Le colture cellulari

Il laboratorio adibito alla preparazione e propagazione delle colture cellulari deve necessariamente essere situato in strutture tali da consentire la riduzione dei rischi di contaminazioni esterne.
Idealmente, un laboratorio di questo tipo dovrebbe essere completamente isolato, quindi in ambienti in cui laria filtrata con filtri ad elevata efficienza (HEPA: high efficiency particulate air) ed in pressione positiva; lingresso agli estranei dovrebbe essere limitato e il movimento del personale che in esso opera ridotto.

Nella realt pratica, i laboratori di colture cellulari sono generalmente provvisti solo parzialmente di quanto ritenuto ottimale e possono supplire ad eventuali carenze strutturali mediante il ricorso a particolari attrezzature e allapplicazione di norme igieniche molto accurate.

VIE DI TRASMISSIONE
Le pi frequenti vie di trasmissione durante lattivit di laboratorio sono: lingestione accidentale (per via orale), linalazione (per via aerea), linoculazione (ferite con oggetti taglienti e punture accidentali), la contaminazione della cute o delle mucose (cute con ferite o lesioni). Per es. la presenza di animali di laboratorio pu comportare unesposizione attraverso tutte queste vie di trasmissione per passaggio degli agenti patogeni ai lavoratori, mediante sangue, urine, feci.

In ogni caso buona norma:

pulire i banchi di lavoro con adatte soluzioni detergenti e disinfettanti allinizio ed al termine di ogni manipolazione di agenti biologici; mantenere porte e finestre chiuse, ridurre al minimo gli spostamenti degli operatori e la presenza di eventuali visitatori durante la manipolazione delle culture; evitare di pipettare con la bocca qualsiasi materiale biologico, utilizzando gli appositi sistemi di aspirazione automatici o manuali; etichettare ogni singolo contenitore in modo da risalire con estrema facilit al suo contenuto anche a distanza di tempo; utilizzare camici, guanti e proteggere viso ed occhi con appositi dispositivi di protezione individuale durante tutte le operazioni che possono in qualche modo provocare schizzi o produzione di aerosol; prima di utilizzare ogni apparecchio leggere il manuale di istruzioni e non utilizzare apparecchiature elettriche non a norma; in presenza di bombole di gas compresso assicurarsi che siano ben ancorate; tenere distinti i camici dagli abiti comuni; lavarsi le mani dopo aver manipolato materiale biologico o animali, anche se si sono indossati i guanti protettivi, prima di uscire dal laboratorio ed in ogni caso al cessare dellattivit lavorativa; nellaria di lavoro non si deve mangiare, bere, fumare, n applicarsi cosmetici; conservare eventuali alimenti in frigoriferi appositamente dedicati e collocati al di fuori dellarea di lavoro; tutte le soluzioni ed i rifiuti devono essere opportunamente decontaminati prima delleliminazione e devono essere smaltiti secondo le disposizioni vigenti in materia.

Inoltre: consultare le schede di sicurezza per valutare le caratteristiche chimico-fisiche della sostanza da utilizzare e stabilire le procedure pi idonee per lutilizzo in sicurezza delle sostanze e dei preparati presenti in laboratorio; conservare in laboratorio solo i quantitativi di sostanze pericolose, necessari per lattivit giornaliera; non lavorare mai soli in laboratorio, specialmente fuori dai normali orari di lavoro ed in caso di operazioni complesse e pericolose; non lasciare mai senza controllo reazioni chimiche in corso; usare sempre le sostanze pericolose sotto cappa con sufficiente aspirazione; preparare ed usare sempre i quantitativi minimi necessari di sostanze e preparati, per evitare sprechi, rischi maggiori per chi lavora, inquinamento allambiente con lo smaltimento di quanto non si utilizzato.

PERICOLO: PERICOLO la capacit di una sostanza o agente biologico di causare un danno

RISCHIO: RISCHIO la probabilit che una sostanza o un agente biologico possano essere dannosi in circostanze specifiche

Sostanza esplosiva: sostanza che pu andare incontro ad un violento cambiamento di stato con rapidissima produzione di una grande quantit di calore e di gas. Sostanze esplosive sono ad esempio l'acido picrico e diversi composti organici nitrurati, la loro vendita soggetta a controlli e restrizioni. Numerose sostanze infiammabili possono dare origine ad esplosivi se mescolate con sostanze comburenti. Sostanza radioattiva: materiali contenenti isotopi radioattivi, cio atomi che emettono particelle alfa o beta e raggi gamma. Esistono norme estremamente severe riguardanti la loro conservazione, manipolazione e smaltimento. Gli operatori devono essere muniti di opportuni dosimetri personali e gli ambienti in cui si opera devono essere attrezzati per evitare ogni eventuale fuga.

Sostanza tossica, pu provocare la morte: sostanze che a seguito di ingestione, inalazione o contatto con la pelle possono provocare avvelenamenti gravi e /o mortali. Vanno maneggiate con molta cautela, quando non impiegate debbono essere conservate in ambienti chiusi a chiave, sui loro contenitori deve essere bene in vista l'indicazione della pericolosit.

Sostanza comburente od ossidante: sostanze che, a contatto con materiali infiammabili ne provocano o ne mantengono la combustione fornendo l'ossigeno necessario, ad esempio una miscela di zucchero e nitrato di potassio brucia in modo molto energico. In qualche caso possono anche formare miscele esplosive. Sono sostanze comburenti ad esempio: nitrati, clorati e perclorati, acido nitrico concentrato. Vanno conservate con cura, lontano da sostanze infiammabili, se si debbono mescolare con una di queste ultime bisogna procedere con la massima cautela.

