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Tecniche di sterilizzazione

La sterilizzazione un processo il cui


scopo quello di stabilire condizioni
asettiche, mediante rimozione di tutti i
microrganismi.
La sterilizzazione molto importante nella
ricerca algologica, specialmente nel
mantenimento dei ceppi isolati in coltura.

Tecniche di sterilizzazione

Inoltre luso di tecniche di


sterilizzazione minimizza la
contaminazione, e consente di
condurre esperimenti in modo pi
preciso. Le tecniche di sterilizzazione
non sono difficili, ma richiedono molta
cura. I materiali sterilizzati esposti
allambiente si contaminano
rapidamente, a causa dei milioni di
spore presenti nellaria.

Il termine disinfettare viene spesso confuso con


sterilizzare.
Disinfettare vuol dire operare per uccidere tutti o
gran parte dei microrganismi patogeni presenti
in un ambiente o in una superficie.
Per esempio, lavarsi le mani e pulire le superfici
con detergenti tipo etanolo al 70% prima di
maneggiare colture sterili una procedura di
disinfezione che fa parte delle tecniche di
sterilizzazione, ma non le esaurisce.

I metodi di sterilizzazione invece


prevedono leliminazione di qualsiasi
microrganismo. Possiamo dividerli in 4
categorie:
- a caldo;
- mediante onde elettromagnetiche;
- per filtrazione;
- con reagenti chimici

La sterilizzazione a caldo la pi usata.


Richiede temperature 100C;
Essa richiede inoltre che i materiali da
sterilizzare siano termoresistenti (es.
vetreria, strumenti metallici,fogli di
alluminio)

Le sostanze liquide possono essere sterilizzate


mediante filtrazione, quando in soluzione siamo
presenti sostanze termolabili.
Es. componenti organici tipo vitamine.

Le onde elettromagnetiche (raggi ultravioletti


[UV], raggi gamma, raggi x, e microonde)sono
usate come alternativa per i materiali solidi che
non possono essere esposti ad alte temperature
(es. prodotti in plastica).

Infine, molti tipi di sostanze chimiche


possono essere usate per la
sterilizzazione.
Bisogna comunque considerare che tracce
di queste sostanze possono rimanere nei
recipienti, interagendo negativamente con
gli organismi.
Per questo motivo, oggi queste procedure
sono usate molto di rado.

Tecniche di sterilizzazione a caldo

autoclave
Lautoclave la macchina pi efficace per effettuare la
sterilizzazione a caldo.
E un apparato consistente in una camera dacciaio,
chiusa ermeticamente al cui interno del vapore sotto
pressione produce temperature di 121 senza che i liquidi
vadano in ebollizione.
10 minuti di autoclave a 121C bastano per sterilizzare
provette di 18 mm di diametro, mentre 1 ora richiesta
per sterilizzare contenitori di 10 l.

Un modello di autoclave

Alcune precauzioni sono fondamentali per effettuare con


successo una sterilizzazione con autoclave
Per i liquidi importante lasciare uno spazio libero nel
contenitore.
Inoltre il tappo dovrebbe essere chiuso non
ermeticamente, per evitare che la pressione salga troppo.
Dopo essere passati in autoclave alcuni materiali sono
ancora umidi, soprattutto i materiali tipo cotone o carta. In
questo caso una successiva sterilizzazione a secco
(150C per almeno unora) consigliata.

Sterilizzazione tramite stufa


Per le sterilizzazioni a secco si usane
generalmente le stufe.
Perch sia efficace le temperature devono
essere pi alte e i tempi pi lunghi di
quanto non sia richiesto quando si usi
lautoclave.
Il modo pi rigoroso richiederebbe 250C
per 3 -5 ore; nella pratica di solito basta
riscaldare a 150C per 3 o 4 ore.

