocce di reattivo di Kovacs direttamente sotto la
pellicola di plastica dello scomparto H2S/indolo (il
reattivo vira al rosso se la prova è positiva).
Eseguire il test di Voges-Proskauer iniettando con una

siringa 3 gocce di soluzione di -naftolo e 2 di KOH
3 direttamente sotto la pellicola di plastica dello
scomparto VP (il reattivo vira al rosso entro 10 minuti se
la prova è positiva).
4 Registrare gli ultimi due dati.
75
(3a FASE)
1 Per identificare il batterio in esame confrontare i dati ottenuti con la tabella

per l’dentificazione biochimica degli enterobatteri.
In alternativa, utilizzare i foglietti di identificazione allegati alla

2 confezione di Enterotube, contrassegnando per ogni reazione positiva i
numeri corrispondenti.
Per esempio:
Sommare i numeri contrassegnati, come indicato sopra. Il numero a 5 cifre ottenuto

(ID value), consente la rapida identificazione del batterio in esame utilizzando il
sistema di identificazione con codifica computerizzata.
76
6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO
U.D. 6.1 PROTEINA C REATTIVA (Test di agglutinazione indiretta)
OBIETTIVO:
Verificare la presenza di infezioni in atto sul soggetto in esame.
PRINCIPIO:
La proteina C reattiva compare nel siero umano in risposta ad una grande varietà di processi
infiammatori determinati da infezioni batteriche, nel reumatismo acuto, nell’infarto miocardico,
nelle neoplasie maligne. La proteina C ha un forte potere antigene e produce negli animali da
laboratorio un anticorpo specifico chiamato “reactive protein antiserum” CRPA. La ricerca della
PCR si esegue utilizzando l’antisiero CRPA.
MATERIALI BIOLOGICI
Siero, sieri positivo e negativo per PCR
MATERIALI CHIMICI
Kit PCR
VETRERIA, ...
Vetrini per agglutinazione a fondo nero
77
METODICA
Il siero in esame deve essere limpido intero e

diluito 1/20 (1 parte di siero e 19 parti di
soluzione tampone pH 8,2).
1 I sieri di controllo positivo e negativo sono
prediluiti 1:20 e quindi pronti all’uso. Agitare
prima dell’uso.
2 Agitare delicatamente prima dell’uso il reattivo al Latex con la proteina C reattiva.
S un apposito
Su i vetrino
i a fondo
f d nero, diviso
di i ini tre settori,
i sii procede
d come segue:
I settore II settore III settore
1 goccia di siero in esame 1 goccia di siero positivo 1 goccia di siero negativo

+ + +
1 goccia di Latex test PCR 1 goccia di Latex test PCR 1 goccia di Latex test PCR
Miscelare con l’apposita bacchetta e

3 quindi roteare delicatamente il vetrino
per 1’ circa.
Il test è positivo con la comparsa di agglutinazione visibile ad occhio nudo

4 trascorsi da 1 a 3 minuti. Agglutinazioni posteriori non sono da considerare.
78
U.D. 6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO (Test di neutralizzazione)
OBIETTIVO:
Determinare la presenza o meno nel siero in esame di anticorpi anti O-streptolisinici e valutarne
il titolo.
PRINCIPIO:
La O-streptolisina è una emolisina prodotta da Streptococcus pyogenes beta emolitico. La O-
streptolisina provoca sulla membrana delle emazie dei fori dai quali fuoriesce l’emoglobina. Gli
anticorpi che si fissano alla tossina, (reazione di neutralizzazione) impediscono l’evento. Come
sistema rivelatore della presenza o meno di anticorpi nel siero si usano le emazie. Se i globuli
rossi più il siero in esame,
esame vengono lisati dall’aggiunta di O-streptolisina
O streptolisina non si è verificata una
reazione di neutralizzazione, dunque nel siero non sono presenti anticorpi anti O-streptolisinici.
Viceversa l’assenza di lisi segnala la presenza di anticorpi capaci di legare e neutralizzare la
tossina.
MATERIALI BIOLOGICI
O-streptolisina titolata, globuli rossi di coniglio al 5%
MATERIALI CHIMICI
Soluzione tampone a pH 6,5
VETRERIA,, ...
Pipette in vetro o pipette automatiche, puntali, provette da sierologia, portaprovette
STRUMENTI
Centrifuga, bagnomaria
79
METODICA
(1a FASE)
Diluire il siero 1/10 = 0,2 ml di siero + 1,8 ml di soluzione tampone

1/100 = 0,5 ml siero 1/10 + 4,5 ml “ “
1/500 = 1 ml siero 1/100 + 4 ml “ “
Lavare la sospensione di globuli rossi almeno 3

2 volte con il tampone, centrifugando ogni volta a
1500-2000 rpm per 5’. Dopo il lavaggio finale
preparare la sospensione al 5% in tampone.
3 Disporre 14 provette come da schema:
1:10 1:100 1:500 Controlli
provetta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
siero diluito 0,8 0,2 1 0,8 0,6 0,4 0,3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 - -
tampone 0,2 0,8 - 0,2 0,4 0,6 0,7 - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,5 1
reagente 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5
o-streptolisina
Agitare ed incubare a 37° per 15’

emazie al 5% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agitare e incubare a 37° per 45’, ripetere l’agitazione dopo 15’. Centrifugare le provette per
1-2’ a 1000-1500rpm
Il titolo del siero in esame è espresso dalla più alta diluizione che è capace di inibire
l’emolisi. L’emolisi nelle provette è caratterizzata dal colore rosso della soluzione in
esame. Le unità anti-o-streptolisiniche sono espresse come il reciproco del titolo di
anticorpi come nello schema:
provetta diluizione provetta diluizione
1 1/12 8 1/500
2 1/50 9 1/625
3 1/100 10 1/833
4 1/125 11 1/1250
5 1/166 12 1/2500
6 1/250 13 non vi deve essere emolisi
7 1/333 14 vi deve essere emolisi completa
80
APPENDICE
TERRENI DI COLTURA
AGAR BIOS SPECIAL LL Preparazione