Sostanza corrosiva: sostanze che esercitano azione distruttiva sui tessuti vivi e sulle attrezzature (acidi e basi forti concentrati, ad esempio). Evitare assolutamente il contatto con la pelle, gli occhi e la bocca. Nel caso usare occhiali e guanti protettivi, se si tratta di sostanze volatili operare sotto cappa aspirante.

Sostanza nociva (Xn): sostanze che ingerite o inalate provocano, nell'immediato, danni limitati, in alcuni casi per un'esposizione prolungata pu provocare danni gravi od avere anche effetti letali (esempio: solventi clorurati). E' necessario seguire le prescrizioni riportate sulle etichette e seguire le indicazioni date per l'uso. Sostanza irritante (Xj): sostanze che possono provocare reazioni infiammatorie od allergiche in seguito a contatto con la pelle. E' necessario seguire le prescrizioni riportate sulle etichette e seguire le indicazioni date per l'uso. Sostanza infiammabile: sostanza che, in presenza di un comburente (solitamente l'ossigeno dell'aria) pu dare origine ad una reazione di combustione pi o meno violenta, in genere perch si sviluppi la combustione necessaria oltre alla presenza della sostanza infiammabile (combustibile) e della sostanza che con essa reagisce (comburente) anche una piccola energia di attivazione che avvia la reazione. Le sostanze infiammabili vanno maneggiate in ambienti in cui non siano presenti fiamme libere o fonti di scintille elettriche. Contaminazione biologica: pericolo di contaminazione da colture batteriche o cellulari, simbolo presente in laboratori di microbiologia,virologia e citologia. Da osservare che il pericolo di contaminazione a doppio senso: l'operatore pu essere contaminato da batteri o virus in coltura, d'altro canto il medesimo operatore pu contaminare colture con i batteri presenti sulla proprio pelle o nel proprio fiato.

COLTURE CELLULARI: COME SI LAVORA?

Le colture cellulari richiedono: ambiente sterile elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, sali minerali) fattori di adesione, presenti nel siero fattori di crescita, presenti nel siero stabilit di pH e temperatura

MANTENIMENTO DI UN LABORATORIO PER COLTURE CELLULARI Requisito indispensabile AMBIENTI STERILI

CAPPE BIOLOGICHE Ambienti isolati e separati per le singole attivit: preparazione terreni, isolamento cellule, mantenimento cellule in coltura, ecc. Procedure asettiche Materiali sterili e mantenuti in condizioni sterili Superfici non porose e facilmente lavabili Rapida eliminazione dei rifiuti

Gestione dell'area sterile

La pulizia e la perfetta efficienza dell'area sterile devono essere controllate costantemente. Si accede e si lavora indossando i dispositivi di protezione individuali (camice), i guanti protettivi (da cambiare spesso). I rifiuti biologici e chimici, solidi e liquidi prodotti nel laboratorio, devono essere raccolti, separati ed eliminati in modo corretto. I piani di lavoro devono essere mantenuti puliti, inoltre occorre controllare e mantenere la pulizia, il buon funzionamento e l'efficienza dei vari strumenti (microscopio, pipettatori automatici, cappe a flusso laminare, incubatori, bagno termostatato, frigorifero, ecc).

ATTREZZATURE PRINCIPALI Cappa a flusso laminare Incubatore a CO2 Microscopio ottico Autoclave Centrifuga Bagno ad acqua Frigo-congelatore Bidone per azoto liquido

Laboratorio di Coltura Cellulare

Spazio o area di lavoro Cappa a flusso laminare Abbigliamento da laboratorio Vetreria e plastica di laboratorio Reagenti colturali

CAPPE BIOLOGICHE A FLUSSO LAMINARE

Flusso daria unidirezionale formato da filetti di aria sterili paralleli che si muovono alla stessa velocit in tutti i punti creando una corrente daria omogenea senza turbolenze Fronte daria sterile che trascina lontano dalla zona di lavoro ogni contaminante creando un ambiente sterile Si ottiene combinando un filtro assoluto (HEPA) con una massa daria che lo attraversa alla velocit costante di 0,45 m/sec

Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air):

costituito da un sottile foglio a base di fibre di vetro submicroniche montato in un telaio di alluminio o di legno ha un efficienza del 99.999% su particelle di 0,3 micron

CAPPE BIOLOGICHE A FLUSSO LAMINARE

Proteggere solo il campione dalla contaminazione: cappa a flusso laminare orizzontale Proteggere sia il campione che loperatore: cappa a flusso laminare verticale Proteggere campione, operatore e ambiente (mat. patogeno): cappe contro il rischio biologico (Biohazard) Per le colture cellulari si utilizzano CAPPE A FLUSSO LAMINARE VERTICALE

A, C, E

Filtri HEPA

Cappa a flusso laminare di classe II

 Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologiche. Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni allinterno della camera sono consentite da due o pi guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sullaria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sullaria in uscita Protezione totale delloperatore e dellambiente Manipolazioni ad alto rischio biologico

Mantenimento delle condizioni fisico-chimiche di una coltura

Allinterno dellorganismo, le funzioni vitali (nutrizione, controllo di pH, protezione, mantenimento della temperatura,) sono regolate nei tessuti da differenti sistemi di controllo. Una volta che le cellule sono nel terreno di coltura, alcune funzioni devono essere mantenute con laiuto di strumenti.

Condizioni fisico-chimiche
pH 7.2-7.4 Sistema tampone (NaHCO3) Temperatura 35-37 C

Condizioni fisico-chimiche
Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dellorganismo vivente. Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37 C, per certi tipi di cellule lincubatore deve poter essere regolato in modo preciso anche a 30 C o 34 C.

