Università degli studi di Parma

QUADERNO DI
LABORATORIO
Corso di laboratorio di chimica applicata agli
alimenti
Esculapi Alessandra

a.a. 2020/2021
PREMESSE
Alimento è una matrice complessa composta da numerosi costituenti come acqua, proteine, lipidi,
carboidrati, vitamine e minerali. Inoltre, possono essere presenti altri componenti (naturali, indotti o
addizionati) privi di valore nutrizionale ma altrettanto importanti per l’alimento stesso, come aromi o
coloranti. Oltre a tutto ciò, non è da sottovalutare la possibile presenza di composti indesiderati come tutte
quelle sostanze potenzialmente dannose per la salute del consumatore (pesticidi, tossine, ecc.)

Aspetti importanti: qualità e sicurezza, caratteristiche nutrizionali e sensoriali.

Qualità e sicurezza degli alimenti e caratteristiche nutrizionali e sensoriali, sono parametri controllati dagli
operatori del settore alimentare (dal produttore al venditore) tramite l’applicazione di protocolli atti a
valutare e gestire i parametri stessi, sia per gli alimenti finiti che per le materie prime utilizzate per la
produzione. Tutto ciò è possibile tramite la messa a punto e l’applicazione di protocolli e tecniche analitiche
finalizzati a determinare parametri e indicatori chimico-fisici direttamente correlabili con la qualità e le
caratteristiche dell’alimento in esame.

DEFINIZIONI

Campione: matrice complessa ed è il contenitore degli analiti che vogliamo andare a recuperare
Analiti : sono i componenti che vogliamo andare a determinare all'interno del campione
Es contenuto di grassi
Analita può essere un unico composto o una classe di composti
Interferenti: assomigliano a tutti i componenti che vogliamo estrarre quindi hanno lo stesso
comportamento chimico fisico. Potrebbero interagire con nostro componente di interesse e quindi
falsare il risultato
Campione sintetico standard è un campione in cui è presente solamente il nostro analita di
interesse, quindi una matrice costruita ad hoc

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SCELTA DI UN METODO

1. Definire il problema: quale analita o analiti bisogna andare a determinare, quali sono le sue
proprietà chimico fisiche (polarità, solubilità, volatilità, ecc.); che concentrazione di questi ci si
aspetta di avere; definire i parametri analitici che si desiderano (accuratezza); capire quali
interferenti possano essere presenti.

2. Ricercare una metodica in letteratura: metodo esistente o sviluppo di un nuovo metodo

3. Analisi di campioni standard (matrice in cui è presente solo il mio analita)

4. Analisi del campione aggiunto di standard Metodo esistente Sviluppo nuovo metodo

Se il metodo funziona allora posso applicarlo al campione alimentare

Solitamente si va a testare anche il metodo di analisi, che vuol dire applicarlo prima di tutto a un campione
sintetico standard, non subito al campione reale

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ESPERIENZA 1:

RICONOSCIMENTO E UTILIZZO DELLA VETRERIA E DELLA STRUMENTAZIONE DI BASE

Scopo: imparare a riconoscere ed utilizzare nel modo corretto la vetreria e la strumentazione di base del
laboratorio

Procedimenti:

1) Cercare e disporre sul bancone la seguente vetreria: 1 beaker da 250 ml (A) , una beuta da 100 ml (B), un
pallone da 100 ml (C) ed un cilindro graduato(D).

2) Tramite l’utilizzo di un cilindro graduato versare 50 ml di acqua distillata nel beaker e 50 ml di acqua
distillata nella beuta. Aggiungere una ancoretta magnetica (E) e provare l’agitazione utilizzando la piastra
riscaldante con agitatore magnetico (F) avendo cura di impostare la temperatura a zero attraverso
l’utilizzo di una termosonda (G) .

Termosonda deve essere in contatto con la soluzione che si sta andando a riscaldare o ad agitare , quindi
dobbiamo fare in modo che l sia sempre immersa all'interno di un liquido nel momento in cui andiamo a
fare un'agitazione o un riscaldamento .

3) Sversare ed asciugare il beaker e la beuta facendo attenzione a non perdere l’ancoretta magnetica.

4) Prendere quindi un matraccio da 250 ml (G) e portarlo a volume con l’acqua distillata Lettura viene fatta
nella parte stretta nel matraccio poiché si evidenzia maggiormente la formazione del menisco

5) Avvinare (bagnare i bordi con il liquido ed effettuare dei movimenti per evitare la formazione di bolle
nella punta ) Riempire la buretta (H) con l’acqua distillata e quindi posizionare il volume sulla linea dello
zero. Sgocciolare in un beaker esattamente 10 ml. Ripetere questa ultima operazione 2 volte. Per leggere il
volume nella buretta si guarda intersezione tra menisco e linea di S che è quella linea disegnata sul fondo
della buretta, questa intersezione creerà una specie di freccia

6) Lasciare vetreria e strumentazione in sicurezza, pulita ed asciugata.

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A B C

D E F

G H I

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CLASSI VETRERIA DA LABORATORIO
VETRERIA DI CLASSE A: altamente precisa, si utilizza per analisi quantitative, errore nella misura molto
basso (+- 0,05-1%): matraccio, buretta, pipetta graduata
VETRERIA DI CLASSE B: vetreria graduata ma errore della misura di +- 1% , cilindro graduato, imbuto,
pipetta pasteur
VETRERIA DI CLASSE C : vetreria non graduata o graduata grossolanamente con errore nella misura di +-
10% , adatta per analisi qualitative, non adatta a misure di volume, ma adatta per trasferire volumi:
beaker, beuta, pallone, provetta
Le classi corrispondono alla precisione con la quale sono stati tarati i materiali

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 LA TITOLAZIONE
La titolazione è un’analisi quantitativa e volumetrica, ciò significa che è un metodo di analisi che permette
di determinare la quantità di una sostanza chimica dispersa in una matrice attraverso la misurazione del
volume di soluzione a concentrazione nota necessario per compiere una determinata reazione.

La titolazione viene terminata quando si raggiunge il punto di equivalenza ovvero il momento in cui tutto
l’analita avrà reagito in modo quantitativo con il reagente e si sarà quindi esaurito.

Punto di equivalenza momento in cui quantità di analita e la quantità di titolante si equivalgono, è difficile
determinarlo in modo sperimentale, quindi andremo a determinare il punto finale della titolazione ovvero
il momento in cui una piccola aggiunta di titolante in più fa si da modificare l'ambiente di reazione.

analita: sostanza di interesse presente in un campione liquido o in un estratto di

soluzione a conc nota: all'interno della burettaun campione solito

Conoscendo la stechiometria della reazione chimica tra analita da determinare e titolante è possibile
risalire alla quantità di analita nel campione partendo dal volume esatto di titolante consumato.

Condizioni necessarie per poter utilizzare il metodo della titolazione:

- La sostanza da quantificare deve reagire in modo veloce, quantitativo e stechiometrico con una seconda
sostanza aggiunta come soluzione standard a titolo noto (titolante);

- Non devono verificarsi reazioni collaterali; prodotti stabili;

- Deve essere possibile individuare sperimentalmente (“punto finale della titolazione”) quella particolare
aggiunta di titolante che corrisponde al completamento della sua reazione con la sostanza da titolare
(“punto di equivalenza”).

Per individuare il punto finale si possono adottare diverse tecniche:

- Utilizzo di un «Indicatore» ovvero una sostanza che viene aggiunta al campione e che cambia colore in
funzione dell’ambiente chimico in cui si trova (esempio: variazione di pH); Solitamente gli indicatori sono
sostanze colorate che cambiano colore a seconda dell'ambiente in cui essi si trovano, variazione di colore
quindi ambiente di reazione è cambiato quindi reazione titolante analita è terminata.

- Applicazione di tecniche elettro-analitiche = uso di uno strumento che misuri una variazione nell’ambiente
di reazione come pHmetro, potenziometro

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Tipi di titolazioni:

1) Acido-base (basate sulla neutralizzazione di un acido da parte di una base o viceversa)

2) Ossido-riduzione (o redox), basate sulla reazione tra un ossidante ed un riducente

3) Complessometrica, basate sulla reazione di formazione di composti di coordinazione

4) Precipitazione che vengono utilizzate per determinare la concentrazione di alcuni anioni

ESPERIENZA 2

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI ACIDO ACETICO TRAMITE TITOLAZIONE ACIDO-BASE

Scopo prima parte: Preparazione del titolante (NaOH) tramite titolazione con HCl (standardizzazione del
titolante NaOH)

Standardizzazione: determinare in maniera precisa e corretta sua concentrazione

Titolante: composizione chimica e concentrazioni note. Solitamente si utilizza una soluzione standard. Se
non è disponibile una soluzione standard, si rende necessaria la standardizzazione del titolante prima di
iniziare le analisi.

E’ possibile utilizzare uno standard primario (sostanza pura, non alterabile, stabile, conservata come pura,
che può essere utilizzato come riferimento) per preparare una soluzione standard da utilizzare come
titolante.

Idrossido di sodio non è uno standard primario quindi necessario preparare soluzione e standardizzarla
con HCl che è uno standard primario

Materiali:

• 1 g di soda
• Bilancia
• Matraccio da 250 ml
• Cilindro graduato
• Beaker 150 ml
• Barretta magnetica
• agitatore magnetico
• Buretta

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Reagenti:

Reagenti Frasi H Frasi P Rischio chimico

NaOH H290, H314 P280, P305+P351+P338,
P310

Fenolftaleina 341-350-361 201-281-308+313

HCl 261 - 280 -

305+351+338 - 310 -
280 - 314 - 331
410+403

Procedimenti:

1) Si prepara una soluzione di NaOH (PM = 40 g mol-1 ) pesando esattamente 1 g di soda (standard
primario) in un matraccio da 250 ml
2) Si aggiunge poca H2O distillata e si agita la soluzione al fine di solubilizzare la soda, non ci deve
essere particolato in sospensione
3) Raggiunta la solubilizzazione si porta poi a volume con H2O distillata.
Questa soluzione è quella che deve essere utilizzata nella buretta.
4) Si determina il titolo della soluzione appena preparata utilizzandola per titolare 15 mL di soluzione
di HCl 0.1N posti in un beaker da 150 ml aggiungendo 2 gocce di indicatore fenolftaleina (pKind =8),
50 ml di H2O distillata ed una barretta magnetica procedendo fino al viraggio dell’indicatore.
Mantenere la soluzione di cui si vuole determinare la concentrazione sotto agitazione costante al
di sopra di un agitatore magnetico.

Calcoli:

Normalità del titolante NaOH : Dal momento in cui stiamo parlando di una specie che in soluzione è
completamente dissociata e cede una mole z=1 quindi molarità= normalità

0.933 g di NaOH

Viraggio = 16 ml
𝑉𝐻𝐶𝑙 ∙ 𝑁𝐻𝐶𝑙 15 𝑚𝑙 ∙ 0.1 𝑁
NNaOH= 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻
= 16 𝑚𝑙
= 0.09375 N

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Scopo seconda parte: determinazione della concentrazione di acido acetico in un campione di aceto di vino
bianco tramite titolazione acido-base

Materiali:

• Beaker 250 ml
• Bilancia tecnica
• Pipetta graduata
• Cilindro graduato
• Ancoretta magnetica
• Agitatore
• Acqua distillata
• Buretta
• Aceto di vino bianco

Reagenti:

Reagenti frasi H Frasi P Rischio Chimico

NaOH H290, H314 P280, P305+P351+P338,
P310

Fenolftaleina 341 - 350 - 361 201 - 281 - 308+313

CH3COOH 226 - 314 210 - 208 -

301+330+331 -
303+361+353 -
305+351+338

Procedimenti:

1) Posizionare beaker su di una bilancia tecnica e fare la tara

2) Prelevare 1 ml di campione di aceto di vino bianco attraverso l’uso di una pipetta graduata, versarlo
nel beaker posizionato sulla bilancia e osservare il peso (0.98 g)
3) Aggiungere al beaker 50 ml di H2O distillata prelevata con l’utilizzo di un cilindro graduato
4) Aggiungere 2 gocce di indicatore fenolftaleina (pKind =8) ed una ancoretta magnetica
5) Posizionare beaker sull’agitatore
6) Avvinare e riempire la buretta con NaOH 0.1 N (titolante) Avvinare: bagnare i bordi con il
7) Posizionare buretta sopra il beaker contenente il liquido ed effettuare dei movimenti
campione e mettiamolo in agitazione per evitare la formazione di bolle
8) Titolare la soluzione mantenendola sotto agitazione nella punta )
costante, con la soluzione di NaOH a titolo noto fino a
viraggio dell’indicatore
Far cadere soda nel campione goccia a goccia, quando la goccia di NaOH tocca la soluzione
contenente acido acetico la reazione avviene e soluzione si colora in rosa. Quando tutta la

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 soluzione avrà un colore rosa permanente fermeremo la titolazione e controlleremo volume di
NaOH sgocciolato (V= 11.1 ml)
Il colore rosa deve risultare permanente, avvicinandosi al punto di viraggio dell’indicatore bisogna
effettuare titolazione in maniera molto più attenta

Calcoli:

Calcolare la concentrazione di acido acetico nel campione espressa come % nel nostro campione di aceto di
vino

𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 ∙𝑀𝑁𝑎𝑂𝐻 ∙𝑃𝑀𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻 0.0111 𝐿 ∙0.1 𝑀 ∙ 60.052 𝑔/𝑚𝑜𝑙

%CH3COOH = 𝑔 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒
∙ 100 = 0.98 𝑔
· 100 = 6.8%

Note bene:

Volume del titolante deve essere espresso in litri

Dati da tenere in considerazione per i calcoli:

NNaOH = MNaOH= 0.1 ciò poiché in una reazione acido-base Z=1

PM CH3COOH = 60.052 g/mol

Risultati e commenti:

Il risultato dell’analisi è un valore pari a 6.8% di CH3COOH, è per questo conforme alla legislazione che
ammette acidità compresa tra il 6 e il 12% espressa in % di acido acetico

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 ESTRAZIONE CON SOLVENTE
L’estrazione è una tecnica che permette di separare e/o di recuperare un componente o più componenti di
interesse, trasferendoli da una matrice (miscela di più componenti, solida, liquida o gassosa) ad un
solvente.

La tecnica prevede di trattare un campione con un solvente, che può essere acquoso oppure organico.

Questa tecnica può essere adottata per 2 scopi:

1) Quando si vuole recuperare un analita da una matrice

2) Quando si vuole recuperare un analita da una miscela di estrazione (purificazione)

Condizione: l’analita da recuperare deve essere solubile (o maggiormente solubile) nel solvente che si è
deciso di utilizzare, poiché deve permetterci di recuperare l’analita in modo quantitativo

Estrazione solido-liquido

Questa operazione si compie quando si vuole andare a recuperare un analita disperso in una matrice solida
(alimento solido) utilizzando un solvente.

• Il solvente ideale è quello che ha affinità con l’analita, ma non con la matrice. Si mette a contatto matrice
con solvente in un contenitore adatto per il riscaldamento e solitamente si usa anche un sistema chiamato
refrigerante per far si che il solvente non evapori e non si disperdi nell'ambiente, gli consente di
condensare e ritornare nel contenitore così che il volume del solvente resti costante

Filtrazione:

Questa operazione si compie per :

• Separare il solido esausto dalla miscela nella quale si trovano gli analiti di interesse

• Separare il solido che contiene ancora gli analiti di interesse dalla miscela in cui si trovano dispersi gli
interferenti

2 metodi

1. Utilizzando un apposito filtro di carta a pieghe

2. Sotto vuoto con imbuto Buchner

Estrazione liquido-liquido

(tecnica che può essere utilizzata anche per purificare un estratto)

• E’ uno dei sistemi più comuni per rimuovere o recuperare un composto organico (analita) da una miscela;
per trasferire l’analita da una fase liquida ad un’altra.

• Usato per estrarre ed isolare composti naturali da miscele di estrazione.

• Usato per recuperare un prodotto di reazione dalla miscela di reazione.

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Eliminazione del solvente: recupero dell’analita estratto, per avere solo un analita in forma solida

- Se si ha un solido sospeso si può usare il metodo della filtrazione

- Se l’analita è dissolto nel solvente di estrazione allora si rende necessario eliminare il solvente per
EVAPORAZIONE, strumento utilizzato ROTAVAPOR

Cristallizzazione e Ricristallizzazione

Nel caso di una sintesi o di un’estrazione di un composto di interesse di origine naturale, a volte è
necessario un passaggio di ricristallizzazione per ottenere il composto PURO ed eliminare eventuali tracce
di impurezza

ESPERIENZA 3

ESTRAZIOME E PURIFICAZIONE DELLA CAFFEINA DAL TE

Scopo: Isolare caffeina a partire da un campione di foglie di te

Si può utilizzare questa tecnica per estrarre caffeina da foglie di te scartate ad esempio perché non
rispettano colore e grandezza, la caffeina estratta può essere utilizzata poi nella bevande energetiche.

Materiali:

• Foglie secche di te (12 g)

• Pallone da 250 ml • Acqua distillata
• Spatola • Imbuto di Buchner
• Carborundum • Beuta cordata
• Cilindro graduato • Tappo di vetro
• Mantello riscaldante • Imbuto separatore
• Supporto per pallone • Bilancia
• Refrigerante a bolle • Filtro a pieghe
• Supporto di sughero • Rotavapor
• Celite • Bagno caldo
• Beaker

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Reagenti:

Reagenti Frasi H Frasi P Rischio chimico

CH2Cl2 315 - 319 - 335 - 336 - 261 - 281 - 305+351+338
351 - 373

NA2SO4 // // //
CaCO3 // // //
Carborundum 315 - 319 - 335 261 - 305+351+338

Celite 319 264, 280, 305+351+338,

313

Procedimenti:

· Estrazione solido-liquido

1) Estrazione della caffeina dalle foglie di te, 12 g già pesati con acqua distillata, versare il tutto in un
pallone da 250 ml, giungere 10 g di calcio carbonato (CaCO3 ), una punta di spatola di carborundum
il quale serve per mantenere l’ebollizione omogenea durante l’estrazione
2) Aggiungere acqua distillata 125 ml misurati con un cilindro graduato

Molecola della caffeina

3) Inserire pallone all’interno del mantello riscaldante, pallone deve essere fissato su un apposito
supporto. Ebollizione a ricadere per 20 minuti
Ebollizione a ricadere: si utilizza un refrigerante per andare a fare condensare acqua che si evapora
durante ebolizzione in questo modo non andiamo a disperdere nostro solvente durante la fase di
estrazione
Pallone riscaldante: supporto che serve a riscaldare i contenitori sferici abbracciandoli quindi
riscaldamento avviene su tutti i punti del contenitore
Attenzione: pallone deve aderire al mantello

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 All’interno del pallone far scendere refrigerante a bolle che è collegato con l’acqua di rete così che
nel momento in cui si sviluppano vapori dal pallone questi condensino nell’apparato refrigerante e
ricadano all’interno del pallone
Attenzione: i due pezzi di vetreria devono combaciare perfettamente
Azionare acqua di rete
Una volta assicurato il tutto all’apposito supporto di metallo possiamo avviare il riscaldamento
Dal momento dell’inizio dell’ebollizione per avere un’estrazione esaustiva della caffeina dobbiamo
tenere in ebollizione il campione per 20 minuti

4) Dopo 20 minuti di ebollizione, togliere il sistema riscaldante dal pallone, e il pallone viene fatto
raffreddare sempre mantenendo il refrigerante al di sopra del pallone

5) Avvenuto il raffreddamento ( pallone tiepido al tatto) si può smontare il refrigerante dal pallone,
appoggiare pallone su di un supporto di sughero

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 6) Portare il pallone al sistema di filtraggio in cui verrà separata la parte solida dalla soluzione acquosa
che conterrà la caffeina estratta. FILTRAZIONE SOTTO VUOTO

Filtrazione

1) Preparare letto di celite: versare celite all’interno di un backer, aggiungere acqua e mescolare in
modo da creare una pappa lattea . Versare il contenuto del beaker in un Imbuto di Buchner
Attenzione: versare in modo omogeneo poichè il letto deve essere il più possibile omogeneo

Pappa lattea

2) Collegare beuta da vuoto con pompa e azionare il sistema

3) Procedere con il filtraggio del nostro campione: versare campione sul filtro e sul letto di celite
Attenzione: agitare bene il campione (campione ancora tiepido).

