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STERILIZZAZIONE CON GAS – ossido di etilene, βpropiolattone.

CH2 CH2
Ossido di etilene
O

Meccanismo d’azione: agente alchilante dei metaboliti cellulari, sostituisce i gruppi

OH , SH, COOH, con gruppi EtOH
Sterilizzazione di superficie, l’ossido di etilene ha poco potere penetrante.

Eur. Pharm. 7° Ed.- Il metodo di sterilizzazione con gas deve essere usato solo quando
non esiste un’alternativa idonea. E’ necessario assicurare la penetrazione del gas e
dell’umidità nel materiale da sterilizzare ed un processo di eliminazione del gas che non
lasci residui tossici di gas nel prodotto sterilizzato.

Gas tossico sottoposto a legge su gas tossici, R.D. 147/27 e succ. modifiche.

Massima concentrazione residua di ossido di etilene nel prodotto permessa < = 1 ppm.

La sterilizzazione con EtO è una reazione chimica con fattore Q10 ~ 2, poco influenzata da T

STERILIZZAZIONE CON ETO

La vel. di reazione dipende da:

Concentrazione ETO (250 e 1000 mg/l).

Umidità relativa

Temperatura

Tempo di esposizione

METODI DI STERILIZZAZIONE CON ETO:

In pressione con miscele di ETO non infiammabili

In depressione con ETO puro e sue miscele infiammabili

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Impianto: autoclave per sterilizzazione con gas

Parametri operativi
Pretrattamento – 60 minuti, 98% umidità, 45 – 55 °C
Eliminazione dell’umidità, vuoto 4,5 mm Hg
Trattamento - Introduzione della miscela sterilizzante EtO+ CO2 1:9, umidità
50-60%, tempo 6 -24 ore.
Evacuazione della camera – vuoto 3,27 mmHg
Quarantena – almeno 24 ore

Esempi di condizioni di esposizione a 55°C.

Composizione (%) Conc. O.E. (mg/ml) Pressione (bar) Tempi esp . (h)
10 O.E.; 90 CO2 450 1.9 6
20°.E.; 80 CO2 670 1.2 4
11 O.E., 54 CO2, 35 CO2 450 0.3 5
12 O.E.; 88 CHFCl2 650 0.5 4

Autoclave per sterilizzazione con ossido di etilene

Fasi operative
Riscaldamento intercapedine
Vuoto Pretrattamento
Umidificazione
Vuoto

Immissione gas Sterilizzazione

Scarico della miscela sterilizzante

Lavaggio con aria sterile a pressione

atmosferica

Fattori che influenzano il ciclo di sterilizzazione: pulizia delle superfici, occlusione da

microrganismi, velocità evacuazione camera.

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Impianto industriale per la

sterilizzazione con ETO

Sterilizzazione mediante
radiazioni ionizzanti

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Radiazioni ionizzanti: vibrazioni elettromagnetiche ad alta frequenza emesse da isotopi

radioattivi.
Raggi α, β , γ
Meccanismo d’azione: blocco della riproduzione dei microrganismi per formazioni di
mutazioni letali che causano la rottura del DNA cellulare.
Azione indiretta
Azione diretta

Radiazioni ad alta energia (ionizzanti)

Raggi β Raggi γ

Radiazioni particellari Radiazioni elettromagnetiche

Basso potere di penetrazione Elevato potere di penetrazione
Provocano un sensibile Non provocano il riscaldamento
riscaldamento del prodotto del materiale irraggiato
Tempo: 1 min Tempo: 6-24 h

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Radiazioni ionizzanti
Meccanismo di sterilizzazione

- Azione diretta:
le radiazioni inducono una ionizzazione del DNA nei
nuclei dei microrganismi

- Azione indiretta:
Formazione di radicali liberi che inducono reazioni
secondarie nel DNA

L’abbattimento della carica microbica è correlata alla dose assorbita

dal prodotto

STERILIZZAZIONE TERMINALE CON RADIAZIONI IONIZZANTI

Dose 25 kGy

BETA RAYS
GAMMA RAYS
Acceleratore
60Co source

- Bassa penetrazione -Elevata penetrazione

- Elevato rateo di dose -Basso rateo di dose

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Radiazioni Gamma

neutroni decadimento
COBALTO 59 COBALTO 60 NICKEL

FOTONE GAMMA
1.17 MEv FOTONE GAMMA
1.33 MEv

PARTICELLA
0.3 MEv

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Eur. Pharm. 7th Ed. - La sterilizzazione con questo metodo si ottiene esponendo
il prodotto a raggi gamma ottenuti da un idoneo radioisotopo (es. Cobalto 60) o
ad un fascio di elettroni (acceleratore di elettroni).
E’ un tipo di sterilizzazione terminale, la dose di riferimento è pari a 25 kGy,
possono essere usate altre dosi previa dimostrazione che la dose scelta porti ad
un livello di letalità adeguato e riproducibile nelle situazioni d’uso.