Condizioni fisico-chimiche
Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per mantenere costante il pH Il pH del terreno dipende generalmente dalla % CO2 nellincubatore La concentrazione di CO2 richiesta pu andare da 0.5% a 8.5% in funzione del contenuto di NaHCO3 nel terreno utilizzato e del pH desiderato

Relazione tra [NaHCO3] e il pH

Condizioni fisico-chimiche
In alcuni casi si pu incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita.
rosso-arancio a pH 7.3

Rosso Fenolo

rosso-viola a pH alcalino giallo-arancio a pH acido

La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata allinterno dei tessuti (35-45 mmHg, equivalgono al 4.6 - 5.9% di CO2).

Cos lincubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

INCUBATORE: FUNZIONI PRINCIPALI

Mantenimento temperatura Mantenimento grado di umidit Mantenimento del pH Protezione dalle contaminazioni

MANTENIMENTO TEMPERATURA Le cellule possono sopportare lipotermia (si conservano congelate), ma la loro attivit metabolica notevolmente disturbata. Le cellule non possono sopportare lipertermia: anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi possono causare la morte.

Temperatura costante di 37 C

MANTENIMENTO GRADO DI UMIDITA Lobiettivo limitare levaporazione dellacqua contenuta nei terreni di coltura per non provocare un aumento nella pressione osmotica incompatibile con la vita delle cellule. In un incubatore a CO2 il parametro della temperatura direttamente collegato con lumidit relativa (RH%).

Nei migliori incubatori RH >98%

MANTENIMENTO DEL pH
Il metabolismo attivo delle cellule in coltura produce grandi quantit di ioni H+ che provocano, in poche ore, una eccessiva acidificazione del terreno di coltura, se non viene aggiunto un tampone (di solito carbonato/bicarbonato). Il sistema tampone interviene soltanto verso la conclusione del periodo di coltura, quando il metabolismo delle cellule ha prodotto ioni H+ sufficienti a provocare la riduzione del pH. La presenza della CO2 permette al sistema tampone del terreno di mantenere la sua efficacia (potere tamponante): infatti diminuendo la pressione della CO2 lefficacia del tampone si riduce del 75% in meno di 5 minuti (cambio di colore dellindicatore presente nel terreno). Allinterno dellincubatore c una pressione pCO2 pari al 5% che corrisponde alla pCO2 cellulare misurata allinterno dei tessuti.

PROTEZIONE DA CONTAMINAZIONE DELLINCUBATORE Solo introduzione di contenitori in polistirene contenenti cellule in coltura Solo utilizzo di acqua sterile e trattata con benzalconio cloruro Suo utilizzo solo dopo avere effettuato il ciclo di sterilizzazione interno che dura 24 ore

CELLULE IN MONOSTRATO NECESSITANO DI UNA SUPERFICIE DI SUPPORTO PER ADERIRE E CRESCERE

Capsule di Petri Piastre multi-pozzetto (da 6, 12, 24 o 96 pozzetti) Fiasche con tappo a vite (T-25, T-75 classificate in
base alla loro area superficiale espressa in cm2) Esistono anche le fiasche con tappo a filtro (capacit filtrante fino a 0,2 micron) che regola gli scambi gassosi e protegge da contaminazioni batteriche e spore. CONTENITORI IN POLISTIRENE (con superficie inerte o specificamente trattata): il polistirene capace di legare i fattori di adesione presenti nel siero. Ladesione cellulare avviene tramite interazione tra recettori di membrana (integrine) con le proteine adesive adsorbite sulla superficie della piastra.

Plastica per coltura

Generalmente in polistirene:
materiale rigido con superficie lucida buona resistenza chimica a soluzioni acquose limitata resistenza a solventi totale assenza di tossicit per le cellule in coltura trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio - la superficie trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero) -

Piastre da coltura
In commercio sono disponibili piastre per colture cellulari e piastre per batteriologia (queste utilizzabili anche per la coltura di cellule in sospensione). Sono tutte in polistirene, ma la superficie delle piastre da coltura trattata chimicamente in modo da renderla idrofila e carica negativamente: il polistirene , in tal modo, capace di legare i fattori di adesione.

Efficienza di semina
- Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densit non crescono in modo efficiente - Regola generale: densit > 104 cellule/cm2

Tempo di duplicazione
- La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione - Il tempo impiegato per ogni duplicazione caratteristico di ogni linea cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-30 ore per le cellule umane

Piastre

Tipi di piastre
Diametro (mm) 35 60 100 150 Superficie (cm2) 8 21 55 148 Volume (ml) 1-2 4-5 10-12 20-30

Multi-well

Tipi di multi-well
Multi-well Superficie (cm2) 96 48 24 12 6 0,32 1,0 1,88 3,83 9,40 Volume (ml) 0,1-0,2 0,3-0,6 0,5-1,2 1,0-2,4 2.0-3,0

Fiasche

Tipi di fiasche
Fiasche Superficie (cm2) 25 75 150 175 225 Volume (ml) 5-10 15-25 30-50 35-60 45-70

T-25 T-75 T-150 T-175 T-225

Preparazione del "cocktail" di coltura Le cellule vengono coltivate in appositi substrati di coltura, che possono avere dimensioni differenti. Ogni substrato caratterizzato da un valore ottimale di densit cellulare, e pertanto, una volta determinata la densit della sospensione iniziale di cellule, si calcola la diluizione da realizzare per ottenere la densit desiderata.
Piastra 90 mm 60 mm 20 mm 12 pz 24 pz 96 pz cellule 6x106 3x106 1x106 5x105 2.5x105 8000/15000

TERRENI DI COLTURA
Mistura di:

1.nutrienti: principalmente carboidrati, aminoacidi,

vitamine, acidi grassi e lipidi, proteine e peptidi

2.sali inorganici 3.antibiotici a largo spettro: penicillina (inibisce

lultima fase della sintesi della parete cellulare batterica) e streptomicina (blocca la sintesi proteica) 4. sistema tampone: carbonato/bicarbonato; HEPES. 5. indicatore del pH (per monitorare lo stato del terreno): di solito ROSSO FENOLO rosso (normale): pH 7,2-7,4 arancio: pH acido viola: pH basico

6. Siero: funziona da tampone favorisce ladesione fornisce nutrienti aggiuntivi, fattori di crescita e proteine plasmatiche apporta circa 5 mg di proteine per ml (10% FBS)
Esistono diversi tipi di sieri: FBS siero bovino FCS siero vitello HS siero equino
Viene inattivato al calore= scomplementazione a 57C per 30

Percentuale di siero aggiunta ai terreni 1%-10%-20%

La crescita delle cellule in vitro viene assicurata dalla presenza di elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, sali minerali) e fattori di crescita (presenti nel siero)

Terreni per colture

I terreni usati per le colture cellulari (BME; MEM; DMEM; ) differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi e sali, e per la concentrazione di glucosio. La composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta produttrice. Per la crescita, le cellule richiedono un valore di pH del mezzo compreso tra 7.2 e 7.4. Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo pi ad incubatori con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 e terreni contenenti NaHCO3. In soluzione acquosa il bicarbonato dissocia va incontro ad idrolisi (tende a riformare lacido debole di partenza). La CO2 presente nellincubatore tende a controbilanciare questo aumento, mantenendo cos il giusto pH del terreno.

Medium di coltura
I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule I pi comuni terreni base di coltura: - MEM: Minimum Essential Medium - DMEM: Dulbeccos modification of MEM - RPMI: Roswell Park Memorial Institute differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

Medium di coltura Sali inorganici

Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di sodio

Medium di coltura Vitamine

Agiscono come catalizzatori o come substrati per facilitare o controllare alcune funzioni metaboliche

Biotina Pantotenato Acido folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12

Medium di coltura Amminoacidi-isomeri L

Alanina Arginina Asparagina Acido aspartico Cisteina Glutamina Acido glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Necessari per la sintesi delle proteine

Medium di coltura Zuccheri Glucosio

Rappresenta la principale fonte di energia o di carbonio per le biosintesi

Medium di coltura
Il terreno base viene conservato a 4 C e, prima di essere utilizzato, viene completato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento pi comune delle colture cellulari)

SIERO
Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi, glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso pi comune il siero fetale di bovino (FBS)

SIERO

Principali terreni di coltura

Soluzioni saline bilanciate
PBS Hanks BSS DPBS Formano la base dei terreni complessi

Terreni base
MEM (Minimal essential medium) Colture primarie e cellule diploidi DMEM (Dulbeccos modified MEM) Maggiori livelli di vitamine e aminoacidi supporta un gran numero di tipi cellulari

Terreni complessi
RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium) Inizialmente usato per cellule di leucemia supporta un gran numero di tipi cellulari Iscoves DMEM Favorisce la crescita ad alta densit Leibovitz L-15 Adatto per atmosfera a bassa CO2

Terreni senza siero

Ham F10 Necessitano dellaggiunta di specifici supplementi Ham F12 (transferrina, insulina, EGF) e contengono HEPES

Per osservare le cellule vive in vitro si utilizza comunemente

il microscopio ottico invertito:

obiettivi e oculari posti sotto il tavolino porta-oggetti lampada di illuminazione e condensatore posti sopra
E possibile osservare cos le cellule anche se queste sono allinterno di recipienti con pareti spesse

Espansione e Mantenimento
Espansione: processo che porta allaumento del numero di cellule disponibili con la perfetta conservazione delle caratteristiche bio-funzionali delle cellule. Dopo una fase di espansione corretto considerare la cellule come archiviabili in una parte della cell bank. Mantenimento: processo che porta allaumento del numero di cellule disponibili allo scopo di fornirle al gruppo di ricerca che le ha richieste. Il processo di mantenimento unicamente finalizzato al sacrificio sperimentale delle cellule e non alla loro rearchiviazione. E pertanto consentito utilizzare procedure non convenzionali nella fase del mantenimento (divisioni meno frequenti oppure concentrazioni di siero pi basse).

Espansione di linee cellulari aderenti

Quando le cellule raggiungono quasi il 90-100% di confluenza e sono in buono stato vengono staccate e divise in due aliquote ed opportunamente ripiastrate in due nuove fiasche Le cellule, dopo 2 lavaggi in PBS sterile, possono essere staccate mediante: Tripsinizzazione: si incuba con tripsina (0.25%) per 2-5 min a 37 C. Le cellule vengono ulteriormente distaccate dal supporto manualmente, percuotendo la fiasca e la tripsina viene neutralizzata mediante aggiunta di terreno di coltura che contiene siero fetale bovino inattivato. La sospensione cellulare divisa in 2 nuove fiasche. Aggiunta di EDTA 0.04%: si aggiunge EDTA, che chelando il Ca++ facilita il distacco manuale delle cellule. Dopo aggiunta di terreno di coltura e centrifugazione a 1000 rpm per 5 min il pellet risospeso in terreno fresco e ripiastrato in 2 nuove fiasche.