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 Con un tappo di vetro rovesciato andare a schiacciare bene foglie di te al fine di estrarre tutto il
liquido. Aspettare che il campione finisca di sgocciolare e successivamente smontare prima il vuoto
e poi spegnere pompa

4) Recuperare soluzione acquosa ricavata in cui è dispersa caffeina

Liquido di colore scuro poiché sono stati estratti anche dei tannini (coloranti) oltre che caffeina
che è un solido cristallino bianco

Estrazione liquido liquido

Per estrarre caffeina dalla soluzione appena ottenuta e purificarla poiché andando ad estrarre il te con una
soluzione acquosa abbiamo estratto anche altre sostanze che danno una colorazione scura alla nostra
soluzione, quello che vogliamo andare a recuperare è la caffeina più pura possibile

1) Vuotiamo soluzione acquosa contenente caffeina e impurezze all’interno di un imbuto separatore

quindi andiamo a recuperare nostra caffeina andando ad aggiungere un solvente .
Caffeina parziale apolarità e noi siamo di fronte a un estratto di natura polare perché abbiamo
utilizzato l'acqua quindi possiamo andare ad aggiungere un solvente apolare che sia immiscibile con
acqua ma nel quale caffeina si vada a sciogliere
Questo solvente è il cloruro di metilene o dicloro metano (CH2CL2) , 60 ml di metilene alla nostra
soluzione acquosa . Effetuando estrazione liquido liquido con solvente organico caffeina passerà
nella fase estraente che in questo caso è la fase organica
Cloruro di metilene ha una densità maggiore di 1 quindi maggiore di quella dell’acqua e per questo
si posizionerà al di sotto di essa, acqua e cloruro di metilene sono due solventi immiscibili tra loro
2) Per andare a recuperare caffeina dalla nostra soluzione acquosa dobbiamo miscelare le due
soluzioni delicatamente attraverso movimenti circolari del pallone separatore in modo che le due
soluzione vengano a contatto tra di loro ma non si formino molte emulsioni, quindi agitiamo
lasciando pallone aperto in modo che si sfiati durante agitazione, possiamo anche inclinarlo
leggermente

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 Attenzione: Se esageriamo troppo
durante agitazione si formano delle
emulsioni che difficilmente riusciremo
a rompere

Imbuto separatore si utilizza per

estrazione liquido liquido e avendo
una parte stretta permette di
visualizzare in modo piuttosto
semplice la formazione delle due fasi
quindi separazione fase estraente e di
origine

Dotato di un rubinetto come quello

della buretta che viene usato per far
scorrere e quindi recuperare una delle
due fasi

3) Far riposare soluzione lasciando tappo aperto e andare a recuperare fase sottostante
4) A questo punto possiamo andare a recuperare nostra soluzione organica contenente caffeina
facendola colare in una beuta pulita dopo aver agganciato pallone a un supporto metallico
Fare attenzione a non raccogliere troppa emulsione almeno durante prima estrazione
5) Durante seconda estrazione (estrazione verrà ripetuta) invece possiamo fare scendere una parte
dell’emulsione (facendola colare lentamente un po’ di emulsione si romperà )
6) Quando vediamo che sta cominciando a scendere anche l’emulsione ci fermiamo, togliamo la
beuta, aggiungo altri 60 ml di CH2Cl2 al pallone e ripetiamo l’operazione, questa volta in maniera
più energica
7) Riposizioniamo beuta sotto il pallone e ripeto l’operazione precedente, ricordarsi l’agitazione dopo
l’aggiunta di CH2Cl2 aspettare dopo agitazione che un po di emulsione si rompa e che il campione di
sfiati, fatta questa operazione per almeno una decina di volte si può fissare il pallone all’apposito
supporto e dopo aver fatto riposare la nostra soluzione in modo che le due fasi (fase acquosa e fase
organica) si separino e poi procedere all’estrazione per recuperare la fase organica sottostante

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 Questa estrazione viene effettuata al fine di recuperare in modo quantitativo la caffeina rimasta
nella soluzione acquosa
8) Questa volta raccogliamo fino all’inizio della fase acquosa raccogliendo anche l’emulsione
Attenzione: non raccogliere troppa acqua perché in essa sono disperde o intrappolate tutte le
molecole che consideriamo interferenti es tannini
9) A questo punto avendo raccolto anche un po’ di emulsione dobbiamo andare ad eliminare
quest’ultima dalla nostra soluzione aggiungendo una spatola di NaSO4 (solfato di sodio anidro) che
è un materiale in grado di andare adsorbire l’acqua, i grumi che precipitano nella nostra soluzione
sono grumi di solfato di sodio che contengono acqua, per essere sicuri mettiamo un’altra spatolina
di solfato di sodio anidro NaSO4
Quando soluzione risulta limpida possiamo procedere alla filtrazione della nostra soluzione

Filtrazione per decantazione e passaggio su filtro a pieghe

1) soluzione va filtrata in un pallone da 250 ml precedentemente pesato ( scrivere sopra al pallone
tara che abbiamo pesato)
2) Filtriamo attraverso un filtro di carta ovvero un filtro a pieghe (inserito in un imbuto)
All’interno del filtro si fermerà il nostro precipitato solido
3) Pallone è stato precedente pesato perché adesso andremo ad eliminare il solvente dalla nostra
soluzione quindi pesando il pallone dopo aver eliminato il solvente e facendo la differenza con la
tara sapremo quanta caffeina avremo estratto
NaSO4 rimarrà nel filtro, mentre CH2CL2 e caffeina finiranno nel pallone

Rotavapor: eliminazione del solvente

1) Tramite l’utilizzo di un rotavapor andremo quindi a eliminare il solvente dalla nostra soluzione
2) Agganciamo pallone al sistema, lo abbassiamo all’interno di un bagno caldo chiudiamo per creare
vuoto all’interno del sistema e quindi facciamo ruotare, in questo modo solvente evaporerà e verrà
raccolto in un apposito pallone di raccolta e nel nostro pallone rimarrà solamente nostro solido cioè
la nostra caffeina estratta
3) Una volta eliminato tutto il solvente andiamo a staccare pallone dal nostro sistema
4) Andremo a recuperare con una spatolina la caffeina rimasta attaccata alle pareti del nostro pallone
prima pesandolo, determineremo resa di estrazione e quindi andremo a verificare purezza della

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 caffeina estratta attraverso la misura del punto di fusione e confrontando il valore ottenuto con
quello tabulato

Esercizi

1) Per l’estrazione della caffeina sono stati utilizzati 12 g di foglie di tè. Il pallone prima dell’estrazione aveva
un peso pari a 102,628 gr, mentre dopo essiccazione al rotavapor presentava un peso di 102,711 gr.

Calcolare la resa di estrazione.

12 g di campione di foglie di te

tara pallone 102,628 g , peso pallone dopo aver eliminato solvente 102,711 g

grammi di estratto di caffeina calcolando differenza prima e dopo l’estrazione della caffeina:

102,711g – 102,628 = 0.083g

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑑𝑖 𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑡𝑜 𝑑𝑖 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛𝑎

Resa di estrazione in %: 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑑𝑖 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒
x 100 = 0.69%

2) Dopo l’estrazione viene misurato il punto di fusione della caffeina grezza ottenendo:

a. Temperatura di fusione della prima goccia: 227 °C

b. Temperatura di fusione completa: 233 °C
La caffeina estratta è pura? Perché?

Il valore tabulato del punto di fusione della caffeina è 235 gradi, essendo quello riportato inferiore a quello
tabulato possiamo concludere che la caffina estratta non è pura, sono presenti delle impurezze nell’estratto

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 DETERMINAZIONE DEGLI ZUCCHERI

La determinazione del contenuto di zuccheri in un campione alimentare può essere effettuata utilizzando
diversi metodi:

CAMPIONE LIQUIDO PER QUESTI 3 PRIMI METODI SE NON LO è PRIMA ESTRAZIONE CON
SOLVENTE POLARE E NEL CASO DEGLI ZUCCHERI SOLITAMENTE SI USA ACQUA

• metodo densimetrico: misure di densità; Si applicano su campioni liquidi, se lo vogliamo applicare su un

solido dobbiamo fare prima un'estrazione. Basato sulla densità perché la quantità di zuccheri, di sostanza
zuccherina disciolta in soluzione determina la densità della soluzione stessa, densità sarà tanto più elevata
quanto più zuccheri sono presenti in soluzione. Il mostimetro è uno strumento molto semplice e alla
portata di tutti. Lo strumento viene immerso nella soluzione della quale si vuole conoscere il tenore
zuccherino (es: mosto) ed esso rimarrà a galla nel liquido. Sulla superficie del liquido si leggerà
direttamente il grado zuccherino della soluzione. La scala è in kg/q.

• metodo rifrattometrico: utilizza il rifrattometro di Abbe, molto usato nell’enologia, strumento facile,
rapido e veloce per avere un primo indice dello zucchero presente; Misura di indice di rifrazione di un
campione. Deviazione è tanto più grande quante più sostanze solidi sono presenti in soluzione. Non
andiamo a misurare deviazione ovvero raggio che viene riflesso ma andiamo a misurare raggio che viene
rifratto

• metodo polarimetrico: utilizza un polarimetro (metodo strumentale), Concetto analogo alla rifrattometria
In questo caso viene utilizzato un polarimetro si ha quindi una luce polarizzata e si va a misurare l’angolo di
deviazione della luce polarizzata. La deviazione sarà proporzionale alla concentrazione zuccherina del
campione. Utilizzato ad esempio per andare a misurare lattosio all'interno dei campioni di latte
Quando abbiamo una soluzione zuccherina molto complessa in cui sono presenti molti zuccheri di diverso
tipo meglio utilizzare altri strumenti
Questo quando sappiamo ci aspettiamo che nostra soluzione zuccherina contenga un particolare tipo di
zucchero.
Si misura il POTERE OTTICO ROTATORIO (α) della soluzione e quindi dello zucchero che essa contiene.
Potere ottico rotatorio caratteristico di ciascuna sostanza solida pura ed è caratteristico soprattutto degli
zuccheri, ogni sostanza zuccherina ha un potere rotatorio specifico e quindi caratteristico di quella
sostanza, questo potere ottico rotatorio è il potere ottico rotatorio di una soluzione standard in zucchero
che viene misurata esattamente alla t di 20 gradi
Valore tabulato

• metodo volumetrico: utilizza una titolazione, metodo di Tollens e di Fehling (quest’ultimo è il metodo

ufficiale per la determinazione degli zuccheri riducenti, Basati su reazione di ossido riduzione)

Metodi volumetrici: metodo di Fehling Metodo basato su una titolazione redox; metodo quantitativo per la
determinazione del tenore di zuccheri riducenti = mono- e di-saccaridi con estremità emiacetalica libera
(gruppo aldeidico o chetonico che può ossidarsi ad acido carbossilico). Il test di Fehling, come quello di
Tollens, può essere applicato anche come analisi qualitativa. Zuccheri si ossidano a acido carbossilico e i
reagenti di tollens o fehling si riducono.

22
ESPERIENZA 4

Determinazione degli zuccheri riducenti del saccarosio in un succo di mele

Scopo: andare a determinare la % di saccarosio in un succo di mela, ci si aspetta che la maggior parte degli
zuccheri riducenti sia fruttosio . Succo di mela dichiarato 100% naturale quindi percentuale di saccarosio
presente deve essere molto bassa al di sotto del 2% se no vuol dire che sono stati aggiunti degli zuccheri

2 parti perché saccarosio non è uno zuccheri riducente quindi è necessario un idrolisi sul campione

Materiali prima e seconda parte:

• Bilancia • Piastra riscaldante

• 2 matracci da 250 ml • Buretta
• 8 g di succo di mela • 2 beute da 100 ml
• Pipetta pasteur • Pipette di vetro graduate
• Imbuto • Cilindro graduato
• Acqua distillata

Reagenti prima e seconda parte:

Reagenti Frasi H Frasi P Rischio Chimico

CuSO4·5H2O 302 - 315 - 319 - 410 273 - 305+351+338 -
302+352

KNaC4H4O6·4H2O // // //
Carborundum 315 - 319 - 335 261 - 305+351+338

Blu di metilene 302 301+312

Fenolftaleina 341 - 350 - 361 201 - 281 - 308+313

23
NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 310

CH3COOH 226 - 314 210 - 208 - 301+330+331

- 303+361+353 -
305+351+338

HCl 280 - 314 - 331 261 - 280 -

305+351+338 - 310 -
410+403

Reattivo di Fehling

Fehling I: 7 g di solfato di Cu(II) pentaidrato (CuSO4 ·5 H20) in 100 mL H2O distillata.

Fehling II: 35 g di tartrato di sodio e potassio (KNaC4H4O6 ·4H2O) e 10 g di NaOH in 100 mL H2O distillata.
Reattivo di Fehling: si ottiene miscelando uguali volume di Fehling I e Fehling II (5 mL + 5 mL)

Il reattivo di Fehling presenta un’intensa colorazione blu: è il colore impartito alla soluzione dal complesso
Cu2+-tartrato. Gli ioni tartrato, hanno il ruolo di complessare gli ioni rameici mantenendoli in soluzione: in
ambiente basico infatti, in assenza di un complessante, gli ioni rameici precipitano sotto forma di idrossido
rameico, elettrolita solido poco solubile.
Ioni tartrato che complessano ioni
rameici in ambiente basico
Senza complessante ioni rameici
precipiterebbero sotto forma di
idrossido di rame
E quindi reazione rame zuccheri
riducenti non avverrebbe

Gli ioni rameici (Cu2+ ) ossidano a ione carbossilato il gruppo carbonilico degli zuccheri riducenti e
contemporaneamente si riducono a ossido rameoso. Il test viene condotto a caldo in un bagnomaria
bollente: un'aldeide o uno zucchero riducente determinano la formazione di un precipitato rosso; nel
contempo si osservano variazioni anche del colore della soluzione (da blu a incolore utilizzando il blu di
metilene)

24
Prima parte: Andremo a determinare gli zuccheri riducenti liberi (Naturalmente presenti come fruttosio
glucosio e altri aldosi e chetosi ) e poi quelli totali (seconda parte) ottenuti sul campione dopo idrolisi, dalla
differenza delle percentuali ottenute otterremo la % di saccarosio

Procedimenti:

Valutazione zuccheri liberi riducenti

1) Pesiamo un’aliquota pari a 8g di succo : faccio sgocciolare in un matraccio da 250 ml circa 8 g di

succo di mela attraverso l’uso di una pipetta (8. 2 g)

2) Prima operazione portare a volume (250 ml) nostra soluzione attraverso l’aggiunta di acqua
distillata con l’aiuto di un imbuto, quando siamo vicini alla tacca fare attenzione e procedere con
una pipetta pasteur
3) Il campione va poi tappato e la soluzione va miscelata bene capovolgendola più volte, questa
soluzione sarà il nostro titolante con il quale andremo ad avvinare e poi riempire la nostra buretta
per effettuare la titolazione

Nel momento in cui vai ad effettuare

4) Per titolazione utilizzeremo una beuta da 100ml nel
quale inseriremo 5 ml di soluzione di Fehling A che
contiene il rame e nella stessa beuta inseriremo 5 ml
della soluzione di Fehling B soluzione di tartrato di
sodio potassio che serve per mantenere in soluzione
gli ioni rameici, entrambe le operazioni vengono
svolte con pipette di vetro graduate, otteniamo
soluzione blu nella beuta
5) Aggiungiamo una punta di spatola di carborundum
per mantenere omogenea ebollizione del campione e
poi 10 ml di acqua distillata misurata con un cilindro
una titolazione acido base o redox o
un'estrazione quando hai il campione
in ebollizione le bolle che si formano
possono andare a disturbare
estrazione stessa, oppure la reazione
che avviene nel momento in cui la
goccia di titolante va a cadere
all'interno del campione.
Carborundum serve affinchè bolle
non siano troppo grandi e non
vadano quindi a disturbare reazione
e per far si che ebollizione sia
costante
Sostanza inerte e granulare in grado
di rompere bolle

25
6) Misceliamo bene il nostro campione e quindi lo poniamo al di sopra della piastra riscaldante dove
settiamo temperatura a 100 gradi
7) Posizioniamo al disopra della nostra beuta la nostra buretta contenente la soluzione zuccherina
ovvero la soluzione diluita di succo di frutta ottenuta precedentemente che sarà il titolante.

8) Aspettiamo che la soluzione di Fehling nella beuta si scaldi per bene, una volta che vediamo le
prime bollicine aggiungeremo i primi 2/3 ml della nostra soluzione zuccherina dalla buretta e due
gocce di blu di metilene, aspettiamo che soluzione nella beuta torni in ebollizione e poi
procederemo con la titolazione vera e propria fino a che le bolle al di sopra della nostra soluzione
risulteranno incolore e precipitato non sarà di colore rosso mattone.
Affinchè la reazione avvenga in modo corretto è necessario mantenere l’ebollizione per tutta la
durata della titolazione

9) Vedremo un primo viraggio verso il viola (soluzione inizia a schiarirsi) dopodichè vedremo il vero e
proprio viraggio: bolle al di sopra del campione sono incolore e al di sotto precipitato di colore
rosso mattone

10) Titolazione è finita, andremo a leggere il volume sgocciolato 17,65 ml

26
Seconda parte: determinazione degli zuccheri riducenti totali

Procedimenti

1. Analogamente pesiamo un’aliquota pari a 6g di succo : faccio sgocciolare in un matraccio da 250 ml

circa 6 g di succo di mela attraverso l’uso di una pipetta pasteur (6.08g)
2. Una volta effettuata la pesata sottoporremo a idrolisi il campione sul quale effettuare la
determinazione degli zuccheri riducenti totali.
3. IDROLISI DEL SACCAROSIO
Per effettuarla è necessario andare a diluire il campione con 50 ml di acqua distillata e ad
aggiungere all’interno del matraccio in cui è stata fatta la pesata un acido, useremo HCl 6 M e
inseriremo 4 ml utilizzando una pipetta graduata, misceliamo
Per far avvenire l’idrolisi andremo a scaldare il campione per 20 minuti a 60/65 gradi
4. Facciamo raffreddare soluzione e aggiungiamo due gocce di fenolftaleina
5. Trascorsi 20 minuti avremo un ambiente acido all’interno del nostro campione nel nostro matraccio
che dobbiamo neutralizzare, quindi mettiamo due gocce di fenolftaleina, misceliamo e al fine di
neutralizzare il nostro campione andremo ad aggiungere NaOH al 10%, non sappiamo quanto
aggiungerne, abbiamo aggiunto l’indicatore per questo motivo, aggiungiamo fin a che la soluzione
nel matraccio non diventerà di colore rosa permanente, per ogni goccia di NaOH aggiunta miscelare
il matraccio

6. Raggiunto il colore rosa vuol dire che noi abbiamo neutralizzato l’acido presente all’inizio nel nostro
campione, però avremo sicuramente superato il ph neutro poiché la fenolftaleina vira a un ph di
circa 8.2, quindi per riportare la soluzione a un ph neutro aggiungiamo un acido debole ovvero
CH3COOH al 12% attraverso l’utilizzo di una pipetta pasteur, bastano pochi ml per far tornare la
soluzione del colore iniziale e a questo punto siamo certi che il nostro campione abbia un ph
prossimo alla neutralità . Si può controllare ph con cartina tornasole.

27
7. Procederemo portando a volume nostro matraccio da 250 ml e utilizzeremo questa soluzione per
riempire la buretta, sarà quindi il titolante.

8. Anche per il campione idrolizzato dobbiamo preparare il reattivo di fehling, in una beuta da 100 ml
aggiungiamo 5 ml soluzione contenente rame Fehling A e 5 ml di soluzione di tartrato di sodio
potassio Fehling B aiutandoci con delle pipette di vetro graduate. Otteniamo anche in questo caso
soluzione azzurra.