Agar Bios Special LL è l'agente solidificante d'elezione per i Sciogliere 71.4 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
terreni dl coltura per microbiologia. fredda, portare all'ebollizione sotto agitazione bollire per
cinque minuti, raffreddare in bagnomaria a 50°C ed
Grazie al suo elevato grado di purezza fornisce soluzioni aggiungere, con le cautele dell'asepsi, 10 ml di una
acquose limpide alle concentrazioni d'uso nei terreni di soluzione acquosa di 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC)
coltura (1.5%). all'1% sterilizzata per filtrazione; il terreno così preparato
AZIDE DEXTROSE BROTH può essere conservato a 50°C per circa tre ore prima di
essere versato nelle piastre. Le piastre preparate possono
F
Formula
l (grammi
( i per litro)
lit ) essere conservate per circa
i 155 giorni
i i ini frigorifero
f i if all buio.
b i
Peptocomplex 15.0 Il terreno non aggiunto di TTC può essere sterilizzato in
Beef Extract 4.5 autoclave a 121°C per 10 minuti e quindi conservato in
frigorifero: una volta scelto un modo di preparazione
Glucose 7.5 attenervisi sempre.
Sodium Chloride 7.5 pH finale 7.2±0.2.
Sodium Azide 0.2 Impiego
Preparazione Azide Maltose Agar, preparato secondo la formula di
Kenner, Clark e Kabler, è un terreno selettivo utilizzato per
Sciogliere 34.7 g di polvere in 100 ml di acqua distillata l'isolamento ed il conteggio degli streptococchi fecali.
fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire APHA e FDA raccomandano il terreno nell'isolamento
in tubi da 10 ml ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. primario degli enterococchi (nel senso lato del termine)
Per inoculi superiori a 1 ml per 10 ml di terreno, preparare il nelle acque e negli alimenti con la tecnica della membrana
terreno a concentrazione doppia o multipla. pH finale filtrante o con il conteggio in piastra (agar-germi).
7.2±0.2. Su Azide Maltose Agar coltivano con colonie da rosse a
Impiego rosa per la riduzione del TTC tutti gli streptococchi fecali
considerati tali da Hartman: enterocchi di gruppo D (S.
Azide
A id Dextrose
D t B th è un terreno
Broth t selettivo
l tti per la
l f
faecalis,
li S.
S faecalis
f li subsp.
b li f i
liquefaciens, S faecalis
S. f li subsp.
b
determinazione presuntiva degli streptococchi fecali nelle zymogenes, S. faecium), i non enterococchi di gruppo D (S.
acque e negli alimenti: la composizione è conforme a quanto bovis, S. equinus) ed inoltre S. mitis e S. salivarius. Dopo
stabilito da OMS e APHA. 48 ore a 35°C si registra sul terreno una crescita scarsa con
colonie incolori, di Lactobacillus plantarum e di
Eseguire il conteggio in tubi, secondo il metodo del numero Pediococcus cerevisiae; completamente inibiti sono gli
più probabile; variare l'entità dell'inoculum (multipli o streptococchi non di gruppo D (S. cremoris, S. lactis, S.
frazioni di 1 ml) in funzione del tipo di campione, allestendo pyogenes, S. termophilus) altri batteri acido lattici
almeno cinque tubi per ogni diluizione. (Leuconostoc mesenteroides, L. lactis, L. acidophilus) ed i
Usare come liquido per diluizione tampone di fosfati oppure coliformi.
una soluzione
l i acquosa di peptone allo
ll 0.5%
0 5% (p/v).
( / ) Incubare
I b a APHA nell'esame degli alimenti suggerisce di inoculare 1
35°C per 24 ore, osservare se vi è sviluppo; in caso negativo ml delle diluizioni decimali del campione con la tecnica
protrarre l'incubazione per altre 24 ore. dell'agar germi e di incubare le piastre a 35°C per 48 ore.
Calcolare il risultato servendosi delle apposite tabelle ed Per il test di conferma trapiantare 5-10 colonie tipiche in
esprimerlo come numero più probabile presuntivo. Brain Heart Infusion Broth e incubare a 35°C per 18-24
Confermare il risultato presuntivo trapiantando in Ethyl ore; usare queste brodocolture per una colorazione Gram,
Violet Azide Broth un test della catalasi, un trapianto in Aesculin Bile Broth,
una semina in Brain Heart Infusion Broth normale
AZIDE MALTOSE AGAR (KF) (incubazione a 45°C) e addizionato di NaCI 6.5%. La
Formula (grammi per litro) g
diagnosi ppresuntiva di streptococco
p fecale è data da:
catalasi negativa, sviluppo in brodo bile dopo 72 ore a
Peptocomplex 10 35°C, crescita a 45°C e in presenza a di NaCI. Tra gli
streptococchi fecali considerati da APHA solo S. equinus,
Yeast Extract 10 S. bovis non coltivano in presenza di NaCI 6.5%.
Sodium Chloride 5
Sodium Glycerophosphate 10
Maltose 20
Lactose 1
Agar Bios LL 15
Sodium Azide 400 mg
Brom Cresol Purple 15
81
BRILLIANT GREEN BILE BROTH 2% ENDO BROTH MEMBRAN FILTER
Formula (grammi per litro) Formula (grammi per litro)
Ox Bile Bios 20.0000 Peptone Bios D 5.000
Lactose 10.0000 Peptomeat 5.000
Peptomeat 10.0000 Biotone 10.000
Brilliant Green 0.013 Yeast Extract 1.500
Lactose 12.500
Preparazione Sodium Chloride 5.000
Sciogliere 40 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata Dipotassium Phosphate 4.375
fredda, riscaldare fino a soluzione, distribuire e autoclavare a
121°C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere nel Monopotassium Phosphate 1.375
tempo e nella temperatura di sterilizzazione.
sterilizzazione Per un terreno Sodium
di Sulphite
l hi 2.100
2X sciogliere 80 g di terreno in 1000 ml di acqua.
Sodium Desoxycholate 0.100
pH finale 7.2±0.2.
Sodium Lauryl Sulphate 0.050
Basic Fuchsin 1.050
Impiego
Preparazione
Brilliant Green Bile Broth 2% è un terreno selettivo
raccomandato per la determinazione e la conferma dei Sciogliere 48 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
q
coliformi nelle acque, nei liquami,
q nei pprodotti lattiero- fredda contenente 20 ml di etanolo, mescolare e portare
caseari, negli alimenti. La presenza del verde brillante all'ebollizione.
ll' b lli i N
Non autoclavare.
l Il terreno deve
d essere
sopprime la crescita dei batteri anaerobi lattosio-fermentanti usato il giorno stesso della sua preparazione; se necessario
(C/ostridium perfringens) non ottenendosi falsi positivi con conservare al buio a 4°C per non più di 96 ore.
incubazione a 44°C; il verde brillante ed i sali biliari pH finale 7.2±0.2.
inibiscono la crescita dei microrganismi Gram positivi. Nella
rassegna dei metodi per la determinazione dei coliformi negli Impiego
alimenti ICMSF suggerisce l'uso del Brilliant Green Bile
Broth 2% per la determinazione, con il metodo del numero Endo Broth Membran Filter è un terreno selettivo per il
più probabile, dei coliformi totali con incubazione a 35-37°C conteggio dei coliformi nell'acqua e nel latte con la tecnica
per 24 e 48 ore, seguito dal test di conferma su piastre di della membrana filtrante.
Vi l Red
Violet R d Bile
Bil Agar
A o di Endo
E d Agar
A i b a 35-37°C
incubate 35 37°C per Per l'esecuzione del metodo si consiglia di seguire le
48 ore; questo metodo è soprattutto utilizzato nei laboratori indicazioni dell'APHA. I coliformi coltivano con viraggio
europei. del terreno verso il color porpora con o senza riflessi
ICMSF in conformità ad APHA ed a FDA consiglia l'uso del metallici in superficie. Il volume di campione da filtrare
Brilliant Green Bile Broth 2% nel test di conferma dei deve essere scelto in base al numero di cellule batteriche
coliformi: trasferire un'ansata di crescita microbica dai tubi che si attende di trovare.
positivi di Lauryl Pepto Bios Broth o di Lactose Broth in tubi La quantità ideale è quella che fornisce una crescita
di Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 35°C per 24 e microbica compresa tra 50 e 200 colonie.
48 ore. La formazione di gas entro le 48 ore conferma la
presenza dei coliformi nei tubi del test presuntivo in Lauryl Ad eccezione delle acque potabili e delle acque delle
Pepto Bios Broth. Seguendo la procedura descritta da piscine che devono essere filtrati in duplicato ad un unico
Mackenzie, ICMSF descrive l'uso del terreno al verde volume di 100 o 500 ml, tutti gli altri campioni di acqua
brillante nella determinazione dei coliformi fecali: trasferire devono essere filtrati a tre diversi livelli volumetrici, diluiti