Protocollo di tripsinizzazione
Trasferire la sospensione in una provetta e centrifugare 5 min a 900-1000 giri al min Aspirare il sovranatante Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule Distribuire nelle nuove piastre

Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidit in modo da tenere le cellule fuori dallincubatore il minor tempo possibile

RACCOLTA E SEMINA DELLE CELLULE

Raggiunta il 90% di confluenza le cellule devono essere raccolte e trasferite in nuove piastre (semina) OPPURE devono essere congelate (crioconservazione) la TRIPSINA un enzima che distrugge le connessioni proteiche, sia fra le cellule sia fra le cellule e la superficie a cui sono adese lEDTA un chelante del calcio, talvolta, richiesto da alcune molecole di adesione le quali facilitano le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice

Espansione di linee cellulari in sospensione

Controllare al microscopio che le cellule siano in buona salute (quando le colture sono troppo concentrate il terreno appare giallo-arancio) Contare le cellule e calcolare una divisione tale che la concentrazione finale sia di 1-2 x 105 cellule/ml, a meno che la linea non richieda concentrazioni diverse Trasferire la coltura in fiasche pi grandi, se necessario Incubare a 36-38C per 2-3 giorni

PROCEDURA PER IL DISTACCO E LA SEMINA CELLULARE

si aspira il terreno dalla fiasca si effettuano 2-3 lavaggi con PBS senza calcio e magnesio (per rimuovere tracce di siero che inattivano la tripsina) si aggiunge la soluzione di TRIPSINA/EDTA e si agita per alcuni secondi si lascia in incubazione per 2-5 min a 37 C si controlla al microscopio per vedere quando le cellule iniziano a diventare tondeggianti e a staccarsi (per evitare una sovraesposizione dannosa allenzima) si interrompe lazione proteolitica dellenzima aggiungendo terreno completo di siero che induce inattivazione si raccoglie la sospensione

La tripsina un enzima, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizza il taglio proteolitico con specificit per l'arginina e la lisina. Nel sito attivo presenta una sequenza specifica che prende il nome di triade catalitica, ovvero Ser195-His57Asp102. Questi residui amminoacidici, nonostante siano distanti nella struttura primaria, si trovano vicini nella struttura terziaria della proteina. Il substrato della tripsina rappresentato da una proteina basica. Il pH ottimale per l'attivit catalitica della tripsina in un range tra 7 e 9; in realt ha attivit catalitica anche ad altri pH ma l'idrolisi mediata da tale proteasi, a pH differenti da quello ottimale, risulta pi lenta.

CONTA DELLE CELLULE

Essenziale per una crescita ottimale Densit di semina troppo bassa troppo tempo per arrivare a confluenza (possibile morte) Densit di semina troppo elevata si arriva a confluenza troppo rapidamente (risultati sperimentali non riproducibili perch la tripsina pu alterare proteine di superficie, compresi i recettori per i farmaci, che hanno bisogno di tempo per rigenerarsi) Si effettua con la CAMERA DI BURKER: vetro spesso in cui ricavata una camera capillare grigliata costituita da 9 larghi quadrati delimitati da linee triple ciascuno contenente 16 quadrati piccoli

Conta cellulare
Diversi metodi: contatori automatici (contator coulter), ma un metodo semplice ed economico luso dellemocitometro o

camera di Burker
La camera costituita da un vetro in cui ricavata una camera capillare; la parte superiore della camera costituita da un vetrino bloccato lateralmente.

Camera di Burker

Questa costituita da un vetro spesso, in cui ricavata una camera capillare, la parete superiore della camera costituita da un vetrino bloccato da due graffe laterali. Al microscopio diventano evidenti una serie di linee ortogonali tra loro, che definiscono una serie di aree e, quindi, di volumi.

Camera di Burker

Conteggio delle cellule

Per effettuare il conteggio: dopo aver pulito la camera, montata correttamente, depositato un dato volume di cellule, al microscopio si contano le cellule presenti nei quadrati delimitati da una tripla barra e quelle presenti su due lati dello stesso quadrato (non si contano, invece, quelle su gli altri due lati).

a b c
cells/ml = (a+b+c)/3 x 104

Test di vitalit delle cellule

Per discriminare tra le cellule vive e quelle morte si ricorre alluso di Tripan blue (colorante che viene assunto solo dalle cellule morte). Le cellule vengono risospese in PBS, aggiunto il colorante e lasciate qualche minuto a temperatura ambiente. Si contano in camera di Burker. In tal modo si ricava la percentuale di cellule morte presenti nel campione esaminato.

Ciascun quadrato dell'emocitometro o camera di Burker con il coprioggetto in posizione ha un volume di 0,1 mm3 o di 10-4 cm3. Essendo 1 cm3 = a 1 ml, la concentrazione di cellule per ml sar determinata da:

Cellule/ml= conteggio medio per quadrato x 104 x fattore di diluizione

Punti cruciali
o Unadeguata accuratezza della misura si ottiene contando almeno 100 cellule o Il Trypan blue tossico ed un potenziale carcinogeno o Le cellule devono essere ben distinte e uniformemente distribuite o Evitare la presenza di bolle e detriti o Non riempire eccessivamente la camera o Se le cellule sono poche, operare una nuova centrifugazione e risospendere in meno terrreno

CENTRIFUGAZIONE
Una centrifuga uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravit terrestre. Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravit. Per ogni particella la velocit alla quale essa sedimenta proporzionale alla forza applicata, conseguentemente macromolecole in soluzione sedimentano pi velocemente quando la forza applicata maggiore di quella di gravit esercitata dalla terra.

Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione

Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocit di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densit, forma e dimensioni e quindi sedimentano con velocit diversa sotto linfluenza di un campo centrifugo applicato.