9. Aggiungiamo carborundum e 10 ml acqua distillata grazie a utilizzo di un cilindro graduato

10. Misceliamo, posizioniamo sulla piastra, impostiamo una temperatura di 100 gradi

11. Posizioniamo al di sopra nostra buretta nella quale abbiamo messo soluzione ottenuta dall’idrolisi
del nostro campione. Aspetteremo anche in questo caso che il campione inizi a fare le prime
bollicine

12. Aggiungeremo 2/3 ml di campione (titolante) dalla buretta e il blu di metilene 2 gocce

13. Procediamo alla titolazione quando ebollizione è evidente con comparsa delle bolle blu scuro.

14. Vedremo un primo viraggio verso il viola (soluzione inizia a schiarirsi) dopodichè vedremo il vero e
proprio viraggio: bolle al di sopra del campione sono incolore e al di sotto precipitato di colore
rosso mattone

28
 15. Volume misurato: 18.6 ml

16. Procediamo con i calcoli

Calcoli

Tramite opportune tabelle è possibile poi correlare il volume gocciolato con la quantità di zuccheri riducenti
presenti nel succo di mela, tenendo conto del volume iniziale della soluzione zuccherina (250 ml) e dei
grammi di succo pesati Per risalire poi alla quantità di saccarosio

Saccarosio % = (% zuccheri rid. dopo idrolisi - % zuccheri rid. naturali) x 0.95

(dove 0,95 è il titolo del Fehling)

Abbiamo detto che noi

siamo andati ad effettuare
una diluizione del nostro
campione perché metodo di
fehling funziona solo nel
caso in cui noi abbiamo una
% di zuccheri riducenti
all'interno del nostro
campione molto bassa

Quindi dobbiamo guardare

prima colonna che è quella
relativa allo 0% di saccarosio
presente nel campione no
saccarosio perché stiamo
andando a determinare
zuccheri riducenti e
saccorosio non lo è

Colonna ci dice quantità di

sostanze riducenti in mg che
hanno reagito con 5 ml di
soluzione contenente rame ovvero i 5 ml di fehling 1 che abbiamo utilizzato per la titolazione quindi questi
sono i mg di zuccheri riducenti che abbiamo all'interno del volume che abbiamo sgocciolato

29
1 zuccheri riducenti liberi
2 zuccheri
V1= 17.65 m1= 8.2 g
V2= 18.6 ml m2= 6.08

1) V= 17.65 ml dobbiamo andarlo ad approssimare al volume a cifra intera più vicino quindi V1= 18 ml
Prendiamo nostra tabella e andiamo a guardare sulla seconda colonna che quantità in mg di zuccheri
riducenti corrisponde il volume sgocciolato = 50.8 mg
Dobbiamo mettere in relazione il volume con la quantità e rapportarlo al volume totale della soluzione
che erano 250 ml, usare volume sgocciolato reale e non approssimato
50.8mg : 17.65 ml = x : 250 ml
X= mg in 250 ml di soluzione= 719.5 mg= 0.719 g

Mg calcolati devono essere trasformati in grammi e rapportare questa quantità ai grammi di campione
che abbiamo pesato all’inizio ovvero 8.2 grammi
Mg di zuccheri calcolati: 8.2 g di campione= x:100 percentuale zuccheri liberi presenti nel nostro
campione
0.719 𝑔
% 𝑧𝑢𝑐𝑐ℎ𝑒𝑟𝑖 𝑟𝑖𝑑𝑢𝑐𝑒𝑛𝑡𝑖 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑖 = 𝑥 100 = 8.77%
8.2 𝑔

2) Stesso calcolo per determinazione zuccheri riducenti totali dopo idrolisi

Volume titolante= 18.6 ml dobbiamo andarlo ad approssimare al volume a cifra intera più vicino quindi
V2= 19 ml
Prendiamo nostra tabella e andiamo a guardare sulla seconda colonna che quantità in mg di zuccheri
riducenti corrisponde il volume sgocciolato = 50.8 mg di zuccheri riducenti
Dobbiamo mettere in relazione il volume con la quantità e rapportarlo al volume totale della soluzione
che erano 250 ml, usare volume sgocciolato reale e non approssimato
50.8mg : 18.6 ml = x : 250 ml
X= mg in 250 ml di soluzione= 682.8 mg= 0.683 g

Mg calcolati devono essere trasformati in grammi e rapportare questa quantità ai grammi di campione
che abbiamo pesato all’inizio ovvero 6.08 grammi
Mg di zuccheri calcolati: 6.08 g di campione= x:100 percentuale zuccheri riducenti totali presenti nel
nostro campione

0.683 𝑔
% 𝑧𝑢𝑐𝑐ℎ𝑒𝑟𝑖 𝑟𝑖𝑑𝑢𝑐𝑒𝑛𝑡𝑖 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑖 = 𝑥 100 = 11.2%
6.08 𝑔

Poi calcolo % saccarosio considerando fattore fehling che nel nostro caso sarà F= 1.0197

% saccarosio= (% zuccheri riducenti dopo idrolisi - % zuccheri riducenti liberi) x F =

(11,2 – 8.77) x 1.0197= 2.47 %

30
Risultati:

è importante conoscere q di zuccheri riducenti poiché sono quelli che possono andare a reagire con i gruppi
ammidici quindi con gli aa presenti all'interno della matrice stessa per dare la reazione di Maillard
soprattutto nel momento in cui alimento è sottoposto a calore

Inoltre il succo di mela analizzato era stato dichiarato 100% naturale quindi percentuale di saccarosio
presente deve essere molto bassa al di sotto del 2% se no vuol dire che sono stati aggiunti degli zuccheri.

In questo caso abbiamo ottenuto una percentuale poco superiore al 2% ma ciò potrebbe essere stato anche
causato da errori durante l’analisi.

Ripetere l’analisi per un risultato più accurato

31
 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DELL’ESTRATTO

Tecnica che permette di separare tra di loro dei componenti diversi presenti in un estratto o in una miscela

Principio: noi abbiamo un materiale solido che è in grado di assorbire i componenti presenti in una miscela
e questo materiale adsorbente contribuisce a far si che questi componenti assorbiti su di esso si separino
quando su di esse viene fatto scorrere un solvente chiamato ELUENTE

Principio: i diversi componenti presenti in una miscela si distribuiscono in modo non uniforme tra 2 fasi non
miscibili tra loro.

Le 2 fasi sono: la fase stazionaria e la fase mobile

La fase MOBILE solitamente è un gas oppure un liquido. Eluente che scorre su fase stazionaria solida

La fase STAZIONARIA solitamente è un solido adsorbente. Nella fase mobile vengono dispersi i componenti
che si vogliono separare. I componenti che vogliamo separare devono essere solubili nella fase mobile

I diversi componenti della fase mobile interagiscono in modo diverso con la fase stazionaria, sono cioè
adsorbiti più o meno intensamente dalla fase stazionaria e vengono solubilizzati più o meno
abbondantemente nella fase mobile. Ogni singolo composto è soggetto a 2 forze: l’interazione con la fase
stazionaria che tende a trattenerlo e la solubilità nel liquido (o trasportabilità nel gas) della fase mobile che
tende a trascinarlo lungo la fase stazionaria. Quindi componenti diversi percorrono la fase stazionaria in
tempi diversi, possono pertanto essere raccolti separatamente

Queste interazioni non sono interazioni chimiche forti, ovvero non si devono instaurare dei legami covalenti
tra componente e fase stazionaria, interazioni deboli legami a idrogeno, forze di van der walss ed
esclusione dimensionale

A seconda dell'affinità che un componente ha con il materiale assorbente verrà più o meno trattenuto da
esso e dal momento in cui scorrerà una fase mobile in cui questo componente si va a dissolvere la fase
mobile tenderà a trasportare questo componente lungo la fase stazionaria

Entrambi i componenti avranno un'interazione con la fase stazionaria, ma uno dei due avrà un'interazione
più forte

Quindi componenti legati in maniera reversibile alla fase stazionaria, per separarli dobbiamo andare ad
aggiungere la fase mobile, liquido o gas che inizierà a scorrere lungo la fase stazionaria

Componenti miscela si muoveranno insieme a fase mobile e il componente che avrà maggiore affinità verso
fase stazionaria verrà maggiormente trattenuto mentre componente con maggiore affinità con fase mobile
sarà trattenuto molto meno e quindi eluirà ovvero percorrerà la fase stazionaria in un tempo più breve

In questo modo riusciamo a separare componente 1 da componente 2 e quindi avremo un tempo di

eluizione del componente 1 e un tempo di eluizione per il componente 2

Questi due tempi si chiamano TEMPI DI RITENZIONE

La fase mobile e la fase stazionaria NON interagiscono

32
ESPERIENZA 5

Isolamento di carotenoidi e clorofille da foglie di spinaci e la loro successiva separazione tramite

tecnica della cromatografia su colonna

Scopo: queste tecniche di separazione come la cromatografia vengono utilizzate industrialmente nel
momento in cui si vogliono andare ad estrarre dei componenti da estratti che poi vogliono essere utilizzati
rimpiegati nell'industria alimentare come ingredienti

Oppure per dare una seconda vita per gli scarti, per utilizzare questi componenti per altri scopi va poi
eseguita un'estrazione

Materiali:

• Beaker • Pallone 100 ml

• Beuta • Pipetta pasteur
• Cilindro graduato • Rotavapor
• Imbuto • Sabbia
• Spatola • Colonna di vetro
• Cotone • Tubo di gonna
• Pipetta graduata • Cuvette
• Spettrofotometro

Reagenti

Reagenti Frasi h Frasi p Rischio

chimico
CH3CH2OH 225 - 319 210 - 240 -
305+351+338 -
403+233

CH2Cl2 H315, H319, H335, P261, P281,

H336, H351, H373 P305+P351+P338

Al2O3 // // //
CH3(CH2)4CH3 H225, H302, H305, H315, H336, H361fd, H373, H411 P201, P202, P210,
P233, P235, P240,
P241, P242, P243,
P260, P264, P271,
P273, P280, P281,
P301+P330+P331,
P302+P352,
P303+P361+P353,
P304+P340,
P308+P313, P310,

33
 P312, P314,
P332+P313, P363,
P370+P378, P391,
P403+P233, P405,
P501
CH3COOC2H5 225 - 319 - 336 - EUH066 210 - 240 - 273 -
301+310 -
CH3OH 302+352 -
403+235

Procedimenti:

1) Prima cosa da fare è eseguire un'estrazione per andare a recuperare il più possibile selettivamente i
nostri pigmenti . Eliminare acqua residua da spinaci aggiungendo 12 ml di etanolo a 10 grammi di
spinaci in una beuta e con una spatola andiamo a schiacciarli bene e a miscelarli con etanolo, se
vediamo che quantitativo di etanolo non è sufficiente ne aggiungiamo un altro po’
Estratto verrà scartato ( ci interessa materiale solido) ovvero etanolo che usiamo per estrazione
dopo filtrazione verrà scartato perché acqua può andare ad interferire con la fase di estrazione
successiva

2) Andiamo a versare nostri spinaci in un imbuto dove avremo posizionato un batuffolo di cotone, li
schiacciamo bene in modo da far uscire tutto l’etanolo e infine scarteremo il filtrato etanolico

3) Trasferiremo tutti nostri spinaci dento un altro becker dove avverrà la fase di estrazione con il
dicloro metano CH2Cl2 inseriamo anche il cotone in modo da essere sicuri di non perdere materiale

Fase di estrazione vera e propria di pigmenti che avverrà con diclorometano solvente apolare un po' meno
apolare dell'esano perché clorofilla presenta una parziale polarità

34
Essendo entrambi apolari nessuno dei due si disperderà nell'etanolo utilizzato precedentemente

1) Aggiungiamo 20 ml di CH2Cl2
2) Agitiamo spinaci e CH2Cl2 per un paio di minuti in modo da estrarre quanto più possibile i
carotenoidi e le clorofille
3) Passati due minuti di estrazione dobbiamo filtrare nostra miscela quindi prendiamo batuffolo di
cotone e lo inseriamo in un imbuto schiacciandolo fino in fondo e ci versiamo il nostro miscuglio di
spinaci e CH2Cl2, in un pallone da 100 ml andiamo anche a schiacciare bene gli spinaci in modo da
recuperare quanto più filtrato possibile

4) Nel filtrato sarà presente CH2Cl2 in cui si saranno solubilizzati i carotenoidi e le clorofille
5) Una volta terminata la filtrazione rimuoviamo il tutto e andiamo ad aggiungere al filtrato un paio di
spatole di allumina Al3O3 materiale adsorbente polare nel pallone dopo di che chiudiamo il pallone
e andremo a fare evaporare il nostro solvente dicloruro di metilene nel rotavapor
6) Evaporazione del solvente avverrà nel rotavapor che è uno strumento in grado di applicare una
pressione molto bassa in questo modo diminuisce la t di ebollizione del solvente e siamo in grado di
far evaporare il diclorometano in una t molto bassa di 30 gradi in modo da non andare a degradare
i nostri pigmenti
7) Fissiamo pallone molto bene con una clip e attiviamo la rotazione, chiudiamo il vuoto e abbassiamo
il pallone nel bagnetto termostatico

8) Si può osservare vedere che iniziano già a formarsi delle bolle quindi il solvente sta già evaporando
9) Una volta evaporato tutto il solvente solleviamo il pallone dal bagnetto termostatico, blocchiamo la
rotazione e pian piano andiamo a rompere il vuoto facendo entrare un pochino di aria
10) Si può vedere che ora tutti i nostri pigmenti sono adsorbiti

35
Preparazione colonna cromatografica

1) Prendiamo una colonna di vetro sotto cappa, abbiamo posizionato sul fondo un batuffolo di cotone
che ci servirà a non far scendere la nostra fase stazionaria
2) Dopodichè andremo a formare un letto uniforme di circa mezzo centimetro con della sabbia sopra
il batuffolo di cotone
3) Andiamo a miscelare in un backer nostra fase stazionaria che è l’allumina (polare) a poco a poco
circa 35 ml con l’esano circa 15 ml, quindi versiamo un quantitativo adatto di allumina nel nostro
backer e l’andiamo a disperdere nell’esano e con l’aiuto di una spatola andiamo a miscelarla bene.
Si formerà una pappetta lattea
4) Andiamo a posizionare un imbuto sulla cima della nostra colonna, agitiamo bene nostra allumina e
versiamo velocemente all’interno della colonna
IMPORTANTE: attenzione all’omogeneità dell’allumina e fare in modo che non vada mai a secco
5) Per far stratificare bene l’allumina ed evitare la formazione di cavità e bolle di aria andiamo a
sbattere contro la parete della colonna con un tubicino di gomma

Purificazione dei pigmenti

1) Ora che colonna è pronta andiamo a caricare i nostri pigmenti adsorbiti sull’allumina dalla sommità
2) Sbattiamo ancora con tubicino di gomma
3) Dopodichè con una pipetta pasteur andiamo ad aggiungere dell’esano in modo da risciacquare e
recuperare i residui di allumina dalle pareti
4) Ora andiamo ad aggiungere un po’ di sabbia sulla sommità in modo da formare un letto di circa
mezzo cm
5) Dopo aver posizionato un backer sotto la nostra colonna facciamo scorrere l’esano in modo da
andare a seccare la sommità della colonna ovvero in modo da andare a portare il livello di esano
pari al livello superiore della sabbia

Eluizione

1) Con una pipetta pasteur andiamo a sgocciolare 30 ml di miscela eluente 1 che è composta dal 90% di
esano e dal 10% di acetato di etile, una volta che abbiamo formato un leggero strato di miscela 1
possiamo andare a versare delicatamente il resto facendolo scorrere lungo le pareti

36
2) Andremo ad aprire il rubinetto e inizierà la cromatografia vera e propria ovvero i pigmenti andranno a
ripartirsi tra fase stazionaria e fase mobile in base alla loro affinità chimica e in base alla loro polarità
(attenzione a non seccare la parte alta della colonna, se l’eluente non basta aggiungerne ancora). I
carotenoidi (giallo-arancio; più apolari delle clorofille) viaggeranno velocemente lungo la colonna ed
eluiranno prima delle clorofille (verdi), che si muoveranno più lentamente.
3) Quando inizia ad eluire la banda gialla dei carotenoidi iniziamo a raccoglierli in un backer
4) Come si può vedere (immagine) rispetto alla banda delle clorofille, la banda dei carotenoidi è molto più
chiara questo perché probabilmente c’era un quantitativo di carotenoidi basso nel campione di spinaci
iniziale che potrebbe essere dovuto alla varietà o a processi degradativi che sono avvenuti durante la
preparazione ad esempio processi di blanching o altri fenomeni che hanno portato a una degradazione
di questi pigmenti
5) Quando ha finito di eluire tutta la banda gialla corrispondente ai carotenoidi andiamo a chiudere il
rubinetto e andremo a preparare la seconda miscela con una polarità più elevata e serve per andare a
fare eluire le clorofille
6) Passiamo all’eluizione delle clorofille che sono leggermente più polari dei carotenoidi quindi
procederemo con 30 ml di una soluzione eluente più polare, composta per il 90% da etilacetato e 10%
di metanolo
7) Anche in questo caso andiamo a prelevare qualche ml di fase mobile con una pipetta pasteur e lo
andiamo ad aggiungere delicatamente alla colonna in modo da non andare a rovinare il letto della
colonna
8) Una volta che abbiamo versato qualche ml di fase mobile 2 possiamo procedere a versare direttamente
dal cilindro stando attenti ad essere delicati per non andare a smuovere il letto di allumina
9) Andiamo a posizionare un backer di scarto sotto la colonna e facciamo partire l’eluizione andando ad
aprire il rubinetto e facendo sgocciolare la fase mobile,
10) Quando vediamo che la banda verde inizia ad uscire, mettiamo sotto la colonna il pallone di raccolta,
stiamo raccogliendo le clorofille, una volta che è eluita tutta la banda corrispondente alle clorofille
chiudiamo la colonna

37
Prima miscela quasi del tutto apolare, questa fase mobile farà di che carotenoidi si sposteranno in maniera
più veloce rispetto alle clorofille quindi si vedrà che ( immagine) la banda gialla dei carotenoidi si sposterà
lungo il basso mentre le clorofille rimarranno intrappolate più in alto, quindi andremo ad aggiungere questa
prima fase mobile fino a che i carotenoidi non percorreranno tutta la lunghezza della fase stazionaria e non
verranno eluiti e raccolti in un apposito contenitore

Seconda miscela farà si che banda verde delle clorofille cominci a eluire, cominci a spostarsi verso il basso e
quindi possa essere raccolta in un secondo momento rispetto a quella dei carotenoidi

11) Andremo ad essiccare al rotavapor i pigmenti che abbiamo raccolto per la successiva analisi
spettrofotometrica

Tecnica spettrofotometrica UV-Visibile per determinarne la purezza

1) Come potete osservare abbiamo ridisciolto i nostri carotenoidi e clorofille in esano e gli abbiamo
trasferiti in appositi contenitori chiamati cuvette che servono per effettuare la lettura
spettrofotometrica

2) Andiamo a inserire la cuvetta nello spettrofotometro assieme a una cuvetta che contiene solo esano
che utilizziamo come controllo, chiudiamo e procediamo con la lettura
3) Una volta letto lo spettro di assorbimento dei carotenoidi procediamo alla lettura dello spettro di
assorbimento delle clorofille

Risultati:
Spettro di assorbimento
Carotenoidi, il massimo
di assorbimento risulta
alla lunghezza d’onda di
450 nm mentre non
abbiamo assorbimento
dai 570 nm ai 700 nm,
quindi risulta arancione

La separazione è
avvenuta correttamente

38
 Spettro di assorbimento della
Clorofilla, il massimo di assorbimento
risulta a 420-430 nm per la clorofilla a
a 660-670 nm mentre non abbiamo
assorbimento dai 500 ai 600 nm,
quindi la molecola risulta verde.

La separazione è avvenuta
correttamente

ANALISI/ TEST PER LA DETERMINAZIONE DI AMMINOACIDI E PROTEINE

Prima di effettuare un test, bisogna prendere in considerazione la SOLUBILITA’

Amminoacidi: molecole anfotere (proprietà sia acide che basiche), possono reagire sia con basi che con
acidi per dare sali

La solubilità in acqua dipende dal tipo di amminoacido, ovvero dalla natura del gruppo –R.