Vantaggi: Svantaggi
• Temperatura e pressione ambiente • Formazione di radicali liberi
• Utilizzabile in contenitori a barriera assoluta • Formazione di ozono
• Basso contenuto di residui • Formazione di prodotti di
degradazione
• Poche variabili di processo

Dose di Riferimento (dose assorbita) per sterilizzazione =

25 KGy per un SAL di almeno 10-6

La dose di riferimento di 25 kGy è calcolata seguendo il criterio dell’overkill per un PNSU pari a 10-6
(N0 = 106) su una popolazione microbica con D10 pari a 2,09.

dose(kGy) = D10 × (log N 0 − log N )

dose( kGy) = 2,09 × (6 + 6 ) = 25kGy

dose( kGy) = 1,7 × (6 + 9) = 25,5kGy

Microrganismo di riferimento come indicatore biologico di sterilizzazione: bacillus pumilus D10 = 1,7
kGy in conc. pari a 107 - 108

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DOSIMETRIA

a) Unità di dose assorbita (D) è il gray (Gy)

1 Gy = deposizione nel materiale irraggiato di una quantità di

energia pari a 1 J/Kg

1 Gy = 100 rad

b) Rateo di dose: Gy .sec-1 (kGy/h)

Dosimetri chimici

• Diretti • Indiretti
(in fase liquida e solida)
Calorimetro 1. routinari
2. di riferimento

Dosimetri diretti
Per via calorimetrica misurando
l’aumento di temperatura prodotto in
materiali che non subiscono
trasformazioni chimiche e nei quali
pertanto si ha la completa conversione
dell’energia radiante in energia termica
(polistirene)

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Dosimetri chimici in fase liquida e solida (indiretti, routinari)

Si misura la quantità di un prodotto della radiolisi dal quale si conosce la resa
radiolitica (G) espressa come numero di molecole formate per 100 eV di energia
assorbita

-Dosimetro di Fricke
soluzione acquosa 10-3 M di FeSO4 in 0,4 M H2SO4; G (Fe3+) = 15,5 per radiazioni γ da
Co60

Dose assorbita (Gy) = 2,94 x 100 x (1-0,007 x ∆T) x ∆A

Dove:
∆A = differenza di assorbanza, misurata a 304 nm in una cella da 1 cm, della soluzione
irradiata rispetto al controllo
∆T = differenza di temperatura tra quella di lettura e quella di riferimento (20°C)
0,007 = fattore di conversione del coefficiente di estinzione molare dello ione Fe3+ per la
temperatura
Radiazioni γ di energia intorno al MeV e per una dose assorbita in acqua o in materiali
equivalenti; per altri materiali si deve apportare la correzione per le diverse densità
elettroniche

Dosimetri chimici in fase liquida e solida (indiretti, routinari)

- Lastre o pellicole di polimetacrilato (PMMA) addizionate di un

colorante rosso che si scurisce proporzionalmente alla dose assorbita – aumento
di assorbanza dovuto alla variazione di colore (360 -640 nm)

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• Temperatura Dosimetri routinari

• Umidità
• Fading
• Rateo di dose
Dosimeter Material Form Readout Dose
method range
(kGy)
Red 4034 Dyed Perspex Strips (3 mm) Spectrometer 5 - 50
640 nm
Amber 3042 Dyed Perspex Strips (3 mm) Spectrometer 1 -30
603/651 nm

Radix Perspex Strips Spectrometer 5 -50

(1.5 mm) 315 nm

Gamma- Dyed Perspex Strips Spectrometer 0.1 - 3

chrome YR (1.5 mm) 530 nm

Dosimetri chimici in fase liquida e solida (indiretti, di riferimento)

- Dosimetro di alanina, nel quale si valuta l’intensità del segnale ESR (spettroscopia di
risonanza di spin elettronico) generato da radicali prodotti nella radiolisi dell’alanina che è
proporzionale alla dose assorbita

Dosimeter Form Readout Dose

method range
(kGy)
Ceric/Cerous Liquid in Spectrometer 1 - 100
glass ampoule 320 nm
Dichromate Liquid in Spectrometer 1 -100
glass ampoule 350/440 nm

Alanine Solid pellet Electron Spin 0,01 -100

Resonace

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Validazione del processo di irraggiamento

1. Scelta della Dose sterilizzazione ( ≤ dose sterilizzante) in base alle caratteristiche
del prodotto e performance dell’irradiatore