Una miscela di particelle eterogenee, approssimativamente sferiche, pu essere separata mediante centrifugazione, in base alla : 1. densit 2. dimensione delle particelle 3. tempo di sedimentazione 4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un periodo di tempo definito

1. Centrifugazione preparativa
permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare

2. Ultracentrifugazione analitica
utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati

Centrifughe preparative

Centrifughe da tavolo
Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0 Massima velocit (RPM): 13300 Massima accelerazione centrifuga

Ultracentrifuga analitica

Puo operare a velocita di 700.000 rpm (500.000 g) Il rotore e contenuto in una camera blindata, refrigerata e sottovuoto. Il rotore fatto in un materiale particolarmente resistente Es. TITANIO La sedimentazione controllata da un sistema ottico per consentire losservazione del materiale che va sedimentandosi

Accelerazione centrifuga
L accelerazione centrifuga definita campo centrifugo relativo (RCF) RCF = 1.118r (n/1000)2 r = raggio di rotazione n = velocit del rotore definita come numero di rivoluzioni per minuto

r.p.m = 945.7RCF/r

TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate)

Centrifughe a bassa velocit (max 3.000-6.000 g) si usano per raccogliere organelli di grandi dimensioni e precipitati grossolani. Microcentrifughe (10.000 g) sono capaci di accelerazioni rapide. Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule. Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre attraverso il rotore. Centrifughe ad alta velocit (max 60.000 g) utili per frazionamento cellulare. Ultracentrifughe (max 600.000 g) possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come i ribosomi e le vescicole di membrana.

Quando si riportano le condizioni di separazione di particelle necessario specificare la velocit del rotore, le dimensioni del raggio e il tempo di centrifugazione.
La velocit di sedimentazione dipende comunque anche 1) dalla massa della particella; 2) dalla densit del mezzo; 3) dalla forma della particella.

Questi parametri pratici ovviamente modificano lequazione teorica.

Coefficiente di sedimentazione
La velocit di sedimentazione (v) di una particella pu essere anche espressa in termini di velocit di sedimentazione per unit di campo centrifugo applicato, pi comunemente chiamato coefficiente di sedimentazione, s. Il valore sperimentale per il coefficiente di sedimentazione una funzione della temperatura, viscosit e densit della soluzione.

Centrifughe e loro utilizzo

Piccole centrifughe da banco
Generalmente la loro velocit massima tra 4.000 e 6.000 rev min1, per un campo centrifugo relativo variabile tra i 3.000 e i 7.000 g

Microcentrifughe
8.000-13.000 rev min1 pari a 10.000 g

Centrifughe refrigerate a grande capacit

6.000 rev min1

Centrifughe refrigerate ad alta velocit

25.000 rev min1

Frazionamento cellulare
Le cellule possono essere rotte in vario modo: shock osmotico, ultrasuoni, frantumandole per omogeneizzazione. Questi procedimenti rompono molte membrane ma lasciano intatti gli organuli che possono essere separati sulla base delle loro dimensioni e densit.

Metodi di separazione
Sedimentazione differenziale: la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

Centrifugazione in gradiente di densit

Si utilizza una soluzione la cui densit aumenta in gradiente Gradiente Continuo (a) Discontinuo (b) Una barriera di densit a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella (c)

Centrifugazione Isopicnica
Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come saccarosio, ficoll, percoll, glicerolo, destrano, ecc., creano dei gradienti durante la centrifugazione). Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti Le particelle sedimentano in funzione della loro densit (si posizionano dove la loro densit uguale a quella del mezzo)

Tipi di rotore
rotore basculante

Tipi di rotore
rotore ad angolo fisso

Rotore con provette verticali

Sono usati per la separazione isopicnica in gradiente di densit nelle centrifughe ad alta velocit e nelle ultracentrifughe Non si possono utilizzare per particelle in sospensione perch non si forma sedimento

Centrifuga
Separare le cellule dal liquido 300-350 g x 5-10 minuti laccelerazione per sedimentare le cellule senza danneggiarle Raccomandazioni: Localizzazione Bilanciamento Aereosol Rottura delle provette

Nomogramma e formula di conversione

Criopreservazione
Le linee cellulari possono essere criopreservate in azoto liquido a -196 C per oltre 10 anni senza significativi cambiamenti delle loro caratteristiche biologiche Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento

CRIOCONSERVAZIONE
Le cellule (ancora in fase logaritmica) possono essere conservate, per un utilizzo successivo, mediante congelamento e stoccaggio in azoto liquido (-196C) Tale processo noto come Crioconservazione Il congelamento pu provocare alterazioni letali allinterno delle cellule: 1) formazione di cristalli di ghiaccio 2) cambiamenti nella concentrazione di elettroliti 3) cambiamenti di pH Per minimizzare i rischi: agente crioprotettivo= DMSO DMSO (dimetil solfossido): abbassa il punto di congelamento prevenendo la formazione di cristalli

Conservazione delle cellule in azoto liquido

Per la conservazione delle cellule per lunghi periodi si ricorre alla conservazione in azoto liquido (-196 C). Il congelamento in azoto liquido mantiene le cellule vive in completa quiescenza per anni. Tramite congelamento, quindi, si pu costituire uno stock di cellule che mantengono le caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle cellule di partenza. Le reazioni enzimatiche cessano a 130 C circa.

Metodica di congelamento
Le cellule vanno raccolte nella fase logaritmica di crescita Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalit Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il sovranatante Medium di congelamento: Medium di coltura al 20% FBS + 10% DMSO Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio Aliquotare in criovials opportunatamente siglate

Iniziare il processo di congelamento

CRIOCONSERVAZIONE: PERCHE?
LA CONSERVAZIONE DELLE CELLULE PERMETTE DI: Creare banche di cellule Ridurre il rischio di aberrazioni geniche e morfologiche Ridurre il rischio di contaminazione microbica e di cross-contaminazione Utilizzare materiale che sia di qualit costante Condurre esperimenti usando colture dello stesso range di passaggi Mantenere le cellule in coltura solo quando necessario con riduzione di costi e tempo

Punti critici
Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo delle cellule Agenti crioprotettivi: DMSO, glicerolo. Proteggono la cellule dai danni indotti dalla formazione di cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento La lunga esposizione, a temperatura ambiente al DMSO pu danneggiare irreversibilmente le cellule Non necessario sterilizzare il DMSO, perch in forma pura letale per i batteri

Punti critici
Se la velocit di raffreddamento troppo bassa

La cellula esposta a concentrazioni crescenti di soluti cellulari dovute alla formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione

Alta concentrazione di soluti

Disidratazione

Variazioni di pH

Aumento della pressione osmotica

Punti critici
Se la velocit di raffreddamento troppo alta

Formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione che allinterno della cellula

Danno meccanico

Cristalli interni

Cristalli esterni

Distruzione della membrana cellulare

Esiste la velocit ideale?

Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare
la formazione di ghiaccio Il raffeddamento deve essere nello stesso tempo rapido per non danneggiare la cellula per disidratazione

Ottimizzazione della velocit: -1C/minuto

-1C/minuto
Utilizzo di freezer meccanici programmabili, ma molto costosi Utilizzo di contenitori di polistirolo seguito da trasferimento prima a -20 C e poi a -80 C Utilizzo di contenitori criostep

CRIOCONSERVAZIONE: PROCEDURA
Il congelamento deve essere lento: processo a stadi
ghiaccio -20 C -80 C azoto liquido

Lo scongelamento al contrario deve essere rapido:

il campione viene trasferito in un bagnetto termostatato a 37 C per pochi minuti si allontana lagente crioprotettivo, centrifugando e risospendendo le cellule in terreno fresco

PROCEDURA DI SCONGELAMENTO
1. Mettere la vail criocongelata nel bagnetto a 37 C 2. Pulire lesterno con alcool assoluto 3. Aprire la vial sotto cappa e trasferire il contenuto in una provetta sterile contenente 3-5 ml di mezzo completo 4. Centrifugare 5 min a circa 800-1000 g/min per eliminare il DMSO 5. Aspirare il sovranatante 6. Risospendere il pellet cellulare in terreno fresco 7. Seminare

Controllo contaminazione
Pur operando in condizioni di sterilit, lavorando con le colture cellulari c sempre rischio di contaminazione da parte di batteri, funghi, micoplasmi e virus. Mentre la contaminazione da batteri e miceti facilmente identificabile (provoca un intorbidimento del terreno), quella da virus e da micoplasmi pi difficile da identificare (tranne che si riscontri un effetto citopatico). Per ridurre il rischi di contaminazioni, perci, vengono aggiunti ai terreni da coltura degli agenti antibiotici (penicillina, streptomicina, kanamicina,) e antimicotici (anfotericina B,).

Procedure di sterilizzazione
Tutto il materiale utilizzato per lisolamento e la coltura delle cellule deve essere sterile, al fine di evitare contaminazioni di batteri o muffe che possano danneggiare le colture. Le soluzioni usate sono preparate con acqua sterilizzata mediante autoclavaggio e sono quindi filtrate con filtri sterili da 0.2 m. Il siero fetale viene inattivato tenendolo a una temperatura di 56 C per 30 e poi filtrato con filtri sterili da 0.2 m. Il materiale di consumo (piastre, tubi da centrifuga, pipette, filtri, siringhe ecc.) acquistato direttamente in confezioni sterili monouso. La sterilt della cappa assicurata dall'irraggiamento con raggi UV, generalmente effettuato per tutta la notte precedente allisolamento delle cellule.

LAVAGGIO E STERILIZZAZIONE

LE PROCEDURE DI LAVAGGIO E STERILIZZAZIONE SONO OGGI RIDOTTE AL MINIMO INDISPENSABILE GRAZIE ALLINTRODUZIONE DI PRODOTTI STERILI E DI MATERIALE MONOUSO E ASSOLUTAMENTE SCONSIGLIATO LUSO DI VETRERIA DA STERILIZZARE IN AUTOCLAVE (FIASCHE E PIPETTE) E CONSIGLIATO LUSO DI MATERIALE MONOUSO STERILE COME PIPETTE INCARTATE SINGOLE O FIASCHI E CAPSULE PETRI (SE CONSERVATE BEN CHIUSE DOPO LAPERTURA DELLA CONFEZIONE) I PRODOTTI FLUIDI SONO STERILIZZATI PER FILTRAZIONI CON MEMBRANE DA 0.22 m

data lubiquit dei microrganismi

STERILITA

Tecniche sterili o asettiche

Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi

STERILITA
Lunico modo di ottenere uno stato sterile mediante la distruzione o rimozione dei microrganismi. Esistono diverse metodologie

TRATTAMENTO CON CALORE AGENTI CHIMICI

RADIAZIONI FILTRAZIONE

Metodi di sterilizzazione
Sterilizzazione al calore rosso su fiamma Sterilizzazione al calore secco mediante lutilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160C per almeno 2 ore.Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante lutilizzo dellautoclave a 121 C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio dopo luso

Il trattamento con calore il sistema pi usato di sterilizzazione e comprende:

sterilizzazione al calor rosso, ottenuta scaldando anse di metallo, pinze, aghi, ecc. su un fiamma Bunsen, poich nessun microbo pu sopravvivere anche a una breve esposizione a una fiamma libera. sterilizzazione al calore secco, dove si usa un forno ad aria calda a una temperatura di almeno 160C per almeno 2 ore. Questo metodo si usa per la sterilizzazione di routine della vetreria di laboratorio. sterilizzazione al caldo umido, scelta per la maggior parte del materiale, compresa la maggior parte dei fluidi, esclusi i mezzi di coltura sensibili al calore. Viene anche usata per decontaminare mezzi liquidi e vetreria dopo luso. Per questi scopi si usa lautoclave da laboratorio. In genere la maggior parte del materiale sar sterile dopo 15 min a 121C. La rapida azione battericida deriva dal calore latente di condensazione del vapore pressurizzato, rilasciato al contatto con il materiale freddo allinterno dellautoclave.