In generale gli amminoacidi sono tutti solubili in acqua, mentre non sono solubili in solventi apolari. La

solubilità di ciascun aa può variare in soluzioni acidi o basiche

Determinare la presenza di aa e proteine

Esistono diversi metodi per la determinazione qualitativa e quantitativa degli amino acidi e delle proteine
presenti in un campione alimentare. Alcuni test qualitativi semplici sono

- TLC (cromatografia su stato sottile) per verificare la presenza di amino acidi

- Saggio del biureto per verificare la presenza di proteine

Cromatografia su strato sottile per verificare la presenza di amino acidi: La cromatografia su strato sottile
(Thin Layer Chromatography = TLC), basata sul principio di adsorbimento solido-liquido, si utilizza per
separare una miscela di sostanze nei singoli componenti sfruttando il diverso tipo di interazione che ha
ciascuna sostanza con la fase stazionaria e la fase mobile. E’ utilizzata prevalentemente come analisi
QUALITATIVA.

TLC:

La fase stazionaria è un sottile strato di materiale adsorbente che può essere gel di silice o allumina fatto
aderire su un foglio di alluminio, plastica o vetro. La sostanza da determinare, sciolta in un opportuno
solvente viene depositata sulla lastra (sottoforma di macchie o «spot») e questa viene posta in una “camera
di sviluppo” o “ camera cromatografica” contenete l’eluente (fase mobile)

39
L’eluente sale per capillarità lungo la fase stazionaria. Le sostanze verranno trascinate dall’eluente a
seconda della loro interazione/affinità con la fase stazionaria (meccanismi di ripartizione, adsorbimento,
legami H, ecc.) e con l’eluente stesso. Alla fine della corsa cromatografica avremo sulla lastra tanti spot
quante sono le sostanze presenti nella miscela depositata

Le sostanze possono essere evidenziate visivamente se risultano colorate oppure con una lampada a UV.

ESPERIENZA 6

Solubilità amminoacidi, cromatografia su strato sottile (TLC) e saggi colorimetrici

Prima parte: Studio del profilo i solubilità dei seguenti aminoacidi: lisina, fenilalanina, acido glutammico a
diversi ph e determinare l’amminoacido incognito confrontando il suo profilo di solubilità con gli altri

Lisina: aa basico che presenta due gruppi amminici protonabili

Fenilalanina: neutro con catena laterale apolare fenilalanina

Acido glutammico: acido due gruppi carbossilici deprotonabili

Aminoacido incognito di cui dovremmo determinare l’identità confrontando il suo profilo di solubilità con
quello degli aa standard

Materiali

• 4 provette con tappo

• Micropipetta
• Beacker
• Vortex
• Lisina
• Fenilalanina
• Acido glutammico
• Aminoacido incognito

40
Reagenti

Reagenti Frasi H Frasi P Rischio chimico

NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 310

HCl 280 - 314 - 331 261 - 280 - 305+351+338

- 310 - 410+403

CH3(CH2)3OH 226 - 302 - 318 315 - 335 280 - 302+352 -

– 336 305+351+338 – 313

CuSO4 302 - 315 - 319 410 273 - 305+351+338 -

302+352

Procedimenti:

Prova di solubilità a ph neutro

Mettiamo ciascun campione di aminoacido utilizzando dell’acqua distillata, aggiungiamo 2 ml di acqua,

tappiamo le provette e infine agitiamo brevemente

Possiamo vedere che:

la lisina in poco tempo si è sciolta completamente questo perché la lisina ha due gruppi amminici
protonabili quindi a ph neutro ha due cariche + e una – del gruppo carbossilico quindi è particolarmente
solubile

procediamo con la fenilalanina, possiamo vedere che confrontata con la lisina è molto meno solubile
questo perché ha una catena laterale apolare e inoltre a ph neutro presenta gruppo amminico protonato e
il gruppo e gruppo carbossilico deprotonato quindi è in una forma zwitterionica quindi carica+ bilancia
carica – e aa presenta un minimo di solubilità

passiamo a acido glutammico, possiamo vedere che è parzialmente disciolto in maniera comunque
superiore alla fenilalanina ma molto inferiore alla lisina, a ph neutro presente un gruppo amminico
protonato e 2 gruppi carbossilici deprotonati

adesso proviamo a sciogliere aa incognito possiamo notare che aa incognito si è dissolto immediatamente
in acqua quindi in base al profilo di solubilità a ph neutro possiamo presumere che si tratti di lisina

Ph acido

Utilizzando soluzione di HCl al 10%, questa soluzione farà si che si crei un ph estremamente acido che farà
si che i gruppi carbossilici di questi aa non siano dissociati al contrario tutti i gruppi amminici saranno
protonati e presenteranno quindi una carica +

Iniziamo sempre dalla lisina, a ph acido presenta una solubilità pressochè completa perché entrambi i
gruppi amminici sono protonati e il gruppo carbossilico non è dissociato quindi presenta una carica netta di
+2

41
Passiamo alla fenilalanina possiamo notare che pur non dissolvendosi completamente ha presentato
comunque una solubilità molto migliore a ph acido rispetto a ph neutro questo perché a ph acido gruppo
carbossilico non dissociato mentre quello amminico è protonato quindi molecola presenta una carica
positiva di +1 che la rende + solubile rispetto al suo punto isoelettrico

Acido glutammico possiamo notare che si è solubilizzato in maniera pressochè completa a ph acido e quindi
ha presentato una solubilità maggiore a ph acido rispetto che a ph neutro questo perché entrambi i gruppi
carbossilici sono presenti in forma indissociata mentre il gruppo amminico è protonato, presenta quindi
una carica netta di +1

Passiamo all’aa incognito possiamo vedere che aa incognito si è sciolto immediatamente a ph acido il che è
compatibile con l’ipotesi che abbiamo formulato precedentemente ovvero il fatto che possa trattarsi di
lisina

Ph basico

Utilizzando una soluzione di NaOH al 10% questa soluzione presenterà un ph molto elevato

Agitare con vortex

Lisina: si è solubilizzata completamente a ph basico, gruppi amminici non protonati mentre presenta
gruppo carbossilico dissociato quindi carica netta di -1 che la rende solubile quindi possiamo concludere
che lisina presenta una buona solubilità sia a ph neutro che acido che basico

Fenilalanina: solubilizzata completamente, gr amminico non protonato gr carbossilico dissociato carica

netta -1 che la rende ben solubile in acqua quindi da queste prove di solubilità possiam ocomncludere che
fenilalanina è maggirmente solubile a ph basico

Acido glutammico si è sciolto immediatamente siamo a ph basico quindi entrambi i gruppi carbossilici sono
dissociati e presenta quindi una carica netta di -2 che lo rende molto solubile

Aa incognito possiamo notare una solubilità pressochè completa dell’aa incognito anche a ph basico

Tabella riassuntiva

Solvente
Aminoacido H2O CHl NaOH
Lisina solubile solubile solubile
Fenilalanina insolubile Parzialmente solubile Solubile
Acido glutammico Parzialmente solubile solubile Solubile
Incognito solubile solubile Solubile

Conclusione

Quindi considerato che l’aa incognito si è sciolto bene sia a ph neutro che acido che basico possiamo
concludere per confronto che possa trattarsi di lisina

42
Seconda parte: Cromatografia su strato sottile (TLC)

Scopo : valutazione qualitativa della presenza di amino acidi all’interno di un campione di dado da brodo.

Materiali

• Fenilalanina
• Lisina
• Acido glutammico
• Provette
• Dado da brodo
• Acqua distillata
• Vortex
• Lastrina di gel di silice
• Righello e matita
• Capillare per TLC
• Phon
• Camera di sviluppo TLC (contenitore con coperchio)
• Pinzetta
• Piastra riscaldante

Reagenti

Frasi H Frasi P Rischio chimico

CH3(CH2)3OH 226 - 302 - 318 - 315 - 280 - 302+352 -
335 - 336 305+351+338 - 313

CH3COOH 226 - 314 210 - 208 - 301+330+331

- 303+361+353 -
305+351+338

Procedimenti

1) abbiamo 3 soluzioni standard di aa sciolti in acqua che sono fenilalanina lisina e acido glutammico
2) Andiamo a sciogliere in acqua anche 100 mg di dado di brodo, aggiungiamo 2 ml di acqua,
chiudiamo provetta e agitiamo brevemente con vortex
3) Una volta che dado si è solubilizzato possiamo procedere, prendiamo una lastrina di gel di silice
quindi una lastrina per TLC e con un righello andiamo a tracciare una linea a circa 1 cm dal fondo,
molto importante utilizzare matita e non biro
4) Ora fissiamo 4 punti equidistanti fra di loro in cui andremo a depositare le gocce dei nostri aa
standard e del dado da brodo e andiamo a indicare con una lettera ciascun aa, K lisina, F
fenilalanina, E acido glutammico, D dado da brodo
5) Prendiamo un capillare per TLC che è semplicemente un piccolo tubicino di vetro che aspira il
liquido per capillarità, andiamo ad immergerlo brevemente nella soluzione standard di lisina,
vediamo che liquido è salito per capillarità e molto delicatamente andiamo a puntare una goccia sul
punto indicato per la lisina (solo una goccia)

43
 6) Procediamo nella stessa maniera anche per gli altri aa (usare altri capillari) molto importante che
goccia sia quanto più piccola possibile
7) per ultimo facciamo il campione di dado da brodo
IMPORTANTE che ogni deposizione sia a una dovuta distanza rispetto all'altra in modo che spot non
si vadano a confondere, solitamente almeno 1 cm
8) ora con un phon asciughiamo le goccioline di deposizione degli aa in modo da eliminare l’acqua
9) Prendiamo la camera di sviluppo della TLC che non è altro che un contenitore dotato di coperchio e
andiamo a versare un quantitativo di eluente che deve essere più basso rispetto alla linea di
deposizione degli aminoacidi, un’altezza inferiore a 1 cm (5-10 ml). L’eluente per la TLC è costituito
da 4 parti di normal butanolo, una parte di acido acetico e una parte di acqua, n-butanolo: H2O:
CH3COOH: = 4:1:1 quindi stiamo lavorando con una cromatografia in fase diretta in cui fase
stazionaria è polare e in cui la fase mobile è apolare quindi andiamo a versare un po’ di eluente
nella camera e andiamo ad appoggiare nostra lastrina all’interno della camera di sviluppo.
10) Si può vedere che liquido inizia a salire per capillarità e man mano aa si distribuiranno tra fase
stazionaria e fase mobile in base alla loro polarità ovvero gli aa + polari come lisina saranno più
affini alla fase stazionaria ovvero tenderanno a percorrere una strada minore, gli aa + apolari come
fenilalanina saranno + affini a fase mobile e tenderanno a correre + velocemente
11) al termine, quando fase mobile ha smesso di salire vuol dire che la separazione cromatografica è
terminata quindi possiamo togliere coperchio dalla camera di sviluppo e con l’aiuto di una pinzetta
estraiamo la lastrina e immediatamente andiamo a segnare il fronte del solvente che ci servirà per
calcolare il fattore di ritenzione di ciascun aa
12) adesso asciughiamo lastrina con il phon stando sotto cappa
come possiamo osservare gli aa non sono visibili perché non assorbono nella lunghezza d’onda del
campo del visibile quindi per poterli vedere dobbiamo utilizzare un particolare reagente che è la
ninidrina che va a reagire con gli aminoacidi formando un composto colorato a caldo
immergiamo brevemente lastrina nella ninidrina, la estraiamo, la facciamo asciugare bene sopra la
carta e la mettiamo su una piastra a caldo, con il calore la ninidrina va a reagire e compaiono le
macchie violacee degli aa, ovviamente serve un po’ di tempo per far avvenire la reazione
13) al termine della reazione possiamo andare a visualizzare i percorsi dei vari aa
aminoacido che ha percorso la distanza maggiore è la fenilalanina che è appunto l’aa più apolare
pertanto era più affine alla fase mobile piuttosto che alla fase stazionaria e quindi ha percorso una
distanza maggiore
al 2 posto acido glutammico che ha percorso una distanza inferiore perché comunque ha una
polarità maggiore rispetto alla fenilalanina e quindi tende ad essere + affine a fase stazionaria
ancora inferiore la distanza percorsa dalla lisina che è rimasta ferma perché essendo molto polare è
molto affine alla fase stazionaria
oltre all’approccio visivo vi è un metodo più scientifico per determinare l’identità degli aa che è il
fattore di ritenzione

Calcoli

Fattore di ritenzione: dividere percorso compiuto da ciascun aa per la distanza totale percorsa dal solvente

Distanza percorsa
Solvente 5.9 cm
Lisina (K) 0.8
Fenilalanina (F) 3 cm

44
Acido glutammico (E) 2 cm
Dado da brodo 1.8 cm

La distanza percorsa dall'eluente non si misura dal basso ma dal pto di deposizione della nostra sostanza
Stessa cosa si fa per le sostanze che siamo andati ad analizzare, partendo dal punto di deposizione

Fattore di ritenzione(RF): distanza percorsa dall’amminoacido/ distanza percorsa dall’eluente

0.8 𝑐𝑚
RF lisina= = 0.14 𝑐𝑚
5.9 𝑐𝑚

3 𝑐𝑚
RF fenilalanina =5.9 𝑐𝑚 = 0.51cm

2 𝑐𝑚
RF acido glutammico = 5.9 𝑐𝑚 =0.34 cm

1.8 𝑐𝑚
RF dado da brodo = 5.9 𝑐𝑚 = 0.31 𝑐𝑚

Conclusioni

Al termine della reazione possiamo andare a visualizzare i percorsi dei vari aa, aminoacido che ha percorso
la distanza maggiore è la fenilalanina che è appunto l’aa più apolare pertanto era più affine alla fase mobile
piuttosto che alla fase stazionaria e quindi ha percorso una distanza maggiore

Al secondo posto acido glutammico che ha percorso una distanza inferiore perché ha una polarità
maggiore rispetto alla fenilalanina e quindi tende ad essere + affine a fase stazionaria

ancora inferiore la distanza percorsa dalla lisina che è rimasta ferma perché essendo molto polare è molto
affine alla fase stazionaria

oltre all’approccio visivo vi è un metodo più scientifico per determinare l’identità degli aa che è il fattore di
ritenzione, caratteristico di ciascuna sostanza analizzata, confrontando gli RF degli aminoacidi analizzati
abbiamo verificato che all’interno del dado da brodo è presente acido glutammico in prevalenza ma
possono essere presenti anche altri aminoacidi

terza parte: saggio del biureto

scopo: valutare qualitativamente la presenza di proteine all’interno di un campione

Materiali:

• provette a fondo conico

• pipetta pasteur
• vortex
• lisina
• dado da brodo
• parmigiano
• caseina

45
Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 310

CuSO4 302 - 315 - 319 - 410 273 - 305+351+338 -

302+352

Per le proteine non andiamo ad utilizzare un saggio cromatografico ma un saggio colorimetrico, si utilizza
un reagente il solfato rameico in cui lo ione rameico va a complessarsi nel caso di presenza di proteine con
il legame peptidico quindi in assenza di proteine il solfato rameico rimane del suo colore azzurro, in
presenza di proteine lo ione rameico forma un complesso con il legame peptidico che diventa di colore
viola

se rimane di colore azzurro saggio del biureto negativo quindi nel campione non ci sono proteine

se saggio biureto positivo, soluzione risulterà viola e vorrà dire che nel campione sono presenti proteine

Ioni rameici rimangono in soluzione grazie al tartrato di sodio e potassio in ambiente basico

Il colore che si sviluppa in presenza di proteine (violetto) ha un massimo di assorbimento a 546-550 nm; è
quindi misurabile tramite spettrofotometria. E’ necessario però uno standard a concentrazione nota

Quindi possiamo andare a misurare il massimo di assorbimento del campione che è risultato positivo alla
presenza di peptidi e proteine e possiamo andarlo a confrontare con il massimo assorbimento dato da una
proteina presa come riferimento e così possiamo andare a comprendere la quantità di proteine presenti nel
nostro campione ma questo NON è il metodo ufficiale che si utilizza per andare a determinare in modo
quantitativo la presenza di proteine all'interno di un campione alimentare

Procedimenti

Iniziamo dalla soluzione di lisina: lisina sciolta in ambiente basico, possiamo procedere direttamente al
saggio, 2 ml di lisina sciolti in NaOH 10%, in una provetta a fondo conico, aggiungiamo qualche goccia della
soluzione di solfato rameico, quindi con una pipetta andiamo a prelevare il solfato rameico e ne
aggiungiamo qualche goccia, chiudiamo , agitiamo brevemente con vortex e possiamo vedere che soluzione
rimane azzurra, saggio del biureto è negativo

46
passiamo ora al dado di brodo, dado da brodo sciolto in acqua, andiamo ad aggiungere ulteriori 3 ml di
acqua e andiamo ad aggiungere 2 ml di idrossido di sodio al 10% in modo da creare l’ambiente basico
necessario a fare avvenire la reazione di complessazione, agitiamo brevemente, da questa provetta
preleviamo 2 ml per fare il saggio, quindi anche in questo caso aggiungiamo qualche goccia di solfato
rameico in una provetta a fondo conico , agitiamo e possiamo vedere che il colore nonostante lo sfondo
giallo del dado da brodo rimane comunque azzurro quindi saggio del biureto negativo,

formaggio parmigiano reggiano, prendiamo una provetta con circa 100 mg di parmigiano reggiano andiamo
a scioglierlo in 5 ml di acqua, e 2 ml di idrossido di sodio al 10% che serve a rendere ambiente di reazione
basico, agitiamo per solubilizzare bene le componenti del formaggio, e allo stesso modo andiamo a
prelevare 2 ml di questa soluzione per effettuare saggio del biureto, aggiungiamo qualche goccia di solfato
rameico, agitiamo e possiamo vedere che soluzione diventa di colore viola indice di presenza di legami
peptidici quindi in questo caso di proteine

caseina che è delle proteine maggiormente presente nel latte e prodotti derivati, 100 mg di caseina che
andremo a sciogliere con 5 ml di acqua distillata e a cui andremo ad aggiungere 2 ml di NaOH al 10% che
serve a rendere l’ambiente di reazione basico per favorire la complessazione

agitiamo brevemente per solubilizzare quanto più possibile la caseina, vediamo formazione schiuma perché
caseine sono proteine schiumogene, andiamo a prelevare 2 ml di questa soluzione per fare saggio del
biureto, aggiungiamo qualche goccia di solfato rameico agitiamo brevemente e possiamo vedere colore
viola indice della presenza di proteine

47
Risultati:

mettendo tutti i campione a confronto possiamo vedere che lisina che è un aa non presenta legami
peptidici quindi da un saggio del biureto negativo.

Allo stesso modo è negativo il saggio del biureto effettuato sul dado da brodo poiché il dado da brodo
presenta aa liberi come abbiamo potuto notare dalla cromatografia su strato sottile effettuata in
precedenza ma solitamente non presenta proteine

al contrario saggio nettamente positivo per formaggio e caseina, caseina proteina quindi presenta legami
peptidici e formaggio contiene caseina e siero proteine

ESPERIENZA 7

Sintesi dell’aroma di banana, acetato di isoamile

Scopo: Con questo esperimento andremo a visualizzare come andare a sintetizzare un aroma che potrà
essere utilizzato poi all’interno di un alimento, aroma in questione è aroma di banana cioè acetato di
isoamile

Per la sintesi di questo composto aromatico si utilizzano come reagenti alcool isopentilico e acido acetico
glaciale, alcool + acido secondo la reazione di esterificazione di Fischer daranno un estere, reazione avviene
in ambiente acido quindi aggiungeremo anche acido solforico per creare l’ambiente necessario alla nostra
reazione

48
Materiali:

• pallone da 250 ml • beuta

• pipetta graduata a stantuffo • spatola
• supporto di sughero • filtro a pieghe
• pipetta pasteur • vial
• mantello riscaldante • raccordo a 3 vie
• spatola • refrigerante a tubo di Claisen
• refrigerante a bolle • elastici
• acqua distillata • carta di alluminio
• imbuto separatore • termometro
• cilindro graduato
• beacker

Reagenti

Reagenti Frasi H Frasi P Rischio chimico

C5H11OH H226, H302, H315 , P210, P233, P240, P241,
H318, H332, H335 P242, P243, P261, P264,
P270, P271, P280 ,
P301+P312, P302+P352,
P303+P36 1+P353,
P304+P312, P304+P340,
P3 05+P351+P338, P310,
P312, P321, P330,
P332+P313, P337+P313,
P362, P370+P378,
P403+P233, P403 +P235,
P405, P501
CH3COOH 226 - 314 210 - 208 - 301+330+331
- 303+361+353
305+351+338
H2SO4 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 309+310

Carborundum 315 - 319 - 335 261 - 305+351+338

NaCl // // //
Na2SO4 // // //
NaHCO3 // // //

Procedimenti:

Sintesi aroma di banana:

Prendiamo un pallone da 250 ml, partendo dall’alcool isopentilico C5H11OH misuriamo 8 ml con una pipetta
graduata a stantuffo e lo versione, dopodichè si aggiungono 10 ml di acido acetico glaciale CH3COOH,

49
quindi aggiungiamo circa 2 ml di acido solforico H2SO4 concentrato che viene aggiunto goccia a goccia
utilizzando una pipetta pasteur.