un'ansata di crescita dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in o non diluiti, (Si veda la tabella sottostante).
provette di Brilliant Green Bile Broth 2% e di Peptone Water
ed incubare a 44±0.1°C; osservare lo sviluppo di gas nelle Volumi da filtrare per il conteggio dei coliformi nelle
provette di Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 e 48 ore di acque:
incubazione ed eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24
ore in Peptone Water; le colture che producono gas e sono
indolo p positive sono da considerarsi coliformi di origine g
fecale.
Anche OMS raccomanda per le acque potabili l'uso del
Brilliant Green Bile Broth 2% per il test di conferma dei
coliformi con incubazioni differenziate a 37°C ed a 44°C per
rispettivamente 48 e 6-4 ore per la distinzione tra coliformi e
coliformi fecali; il test di conferma segue la semina
preliminare
in Lactose Broth o in Mac Conkey Broth e precede il test di
verifica finale in terreno solido (Endo Agar o Levine EMB
Blue Agar o Mac Conkey Agar OMS). Per le acque potabili l'arricchimento preliminare del
campione dà risultati eccellenti, anche se esso non è
indispensabile per l'esame di routine dei campioni.
82
EOSINE METHYLENE BLUE AGAR ETHYL VIOLET AZIDE BROTH
Formula (grammi per litro) Formula (grammi per litro)
Peptone Bios D 10.00 Biotone 20.0
Sodium Chloride 5.00 Sodium Chloride 5.0
Lactose 5.00 Sucrose 5.00 Glucose 5.0
Dipotassium Phosphate 20.0 Dipotassium Phosphate 2.7
Methylene Blue 0.065 Monopotassiurn Phosphate 2.7
Eosin Yellow 0.40 Sodium Azide 0.4
Agar Bios LL 15.00 Ethyl Violet 0.83 mg
P
Preparazione
i P
Preparazione
i
Sciogliere 42.5 g di polvere in 1000 mi di acqua distillata Sciogliere 35.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire e fredda. Scaldare fino a completo scioglimento del terreno,
sterilizzare a 121°C per 15 minuti. distribuire in provette ed autoclavare , a 121°C per 15
minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo di
Raffreddare il terreno a circa 50°C e, prima di trasferirlo in sterilizzazione.
piastra, agitare delicatamente per disperdere il materiale
flocculante che si forma durante la sterilizzazione. pH finale 7.0±0.2.
pH finale 7.2±0.2.
Impiego
Impiego Ethyl Violet Azide Broth è un terreno selettivo per la
determinazione degli enterococchi nelle acque, come indice
Eosine Methylene Blue Agar è un terreno differenziale di un inquinamento fecale delle stesse. Il terreno è
preparato secondo una modificazione del terreno originale di preparato secondo una modificazione della formula
Halt-Harris e Teague, da usarsi in piastra per l'isolamento originale proposta da Litsky ed è in accordo con le
degli enterobatteri e per la differenziazione dei microrganismi specificazioni dell'APHA riguardo all'uso delle tecniche
lattosio-Saccarosio fermentanti. per la determinazione degli streptococchi fecali nelle
I batteri Gram-positivi sono notevolmente inibiti. La acque.
combinazione
bi i d ll' i e del
dell'eosina d l blu
bl di metilene
il nell terreno, L'uso dell'azide sodica, associata al violetto di etile, rende il
contenente lattosio e saccarosio, permette di distinguere i terreno selettivo per gli enterococchi essendo inibiti tutti gli
membri dei generi Escherichia e Enterobacter dagli altri altri microrganismi Gram-positivi ed i microrganismi
enterobatteri. Gram-negativi.
I batteri lattosio-saccarosio fermentanti sull'EMB Agar Gli enterococchi che si devono considerare come indicatori
formano colonie mucoidali e convesse con una colorazione di inquinamento fecale sono: Streptococcus faecalis subsp.
da rosso a porpora con assenza o presenza di riflessi metallici. liquefaciens, Streptococcus faecalis subsp. zymogenes,
Salmonella, Shigella e gli altri batteri lattosio-saccarosio non Streptococcus faecium, Streptococcus bovis, Streptococcus
fermentanti formano colonie da incolori a rosa. equinus.
La presenza del tampone fosfato nel terreno permette di Le caratteristiche di crescita di questi microrganismi,
distinguere E. coli da E. aerogenes; E. coli anche in presenza resistenza alle alte temperature, ai detergenti, ai
di un sistema tampone, produce una notevole acidificazione disinfettanti, fanno si che l'indice di inquinamento da loro
del terreno, mentre E. aerogenes, avendo modeste proprietà espresso debba essere integrato dalla ricerca di altri
fermentanti, provoca una minore acidificazione del terreno. indicatori faecali (coliformi).
L'abbassamento del p H durante la crescita di E. coli induce APHA consiglia di utilizzare l'Ethyl Violet Azide Broth per
la formazione di legami amidici tra l'eosina e il blu di il test di conferma degli enterococchi coltivati nei tubi di
metilene che si traduce in una colorazione porpora metallica Azide Broth. Dopo 24-48 ore di incubazione delle provette
delle colonie. di Azide Broth si trasferiscono tre ansate di crescita
Per l'isolamento degli enterobatteri patogeni si consiglia di i bi in
microbica i tubi
bi contenentii 10 mll di Ethyl
E h l Violet
Vi l Azide
A id
utilizzare, parallelamente all'EMB Agar, terreni più selettivi Broth e si incuba per 24 ore a 35°C.
quali l'XLD, il Brilliant Green Agar, ecc. La presenza di enterococchi è rivelata dall'intorbidimento
Nella tabella sottostante sono riportate le caratteristiche del brodo e dalla formazione di un anello porporino attorno
colturali di alcuni microrganismi su EMB Agar: al menisco del liquido.
83
FAECAL COLIFORM BROTH Preparazione
Formula (grammi per litro) Sciogliere 13 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione,
Biotone 10.0 distribuire in tubi Durham ed autoclavare a 121°C per 15
Peptocomplex 5.0 minuti. Se necessario, usare il terreno a doppia o tripla
concentrazione
concentrazione.
Yeast Extract 3.0
pH finale 6.8±0.2.
Sodium Chloride 5.0
Impiego
Lactose 12.5
Lactose Broth è consigliato da APHA per la
Bile Salts Bios 1.5 determinazione presuntiva dei coliformi con il metodo del
Aniline Blue 0.1 numero più probabile, nelle acque e nei liquami, per
eseguire il test finale di conferma dei coliformi nei prodotti
Preparazione lattiero caseari dopo la semina in Endo Agar o in Levine
EMB Blue Agar g ed è consigliato
g da FDA e ICMSF pper
Sciogliere
S i li 37 g di polvere
l i 1000 mll di acqua distillata
in di ill l'arricchimento non selettivo di SaJmonella.
fredda; addizionare 10 ml di una soluzione al1'1 %, in
Il terreno contiene lattosio, estratto di carne e peptone in
NaOH 0.2 N, di acido rosolico. Portare all'ebollizione sotto quantità tali da permettere una crescita ottimale dei
agitazione, raffreddare e saturare dei tamponi assorbenti microrganismi non particolarmente esigenti quali sono i
sterili con 2 ml di terreno in piastre Petri. coliformi.
p H finale 7.4±0.1. Per la determinazione presuntiva dei coliformi nelle acque
Impiego APHA suggerisce la seguente tecnica:
Faecal Coliform Broth,, ppreparato
p in in accordo alla formula inoculare una serie di tubi da fermentazione con volumi
proposta da APHA, è utilizzato per il conteggio dei coliformi i ti di campione
appropriati i i modo
in d dad non alterare
lt il rapporto
t
fecali nell'acqua con il metodo delle membrane filtranti. Per tra volume finale di terreno inoculato e ingredienti per litro;
l'esecuzione del test filtrare un volume opportuno di ogni variazione rispetto allo schema di lavoro consigliato e
campione d'acqua (si veda la tabella sottostante) e depositare i riportato nella tabella sottostante, può alterare le
filtri sui tamponi impregnati di Faecal Coliform Broth in caratteristiche biologiche del terreno
piastre Petri. Entro 30 minuti deporre in bagnomaria
termostatato a 44-45°C e incubare in contenitori a tenuta per
24 ore. I coliformi fecali coltivano con colonie blu, le rare
colonie date dai coliformi non fecali appaiono di colore
ggrigio-crema.
g Per il conteggio
gg delle colonie si consiglia
g di
utilizzare un microscopio a basso potere d'ingrandimento (10-
15 ingrandimenti).
Volumi da filtrare per il conteggio del coliformi fecali nelle
acque:
Incubare i tubi da fermentazione a 35°C ed eseguire una