Molti articoli monouso di plastica usati in microbiologia e in biologia cellulare vengono sterilizzati mediante esposizione a UV o a radiazioni ionizzanti. Questi sono forniti in pacchi sterili, pronti per luso. Le radiazioni ultraviolette hanno un uso limitato in laboratorio, mentre le radiazioni ionizzanti (ad es. i raggi ) richiedono strutture industriali e non possono essere utilizzate su scala di laboratorio. Le soluzioni labili al calore (ad esempio macromolecole complesse, comprese proteine, antibiotici, siero) sono particolarmente adatte alla sterilizzazione tramite filtrazione. I filtri esistono in una variet di forme, dimensioni e materiali, in genere con una dimensione dei pori o di 0,2 m o di 0,45 m.

Gli agenti chimici sono noti come disinfettanti e sono usati pi spesso per leliminazione di oggetti contaminati dopo luso, ad es. vetrini e pipette. Vengono usati anche per trattare versamenti. Il termine disinfezione implica la distruzione di cellule batteriche che provocano infezioni, anche se spore e virus non vengono sempre distrutti. I disinfettanti richiedono tempo per esercitare il loro effetto battericida: qualunque versamento deve essere coperto con un disinfettante appropriato e lasciato per almeno 10 min prima di asciugarlo.

TRATTAMENTO AL CALORE
Fiamma Bunsen

Autoclave

RADIAZIONI
Molti strumenti vengono sterilizzati mediante raggi UV e ionizzanti; questi sono forniti commercialmente in pacchi sterili, pronti per luso

350 800 nm

AGENTI CHIMICI
Utilizzati, soprattutto, per ripulire oggetti contaminati dopo luso, come vetrini e pipette.

Anche larea di lavoro deve essere sterile, pulita ed ordinata

Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni

Per prevenire le contaminazioni occorre seguire alcune regole: 1) i terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili; 2) si aggiunge penicillina-streptomicina per evitare contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le cellule) contro i miceti; 3) si destina un laboratorio solo alle colture cellulari; 4) si opera sempre sotto cappa a flusso laminare; 5) si utilizza solo materiale sterile (di vetro o di plastica); 6) si utilizzano pipettatori elettrici; 7) la cappa va pulita a inizio e fine lavoro; 8) i filtri della cappa vanno periodicamente controllati; 9) lincubatore va pulito periodicamente.

Contaminazioni
Micoplasma Cross-contaminazione

La morfologia indicatore dello stato della cellula

Presenza di contaminazioni

Durante la Stabilizzazione LINEA B

LINEA A

LINEA A

LINEA B

LINEA A

LINEA B

Metodi per svelare una cross-contaminazione Morfologia e pattern di crescita Immunofenotipo Identificazione di marcatori molecolari DNA Fingerprinting Cariotipo e analisi citogenetica

Contaminazione da micoplasma
Rappresenta il secondo grande problema nel campo della ricerca biotecnologica che si avvale delle colture cellulari

Micoplasmi
Rappresentano un grande gruppo di microorganismi caratterizzati tutti dalla mancanza di una parete cellulare rigida

MINIMUM CELL
Membrane Ribosomi Cromosoma

CARATTERISTICHE SALIENTI
Dimensioni estremamente ridotte: 0.3-0.8 m Filtrabili a 0.45 m Morfologicamente polimorfici Alta richiesta metabolica di vitamine, precursori di acidi nucleici, lipidi, acidi grassi ed aminoacidi Sono tutti commensali, parassiti oppure patogeni Le infezioni sono croniche e spesso difficili da diagnosticare La maggior parte formano colonie in agar

Frequenza della contaminazione

15-35% delle linee cellulari continue 5% delle colture cellulari a precoci passaggi 1% delle colture cellulari primarie

La presenza dei micoplasmi pu passare del tutto inosservata alloperatore e pu provocare cambiamenti profondi nel metabolismo e nelle propriet delle cellule

Cellule contaminate

Cellule colorate con Hoechst rivelano la presenza di micoplasmi

Effetti della contaminazione

Alterati livelli di sintesi di proteine, RNA e DNA Alterazione del metabolismo cellulare Induzione di aberrazioni cromosomiche Alterazione del pattern immunofenotipico Alterazione della morfologia cellulare Induzione o soppressione di citochine Interferenza con saggi biochimici e biologici Influenza sulla trasduzione del segnale Alterazione del pattern di crescita e della vitalit

Graduale degenerazione

PERDITA

Tassonomia dei micoplasmi

Classe Mollicutes

3 Ordini
Anaeroplasmatales Mycoplasmatales

Acholeplasmatales
Generi
Anaeroplasma Asteroleplasma

Generi Genere
Acholeplasma Mycoplasma Ureaplasma Spiroplasma

Comuni specie contaminanti

UOMO
M. Orale 20-40% M. Fermentans 10-20% M. Hominis 10-20% M. Arginini 20-30% M. Laidlawii 5-20%

BOVINO

MAIALE

M. Hyorhinis 10-40%

Sorgenti di contaminazione
M. Arginini 20-30% M. Laidlawii 5-20%

BOVINO

M. Hyorhinis 10-40%

MAIALE

SIERO

Sorgente di contaminazione
M. Orale M. Fermentans M. Hominis

Uomo

Personale del Laboratorio

Linee cellulari continue

Diventano la fonte principale di contaminazione grazie: alla generazione di minuscole gocce durante la manipolazione alla prolungata sopravvivenza del micoplasma in forma essiccata alla contaminazione dei reagenti utilizzati rappresentati soprattutto dal terreno colturale