Miscelare.

Al fine di far avvenire la reazione il tutto va posto in ebollizione, utilizzando un mantello riscaldante; per
fare in modo che ebollizione sia omogenea durante reazione di sintesi dobbiamo aggiungere una spatola di
carborundum, fatto ciò posizionare pallone su mantello riscaldante fissandolo sul supporto.

Utilizziamo un refrigerante a bolle per fare in modo che vapori della reazione condensino e ricadano
all’interno del pallone in cui sta avvenendo la sintesi. Una volta azionata acqua di rete possiamo accendere
mantello riscaldante e nel momento in cui liquido all’interno del pallone comincerà a bollire attenderemo
un’ora.

Durante l’ebollizione potremo vedere un imbrunimento della reazione

Dopo un’ora il nostro aroma di banana si sarà formato e dovremo procedere con la purificazione

Aspetto del campione dopo un’ora: campione si è imbrunito e si è formato nostro estere all’interno del
pallone, noi dobbiamo ora andare a purificare quello che è il prodotto di reazione soprattutto andando a
cercare di togliere sostanze scure che si sono formate e i reagenti in eccesso

Purificazione

Scolleghiamo pallone dal refrigerante e versiamo contenuto del nostro pallone all’interno di un imbuto
separatore

La prima purificazione viene effettuata con 30 ml di acqua misurati con un cilindro graduato tramite
un’estrazione liquido-liquido, quindi si versano i 30 ml di acqua distillata all’interno dell’imbuto separatore

si stacca imbuto da apposito supporto, si tappa e si agita la soluzione in modo che si misceli per bene.

Si riaggancia pallone, si toglie il tappo e si procede mettendo all’interno 20 ml di una soluzione di

bicarbonato al 5 % attraverso l’uso di un cilindro graduato, per fare in modo di eliminare l’acido in eccesso,
è una reazione acido base quindi dopo l’aggiunta si sviluppa CO2,

si ripete l’operazione di miscelazione sfiatando.

Questa operazione deve procedere finchè non si ha più la formazione di bolle all’interno dell’imbuto e
quindi di CO2. Effettuata questa operazione una decina di volte possiamo far riposare la nostra miscela

50
agganciando pallone al supporto e togliendo il tappo. Aspettiamo che strato sovrastante quindi nostra
soluzione organica si separi da quella acquosa

Lascio un po di emulsione quando scarico l’acqua per non rischiare di scardare anche l’aroma

Quando vediamo molto bene distinzione possiamo procedere a scaricare la fase acquosa e ripetiamo
un’altra volta l’operazione di basificazione utilizzando sempre la soluzione di bicarbonato al 5%

Procedo con altri 20 ml di carbonato di sodio che aggiungo nell’imbuto separatore, tappo sgancio miscelo e
sfiato anche questa volta per una decina di volte, quando vediamo che sfiatando non si sente più il rumore
della CO2 che esce dal pallone possiamo considerare conclusa l’operazione.

Aggancio pallone, tolgo il tappo e faccio riposare la soluzione.

Possiamo notare che soluzione si sta già stratificando

Nel momento in cui andremo a far scendere la soluzione acquosa sottostante controlleremo il ph e se non
risulterà acido ma verso la neutralità potremmo concludere questa operazione e procedere con la
successiva

Controllo del ph con una cartina tornasole facendo percolare lentamente la soluzione acquosa, come
vediamo il ph raggiunge valori di 8-9 quindi ph basico

51
Possiamo considerare questa operazione conclusa e possiamo procedere con la successiva fase della nostra
purificazione :

aggiungiamo 20 ml di soluzione satura di NaCl alla soluzione organica che è ancora all’interno dell’imbuto
separatore, analogamente a quanto effettuato in precedenza procediamo ad agitare bene nostro imbuto
separatore per fare in modo che nostra soluzione organica e acquosa entrino in contatto, anche in questo
caso sfiatiamo, non è una reazione acido base che produce gas.

Eseguiamo questa operazione una decina di volte

Facciamo riposare nostra soluzione

Adesso andremo a scartare tutto lo strato acquoso. Il nostro strato organico che contiene acetato di
isoamile che dovrebbe essere il più possibile puro a questo punto lo andremo a far percolare in una beuta,
aggiungeremo del solfato di sodio anidro per togliere eventuali umidità e quindi poi lo andremo a filtrare

Facendo percolare l’acqua andremo a rimuovere anche lo strato di emulsione che vediamo al di sopra della
fase acquosa, quello che rimane all’interno del nostro imbuto separatore dovrebbe essere il nostro aroma
di banana il più possibile puro

A questo punto possiamo sversare la soluzione organica in un altro contenitore pulito, una beuta, lo
sversiamo dall’alto

Per andare ad eliminare le eventuali tracce di acqua rimaste all’interno della nostra soluzione organica
metteremo una spatolina o circa 1 g di solfato di sodio anidro, agitiamo controlliamo che solfato di sodio
riesca a raccogliere tutta l’acqua, se vediamo ancora bollicine di acqua all’interno continuiamo ad
aggiungere solfato di sodio anidro.

Dopo l’aggiunta lasciamo il tempo di reagire quindi possiamo andare a filtrare nostra soluzione organica
tramite utilizzo di un filtro a pieghe all’interno di un contenitore pulito

52
Raccogliamo nostro prodotto di reazione che per essere purificato del tutto perché come vediamo colore
della nostra soluzione è un colore giallo ambra e soluzione dovrebbe essere il più possibile trasparente

Per eliminare queste impurezze non volatili andremo ad effettuare una distillazione semplice sul nostro
filtrato appena ottenuto che è una soluzione limpida

Presenti impurezze non volatili quindi per eliminarle possiamo utilizzare distillazione semplice, se reazione
non fosse andata a compimento avremmo avuto all’interno anche alcool che ha punto di ebollizione vicino
e quindi non avremmo potuto usare distillazione semplice

Distillazione semplice dell’aroma di banana sintetizzato nella parte precedente

Nostro campione di banana da distillare è contenuto in un apposito contenitore vial

Per la distillazione servirà il mantello riscaldante, un pallone da 250 o 500 ml in cui inseriremo nostro
campione da distillare, un raccordo a 3 vie che va montato sopra il pallone che si usa per il riscaldamento,
un refrigerante a tubo di Claisen cioè all’interno vi è un tubo di vetro lineare che fungerà da condensatore,
alla fine del nostro refrigerante metteremo una curva e un pallone di raccolta.

Per fissare il refrigerante al sistema utilizzeremo dei semplici elastici, a questo punto prima canula può
essere inserita, nella parte finale del refrigerante inseriremo una curva anch’essa fissata con gli elastici e
anche qui fatto ciò possiamo collegare il tutto all’acqua di rete.

53
Possiamo andare ad azionare acqua di rete e a questo punto tramite utilizzo di una pipetta pasteur
possiamo inserire campione all’interno del nostro pallone

Una volta inserito il campione, al di sopra del raccordo a tre vie va inserito un termometro che servirà per
andare a leggere quella che è la temperatura dei vapori che si svilupperanno dal nostro riscaldamento

Per fare in modo che tutta la nostra apparecchiatura rimanga in temperatura nel momento in cui andiamo
ad azionare il riscaldamento, possiamo andare a ricoprire le varie parti con della carta di allumini, questa
per far si di non disperdere troppo il calore

Ultima cosa necessaria prima di iniziare il riscaldamento, bisogna aggiungere una punta di spatola di
carborundum al sistema, quindi si sfila un attimo termometro con una spatola si inserisce carborundum
dall’alto e riposizioniamo termometro.

Possiamo attivare riscaldamento, impostare 250 su piastra riscaldante possiamo osservare quando
campione ha iniziato sua ebollizione , quindi pian piano vapori saliranno verso l’alto , condenseranno e
verranno raccolti nell’apposito pallone

Se il liquido che si sta distillando è puro, la temperatura letta sul termometro nel momento in cui la
distillazione ha inizio (formazione di vapore) sarà uguale alla temperatura di ebollizione del liquido stesso e
rimarrà costante per tutta la durata del processo. Se si sta distillando una miscela, la temperatura iniziale
(temperatura della testa) sarà diversa (più bassa) così come la temperatura finale (temperatura della coda)

Una volta che lo sgocciolamento si fermerà avremo raccolto tutto il nostro distillato nel pallone di raccolta
e a quel punto sarà puro

Il prodotto ottenuto, acetato di isopentile, verrà pesato conservato in una vial (contenitore di vetro con
tappo a vite e setto in teflon) per essere analizzato mediante Gascromatografia accoppiata a spettrometria
di massa (GC-MS) per determinare la purezza.

54
Esercizi

1) Per la sintesi dell’aroma di banana si sono utilizzati 15 ml di alcol isopentilico (d = 0,809 g/ml; pm =
88,15 g/mol) e 20 ml di acido acetico (d = 1,05 g/ml; pm = 60 g/mol). Calcolare le moli di prodotto
che si possono ottenere
𝑚 𝑔
d= 𝑉
→ 𝑚 = 𝑑𝑥𝑉 → 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑎𝑙𝑐𝑜𝑜𝑙 𝑖𝑠𝑜𝑝𝑒𝑛𝑡𝑖𝑙𝑖𝑐𝑜 = 0.809 𝑚𝑙 𝑥 15 𝑚𝑙 = 12,14 𝑔

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒 12.4 𝑔

N moli alcool isopentilico = 𝑀𝑀
→ 𝑛 𝑚𝑜𝑙𝑖 = 88.15 𝑔/𝑚𝑜𝑙
= 0.140 𝑚𝑜𝑙

𝑚 𝑔
d= 𝑉
→ 𝑚 = 𝑑𝑥𝑉 → 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑔𝑙𝑎𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒 = 1.05 𝑚𝑙 𝑥 20 𝑚𝑙 = 21 𝑔

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒 21 𝑔
N moli acido acetico glaciale = → 𝑛 𝑚𝑜𝑙𝑖 = 𝑔 = 0.35 𝑚𝑜𝑙
𝑀𝑀 60
𝑚𝑜𝑙

Alcool isopentilico è quindi il reagente limitante della reazione di esterificazione che da come prodotto
l’acetato di isopentile, quindi essendo il rapporto tra reagente limitante e prodotto 1:1, in questo caso si
formeranno 0.140 mol di acetato di isopentile

2) In seguito a distillazione, si è registrato il peso del prodotto ottenuto che è risultato essere pari a
0,679 g
Calcolare la resa della reazione (P.M.acetato di isopentile = 130.19 g/mol)
𝑔
Grammi teorici di acetato di isopentile= 0.140 𝑚𝑜𝑙 𝑥 130.19 𝑚𝑜𝑙 = 17.9 𝑔

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑜𝑡𝑡𝑜 𝑜𝑡𝑡𝑒𝑛𝑢𝑡𝑖 0.679 𝑔

Resa % = 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑖
𝑥 100 = 17.9 𝑔
x 100 = 3.79 %

Risultati

Calcoliamo i grammi di acetato di isopentile che abbiamo sintetizzato con il nostro esperimento utilizzando
le formule riportate negli esercizi:

Dati
𝑑𝑥𝑉
8 ml di alcool isopentilico (MM 88.15 g/mol , d= 0.809 g/mol) -> n moli= 𝑀𝑀 = 0.0734 𝑚𝑜𝑙

𝑑𝑥𝑉
10 mL acido acetico glaciale (M.M. = 60 g/mol, d = 1,05 g/mL ) ) -> n moli= 𝑀𝑀 = 0.175 mol

Reagente limitante: alcool isopentilico, moli di acetato di isopentile risultano quindi essere 0.0734 mol
𝑔
Grammi teorici di acetato di isopentile= 0.0734 𝑚𝑜𝑙 𝑥 130.19 𝑚𝑜𝑙 = 9.5559 𝑔

55
ESPERIENZA 8

Comportamento dei coloranti naturali in conseguenza a variazione di ph

Scopo: andare a verificare quale sia il comportamento della clorofilla contenuta in campioni di piselli in
diverse condizioni di ph

Materiali

• piselli surgelati
• piselli in scatola
• cucchiaio
• aceto
• pipetta pasteur
• baker da 100 ml
• spatola
• cartina tornasole
• carta assorbente

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

NaHCO3 // // //
NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 310

CuSO4 302 - 315 - 319 - 410 273 - 305+351+338 -

302+352

Procedimenti:

Prendiamo 5 beaker da 100 ml e prepariamo i campioni: Preparo 6 provette da 50ml contenenti ciascuna
5mL, misurati con la pipetta di vetro a stantuffo, della soluzione di succo di mirtillo diluito.

prendiamo come riferimento un campione di piselli surgelati, si posizionano alcuni piselli 20 g in ciascuno
dei baker

1) baker che prenderemo come riferimento allungheremo i piselli con 70 ml di soluzione acquosa
2) aggiungere circa 70 mL di acqua e 10 mL di aceto con pipetta pasteur, ambiente basico
3) aggiungere circa 70 mL di acqua e 10 mL di NaOH 1M con pipetta pasteur.ambiente fortemente
basico
4) aggiungere circa 70 mL di acqua e 2g di NaHCO3 con una spatolina, ambiente basico ma non
fortemente
5) utilizzeremo come controllo un campione di piselli in scatola in cui e aggiungeremo 70 mL di acqua
con pipetta pasteur e una punta di spatola di solfato rameico (CuSO4). Piselli in scatola hanno
subito un trattamento ad alta temperatura e ambiente acido dato da acido citrico o ascorbico
aggiunto come conservante quindi in questo caso presenteranno un colore già degradato perché
clorofilla ha subito degradazione e si presenta come feofitina quindi di colore verde oliva

56
Andiamo a miscelare i nostri campioni con l’uso di una spatola

Attenzione nel baker dove è stato aggiunto bicarbonato miscelare bene perché il bicarbonato si deve
disperdere bene in acqua anche per l’ultimo rame si deve disperdere

Una volta miscelate e dopo aver fatto riposare le soluzioni andiamo a misurare il ph attraverso l’utilizzo
della cartina tornasole

1. ph 7
2. ph acido circa 3
3. ph basico fortemente 14
4. ph debolmente basico tra 8 e 9
5. ph verso il 5 debolmente acido

valutiamo consistenza

per ciascun campione preleviamo un pisello e lo posizioniamo sulla carta assorbente o sulla carta da filtro

aspetto visivo è chiaramente quello iniziale

consistenza: possiamo schiacciare i piselli con il cucchiaino e annotare un leggero rammollimento del
campione che è stato messo a contatto con il bicarbonato, per quanto riguarda gli altri campioni la
consistenza è pressochè identica a quella iniziale

57
Dopo bollitura

vediamo cosa succede a caldo posizionando quindi i campioni sulla piastra riscaldante, lasciamo bollire per
7 minuti e poi rifacciamo questa valutazione dopo averli lasciati raffreddare

preleviamo un pisello per andarlo a confrontare con il pisello iniziale

1. piselli mantenuto loro colore e loro consistenza

2. cambiamento del colore, clorofilla si è degradata passando da clorofilla a feofitina e feoforbide
quindi abbiamo provocato degradazione clorofilla e il campione ha assunto il colore verde oliva
3. clorofilla che è una molecola abbastanza stabile a ph basico ha mantenuto il colore ma la
consistenza non è più quella iniziale perché il campione si sfalda
4. campione mantenuto colore ma consistenza non è più quella iniziale, campione si sfalda
5. campione ha ripreso colore, colore è tornato verde, è un verde blu siamo quindi andati a
stabilizzare quella che era la clorofilla che si era degradata inizialmente e quindi ora il colore del
campione assomiglia a quello naturale dei piselli

Risultati

Clorofille sono le responsabili del colore verde delle foglie dei vegetali e dei frutti non ancora maturi

Struttura caratterizzata da anello porfirinico nel quale si trova un atomo di Mg (clorofille naturali). Nelle
clorofille sintetiche, il Mg è sostituito da un atomo di Cu che rende la struttura più stabile ai trattamenti
tecnologici. La porfina è il nucleo che contiene i 4 anelli pirrolici, la forbina è la struttura base della clorofilla
che comprende anche l’anello a 5 atomi di C legato alla porfina

Clorofille naturali: molecole instabili al pH, temperatura,

presenza di enzimi (clorofillasi). Si alterano, perdendo le
proprietà biologiche e quelle coloranti (variazione di colore).

Clorofillasi rompe legame tra anello porfirinico e fitolo

Queste sostanze tendono ad avere un colore verde scuro o

verde oliva

58
 Per quanto riguarda la parte dell’esperimento
effettuata a temperatura ambiente abbiamo
potuto verificare che la clorofilla non subisce
variazioni a ph acidi o tendenti al neutro mentre
a ph basici in particolare nel campione 3 e 4
dove avevamo rispettivamente aggiunto NaOH e
NaHCO3 il colore rimane invariato ma i piselli
subiscono un rammollimento

Dopo bollitura abbiamo invece verificato che la consistenza dei piselli dei campioni a ph basico cioè il 4 e il
5 si sfaldano completamente dimostrando che clorofilla che è una molecola abbastanza stabile a ph basico
ha mantenuto il colore ma la consistenza non è più quella iniziale

A ph acido invece (campione 2) vi è stato un cambiamento del colore, clorofilla si è degradata passando da
clorofilla a feofitina e feoforbide quindi abbiamo provocato degradazione clorofilla e il campione ha
assunto il colore verde oliva

Il quinto campione invece, che conteneva piselli in scatola, ph leggermente acido intorno a 5 e solfato
rameico ha ripreso colore, colore è tornato verde, è un verde blu siamo quindi andati a stabilizzare quella
che era la clorofilla che si era degradata inizialmente e quindi ora il colore del campione assomiglia a quello
naturale dei piselli

Ciò dimostra che l’aggiunta di solfato rameico provoca la conversione della clorofilla in clorofilla più stabile
(sostituzione atomo di Mg con Cu, E141)

ESPERIENZA 9

Valuteremo quale è il comportamento dei coloranti naturali presenti all’interno del succo di
mirtillo ovvero gli antociani in base alle condizioni di ph in cui essi si trovano

Materiali:

• 6 provette da 50 ml con tappo

• Succo di mirtillo diluito
• Acqua distillata
• Pipette di vetro a stantuffo

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 310

HCl 280 - 314 - 331 261 - 280 - 305+351+338

- 310 - 410+403

59
Procedimenti

Preparare 6 provette da 50ml contenenti ciascuna 5ml della soluzione di succo di mirtillo diluito.