p
prima lettura agitando
g leggermente
gg le pprovette dopo
p 24 ore;;
se non si osserva produzione di gas incubare per ulteriori
24 ore.
La formazione di gas entro le 48 ore è indice di positività
per i coliformi. Il limite arbitrario di 48 ore può escludere
la possibilità di coltivare occasionali coliformi che
fermentano lentamente il lattosio, i quali comunque hanno
scarso interesse sanitario e non inficiano la validità del
metodo.
GELATIN BIOS Co e a e il test ppresuntivo
Confermare esu t vo co
con se
seminee da
dai tub
tubi pos
positivi
tv
di Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% e
Gelatin Bios, costituita da materiale proteico, è utilizzata ricercare, se necessario, i coliformi fecali con semine in EC
come agente solidificante nei terreni di coltura per la Medium.
microbiologia e per saggiare l'attività gelatinolitica dei batteri.
Gelatin Bios, priva di carboidrati a fermentabili e di La presenza di coliformi nelle acque è considerata indice di
conservanti, è realmente solubile in acqua e fornisce soluzioni inquinamento fecale; il loro ritrovamento in prodotti
limpide e prive di colore. lattiero caseari è indice di cicli produttivi non
rigorosamente controllati da un punto di vista sanitario e/o
di modalità di conservazione non idonee.
LACTOSE BROTH
Formula (grammi per litro)
Beef Extract 3
Peptocomplex 5
Lactose 5
84
M17 AGAR Preparazione
Formula (grammi per litro) Sciogliere 69.2 g di agar e 54.2 g di brodo in 1000 ml di
acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto
Tryptone 2.50 agitazione, aggiungere 1 ml di polisorbato 80 (Tween),
Meat Peptone 2.50 distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Soya Peptone 5.00 pH finale 6.4±O.2.
Yeast Extract 2.50 Impiego
Meat Extract 5.00 MRS Agar e Broth, preparati secondo la formula di De
Man, Rogosa e Sharpe, sono terreni selettivi indicati per
Sodium Glycerophosphate 19.00 l'isolamento dei lattobacilli.
Magnesium Sulphate 0.25 Sui due terreni coltivano lattobacilli provenienti da
Ascorbic Acid 0.50 qualsiasi materiale: latte, prodotti lattiero caseari, cavo
orale, feci, ed inoltre i lattobacilli normalmente difficili da
Lactose 5.00
00 coltivare
lti su altri
lt i terreni
t i (Lactobacillus
(L t b ill b i
brevis,
Lactobacillus fermentum).
Agar Bios LL 15.00
De Man e coll. riportano una migliore rispondenza
dell'MRS Agar rispetto ai terreni contenenti estratto di
Preparazione pomodoro di Briggs e di Cox Briggs e al terreno all'estratto
di carne di De Man, nell'isolamento dei lattobacilli.
Sciogliere 57 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire Il Tween 80, il sodio acetato e il triammonio citrato
beuta ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Non eccedere intensificano la crescita dei lattobacilli; il magnesio solfato
nella temperatura di ebollizione. L
L’acidità
acidità del terreno può è inserito per motivi precauzionali poiché lo Yeast Extract
idrolizzare parzialmente l’agar. d
dovrebbe
bb fornire
f i una quantità i à di magnesio i sufficiente
ffi i alla
ll
crescita dei lattobacilli. Per l'isolamento dei lattobacilli
pH finale 6.8±0.2. operare come segue: inserire 1 mi delle diluizioni decimali
del campione in piastre Petri e addizionare 10-15 ml di
Impiego terreno, lasciar solidificare e addizionare un secondo strato
Il terreno M17 è selettivo per l’identificazione di di MRS Agar non inoculato e incubare a 37°C per 3 giorni
Sterptococcus thermophilus. o a 30°C per 5 giorni. Le colonie coltivate su MRS Agar o
la crescita in MRS Broth devono essere sottoposte ai tests
biochimici per l'identificazione dei lattobacilli in MRS
MRS AGAR Aesculin Broth, MRS Arginine Broth ed in MRS
F
Fermentation
t ti Broth.
B th
Peptomeat 10.00 MUELLER HINTON MEDIUM
Beef Extract 10.00 Formula (grammi per litro)
Yeast Extract 5.00 Beef, Infusion from 300.0
Glucose 20.00 Hydrolyzed Casein Bios A 17.5
Dipotassium Phosphate 2.00 Starch 15
1.5
6odium Acetate 5.00 Agar Bios LL 14.0
Triammonium Citrate 2.00
Magnesium Sulphate 0.20 MUELLER HINTON BROTH
Manganous Sulphate 0.05 Formula (grammi per litro)
Agar Bios LL 15.00 Biomeat 2.0
Hy Casein Bios A 17.5
MRS BROTH Starch 1.5
Formula (grammi per litro) Preparazione
Peptomeat 10.00 Sciogliere 36 g di agar e 21 g di brodo in 1000 ml di acqua
Beef Extract 10.00 distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione
l'agar e scaldare fino a completa soluzione il brodo,
Yeast Extract 5.00 distribuire ed autoclavare a 115°C per 10 minuti.
Glucose 20.00 Non superare il tempo e la temperatura di sterilizzazione
Dipotassium Phosphate 2 00
2.00 indicati.
6odium Acetate 5.00 pH finale 7.4±0.2.
Triammonium Citrate 2.00
Magnesium Sulphate 0.20
Manganous Sulphate 0.05
85
Impiego NUTRIENT BROTH
Mueller Hinton Medium e Broth sono terreni originariamente Formula (grammi per litro)
preparati per l'isolamento dei meningococchi e dei
gonococchi e trovati indicati, dato i bassi livelli di acido p- Beef Extract 3
aminobenzoico per il test di sensibilità ai sulfamidici. Peptomeat 5
Mueller Hinton Medium è raccomandato da FDA per il test di Preparazione
sensibilità agli antibiotici chemioterapici con il metodo
dell'agar diffusione utilizzando dischi di carta da 6 mm ad Sciogliere 23 g di agar e 8 g di brodo in 1000 ml di acqua
alta concentrazione. distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione,
distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Mueller Hinton Medium è preparato con peptoni
rigorosamente selezionati, contenenti bassi livelli di agenti pH finale 6.8±0.2.
inibitori dei sulfamidici e del co-trimossazolo, tanto che è Impiego
possibile effettuare l'antibiogramma senza ricorrere
all'utilizzo del sangue lisato di cavallo per neutralizzare Nutrient Agar e Nutrient Broth sono terreni a base di
ll'azione
azione della timidina antagonista del trimetoprim peptoni di carne utilizzati per la coltivazione dei
nell'associazione trimetoprim-sulfametossazolo. Il contenuto microrganismi non particolarmente esigenti sotto il profilo
di cationi bivalenti (Ca++, Mg++) del terreno è entro delle richieste nutritive.
l'intervallo di valori suggerito da Reller e coll. (Ca++: 50-100
mg/l; Mg++: 20-35 mg/l), cosicché gli aloni di inibizione da Il Beef Extract e il Peptomeat forniscono una quantità di
aminoglucosidi su Pseudomonas aeruginosa risultano entro il carbonio, azoto e vitamine sufficienti per la crescita della
range raccomandato da ASM e riportati in tabella. maggior parte dei microrganismi non esigenti
(enterobatteri, stafilococchi).
Nell'esecuzione dell'antibiogramma secondo il metodo di
Bauer e coll. e raccomandato da FDA utilizzare il Mueller L'APHA raccomanda l'uso di Nutrient Agar nell'esame
Hinton Medium in p piastre da 14 cm o da 10 cm, in strato di 4 microbiologico delle acque e dei prodotti lattiero caseari. I
mm (60 ml di terreno per piastre Ø 140 mm 25 ml per piastre t
terrenii possono essere impiegati
i i ti come base b a cuii
Ø 100 mm); addizionare sangue defibrinato di montone o di aggiungere vari materiali quali carboidrati, sali, coloranti
cavallo al 4-5% per eseguire l'antibiogramma su specie ecc., per ottenere terreni selettivi, differenziali,
batteriche particolarmente esigenti (streptococchi, d'arricchimento. Il Nutrient Agar e il Nutrient Broth, sono
pneumococchi) e utilizzare l'agar cioccolato con gli emofili. stati tra i primi terreni utilizzati in microbiologia e tuttora
possono essere usati di routine per l'esame a delle acque,
Per preparare l'inoculo sospendere 4-5 colonie coltivate su degli alimenti, per preparare colture stock, per la
terreno primario d'isolamento in 4-5 ml di Tryptic Soy Broth coltivazione preliminare di un campione da sottoporre a
e incubare per 2-6 ore fino a che la brodocoltura raggiunga la successivi esami batteriologici, per l'isolamento dei