Tecniche di sterilizzazione tramite


filtrazione

La Sterilizzazione mediante filtrazione richiesta


per componenti termolabili.
E un metodo rapido, se deve essere sterilizzato
un piccolo volume di liquido.
Esiste in commercio una grande variet di filtri, a
differente porosit, fatti di materiali diversi e di
differenti dimensioni.
In genere i filtri possono essere autoclavati ed
hanno portosit minore di 0.2 mm; soltanto i virus
sono pi piccoli e possono passare.
Se la soluzione viscosa o contiene particelle in
sospensione, conviene effettuare prefiltrazione con
un filtro dai pori di 1mm di diametro.

Tecniche di sterilizzazione tramite


onde elettromagnetiche

Sterlilizzazione tramite UV
La sterilizzazione con raggi X o Gamma, si
realizza a livello industriale e non viene
applicata in laboratorio, per ragioni di sicurezza.
La radiazione UV pu essere usata in
laboratorio per sterilizzare piccoli ambienti,
quando non ci sia nessuno allinterno(es. cappe
a filtro laminare, banchi di laboratorio).
La radiazione UV efficace soprattutto a 260
nm, causando la formazione di legami covalenti
tra timine adiacenti nel DNA. Questi dimeri
causano errori di replicazione del DNA,
provocando mutazioni letali.

Una lampada UV produce radiazioni con lunghezza


donda tra 240 and 280 nm. Lenergia varia con il
bulbo, e va da 40 a 40.000 microwatt/s .cm2.
La scelta del bulbo dipende dallo scopo. Bulbi a
base energie sono usati per sterilizzare cappe e
banchi, mentre quelli ad elevata energia servono
per sterilizzare lacqua.
I raggi UV non attraversano il vetro. Per sterilizzare
i liquidi ci vorr un bulbo ad immersione.

La sterilizazione con il forno a microonde la


pi rapida.
Leffetto prodotto dalle microonde di due tipi: le
microonde possono uccidere direttamente le
cellule o indirettamente, facendo innalzare la
temperatura dei liquidi fino allebollizione.
Si raccomanda luso di un microonde con un
tavolo girevole e con una potenza di 700 watt.

Tecniche di sterilizzazione tramite


composti chimici

Sterilizzazione tramite ipoclorito di


sodio

La sterilizzazione con sodio ipoclorito molto usata in acquacultura,


le cui pratiche richiedono sterilizzazione di ampi volumi di liquidi.
Lapplicazione di questa tecnica pu non essere sufficiente per
uccidere le forme di resistenza di taluni microganismi (cisti).
Generalmente il trattamento prevede luso di 1-5 ml di sodio
ipoclorito per litro di acqua. Durante il trattamento le acque non
vanno agitate. Il trattamento dovrebbe durare alcune ore, altrimenti
si devono usare concentrazioni maggiori della sostanza.
Ler soluzioni non devono essere esposte alla luce del sole durante il
trattamento.
A fine trattamento il sodio ipoclorito viene neutralizzato con
laggiunta di sodio tiosolfato (Na2S2O3 5H2O).
Generalmente si aggiunge 1 ml di sodio tiosolfato per 4 ml di sodio
ipoclorito

Camere a flusso laminare


Una camera a flusso laminare posta in una
piccola stanza chiusa la scelta migliore per
maneggiare il materiale e le culture sterili.
Di solito sono attrezzate con una lampada UV,
per sterilizzare lambiente quando non in uso,
e con un bruciatore Bunsen.
Nella zona di lavoro la circolazione dellaria
dovrebbe essere ridotta al massimo e
loperatore dovrebbe muoversi il meno possibile
e molto lentamente.

Sterilizzazione di terreni solidi


Come per i terreni di coltura liquidi, la sterilizzazione si
effettua autoclavando a 121C per 15 minuti.
Gli slants nelle provette devono essere riscaldati
tenendoli inclinati, in modo che lagar si solidifichi
formando una superficie in pendenza vicino allestremit
della provetta. Questo faciliter le operazioni di
trasferimento del campione algale.
Quando si usano piastre Petri, il terreno agarizzato va
versato in Piastre sterili e sotto cappa a flusso laminare.
Per ridurre la contaminazione lagar non deve riempire
pi della meta della piastra
Eventuali componenti termolabili vanno aggiunti prima
che lagar solidifichi (50-60C), sterilizzandoli a freddo.