Portare quindi a 50 ml ciascun campione utilizzando i seguenti:

1) acqua (controllo)

2) HCl 0.1M

3) tampone acetato a pH 5

4) tampone fosfato a pH 7

5) tampone borato a pH 10

6) NaOH 0.1

Misceliamo e confrontiamo il risultato con il controllo: si vede chiaramente come il controllo abbia un
colore naturale quindi viola pallido, nel momento in cui mettiamo succo di mirtilllo a contatto con HCL
quindi in ambiente fortemente acido, in presenza di ioni H+ abbiamo una protonazione della molecola degli
antociani quindi il colore diventa un po’ più sul rosso, mentre invece quando mettiamo la soda quindi
ambiente fortemente basico il colore degli antociani tende a diventare giallo verde

Vediamo ora cosa accade in condizioni di ph intermedie

1) Ph 5 utilizzando un tampone acetato

2) Ph 7 utilizzando un tampone fosfato
3) Ph 10 utilizzando un tampone borato

Ricordiamo che il controllo in acqua non è esattamente a ph 7 perché il succo di mirtillo è debolmente
acido quindi il ph sarà circa 6

Aggiungiamo a ciascuno di questi 3 campioni 5 ml di succo di mirtillo misceliamo e confrontiamo poi con il
controllo

1) Colore molto simile perché l’ambiente è abbastanza simile, quindi il colore rosa si è mantenuto
quasi inalterato
2) Andando verso la neutralizzazione di quello che è il naturale ambiente acido del succo di mirtillo il
colore tende a iscurire, tende al grigio
3) Andando verso il ph fortemente basico il colore è comunque scuro ma tende ad andare verso il
giallo-verde come nel caso dell’ambiente fortemente basico dato dalla presenza di NaOH

Quindi se dovessimo mettere in scala i nostri campioni potremmo passare dal campione messo in HCl con
quello del tampone acetato a ph 5 , campione tal quale disperso in acqua, il tampone fosfato a ph 7, il
tampone borato a ph 10, e il campione con NaOH quindi ph fortemente basico ph 14

Colore passa dal rosso al rosa viola naturale per poi inscurirsi verso il grigio e passando poi al giallo verde

60
Risultati:

Variazione di colore degli antociani in base a condizioni: ciò che può far variare la colorazione degli
antociani è il pH così come la possibile formazioni di addotti con altre sostanze come ad esempio il solfuro
biossido utilizzato in enologia (decolorazione). In questo esperimento abbiamo dimostrato la variazione di
colore degli antociani in seguito a variazioni di ph
AMBIENTE ACIDO: succo di mirtillo a
contatto con HCL quindi in ambiente
fortemente acido, in presenza di ioni H+
abbiamo una protonazione della molecola
degli antociani quindi il colore diventa un
po’ più sul rosso

AMBIENTE BASICO: quando mettiamo

succo di mirtillo in soluzione con la soda
quindi ambiente fortemente basico il
colore degli antociani tende a diventare
giallo verde

AMBIENTE NEUTRO: soluzione succo di

mirtillo disciolta in non è esattamente a ph
7 perché il succo di mirtillo è debolmente
acido quindi il ph sarà circa 6 e ha per
questo un colore naturale quindi viola
pallido

A ph 5 circa con aggiunta del tampone acetato il colore è molto simile al campione di controllo con solo
acqua, perché l’ambiente è abbastanza simile, quindi il colore rosa si è mantenuto quasi inalterato

A Ph 7 dove abbiamo aggiunto un tampone fosfato, andando verso la neutralizzazione di quello che è il
naturale ambiente acido del succo di mirtillo il colore tende a iscurire, tende al grigio, poiché abbiamo
innalzato leggermente il ph

A ph 10 dove abbiamo aggiunto tampone borato, andando verso il ph fortemente basico il colore è
comunque scuro ma tende ad andare verso il giallo-verde come nel caso dell’ambiente fortemente basico
dato dalla presenza di NaOH

61
ESPERIENZA 10

Studio andamento reazione di Maillard

Reazione di maillard è una reazione che avviene tra gli zuccheri e gli amminoacidi all’interno degli alimenti,
noi studieremo in particolare la reazione tra glucosio e amminoacidi e utilizzeremo anche il saccarosio e lo
faremo reagire con un aa

Materiali:

• Glucosio • 5 provette
• Saccarosio • baker
• Alanina • Piastra risaldante
• Arginina • Carta stagnola
• Lisina • Parafilm
• Serina • Acqua distillata
Per la nostra reazione utilizzeremo glucosio e lo sottoporremo a reazione con 4 diversi aa:

1) Alanina
2) Arginina
3) Lisina
4) Serina

Per il saccarosio utilizzeremo solo ed esclusivamente l’arginina

Procedimenti

Per la reazione scioglieremo zuccheri e aa in acqua e utilizzeremo come temperatura quella di ebollizione
quindi 100 gradi, lasceremo sul bagnetto a caldo le nostre provette per un’ora e monitoreremo la reazione
ogni 10 15 minuti per capire qual è l’andamento della reazione a seconda dell’aa che stiamo utilizzando

Prepariamo quindi le provette: 4 che contengono glucosio e una che contiene saccarosio, quindi andiamo
ad aggiungere in ciascuna provetta 50 mg di glucosio, nella quinta provetta aggiungeremo il saccarosio

Fatto ciò occupiamoci degli aa

Nella provetta numero 1 con il glucosio aggiungeremo 50 mg di alanina

Provetta 2 con glucosio aggiungeremo 50 mg di arginina

Provetta 3 con glucosio aggiungeremo 50 mg di lisina

Provetta numero 4 con glucosio aggiungeremo 50 mg di serina

Provetta numero 5 con saccarosio aggiungeremo 50 mg di arginina

Adesso scioglieremo i nostri aa e zuccheri con circa 1 ml di acqua distillata, aggiungere l’acqua a tutte e 5 le
provette.

Mescoliamo delicatamente cercando di sciogliere contenuto di ciascuna delle nostre provette, ciò che non
si scioglierà si scioglierà successivamente quando sottoporremo i campioni ad alta temperatura

62
Per far si che acqua all’interno delle provette non evapori durante il riscaldamento dovremo ricoprire le
nostre provette con la carta di alluminio e sopra aggiungiamo il parafilm in modo da sigillare la provetta.
Fare attenzione a non coprire la scritta deve rimanere ben visibile per capire qual è il campione che sta
reagendo durante il riscaldamento

Applicato anche il parafilm potremo andare a inserire le provette nel bagnetto termostatato che abbiamo
preventivamente scaldato a 100 gradi

Inseriamo le provette cercando di girarle in modo che scritta rimanga visibile

Monitorare il tempo di un’ora, ogni 10/ 15 minuti monitoreremo le provette per capire quale aa sta
incominciando a reagire con gli zuccheri e quale no

Dopo 15 minuti la provetta numero 2 con glucosio e arginina si è gia colorata in giallo, quindi questo aa è
maggiormente reattivo rispetto agli altri aa che abbiamo considerato e quindi la reazione ha già prodotto
dei composti colorati

Dopo 30 minuti dall’inizio della reazione la soluzione contenente glucosio e arginina si è inscurita molto
quindi si sono formati le melanoidine i composti bruni, le altre reazioni sono ancora incolore

Dopo 1 ora dall’inizio della reazione facciamo raffreddare le nostre provette e quando sono a t ambiente
valutiamo colore e odore dei nostri campioni

COLORE

1) Glucosio e alanina colore giallo pallido

2) Glucosio e arginina colore bruno scuro
3) Glucosio e lisina colore giallo molto molto pallido
4) Glucosio e serina è rimasta praticamente incolore
5) Saccarosio e arginina anch’essa praticamente incolore

ODORE aprire nostre provette avvicinarle al nostro naso e annusarle

1) Glucosio e alanina odore che ricorda il fruttato

2) Glucosio e arginina odore è praticamente inconsistente nonostante il colore bruno scuro
3) Glucosio e lisina odore dolce di caramello
4) Glucosio e serina odore che ricorda il fruttato
5) Saccarosio e arginina odore praticamente inconsistente

63
Risultati

Possiamo concludere che i nostri aa reagiscono in modo diverso con gli zuccheri, dando in alcuni casi
composti colorati ma nessun tipo di aroma mentre in altri casi dando aromi ma nessun composto che può
conferire colore agli alimenti

Nel momento in cui utilizziamo il saccarosio che è uno zucchero non riducente la reazione con gli aa non
avviene

ESPERIENZA 11

Alginati

Scopo: Verificheremo comportamento di alcuni gelificanti alimentari che si utilizzano solitamente per
produrre le gelatine quindi caramelle gelatinose o altre preparazioni come la gelatina di carne di pesce e di
verdura

Materiali

• Beaker
• Coloranti alimentari
• Provette
• Cucchiaino
• Carta da filtro

Reagenti

Frasi H Frasi P Pericolo chimico

CaCl2 319 305+351+338

MgCl2 319, 335

Alginato di sodio // // //

Procedimenti

Abbiamo preparato 4 soluzioni di alginato di sodio all’1% in acqua (1 g di alginato di sodio in 100mL in H2O)
e abbiamo aggiunto a queste soluzioni diversi coloranti alimentari

Primo colorante amaranto, secondo colorante di colore blu ed è erioglaucina A, terzo tartrazina che è giallo
e il quarto colorante è il fast green di colore verde petrolio

Utilizzeremo per la reazione di gelificazione una soluzione 5% CaCl2 in H2O (5 g CaCl2 in 100ml H2O)
perché serve uno ione bivalente ovvero il calcio 2+ perché esso si va a complessare con gli alginati quindi

64
con la struttura molecolare dell’alginato e la struttura molecolare che si viene a formare è in grado di
inglobare acqua e quindi di formare un gel

Per la reazione di gelificazione utilizzeremo quindi la nostra soluzione di cloruro di calcio contenente ioni
calcio 2+ la metteremo in un backerino, e per formare un gel faremo cadere la soluzione di alginato
all’interno della soluzione contenente calcio

Partiamo con colorante rosso, lo preleviamo con una pipetta e facciamo cadere 3 gocce all’interno della
nostra soluzione, lasciamo reagire un attimo quindi possiamo andare ad estrarre il nostro gel che si è gia
formato, lo facciamo riposare su carta da filtro, e come si può osservare si è formato un gel che deve
riposare, si deve seccare e una volta essiccato avrà le caratteristiche di una gelatina

Possiamo provare anche con le altre soluzioni colorate

Quella blu: possiamo cercare di creare delle palline di gel più consistenti semplicemente andando a
schiacciare di più la nostra pipetta, preleviamo e facciamo riposare sulla carta da filtro

Ora soluzione gialla: facciamo la stessa cosa

Soluzione verde petrolio: stessa cosa, si può osservare che alginato in contatto con cloruro di calcio forma
immediatamente un gel

Risultati

Si possono formare gel di diversi colori utilizzando diversi coloranti, e se si utilizza contemporaneamente al
colorante un’aroma alimentare alla fine avremo quello che andrà a formare una caramella gommosa

Gli alginati poi formati in questo modo per la produzione delle caramelle gommose vengono messi in
stampini, lasciati essiccare per diverso tempo, vengono poi ricoperti di zucchero e in questo modo si hanno
le caramelle gommose

Come si può osservare il nostro è ancora molto acquoso, quindi ha bisogno di essiccarsi ma si riesce già a
prelevare con l’aiuto di una spatola

Gli alginati fanno parte della «famiglia» dei polisaccaridi, questi composti vengono sciolti in acqua ma loro
viscosità è molto bassa, nel momento in cui queste molecole vengono a contatto con i cationi soprattutto
divalenti ecco li aumenta loro viscosità e loro capacità di inglobare acqua

Struttura dell’alginato: acidi β-D-mannuronico e α-L-

guluronico, legame 1 → 4

65
I blocchi di acido mannuronico (M-block) hanno una struttura lineare a causa della presenza di legami
equatoriali tra le subunità monomeriche, mentre i blocchi di acido guluronico (G-block) hanno un
andamento corrugato a causa della presenza di legami glicosidici assiali. Le regioni G-block, in presenza di
ioni calcio, tendono ad aggregarsi formando strutture caratteristiche dette “ egg box” e questa reattività è
una conseguenza diretta della particolare geometria molecolare di queste regioni, questa interazioni ioni
calcio e G block riesce a coordinare i gruppi di acido guluronico

ESPERIENZA 12

Emulsioni e TLC per la determinazione della presenza di colesterolo

Prima parte: Comportamento, formazione e stabilità emulsioni, ci occuperemo in particolare sia di

emulsione o/w e w/o, le emulsioni olio in acqua fase dispersa costituita da olio, fase continua da
acqua

Materiali:

• sudan red
• olio vegetale
• tuorlo d’uovo
• Span
• Decaetilene glicole monododecil etere
• lecitina di soia
• SDS
• Pipetta pasteur
• Provette con tappo

Reagenti

Frasi H Frasi P Rischio chimico

Sudan red 350 201-202-281-308+313-
405-501

66
Procedimenti:

Iniziamo da emulsioni o/w studieremo stabilità e formazione in presenza di nessun emulsionante, e con la
presenza di diversi emulsionanti con valori diversi di HLB nelle provette da 2 a 6

attenzione quando aggiungiamo emulsionante sciacquare bene tutto l’interno della pasteur in modo da
recuperare tutto l’emulsionante

iniziamo mettendo 2 ml di olio e 8 ml di acqua nelle provette, olio rosso perché Abbiamo colorato l’olio di
semi con una piccolissima q di colorante sudan red affinchè olio diventasse rosso per visualizzare meglio
separazione di fase

Preparare le seguenti emulsioni in provette con tappo da 15 ml

provetta 1 no emulsionante

provetta 2: 0.1 ml di span

provetta 3: 0.1 g lecitina di soia precedentemente pesata, agitare per farla solubilizzare

provetta 4: tuorlo d’uovo, più idrofilo quindi iniziando aggiungendo 8 ml di acqua, prelevare tuorlo d’uovo
con pasteur (sciacquare) e infine aggiungiamo 2 ml di olio

provetta 5: decaetilene glicole monodecil etere abbastanza idrofilo quindi in questo caso aggiungiamo
prima gli 8 ml di acqua, siccome emulsionante è molto denso preleviamo prima un pochino di acqua e
andiamo a recuperarlo direttamente nella Effendorf poi aggiunta olio si può osservare anche formazione di
schiuma

provetta 6 SDS: 2 ml di olio, SDS 0.1 grammi già pesati, e 8 ml di acqua

si può osservare una netta separazione di fase tra la fase acquosa e la fase oleosa colorata in rosso dal
sultan red nella parte superiore

adesso andremo ad agitare le provette per almeno 30 s in modo da mescolare le due fasi ed ottenere
quindi un’emulsione

Risultati

dopo 30 secondi mettiamo nostre provette a riposo, possiamo osservare che si è formata una fase continua
ma alcune iniziano già a separarsi per il fenomeno della coalescenza ovvero le piccole goccioline della fase
dispersa tendono a riunirsi, in questo caso olio meno denso dell’acqua tende a galleggiare sopra di essa

possiamo notare che provetta 5 con decaetilene glicole monocel etere si è già separata quindi possiamo
dire che questo emulsionante è il meno adatto alla stabilizzazione di emulsioni olio in acqua

possiamo notare che si stanno iniziando anche a separare provetta 1 di controllo e provetta 6 con SDS

quindi la prima provetta in cui abbiamo notato la rottura dell’emulsione e quindi la separazione di fase è la
provetta 5 a seguire provetta 1 di controllo e provetta 6 con SDS

provetta 2 3 4 continuano a mostrare un’emulsione uniforme senza separazione di fase

67
dopo 5 minuti inizia a mostrarsi una leggera separazione di fase nella provetta 4 con tuorlo d’uovo, base un
po’ più chiara mentre le goccioline di olio stanno avendo fenomeno coalescenza e stanno salendo verso
l’alto

anche nel caso della lecitina di soia provetta 3 fenomeno è meno evidente ma inizia a schiarirsi un po’ il
fondo della provetta e a diventare + rosso l’alto

provetta con spam presenta ancora un’emulsione continua

dopo 10 minuti possiamo notare che si è quasi completata la separazione di fase nella provetta 4

provetta 2 e 3 ancora stabili in particolare provetta 2, 1 5 e 6 completamente separate

dopo 30 minuti

separate quasi tutte le emulsioni tranne emulsione2 che risulta ancora omogenea

Per emulsioni olio in acqua emulsionante in ordine di efficacia:

Span, lecitina di soia, tuorlo d’uovo, SDS, decaetilene glicole monocel etere

seconda parte: valutazione e stabilità emulsioni acqua in olio in cui fase dispersa è acqua, fase continua olio

anche in questo caso olio di semi è stato precedentemente colorato con una piccola quantità di sultan red

provetta 1 : di controllo no emulsionante: 8 ml di olio, 2 ml di acqua

provetta 2: 8 ml di olio, con pipetta pasteur andiamo ad aggiungere 0.1 ml di span precedentemente
aliquotati in una provettina monouso, li depositiamo all’interno dell’olio e sciacquiamo molto bene pipetta
pasteur aspirando e scaricando diverse volte in modo da recuperare tutto l’emulsionante infine
aggiungiamo i 2 ml di acqua

provetta 3: 8 ml di olio, 0.1 g di lecitina precedentemente pesati, agitiamo per sciogliere il + possibile la
lecitina che è contituità tendenzialmente da fosfolipidi, infine aggiungiamo 2 ml di acqua

provetta 4 : aggiungiamo prima acqua perché tuorlo più solubile in acqua, quindi aggiungiamo 2 ml di acqua
poi tramite pipetta pasteur aggiungiamo 0.1 ml di tuorlo d’ovo precedentemente aliquotati, anche in
questo caso emulsionante molto denso quindi dobbiamo immergere sciacquare bene pipetta pasteaur in
modo da recuperare tutto l’emulsionante, infine aggiungiamo 8 ml di olio

68
provetta 5: più solubile in acqua quindi anche in questo caso andiamo ad aggiungere prima i 2 ml di acqua,
poi aggiungiamo emulsionante che però essendo molto denso come abbiamo fatto prima andiamo a
prelevare l’acqua e a recuperare direttamente l’emulsionante dalla provettina, facciamo diversi risciacqui,
infine aggiungiamo 8 ml di olio. Osserviamo formazione di schiuma

provetta 6: aggiungiamo 8 ml di olio, 0.1 g di SDS precedentemente pesati, infine 2 ml di acqua. Agitiamo
bene

in questo caso si può osservare che strato acquoso si deposita sul fondo, mentre strato oleoso rimane
sopra

andiamo ad agitare nostre provette in modo formare un’emulsione continua

Risultati

dopo 30 s : in assenza di emulsionante si nota già una separazione di fase che è già pressochè terminata
dopo l’agitazione, per gli altri emulsionanti continua ad esserci un’emulsione omogenea

dopo 5 minuti : separazione fasi in assenza di emulsionanti è pressochè completa, e si è avuto separazione
di fase anche nella provetta 3 con lecitina di soia . Anche nella provetta 6 SDS inizia a depositarsi un
pochino di acqua sul fondo della provetta quindi iniziamo ad avere una certa separazione di fase

dopo 10 minuti : possiamo notare 2 fasi chiaramente distinte in assenza di emulsionanti nella provetta 1 ,
separazione di fase terminata anche nella provetta 3 con lecitina, c’è stata una separazione di fase anche
nella provetta 4 con il tuorlo più difficile da notare per il colore simile ma notare bene linea di
demarcazione tra le due fasi, anche nella provetta 6 SDS si è avuta separazione di fase

al contrario provetta 5 con decaetilene glicole monocel etere presenta ancora un’emulsione continua così
come provetta 2 con span

dopo 1 h : è terminata la separazione di fase nella provetta 4 con tuorlo, si è separato molto bene provetta
6 con SDS, abbiamo avuto separazione di fase anche nella provetta 5. Anche provetta 2 ha visto rottura
dell’emulsione con separazione delle due fasi

Per emulsioni acqua in olio emulsionanti per ordine di efficacia:

Span, decaetilene glicole monocel etere, tuorlo d’uovo ,SDS, lecitina di soia

69
 Quando abbiamo un
valore HLB basso vuol
dire che abbiamo un
alto numero, è
maggiore il contributo
dei gruppi idrofobici

Un emulsionante che presenta un gruppo lipofilo forte e un gruppo idrofilo debole, sarà maggiormente
solubile in olio rispetto all’acqua e quindi stabilizzerà un’emulsione w/o. Un emulsionante che presenta un
gruppo idrofilo forte e un gruppo lipofilo debole stabilizzerà meglio un’emulsione o/w perché
maggiormente solubile in acqua. Scelta dell’emulsionante in base a emulsione da stabilizzare e quindi alla
forza dei gruppi lipofilo e idrofilo del composto. Sistema standard in base al quale si effettuano queste
valutazione: HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance)

Il sistema HLB è un modello empirico per descrivere numericamente le proprietà di un tensioattivo, in

modo da rappresentarne le proprietà idrofile e lipofile relative

ESERIENZA 13

Analisi qualitativa in cui valuteremo presenza o assenza del colesterolo

Scopo: In questa esperienza utilizzeremo cromatografia su strato sottile o TLC per la determinazione della
presenza di colesterolo in diversi campioni alimentari, in particolare utilizzeremo:

Materiali:

• pasta senza uovo in cui non dovrebbe essere presente

• Capillari da TLC
colesterolo perché contiene ingredienti di
sola origine vegetale • Specilli
• pasta con l’uovo in cui dovremmo avere presenza • Matita e righello
di solesterolo data dala presenza dell’uovo, • Piastra riscaldante
• tuorlo d’uovo • Pinze
• 5 mg di uno standard di colesterolo che • Phon
utilizzeremo come riferimento per valutare la • Foglio di carta da filtro
presenza o l’assenza di colesterolo all’interno dei nostri campioni
• Lastra TLC
• Provette

70
 • Pipetta graduata a stantuffo

Reagenti

Frasi H Frasi P Rischio chimico

CH3(CH2)4CH3 esano 225 - 304 - 361f - 373 - 210 - 240 - 273 -
315 - 336 - 411 301+310 - 331 -
302+352 - 403+235

C3H6O acetone 225 - 319 - 336 - EUH066 210 - 240 -

305+351+338 - 403+233

C4H10O etere etilico 224 - 302 - 336 - 210 - 240 - 403+235

EUH019 - EUH066

H2SO4 314 - 290 280 - 301+330+331 -

305+351+338 - 309+310

C2H6O 225 - 319 210 - 240 -

305+351+338 - 403+233

Procedimenti:

Estrazione solido liquido

Per estrarre colesterolo dalla matrice utilizzeremo acetone (solvente estraente) , in particolare ad
aggiungere 2 ml di acetone ai campioni di pasta alimentare sia con che senza uovo e 5 ml nel campione di
tuorlo d’uovo e di standard di colesterolo, misurati con pipetta graduata a stantuffo

nella provetta contenente 5 mg di colesterolo abbiamo aggiunto 5 ml di acetone in modo da ottenere una
soluzione standard dello 0.1%, adesso per estrarre il colesterolo andiamo a sminuzzare con uno specillo la
pasta contenuto nelle provette, in modo che acetone riesca a estrarre bene colesterolo agitiamo e
sminuzziamo il più possibile

utilizzare specilli diversi per non contaminare i campioni

infine andiamo a omogeneizzare bene anche il tuorlo d’uovo e ad agitare bene soluzione contenente lo
standard

TLC

Preparazione della cromatografia su strato sottile, in particolare utilizziamo una lastrina di gel di silice
quindi una fase stazionaria polare, mentre l’eluente sarà una miscele di etere esano 1:1 quindi una miscela
apolare.