stessa densità dello standard opacimetrico preparato microrganismi in coltura pura.
aggiungendo a 99.5
99 5 ml di acido solforico 0.36
0 36 N,
N 0.5
0 5 ml di
bario cloruro 1 %. Entro 15 minuti dalla preparazione
dell'inoculo immergere un tampone sterile nella brodocoltura, O/F HUGH LEIFSON BASE
spremerlo contro le pareti della provetta per eliminare
l'eccesso di liquido quindi strisciare sulla superficie dell'agar Formula (grammi per litro)
in piastra in modo da ottenere una dispersione uniforme
dell'inoculo. Peptone Bios D 2.00
Lasciare asciugare le piastre quindi depositare i dischi di carta Sodium Chloride 5.00
premendoli sulla superficie dell'agar con la punta dell'ago; Dipotassium Phosphate 0.30
depositare un massimo di 5 dischi nelle piastre Ø 100 mm e
un massimo di 9 dischi nelle piastre Ø 140 mm in modo tale B
Bromthymol
th l Blue
Bl 0 03
0.03
che tra i dischi e il bordo della piastra vi siano non meno di 2 Agar Bios LL 2.50
cm. Incubare 18 ore a 35°C quindi leggere gli aloni di
inibizione tenendo conto della zona completamente priva di Preparazione
crescita microbica e con bordi netti. Essendo numerose le
variabili del metodo dell'agar diffusione che giocano un ruolo Sciogliere 9.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fondamentale per l'ottenimento di risultati precisi ed accurati fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, distribuire
(inoculo, strato dell'agar, temperatura di incubazione, ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 50°C
contenuto dei dischi, etc.), è indispensabile stabilire un ed aggiungere sterilmente una soluzione del carboidrato
programma per il controllo di qualità del metodo. Per tale desiderato (concentrazione finale 1-2% p/v) ovvero, per
scopo sii utilizzano
tili d
due ceppi:
i Staphylococcus
St h l aureus, evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili,
sterili
Escherichia coli; questi ceppi devono essere inseriti di routine addizionare dischi di carta contenenti carboidrati.
nella procedura operativa, ogni volta che si esegue Inoculare due tubi e ricoprire uno di essi con olio di
l'antibiogramma. vasellina sterile.
pH finale 7.1±0.2.
NUTRIENT AGAR Impiego
Formula (grammi per litro) O/F Hugh Leifson Base preparato in accordo alla formula
Beef Extract 3 proposta da Hugh e Leifson è un terreno a cui possono
i i varii carboidrati
essere aggiunti b id i per lo l studio
di delle
d ll
Peptomeat 5 ossidazioni e/o fermentazioni dei microrganismi.
Agar Bios LL 15
86
Il terreno è usato per la differenziazione della flora intestinale Nelle tabelle sottostanti sono indicati i modelli di reazione
non enterica, Gram negativa dagli enterobatteri, per la su O/F Hugh Leifson Base, e le caratteristiche colturali di
differenziazione dei micrococchi e per la determinazione del alcuni microrganismi su detto terreno.
modello metabolico con cui vengono degradati gli zuccheri
dai microrganismi.
L utilizzo dei carboidrati da parte dei batteri può avvenire
L'utilizzo
secondo due processi: fermentativo o ossidativo.
Alcuni microrganismi sono capaci di utilizzare i carboidrati
con produzione di acido solamente in condizioni aerobie, altri
in condizioni sia aerobie che anaerobie (anaerobi facoltativi).
La degradazione anaerobia dei carboidrati avviene attraverso
la via metabolica di Embden Meyerhof o attraverso una
combinazione di questa con lo « shunt » dei pentosi con la
via di Entner Doudoroff; tutte e tre le vie metaboliche
richiedono la fosforilazione iniziale del glucosio, hanno come
prodotto
d i
intermedio
di l'acido
l' id piruvico,
i i richiedono
i hi d un composto
organico come acettore ultimo di elettroni e conducono a
metaboliti finali diversi essendo diverso il patrimonio
enzimatico delle varie specie batteriche.
La degradazione ossidativa del glucosio non richiede la sua
fosforilazione iniziale, ha come prodotto intermedio l'acido
piruvico e richiede l'ossigeno o un composto inorganico, + reazione positiva, acidificazione con viraggio al giallo
come acettore finale di elettroni. dell’indicatore
L'O/F Medium Base, addizionato del carboidrato adatto, g , nessun cambiamento di colore del
- reazione negativa,
permette di distinguere
di i tra i due
d processii metabolici
b li i descritti.
d i i mezzo
Il terreno contiene il blu di bromotimolo come indicatore di
pH; una variazione del pH del mezzo verso l'acidità, indotta
dalla degradazione del carboidrato aggiunto, fa virare PEPTONE WATER
l'indicatore da verde a giallo. Il permanere, dopo Formula (grammi per litro)
l'incubazione, di una colorazione verde del terreno o
l'apparizione di una colorazione blu, dovuta ad una Peptone Bios D 10
trasformazione alcalina del mezzo, indicano che il test è
negativo e che non vi è stata nessuna degradazione dei Sodium Chloride 5
carboidrati
carboidrati. P
Preparazione
i
Il terreno ha un basso contenuto di peptoni per evitare una Sciogliere 15 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
loro degradazione da parte dei microrganismi con fredda. Riscaldare agitando, distribuire ed autoclavare a
metabolismo ossidativo, che porterebbe alla formazione di 121°C per 15 minuti.
prodotti finali di natura alcalina che potrebbero mascherare
l'acidità del mezzo. Per studi sull'utilizzazione degli zuccheri aggiungere, prima
della sterilizzazione, a 900 ml di terreno, 100 ml di una
O/F Hugh Leifson Base è un terreno semisolido; la presenza soluzione acquosa allo 0.2% di un indicatore (porpora
dell'agar a una concentrazione del 0.25% impedisce ai bromocresolo, blu bromotimolo o rosso fenolo).
prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con
una conseguente loro diluizione.
diluizione Aggiungere alla base sterilizzata una soluzione sterile dello
zucchero desiderato e distribuire in tubi con campanella
Il dipotassio fosfato è incorporato per promuovere la oppure addizionare alle provette dischi di carta contenenti
fermentazione dei carboidrati e per stabilizzare il pH del carboidrati.
terreno, mentre il sodio cloruro stimola la crescita di
Brucella. L'aggiunta di alcuni zuccheri può produrre un
abbassamento del pH del terreno: in questo caso
II glucosio è il carboidrato che più frequentemente viene ricorreggere il pH con NaOH 0.1 N sterile.
usato per il test O/F; Cowan e Steel comunque raccomandano
di usare, per la differenziazione dei microrganismi che non pH finale 7.2±0.2.
degradano il glucosio, una batteria di zuccheri costituita da
glucosio lattosio,
glucosio, lattosio saccarosio,
saccarosio maltosio.
maltosio p ego
Impiego
Per l'esecuzione del test si inoculano due provette, contenenti Peptone Water, dato l'elevato contenuto in triptofano del
il carboidrato alla concentrazione dell'1 %, per infissione di Peptone Bios D, è particolarmente adatto come substrato
un ago caricato di una sospensione batterica. Dopo aver per .la determinazione della produzione di indolo.
ricoperto una delle provette con olio di vasellina si incuba per La capacità di metabolizzare il triptofano con formazione
48 ore o più a 37°C. di indolo è caratteristica distintiva di alcune specie
I microrganismi con metabolismo ossidativo produrranno batteriche; il test è perciò utile ai fini dell'identificazione e
un'acidificazione del mezzo, con viraggio dell'indicatore da classificazione dei microrganismi.
verde a giallo, nella provetta aperta; i batteri con metabolismo Il tempo e la temperatura di incubazione variano a seconda
fermentati o produrranno
fermentativo prod rranno un'acidificazione
n'acidifica ione del terreno in d ll specie
della i batterica
b i in i esame; lal presenza di indolo
i d l può
entrambe le provette. essere rivelata con il reattivo di Kovacs o di Erlich.
Con il test O/F si può determinare anche la produzione di gas
da parte dei microrganismi e la loro mobilità (crescita diffusa