2. Qualifica del processo:

a. determinazione del carico: Il committente deve standardizzare le dimensioni e il
peso dei colli. Si studia la disposizione dei colli nel convogliatore che consente un
miglior sfruttamento dello spazio.
b. mappatura dosimetrica: si effettua per ogni tipo di collo e caricamento (almeno 3
mappature) sul volume occupato dal prodotto nel convogliatore

Determinazione sperimentale della zona “fredda” (dose minore)

e della zona “calda” (dose maggiore), nonché del rapporto di
uniformità (R.U.=Dmax/Dmin)
3. Compilazione della parte documentale:
- Validazione della sterilizzazione (descrive le fasi sperimentali e risultati ottenuti)
- Capitolato dell’Irraggiamento (descrive le specifiche di fornitura, clausole di
invariabilità, penali)

Validazione del processo di irraggiamento

Scelta della dose sterilizzante (validazione microbiologica) -

Metodo 1
Questo metodo si basa sulla verifica sperimentale che la risposta alla radiazione della
popolazione microbica presente su un prodotto è maggiore rispetto a quella della
popolazione standard.

Procedura

a. Misura quantitativa dell’inquinamento (Bioburden)

b. Definizione della dose di verifica (SAL = 10-2)
c. Irraggiamento alla dose di verifica di campioni
d. Test di sterilità sui campioni trattati
e. Analisi dei risultati

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a. Misura quantitativa dell’inquinamento

Il laboratorio di microbiologia misura l’inquinamento presente su 30 campioni scelti
a random da almeno 3 lotti consecutivi di produzione (10 pezzi per lotto)

b. Irraggiamento alla dose di verifica di campioni

Il laboratorio di microbiologia o l’irradiatore definisce la dose di verifica (SAL 10-2)
dai valori tabulati nella ISO 11137 (tabella in cui sono riportati le dosi di
irraggiamento necessarie per raggiungere un certo SAL in funzione del grado di
inquinamento)

c. Test di sterilità sui campioni trattati

L’irradiatore irraggia alla dose di verifica 100 campioni provenienti da uno dei tre
lotti precedenti (punto a) o un lotto immediatamente successivo. La dose effettiva
può variare dalla dose di verifica di +10% e la dose somministrata non deve
essere inferiore al 90% di quella calcolata.

Mappatura dosimetrica sui campioni trattati

d. Test di sterilità sui campioni trattati

100 campioni

e. Analisi dei risultati

Se i pezzi non sterili sono 0, 1 o 2 significa che la risposta alla radiazione della
popolazione microbica sul prodotto è maggiore rispetto a quella della popolazione
starndard. E’ quindi possibile estrapolare dalla tabella ISO 11137 il valore di dose
sterilizzante.
Se l’esperimento fallisce, ovvero il numero di test positivi è maggiore di 2, si ripete
la procedura o si cambia metodo.

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dose(kGy) = D10 × (log N 0 − log N )

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FILTRAZIONE STERILIZZANTE

Eur. Pharm. 7th Ed.- è una filtrazione che, tramite un opportuno test microbiologico,
si dimostra soddisfacente a produrre una soluzione sterile. I filtri sterilizzanti devono
avere porosità di riferimento pari a 0,22 µ.
Definizione FDA – Un filtro sterilizzante è quel filtro che dovendo filtrare una
sospensione contenente il microrganismo Pseudomonas Diminuta, alla conc. minima
di 107 ufc per cm2 di superficie filtrante, produrrà un effluente sterile
Lo Pseudomona Diminuta ATCC 19146 ha un diametro medio di 0,3 µ

Filtrazione di superficie, membrane filtranti con porosità

omogenea e standardizzata.

Materiale di costruzione : esteri di cellulosa, nylon, teflon,

polivinil cloruro, poliammide, polisulfone.
Parametri del filtro: pressione al punto di bolla, ∆P di progetto

Il sistema filtrante deve essere strutturato in modo da evitare contaminazioni

Tests di integrità di un filtro

Diffusion test
Test del punto di bolla

Pressione al punto di bolla: minima Valutazione della quantità di aria

pressione richiesta per superare la spostata ad una pressione pari all’
tensione superficiale del liquido e 80% della pressione al punto di bolla.
forzarlo attraverso i capillari del
filtro.
Si fa riferimento alla quantità di aria
4γ cos θ
P=K spostata in condizioni di filtro integro.
D
Aumento della quantità di aria
P = pressione al punto di bolla spostata indicano filtro rotto
D = diametro del poro Diminuzione della quantità di aria
θ = angolo di contatto liquido/membrana. spostata indicano filtro intasato
γ = tensione superficiale del liquido

I valori della pressione al punto di bolla sono dati dal produttore del filtro (certificato di analisi)

Aumento del valore di P indicano che il filtro è intasato.