Andiamo a tracciare una riga a circa 1.5 cm dal fondo con una matita e disegniamo 4 punti equidistanti,
sotto il punto mettiamo codice di ogni di ogni campione, in questo caso 1,2,3,4

71
poi si prende un capillare da TLC andiamo a immergere il capillare nella soluzione che per capillarità questo
preleverà della soluzione, andiamo a depositare una goccia nel punto che abbiamo disegnato.

Nel caso della pasta bisogna ripetere diverse volte la deposizione perché ovviamente non ci aspettiamo una
concentrazione di colesterolo elevata come nel tuorlo d’uovo tal quale

Tra una deposizione e l’altra è molto importante far asciugare bene la goccina per evitare che macchia si
allarghi troppo.

Secondo campione: pasta all’uovo nel punto 2 ripetiamo deposizione altre 3 4 volte per essere sicuri di
riuscire a vedere presenza di colesterolo

Terzo campione tuorlo d’uovo dove ci aspettiamo una presenza di colesterolo molto maggiore pertando in
questo caso basta depositare una sola goccia

Quarto campione: standard di colesterolo precedentemente preparato

Lasciamo asciugare bene la lastrina, dopodichè la immergiamo nella camera di sviluppo in cui abbiamo
preventivamente messo un foglio di carta da filtro di dimensioni più grandi di quelle della lastrina in modo
da saturare completamente la camera con i vapori

Andiamo quindi a immergere delicatamente la lastrina della TLC nella camera di sviluppo, piano piano
adesso eluente salirà e in base all’affinità del colesterolo con la fase stazionaria polare o l’eluente apolare
avremo la separazione del colesterolo da eventualmente altri composti e dopodichè potremo visualizzarlo
utilizzando una soluzione di sviluppo che sarà acido solforico al 10 % etanolo

Chiudiamo bene camera cromatografica e aspettiamo che il fronte del solvente raggiunga circa ¾ l’altezza
della lastrina. Quando il fronte del solvente è arrivato oltre ¾ dell’altezza della lastrina possiamo
considerare la nostra corsa cromatografica terminata e possiamo estrarre la lastrina dal vaso.

La prima cosa da fare è segnare il fronte del solvente con la matita prima che il solvente evapori per riuscire
a calcolare successivamente i fattori di ritenzione .

Una volta segnato il fronte del solvente lasciamo evaporare l’eluente. Per vedere colesterolo dovremo
eseguire un’opportuna reazione che svilupperà colore

Questa reazione avviene in presenza di acido solforico H2SO4 al 10% in etanolo a caldo

Prendiamo con delle pinze la lastrina e la immergiamo brevemente nella nostra soluzione di sviluppo,
facciamo sgocciolare eccesso di soluzione su della carta, e visto che reazione avviene a caldo mettiamo
lastrina TLC su una piastra riscaldata e aspettiamo che avvenga la reazione che trasformerà il colesterolo in
un composto colorato.

Come si può osservare si sono sviluppate le macchie colorate corrispondenti ai composti di interesse, in
particolare possiamo osservare nella corsia 4 la macchia corrispondente al colesterolo, siamo sicuri che
questo sia colesterolo perché è lo standard di riferimento. Nel tuorlo d’uovo possiamo osservare in corsia 3
che è presente il colesterolo anche in q abbastanza elevata anche valutando intensità colore macchia
(ricordarsi però che in questo caso TLC solo tecnica qualitativa e non quantitativa) .

72
Possiamo notare presenza di colesterolo anche nella pasta all’uovo e infine possiamo osservare che nella
pasta senza uovo non è presente il colesterolo perché non c’è nessuna macchia in corrispondenza dello
stesso fattore di ritenzione

Possiamo notare che nell’uovo e nella pasta all’uovo sono presenti delle altre macchie non corrispondenti
allo standard di riferimento, si tratta probabilmente di altri composti come ad esempio i carotenoidi

Adesso dobbiamo andare a misurare il fattore di ritenzione

Calcoli

Distanza percorsa da standard di riferimento 1.5 cm

Distanza percorsa dalle macchie più o meno alla stessa altezza nell’uovo e nella pasta all’uovo: 1.4 cm per
corsia 3 uovo e 1.3 cm per corsia 2 pasta con uovo

Corsia 1 pasta senza uovo no macchie

Distanza totale percorsa dal solvente 5.8 cm

1.5 𝑐𝑚
RF standard :5.8 𝑐𝑚 = 0.2686

0 𝑐𝑚
RF pasta senza uovo = 5.8 𝑐𝑚 = 0

1.3 𝑐𝑚
RF pasta con uovo = 5.8 𝑐𝑚 = 0.2241

1.4 𝑐𝑚
RF uovo = 5.8 𝑐𝑚 = 0.2414

Risultati

Possiamo concludere che nel tuorlo d’uovo e nella pasta all’uovo abbiamo determinato con un metodo
qualitativo la presenza di colesterolo. Nella pasta di grano duro senza uovo non abbiamo determinato
presenza di colesterolo poiché è composta solo da ingredienti di origine vegetale.

I fattori di ritenzioni calcolati dimostrano ciò, RF pasta con uovo, uovo e standard presentano risultati molto
simili .

73
ESPERIENZA 14

Determinazione della quantità di grasso in campioni di mosche iofilizzate e polverizzate tramite

metodica Soxhlet

Scopo: determinare il tenore lipidico

Materiali:

• Campione di mosche liofilizzate e polverizzate

• Ditale
• Cotone
• Bilancia analitica
• Spatola
• Beaker
• Anelli calamitati
• Cilindro graduato

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

Etere dietilico C4H10O 224 - 302 - 336 - EUH019 210 - 240 - 403+235
EUH066

Procedimenti

La prima cosa da fare è prendere un ditale, inserire all’interno un batuffolo di cotone idrofilo, dopodichè si
va a pesare il campione, in questo caso pesiamo circa 0.5 g, facciamo la tara e andiamo a pesare 0.5 g di
campione e ci segniamo pesata esatta compresi i decimali: 0.5344 g, dopodichè prendiamo un secondo
batuffolo di cotone e lo inseriamo sopra il campione in modo che durante il procedimento il campione non
fuoriesca dal ditale

Analizziamo il campione in triplicato, mettiamo batuffolo di cotone nel secondo ditale e andiamo a pesare
circa 0.5 g di campione, segniamo la pesata esatta 0.4788 g, inseriamo secondo batuffolo di cotone sopra il
campione

Pesiamo terzo replicato eseguendo le stesse operazioni per i due precedenti, pesata esatta 0.5656 g

Dobbiamo andare a pesare degli appositi beaker che si utilizzeranno per il procedimento Soxhlet, perché
alla fine noi raccoglieremo tutto il grasso all’interno di questi beaker di conseguenza dobbiamo fare prima
la tara: beaker 1 76,2874 g , secondo beaker 72,8159 g, terzo 75.2592g

A questo punto prendiamo i nostri ditali con all’interno il campione, ci inseriamo speciali anelli calamitati e
andiamo a posizionarli nell’apparato Soxhlet , essendo calamitati si attaccheranno automaticamente al
sostegno.

74
 A questo punto possiamo alzare i ditali tirando verso il basso la manopola nera per ciascuno e dopodichè
metteremo 60 ml di etere dietilico nel beaker, etere dietilico si utilizza sotto la cappa, misuriamo 60 ml con
l’utilizzo di un cilindro e poi li inseriamo nel beaker che posizioniamo sopra un’apposita piastra riscaldante
sotto i ditali. Eseguiamo lo stesso procedimento per gli altri due beaker . Il sistema è chiuso grazie ad
un’apposita leva. Non si ha fuoriuscita di solvente.

E’ la fase in cui il campione, ancora nel ditale, viene lavato con il solvente di estrazione, mettiamo i rubinetti
nella posizione di aperto

A questo punto possiamo immergere i nostri ditali nell’etere alzando le manopole.

La prima fase è quella di immersione in cui l’etere dietilico viene portato ad alta temperatura grazie alla
piastra riscaldante che lo porta a 130 gradi, l’etere che evapora ricondensa nell’apposito refrigerante,
motivo per cui c’è da aprire il rubinetto del refrigerante, e una volta che ricondensa nel refrigerante ricade
dentro al campione. Quindi vengono estratti i grassi in continuo.

Una volta che ho accesso il refrigerante e tutti i miei beaker sono in posizione, devo abbassare la leva di
sicurezza che bloccherà i miei beaker dentro il supporto e provocherà l’immersione dei ditali. A questo
punto posso schiacciare start.

Questa prima fase in cui i grassi vengono estratti per immersione durerà un’ora, alla fine di questa ora
sistema suonerà per avvisarci di passare alla seconda fase che è quella di lavaggio

Etere quando raggiunge t di 130 gradi inizierà a bollire estraendo quindi i grassi, l’etere che evapora
ricondensa nel refrigerante in alto ed essendo il rubinetto aperto ricade dentro il campione in continuo.

Una volta terminata fase di immersione inizia fase di lavaggio, per questa fase basta abbassare i pomelli in
modo da alzare i ditali sopra il livello dell’etere e si dà l’invio, in questo modo lo strumento passa alla
seconda fase

In questa fase l’etere bolle, viene condensato nel refrigerante e ricade dentro il ditale e successivamente
dentro il beaker, in questo modo attraversa il campione lavandolo sciacquandolo da eventuali grassi residui
che trascina dentro il beaker.

Si può osservare che in questa seconda fase di lavaggio, l’etere bolle perchè siamo a 130 gradi e i vapori
salgono, ricondensano nel refrigerante in alto e dopodichè l’etere liquido ricade attraversando il ditale e
trascinando eventuali tracce di grasso ancora presenti dentro al beaker.

Al termine della seconda fase inizia la terza fase che è quella del recupero dell’etere, in questa fase
andremo a chiudere i rubinetti mettendoli in orizzontale, in questo modo la piastra continua a scaldare
l’etere, evapora, ricondensa nel refrigerante, però il rubinetto chiuso pertanto non riesce più a ricadere in
basso ma viene raccolto nel refrigerante in alto in questo modo evaporando tutto l’etere che viene raccolto
in alto, nel beaker rimarrà solamente il grasso che abbiamo estratto. Premiamo invio e facciamo iniziare
l’ultima fase di recupero dalla durata di 15 minuti, etere verrà raccolto nella parte superiore.

Una volta terminata anche la fase di recupero possiamo procedere allo spegnimento dello strumento, alzo
leva di sicurezza e prendiamo i beaker che contengono il grasso e li lasciamo raffreddare.

A questo punto posso spegnere lo strumento

75
Una volta che i beaker si sono raffreddati procediamo alla pesata del grasso estratto dai campioni di
mosche.

Primo backer: 76.3790 g

Secondo: 72.9376 g

Terzo: 75.3502 g

Calcoli

Quindi facendo la differenza fra il peso lordo appena pesato e la tara otterremo il peso netto di grasso e
rapportandolo alla pesata di campione iniziale sapremo la percentuale di grasso nel nostro campione

Tara 1 : 76,2874 peso lordo 1: 76.3790g peso netto 1: 76.3790 - 76.2874 = 0.0916 g

Tara 2 : 72,8159 g peso lordo 2: 72.9376 g peso netto: 72.9376 - 72,8159 = 0.1217 g

Tara 3 : 75,2592 g peso lordo 3: 75.3502 g peso netto 3 : 75.3502 - 75,2592 = 0.091 g
0.0916+0.1217+0.091
Media peso netto: 3
= 0.1014 𝑔

0.5344𝑔+0.4788 𝑔 + 0.5656 𝑔
Media peso campione a fine esperimento: 3
= 0.5263𝑔

𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑑𝑖 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑠𝑜 𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑡𝑜

% grassi = x 100
𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑖 𝑑𝑖 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒 𝑝𝑒𝑠𝑎𝑡𝑜

0.1014 𝑔
% 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑠𝑖 = 𝑥 100 = 19.27%
0.5263 𝑔

Risultati:

Determinazione quantitativa del contenuto di grassi in un campione alimentare (tabella nutrizionale),

metodo ufficiale

Estrazione della componente lipidica = estrazione con solvente = estrazione solido-liquido. Si utilizza
prevalentemente per matrici solide, se liquida o si usa altra metodologia o si cerca di togliere l'acqua e
utilizzare questa tecnica

Lipidi = sostanze prevalentemente apolari (insolubili in acqua e solubili in solventi organici apolari come
etere, esano, cloroformio, ecc.)

Estrazione

76
- A caldo: è più completa, anche se si rischiano alterazioni di alcune frazioni lipidiche per formazione di
perossidi. Solitamente si usa quando si vuole determinare in modo quantitativo il contenuto di lipidi in un
alimento.

- A freddo: elimina gli inconvenienti della degradazione dei lipidi, ma non è quantitativa. Si può utilizzare se
sull’estratto si vogliono fare ulteriori indagini qualitative.

Metodo semi automatico quindi minimizza gli errori intrinsechi della metodica stessa, minimizza
fluttuazioni temperatura della piastra riscaldante e anche gli errori dell'operatore . 3 posizioni ma anche
strumenti da 6 e da 12 ciò migliora quindi anche efficienza perché si riescono a estrarre più campioni in
modo contemporaneo quindi confronti più oggettivi tra i diversi campioni perché stesse condizioni per tutti
i campioni, + estrazioni contemporaneamente.

ESPERIENZA 15

Determinazione dell’acidità di un olio di oliva

Scopo: capire e classificare se si tratta di un olio di oliva extravergine o no

Materiali:

• Campione di olio di oliva

• Bilancia
• Cilindro graduato
• Beaker
• Beuta
• Ancoretta magnetica
• Agitatore magnetico
• Buretta

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -
305+351+338 - 310

Fenolftaleina 341 - 350 - 361 201 - 281 - 308+313

Procedimenti:

Prima cosa da fare determinare l’acidità

Abbiamo pesato due aliquote dello stesso campione pesando esattamente circa 5 g ( primo campione 5.00
g secondo 4.96g) ora aggiungeremo il solvente opportuno che è una miscela di alcol etere, aggiungeremo
un indicatore che è la fenoftaleina ed effettueremo una titolazione acido-base

77
Tutte le operazioni vengono fatte sotto cappa

Campione numero 1 a cui aggiungeremo 25 ml della soluzione alcool etere con l’utilizzo di un cilindro
graduato

Dopo aver aggiunto miscela al campione agitiamo leggermente a mano in modo che campione si disperda
all’interno del solvente quindi nella beuta mettiamo un’ancoretta magnetica e poniamo il campione sulla
piastra.

Aggiungiamo 2 gocce di fenolftaleina alla beuta che utilizzeremo come indicatore

Facciamo partire agitazione del campione in modo che rimanga sempre miscelato durante tutta la
titolazione. Buretta è una buretta da 50 ml ed è stata riempita con NaOH alla concentrazione 0.1 N

Posizioniamo buretta esattamente sul nostro campione e quindi iniziamo a titolare goccia a goccia.

Andando a titolare l’acido oleico con NaOH avviene la reazione:

R-COOH + NaOH R-COONa + H2O

Campione virerà da giallo a arancione, in questa caso non vedremo il colore rosa caratteristico della
fenoftaleina perché soluzione è già colorata in giallo essendo una soluzione di olio di oliva

Vedremo un intorpedimento della soluzione, quando la soluzione diventa arancione abbiamo ottenuto il
viraggio, fermiamo la titolazione e andiamo a leggere il volume che abbiamo sgocciolato dalla buretta: 0.7
ml di NaOH

Possiamo togliere la beuta

Procediamo quindi con il campione numero 2 facendo la stessa identica cosa, aggiungiamo 25 ml della
soluzione alcool etere sempre sotto cappa, aggiungiamo miscela al campione, agitiamo leggermente per
dissolvere il campione

Se confrontiamo i due campioni prima della titolazione del secondo tra di loro il viraggio è assolutamente
visibile

Aggiungiamo ancoretta nel campione 2, portiamo a zero o a un valor specifico scelto da noi la nostra
buretta, posizioniamo buretta e campione in cui inseriamo 2 gocce di fenolftaleina

attiviamo agitazione piastra e procediamo con la titolazione , volume sgocciolato: 0.8 ml

procediamo con i calcoli utilizzando la formula.

Calcoli

Dati:

Campione 1 : 5 g VNaOH= 0.7 ml

Campione 2: 4.96 g VNaOH= 0.8 ml

Quando tutto l’acido avrà reagito con la base la soluzione diventerà rosa.

78
E quindi si ottiene l’acidità (in %) dell’olio.
𝑚𝑜𝑙 𝑔
𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻∗𝑀𝑁𝑎𝑂𝐻∗𝑃𝑀 𝑂𝐿𝐸𝐼𝐶𝑂 0.7 𝑚𝑙 𝑥 0.1 𝑥 282.2
𝐿 𝑒𝑞
1) % 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑜𝑙𝑒𝑖𝑐𝑜 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑜𝑙𝑖𝑜 (𝑚𝑔)
𝑥 100 = 5000 𝑚𝑔
𝑥 100 = 0.39%
𝑚𝑜𝑙 𝑔
𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻∗𝑀𝑁𝑎𝑂𝐻∗𝑃𝑀 𝑂𝐿𝐸𝐼𝐶𝑂 0.8 𝑚𝑙 𝑥 0.1 𝑥 282.2
𝐿 𝑒𝑞
2) % 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑜𝑙𝑒𝑖𝑐𝑜 = 𝑥 100 = 𝑥 100 = 0.45%
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑜𝑙𝑖𝑜 (𝑚𝑔) 4960 𝑚𝑔

Media % di acido oleico dei due campioni analizzati:

0.39 %+0.45 %
Media= 2
= 0.42%

Risultati

L’olio d’oliva è un alimento di elevato pregio, bersaglio di numerose manipolazioni illecite e frodi (esempio:
taglio con olio meno pregiato, di altro tipo).