a partire dalla linea dell'inoculo).
87
Il metodo prescelto deve essere controllato con ceppi di Tali prove, che vanno sotto il nome generico di “prove di
collezione: Escherichia coli indolo +, Enterobacter fermentazione degli zuccheri“, anche se a volte vengono
aerogenes indolo -. eseguite su microrganismi a metabolismo prevalentemente
ossidativo e se fanno uso di carboidrati che non sono solo
Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSF zuccheri ma anche alcoli e glucosidi, consistono nel
suggerisce l'uso di Peptone Water nel test di conferma dei seminare il germe in esame, in coltura pura, in terreni
coliformi fecali negli alimenti: trasferire un
un'ansata
ansata di crescita contenenti
t ti varii carboidrati.
b id ti
microbica dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provette
di Peptone Water e di Brilliant Green Bile Broth 2% e Phenol Red Agar Base e Broth, contengono il rosso fenolo
incubare a 44°C; eseguire il test dell'indolo sulla crescita di come indicatore di pH che, da rosso, in terreno alcalino,
24 ore in Peptone Water e osservare lo sviluppo di gas in diventa arancio in terreno neutro e giallo in terreno reso
Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 ore e 48 ore. Le acido dall’attacco dei carboidrati da parte dei
colture che a 44°C sono indolo positive e producono gas sono microrganismi.
da considerarsi coliformi di origine fecale. Peptone Water è
anche utilizzato come base per lo studio della utilizzazione Metodo in terreno solido con dischi di carta (Bios Discs)
degli zuccheri. Dopo l'aggiunta degli zuccheri incubare alla Dividere il terreno autoclavato in piastre sterili (Ø 14 mm),
temperatura desiderata e osservare tutti i giorni per 7 giorni se lasciar solidificare indi seminare in superficie il germe in
vi è stata produzione di gas e/o di acido. esame. Per ottenere risultati più rapidi e più netti ricorrere
alla tecnica dell'agar-germi. Deporre i Bios Discs sulla
superficie dell'agar inoculato, facendo attenzione che siano
PHENOL RED AGAR BASE opportunamente distanziati e ben aderenti al terreno
(seminare anche una piastra di controllo senza carboidrati)
Formula (grammi per litro) incubare a 37°C. La produzione di acido è segnalata da un
Peptocomplex 11.000 alone di viraggio giallo attorno ai dischi.
Sodium Chloride 5.000 Metodo in terreno liquido con dischi di carta (Bios Discs)
Ph l Red
Phenol R d 0 025
0.025 Nelle provette di Phenol Red Broth Base autoclavate,
autoclavate
introdurre sterilmente i Bios Discs e inoculare con
Agar Bios LL 15.000 un'ansata di crescita microbica. Seminare anche una
provetta di controllo senza carboidrati e incubare a 37°C.
PHENOL RED BROTH BASE La produzione di acido è segnalata dal viraggio al giallo del
brodo di coltura. Con entrambi i terreni la produzione di
Formula (grammi per litro) acido è rapida, è bene quindi eseguire letture frequenti, la
prima dopo circa 4 ore. Dopo che si è osservata una
Peptomeat 10.000 reazione positiva scartare il tubo; prolungando infatti il
Beef Extract 3 000
3.000 pperiodo di incubazione si ppuò assistere ad un'inversione
della reazione con viraggio dell'indicatore verso l'alcalinità.
Sodium Chloride 5:000
Phenol Red 0.018
TRIPTIC GLUCOSE EXTRACT AGAR
Preparazione
Peptone Bios D 5
Sciogliere 31 g di agar e 18 g di brodo in 1000 ml di acqua
distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, Beef Extract 3
distribuire in tubi da fermentazione il brodo in ragione di 33-44 Glucose 1
ml per tubo, e in beuta l'agar, autoclavare a 121°C per 15
minuti. Agar Bios LL 15
Raffreddare a circa 50°C ed aggiungere con le precauzioni
dell'asepsi una soluzione sterilizzata per filtrazione TRIPTIC GLUCOSE YEAST AGAR (Plate count
dell'appropriato carboidrato, in modo che si ottenga una agar)
concentrazione finale dell'1-2% (p/v).
Per evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili si può Formula (grammi per litro)
addizionare in provetta (brodo) o deporre sulla superficie Peptone Bios D 5.0
dell'agar
dell agar in piastra,
piastra dischi di carta contenenti carboidrati
Yeast Extract 2.5
pH finale 7.4±0.1
Glucose 1.0
Impiego
Agar Bios LL 15.0
Phenol Red Agar Base e Broth Base sono terreni contenenti
un indicatore di pH utilizzati per lo studio delle fermentazioni Preparazione
dei carboidrati rispettivamente con il metodo in terreno solido Sciogliere 24 g di Tryptic Glucose Extract Agar e 23.5 g di
e con il metodo in terreno liquido. Phenol Red Broth Base è Tryptic Glucose Yeast Agar in 1000 ml di acqua distillata
preparato in accordo alla formula raccomandata da AOAC e fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire
da ICMSF p per lo studio della fermentazione dei carboidrati ed autoclavare a 121
121°CC per 15 minuti.
minuti
con il metodo preparato da “International Committe on
Enterobacteriaceae"; Phenol Red Agar Base è preparato in pH finale 7.0±0,2.
accordo alla formula raccomandata da APHA.
Per l'identificazione e la classificazione delle specie
batteriche si fa spesso ricorso a prove biochimiche che ne
studiano il metabolismo glucidico.
88
Impiego Per le loro caratteristiche nutrizionali; per l'assenza di
inibitori, per la possibilità di essere supplementati con i
Tryptic Glucose Extract Agar e Tryptic Glucose Yeast Agar composti più svariati, i due terreni si prestano bene per
sono terreni d'uso generale raccomandati da APHA, ICMSF, l'isolamento dei patogeni, per lo studio dei microrganismi a
AOAC per il conteggio dei microrganismi con la tecnica crescita fastidiosa, per il mantenimento dei ceppi di
dell'agar germi, utilizzato in passato per la conta microbica collezione, per la preparazione di autovaccini, per
totale nel latte e prodotti lattiero caseari,
caseari Tryptic Glucose l'
l'esecuzione
i d ll' tibi
dell'antibiogramma.
Extract Agar è ora raccomandato da APHA insieme al
Tryptic Glucose Yeast Agar, solo per il conteggio dei Il sangue è l'additivo più comune per il Tryptic Soy Agar e
microrganismi nelle acque e negli alimenti, Tryptic Glucose viene aggiunto a concentrazioni variabili tra il 5 e i115%
Yeast Agar, corrispondente al Plate Count Agar (Standard come sangue defibrinato (di coniglio, cavallo, montone,
Methods Agar) di APHA, AOAC, ICMSF, è il terreno uomo).
d'elezione per il conteggio dei microrganismi aerobi e di
quelli anaerobi facoltativi eterotrofi, nell'acqua, latte, prodotti In alcuni casi (isolamento di Neisseria e di Haemophilus) il
lattiero caseari, alimenti. sangue viene aggiunto come tale al terreno e poi riscaldato
a 80°C per 10 minuti ottenendo così l'agar cioccolato.
Lo schema di lavoro da seguire per effettuare la conta
microbica
i bi su ciascun i tipo
i di materiale
i l deve
d essere il più
iù Tryptic Soy Agar è comunemente usato per il conteggio dei
possibile conforme a quanto raccomandato dagli organismi germi presenti nelle urine e negli espettorati ed in
ufficiali citati. Il metodo dell'APHA consiste nel preparare microbiologia alimentare per la conta dei microrganismi
diverse diluizioni del campione in esame; a 1 ml di ciascuna presenti nel latte, carni, alimenti conservati, ecc.
diluizione in piastre Petri viene aggiunto in duplicato uno dei Tryptic Soy Broth è utilizzato per la coltivazione di
due terreni al 44-46°C. Dopo aver mescolato l'inoculo con microrganismi aerobi, aerobi facoltativi, inclusi alcuni
agar si incuba per 48 ore a 32-35°C e quindi si contano le funghi e, aggiunto d'agar a concentrazioni 0.1-0.2% per la
colonie coltivate, in quelle piastre in cui siano presenti da 30 coltivazione degli anerobi obbligati.
a 300 colonie. Per il conteggio di microrganismi che
richiedono altre temperature di crescita si incuba a 5-7°C per
10 giorni a 20°C per 3-5
3 5 giorni e a 45°C per 2-3
2 3 giorni.
giorni
TRYPTIC SOY AGAR