Diminuzione del valore di p indicano che il filtro è rotto

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ESEMPI DI APPLICAZIONE NEL SETTORE FARMACEUTICO DEI

DIFFERENTI PROCESSI DI STERILIZZAZIONE

Metodo di sterilizzazione Prodotto/materiale

Vapore saturo sotto pressione
Soluzioni parenterali in fiala
Materiale da medicazione
Strumenti per lavorazioni asettiche
Materiale plastico termoresistente
Terreni di coltura
Materiale in gomma
Indumenti per le lavorazioni asettiche
In generale qualsiasi materiale che sopporta questo tipo
di sterilizzazione.

Vetreria (contenitori, fiale)

Calore secco
Oli
Strumenti chirurgici
Strumenti per lavorazioni asettiche
Polveri

ESEMPI DI APPLICAZIONE NEL SETTORE FARMACEUTICO DEI

DIFFERENTI PROCESSI DI STERILIZZAZIONE

Metodo di sterilizzazione Prodotto/materiale

Ossido di etilene Strumenti chirurgici
Materiale plastico
Materiale da medicazione

Raggi γ Polveri
Guanti chirurgici
Materiale plastico
Contenitori
Materiale da medicazione

Filtrazione Liquidi termolabili

(Iniettabili, soluzioni oftalmiche, terreni di
coltura, soluzioni di vitamine, soluzioni di
antibiotici, vaccini ecc.)

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INDICATORI BIOLOGICI DI STERILIZZAZIONE

METODO DI STERILIZZAZIONE INDICATORE BIOLOGICO

Vapore saturo sotto pressione Bacillus stearothermophilus
ATCC7953, D121 = 1,5 min conc. 5 x 10 5
Calore secco Bacillus subtilis var. niger
ATCC9372, D160 = 5-10 min conc. 1 x 105

Un qualsiasi indicatore usato nella

Gas (es. ossido di etilene)
sterilizzazione con calore
Bacillus pumilus ATCC14844 D=1,7 kGy, conc.
Raggi γ 107 – 108

Pseudomonas Diminuta, conc. minima di

Filtrazione sterilizzante
107 ufc per cm2 di superficie filtrante

STERILIZATION, STERILITY ASSURANCE: regulatory remarks

GUIDELINE OF THE EUROPEAN COMMUNITY

CPMP/QWP/054/98

Decision tree for sterilization Decision tree for sterilization

choices for aqueous choices for non-aqueous liquid,
products semi-solid or dry powder products

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Guideline of the European Community CPMP/QWP/054/98

DECISION TREE FOR STERILIZATION CHOICES FOR AQUEOUS PRODUCTS

Can the product be sterilized by moist heat at 121°C for 1 5 minutes?

NO YES

Can the product be sterilized by Use autoclaving at 121°C for 15 min

moist heat with Fo ≥ 8 mins
achieving SAL ≤10-6 ?

YES
NO
Use moist heat with Fo ≥ 8 mins
Can the formulation be filtered
through a microbial retentive filter ?

NO
YES

Use presterilizaed individual components Use a combination of aseptic

and aseptic compounding and filling filtration and aseptic process

Guideline of the European Community CPMP/QWP/054/98

DECISION TREE FOR STERILIZATION CHOICES FOR NON- AQUEOUS LIQUID, SEMI-SOLID OR
DRY POWDER PRODUCTS
Can the product be sterilized by dry heat at 160° C for 120 minutes?

NO YES

Can the product be sterilized by dry heat

Use sterilization at 160 °C for 120
with alternative combinations of time and
minutes
temperature to the standard cycle
achieving SAL ≤ 10-6?
NO
YES
Can the formulation be sterilized with an Use dry heat with alternative combinations
alternative method different from dry heat of time and temperature to the standard
e.g. ionizing radiation with an absorbed cycle achieving SAL ≤ 10-6
minimum dose ≥ 25 kGy?
YES

NO Use sterilization with ionizing radiation with an

absorbed minimum dose ≥ 25 kGy

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Guideline of the European Community CPMP/QWP/054/98

DECISION TREE FOR STERILIZATION CHOICES FOR NON- AQUEOUS LIQUID, SEMI-SOLID OR
DRY POWDER PRODUCTS follows….
Can the formulation be sterilized with an alternative method different from dry heat e.g.
ionizing radiation with an absorbed minimum dose ≥ 25 kGy?

NO

Can the product be sterilised with a

validated lower irradiation dose?(ref.
ISO11137)

YES
Use sterilisation by validated
NO irradiation dose

Can the formulation be filtered

through a microbial retentive
filter?

NO YES Use filtration and

aseptic processing
Use presterilised individual components
and aseptic compounding and filling

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