Tryptic Casein Bios D 15
Soy Peptone 5
SQdium Chlbride 5
Agar'Bios LL 15
TRYPTIC SOY BROTH

Tryptic C~sein Bios D 17.0
Soy PeptoÌle 3.0
Sodium Ch.foride 5.0
Dipotassium Phosphate 2.5
Glucose 2.5
Preparazione
Sciogliere 40 g di agar e 30 g di brodo in 1000 ml di acqua
distillata fredda.
fredda Portare all
all'ebollizione
ebollizione sotto agitazione,
agitazione
distribuire e autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 7.3±0.2.
Impiego
Tryptic Soy Agar e Tryptic Soy Broth sono terreni d'uso
generale che supportano la crescita di una larga varietà di
microrganismi.
89
BIBLIOGRAFIA
Sergio Campari Guida al laboratorio di microbiologia Zanichelli, Milano 1992
Pitzurra/Franceschini Elementi di microbiologia Galeno, Perugia 1981
M.G. Fiorin Microbiologia Edi-Ermes, Milano 1993
Seeley Vandemark Laboratorio di microbiologia Zanichelli, Bologna 1995
Quagliarini Vannini Chimica delle fermentazioni Zanichelli Bologna 1995

Zanichelli,
Manuale Biolife Milano, 1982
Manuale Oxoid Milano, 1979
Manuale Pbi Omnialab Milano 2001
Catalogo Carlo Erba Milano 1998
90

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ISTITUTO TECNICO PER ATTIVITÀ SOCIALI

Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni

1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI

3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

U.D. 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

• REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA

Sull’etichetta dei reagenti sono riportati:

Tossico: sostanza chimica che Infiammabile: qualsiasi sostanza

Materiale ossidante: sostanza in Esplosivo: materiale che produce un

Corrosivo: sostanza chimica Irritante: materiale non corrosivo che

Le finalità di queste tecniche sono:

Una “coltura pura” è costituita solo da una specie di microrganismo.

- usare terreni e attrezzature sterili

INCUBAZIONE DELLE COLTURE

160° per 60’

TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN

Temperatura Pressione (atm) tempo (minuti)

110 0,5 150

125 1,35 6,5

c) cappa a flusso laminare

USO DEL MICROSCOPIO

PRECAUZIONI D’USO DEL MICROSCOPIO

CAPPA A FLUSSO LAMINARE

PRECAUZIONI D’USO DELL’AUTOCLAVE

Esistono due fattori critici per la riuscita del processo:

CONTACOLONIE DIGITALE QUEBEC

Distribuire in provettoni con tappo metallico

3 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.

4 Piastrare in ambiente sterile.

(2a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI

a) una piastra con 0,1ml di acqua, una con 0,1ml di

1 b) una piastra appoggiando delicatamente i

c) una piastra lasciandola aperta per circa 20-30’

d) una piastra con 0,1 ml di sospensione di terriccio

- lasciare una piastra senza seminarla come prova in bianco

2 Incubare le piastre capovolte a 37° C per 48 h.

1 Osservare le colonie formatesi e descriverle in relazione a:

b) forma puntiforme rotonda lenticolare irregolare rizoide filamentosa

e) superficie liscia rugosa lucida opaca

f) consistenza compatta sfaldabile pastosa mucosa

Disegna ciò che hai osservato

U.D. 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

Blu di metilene 1%:

1 Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale

Distendere il materiale su un vetrino dove era stata

Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura

(2a FASE) colorazione

Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per

Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,

I più comuni tipi morfologici dei batteri

cocchi streptococchi stafilococchi diplococchi

bastoncelli vibrioni spirilli

1 Deporre una goccia di nigrosina su un vetrino

Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale

Distendere uniformemente il materiale sul vetrino

(2a FASE) osservazione al microscopio

1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,

Preparazione soluzione di safranina:

1 Preparare delle provette con 16-18 ml di agar al

2 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.

3 Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare.

Incubare a 35° per 18-24 h.