Parametri di composizione dell’olio di oliva che devono essere controllati e confrontati con quanto
riportato. Se non corrispondono, l’olio non è conforme.

L’acidità è espressa come %: g di acido oleico/100 g di olio Parametro che esprime la quantità di acidi grassi
liberi all’interno di un olio. Viene espressa in acido oleico perché è l'acido maggiormente presente nell'olio
di oliva maggior rappresentante degli acidi organici presenti all'interno dell'olio

0.39 % Percentuale di acido oleico nel primo campione, 0.45% per il secondo campione

Facciamo media e otteniamo 0.42%, questa è l’acidità del nostro olio di oliva che risultando inferiore a 0.8
% possiamo concludere che sia olio extravergine di oliva.

79
ESPERIENZA 16

Determinare il numero di perossidi in un olio di oliva

Scopo: la determinazione del numero di perossidi (o indice di perossidi) è importante al fine di valutare la
qualità di un olio. Maggiore risulterà questo parametro e maggiore sarà il grado di irrancidimento del
prodotto.

Materiali:

• Campione di olio di oliva

• Cilindro graduato
• Beuta 250 ml
• Acqua distillata
• Pipetta pasteur
• Buretta
• Ancoretta magnetica
• Agitatore magnetico

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

C2H4O2 226 - 314 210 - 208 -
301+330+331 -
303+361+353 -
305+351+338
CH2Cl2 315 - 319 - 335 - 336 - 261 - 281 - 305+351+338
351 - 373

KI 312 - 317 - 391 263 - 304 -

305+351+368 -
342+311 - 405+501
Na2O3S2 · 5H2O H315, H319, H335 P261, P264, P271, P280,
P302+P352, P304+P340,
P305+P351+P338, P312,
P321, P332+P313,
P337+P313, P362,
P403+P233, P405, P501

Procedimenti

Abbiamo pesato un’aliquota di olio di oliva pari circa a 5 g (4.99 g), adesso andremo a dissolvere il nostro
campione di olio al fine di portare in soluzione i perossidi

Scioglieremo in una beuta da 250 ml di campione con 25 ml di una miscela di acido acetico C2H4O2 e cloruro
di metilene CH2Cl2 (3:2), li misuro con un cilindro graduato, agitiamo per portare in soluzione campione di

80
olio e si aggiunge 0.5 ml di una soluzione di ioduro di potassio satura KI. In questo modo lo ioduro di
potassio quindi lo ione I- va a reagire con i perossidi in base a una reazione di ossido riduzione dalla quale si
sviluppo iodio. Olio è stato disperso in una soluzione di cloruro di metilene e acido acetico che fa si che si
sviluppi HI che reagisce con i perossidi

Si può osservare che soluzione inizia a prendere un colore bruno che ricorda la tintura di iodio. Al fine di
portare a completezza la reazione bisogna tappare il contenitore e lasciare al buio per 5 minuti

Schema di reazione in cui si sviluppa Iodio

2KI + 2 CH3COOH -> 2 HI + 2 CH3COO-K+

ROOH + 2 HI -> ROH + H2O + I2

ROOR’ + 2 HI -> ROH + H2O + I2

Trascorsi 5 minuti ritiriamo nostro campione ed andiamo ad aggiungere 75 ml di acqua distillata e un

indicatore che è la salda d’amido all’1% aggiungere una pippettata

Soluzione diventa di colore bruno scuro

Andremo a titolare questa soluzione con tiosolfato di sodio Na2O3S2 · 5H2O, 0.01 N fino a che colore bruno
scuro scomparirà

Al fine di risalire al NP di un olio si sfrutta una titolazione IODOMETRICA cioè una titolazione di tipo REDOX,
I- avrà reagito e avrà dato luogo alla formazione di HI che avrà reagito con i nostri perossidi per dare I2 a
questo punto andiamo a titolare lo iodio sviluppato con la soluzione di tiosolfato di sodio

Il tiosolfato di sodio va a reagire con iodio che si è sviluppato nel passaggio precedente

Mettiamo sotto agitazione e iniziamo titolazione

È necessario che la soluzione sia in agitazione durante la titolazione dal momento che abbiamo aggiunto
acqua ad un solvente organico e quindi abbiamo una separazione tra due fasi, mantenendo la soluzione in
agitazione le due fasi organica e acquosa sono in miscela durante la titolazione

Noteremo che colore bruno scuro scompare, quando sarà scomparso del tutto e permane fermeremo la
titolazione.

I2 + 2 S2O3 2- -> 2 I- + S4O6 2-

Volume sgocciolato 12.4 ml

Calcoli

Possiamo risalire al numero di perossidi del campione

Dati

M olio: 4.99 g

V Na2O3S2 = 12.4 ml

81
N Na2O3S2 = 0.01

Il numero di perossidi si esprime in milliequivalenti (mEq) di ossigeno attivo la quantità di perossidi in 1Kg
di olio, che corrispondono ai mEq di I2 liberato da KI, per 1000 g di olio:

𝑉𝑁𝑎2𝑆2𝑂3 (𝑚𝑙) ∗ 𝑁 𝑁𝑎2𝑆2𝑂3 ∗ 1000 12.4 𝑚𝑙∗0.01∗1000 𝑚𝐸𝑞 𝑂2

NP = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒 𝑑𝑖 𝑜𝑙𝑖𝑜 (𝑔)
= 4.99 𝑔
= 24.85 𝐾𝑔

Risultati

Otteniamo un numero di perossidi pari

a 24.85 ciò vuol dire che nostro olio si
è ossidato poiché da disciplinare il
numero di perossidi dell’olio di oliva
misurato in equivalenti di ossigeno
attivo per kg di olio deve essere
inferiore a 20, nel nostro caso è
risultato circa 25 quindi il nostro olio di
oliva è perossidato e non è conforme
alla normativa

Per essere sicuri del risultato

dovremmo ripetere l’operazione una
seconda volta

Perossidi si possono formare nel

momento in cui olio non viene
conservato in maniera corretta e viene
a contatto con luce e ossigeno gli acidi
grassi si possono andare ad ossidare
per andare a formare perossidi,
nell'olio di oliva può avvenire perchè
acido oleico e altri acidi presenti sono
insaturi

82
ESPERIENZA 17

Determinazione dell’azoto totale e del contenuto proteico: il metodo Kjeldhal

Scopo: Determinazione quantitativa del contenuto di azoto e proteine in un campione alimentare (tabella
nutrizionale)

Materiali:

• Bilancia analitica
• Campione di mosche fermentate e pupari
• Carta stagnola
• Provettoni da mineralizzazione
• Spatola
• Pipetta graduata
• Fornetto di mineralizzazione
• Beuta
• Buretta
• Distillatore

Reagenti

Frasi H Frasi P Pericolo chimico

H2SO4 314 P260, P264, P280,
P301+P330+P331,
P303+P361+P353,
P304+P340,
P305+P351+P338, P310,
P321, P363, P405, P501
K2SO4 H318 P280, P305+P351+P338,
and P310
HCl 280 - 314 - 331 261 - 280 - 305+351+338
- 310 - 410+403

CuO 302 - 410 260 - 273 [

Acido borico H3BO3 360 201 - 308+313

Rosso di metilene H351, H411 P201, P202, P273, P281,

P308+P313, P391, P405,
P501
Verde di bromocresolo H315, H319, H335 /

NaOH 314 - 290 280 - 301+330+331 -

305+351+338 - 310

83
Procedimenti:

Mineralizzazione:

Si inizia pesando il campione che in questo caso analizzeremo un campione di mosche fermentate e di
pupari

Iniziamo pesata del campione, campione si può pesare su un foglio di carta stagnola e poi si può trasferire
negli appositi provettoni da mineralizzazione. Facciamo calibrazione bilancia, pesiamo una q di campione
tra gli 0.2 e gli 0.3 grammi e ci annoteremo la pesata esatta, per pesate così piccole è necessario l’utilizzo di
una bilancia analitica

Il primo campione è un campione di mosche fermentate essiccate e ridotte in polvere, mettiamo stagnola
facciamo la tara e andiamo a fare la pesata, pesata esatta 0.2360 g

Dopodichè trasferiamo campione nell’apposito provettone di mineralizzazione

I campioni si fanno in triplicato, essendo lo stesso tipo di campione possiamo utilizzare la stessa spatola e lo
stesso foglio di stagnola

Secondo replicato: 0.2259 g e andiamo a trasferire campione nel tubo da mineralizzazione

Terzo replicato: 0.2240 g e adiamo a trasferire nel provettone da mineralizzazione

Adesso pesiamo un secondo campione che è un campione di pupari essiccati e ridotti in polvere, essendo
un campione diverso dobbiamo cambiare il foglio di carta stagnola e la spatola

Anche in questo caso pesiamo una quantità di campione tra gli 0.2 e gli 0.3 g, ci annotiamo la pesata esatta
che è 0.2188 g e andiamo a trasferire nel provettone da mineralizzazione. Ripetiamo operazione altre due
volte

Secondo replicato: 0.2336 g

Terzo replicato: 0.2270 g

A questo punto andiamo ad aggiungere 7 ml di acido solforico al 96% con una pipetta graduata

Attenzione: quando si usano gli acidi è molto importante stare sempre molto vicini ai provettoni perché
acido tende molto facilmente a scappare dalla pipetta

Ora sempre con molta cautela andiamo ad aggiungere 10 ml di acido fosfosolforico stando sempre molto
vicini con la bottiglia ai provettoni perché quando si usano delle pipette di vetro con gli acidi tendono a
perdere qualche goccia abbastanza facilmente

Con un pezzo di carta asciughiamo eventuali gocce di acido che possiamo avere perso durante il
trasferimento poiché essendo molto concentrati sono molto corrosivi

Dopodichè aggiungiamo una puntina di spatola di ossido di rame che ci servirà per vedere quando è finita il
processo di mineralizzazione, quando sarà finita ossido di rame assumerà un colore verde- azzurro, essendo
un indicatore ce ne servirà una quantità minima

84
Si aggiunge una pastiglia per ogni campione di catalizzatore a base di selenio che serve a favorire la
reazione di mineralizzazione.

Infine aggiungiamo una pastiglia di antischiuma quindi solfato di sodio K2SO4 ad ogni campione per evitare
che si sviluppi della schiuma che potrebbe risalire lungo il provettone andando ad uscire e quindi a inficiare
il risultato dell’analisi

Una volta aggiunti tutti i reagenti si mettono i provettoni nell’apposito fornetto di mineralizzazione, si può
osservare che il colore dei provettoni è rosso marrone, alla fine del processo di mineralizzazione
diventeranno di un colore verde-azzurro

È presente una cappa di aspirazione dei vapori acidi collegata a una trappola per cui tutte le tracce di acido
che eventualmente potrebbero essere trasportate dal vapore ricadono nella trappola per cui non vanno in
rete

Accendiamo fornetto, impostiamo metodica di mineralizzazione a 420 gradi per 60 minuti conferma start

Si possono osservare i campioni che si abbassano automaticamente nel fornetto di mineralizzazione, inizia
il riscaldamento e una volta raggiunta la t di 420 gradi inizierà il countdown dei 60 minuti

Processo di mineralizzazione dopo 60 minuti è terminato e questo si capisce dal colore verde acqua che
hanno assunto i campioni. Durante fase di mineralizzazione tutte le proteine sono state scomposte in
particolare l’azoto è presente sotto forma di ioni ammonio poiché siamo in ambiente acido.

85
Terminata la fase di mineralizzazione si procederà alla fase di distillazione

Essendo in ambiente acido durante la distillazione andremo ad aggiungere dell’idrossido di sodio per
neutralizzare acido presente, convertire ione ammonio in ammoniaca, che è facilmente distillabile e
ricondensabile in una beuta di raccolta

In ogni beuta andiamo ad aggiungere 25 ml della soluzione di tampone che è una soluzione al 4% di acido
borico con indicatore rosso di metile e verde di bromocresolo usando un cilindro graduato

La soluzione vedremo che sarà rosa perché ph è acido

Man mano che ci condenserà dentro l’ammoniaca ph salirà e soluzione virerà da colore rosa a verde

Fase di distillazione

Provettone sistemato del kjeldahl nell’apposito apparato per la distillazione automatica, da questo tubo
scenderanno l’acqua e l’idrossido di sodio necessari per innalzare il ph e permette la distillazione in
corrente di vapore dell’ammoniaca che ricondenserà nella beuta contenente la soluzione di cattura di
acido borico innalzandone il ph e quindi causando il viraggio di colore da rosa a verde. Se la soluzione non
diventa verde vuol dir che nel campione non c’erano abbastanza proteine.

86
Si sviluppa NH3

NH4 + + OH- NH3 + H2O

Il calore va evaporare NH3 + H2O che viene condensata e raccolta in una beuta contenente H3BO3 + 2
indicatori Indicatore 1 = ROSSO DI METILE pH fortemente acido

Dopo la distillazione (10 min) la soluzione di NH3 + H2O è stata quantitativamente raccolta nella beuta e
NH3 ha reagito in modo quantitativo con H3BO3

Nella beuta si è formato un tampone: NH4 (H2BO3 ) + H3BO3 Indicatore 2 = VERDE DI BROMOCRESOLO pH
debolmente acido

Facciamo partire il processo che è automatizzato e dura circa 5 min

Si può osservare che vengono aggiunti i reagenti quindi acqua e idrossido di sodio e viene effettuata una
distillazione in corrente di vapore, il cambiamento del colore della soluzione è proprio dovuto a un
aumento repentino del ph che fa diventare la soluzione molto scura anche in virtù della presenza degli ioni
rame

Al termine della distillazione si può osservare che tutta l’ammoniaca è condensata nella beuta e il colore è
diventato verde brillante

Ripetere l’operazione con tutti i campioni.

H3BO3 + NH3 H2BO3 -NH4 +

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Titolazione

Terza fase titolazione andiamo a titolare soluzione con una soluzione di acido cloridrico 0.1 molare fino a
viraggio da colore verde a rosa

Sgoccioliamo piano per evitare di oltrepassare punto di viraggio

-
H2BO3 -NH4 + + H3O+ Cl -> H3BO3 + NH4 + + Cl- + H2O

Continuiamo a sgocciolare fino a che non arriviamo al punto in cui è grigia a metà tra colore rosso e verde

aggiungiamo goccia piccolissima in modo che soluzione diventi rosa quindi alla prima goccia che fa
diventare rosa la soluzione ci fermiamo.

Lettura: 18.1 ml

Passiamo a titolazione del secondo replicato, lettura: 17.2 ml

Passiamo al terzo campione replicato, lettura: 17.2 ml

Terminati i campioni di mosca passiamo ai campioni di pupari

Primo campione: 13.5 ml, probabilmente contenuto proteico è inferiore rispetto a quello di mosche, sarà
poi verificato con i calcoli

Secondo replicato: 14 ml

terzo replicato: 14.6 ml

per sapere il contenuto proteico delle mosche e dei pupari che abbiamo analizzato oggi bisogna fare i

88
Calcoli

In realtà si titola l’acido borico e non l’ammoniaca, quindi si ha una sorta di «RETROTITOLAZIONE».

L’acido borico e l’ammoniaca sono in rapporto stechiometrico = titolare uno è come titolare l’altro

Ora si conoscono gli equivalenti di NH3 dai quali si può ricavare la % di azoto:

𝑒𝑞
14.008 ∗ 𝑉𝐻𝐶𝑙(𝐿) ∗ 𝑁𝐻𝐶𝑙 ∗ 100 14.008 𝑥 0.0175 𝐿 𝑥 0.1
𝐿
% di azoto = = 𝑥 100 = 10.72%
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒 (𝑔) 0.2286 𝑔

% di proteine = % di azoto * Fattore di conversione -> % proteine = 6.25 𝑥 10.72% = 67%

Fattori di conversione: fattore standard = 6.25

Stessi calcoli per i campioni di pupari:

𝑒𝑞
14.008 ∗ 𝑉𝐻𝐶𝑙(𝐿) ∗ 𝑁𝐻𝐶𝑙 ∗ 100 14.008 𝑥 0.014 𝐿 𝑥 0.1
𝐿
% di azoto = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑒 (𝑔)
= 0.2265 𝑔
𝑥 100 = 8,66%

% di proteine = % di azoto * Fattore di conversione -> % proteine = 6.25 x 8,66% = 54%

Risultati:

Utilizziamo questo metodo per andare a quantificare le proteine senza voler andare a determinare quella
che è la loro qualità , natura o tipo

Volume per normalità mi da il numero di equivalenti, nel caso dell'HCl che è un acido forte la normalità e la
molarità sono la stessa cosa quindi andando a moltiplicare volume HCl per molarità HCl ottengo numero
moli HCl utilizzate per la titolazione che corrisponderà al numero di moli di acido borico che avevano
reagito con l'ammoniaca quindi numero moli HCl è direttamente proporzionale e corrisponderà
esattamente al numero di moli di ammoniaca che avevo nella mia soluzione che corrisponderanno al
numero di moli di solfato di ammonio che si erano formate nella prima fase di digestione quindi
corrisponde alla q di azoto del mio campione iniziale
Quindi moltiplicando queste moli per PM azoto che è 14.008 ottengo grammi di azoto presenti nel
campione, mettendoli in relazione con peso campione iniziale ottengo risaliamo alla % di azoto presente
nel mio campione alimentare iniziale
Attenzione nei diversi passaggi per minimizzare gli errori dell'operatore . Anche questo è un metodo semi
automatico perché fase di digestione e distillazione vengono fatti in maniera automatica dal sistema .

Fase titolazione invece è un'operazione manuale quindi importante farla in maniera corretta

89
ESPERIENZA 18

Determinazione della caffeina in bevande di tipo cola tramite tecnica HPLC-UV

Scopo: analizzare il contenuto di caffeina in un campione reale tramite misurazione diretta e confronto con
una soluzione standard di caffeina

Materiali:

• Campioni di bevande a base cola

• Standard di caffeina
• Bagnetto a ultrasuoni
• Vials e tappi da 2 ml di volume
• Acqua distillata
• Strumentazione HPLC-UV
• Micropipetta
• Bilancia analitica
• Matraccio da 10 ml

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

CH3OH 225 - 301 - 311 - 331 - 210 - 233 - 280 -
370 302+352 - 304+340
308+310 - 403+235

Procedimenti

Il campione si trova già in forma liquida quindi non è necessaria estrazione, ma bevande analcoliche sono
bevande gassate quindi è necessario un passaggio in un bagnetto a ultrasuoni per andare a eliminare la
CO2 perché questa potrebbe andare a creare dei problemi in fase di separazione cromatografica

La prima cosa da fare è sgasare la bevanda di tipo cola al fine di eliminare l’anidride carbonica presente,
questa operazione si fa utilizzando un bagnetto a ultrasuoni i quali permettono all’anidride carbonica di
separarsi ottenendo così la bibita degasata

Mettiamo una piccola quantità di bevanda all’interno di una beuta, osservare che fa la schiuma. Dopodichè
si immerge in questo bagno a ultrasuoni, una volta fissata la beuta all’apposito supporto si accendono gli
ultrasuoni, si può osservare come la schiuma emerge dalla cola, questa è l’anidride carbonica che si sta
allontanando. Lasciare la beuta per un tempo di 5 10 minuti fino a che non ci sarà più la comparsa di
schiuma.

90
Diluire 10 volte la soluzione di tipo cola quindi con una pipetta automatica impostare 900 μL e preleviamo
900 μL di acqua che inseriamo in una vial, dopodichè cambiamo puntale e preleviamo 100 μL di bevanda
tipo cola. Dobbiamo essere sicuri che campione sia analizzabile, sappiamo che ci possono essere degli
interferenti perché bevande a base di colo sono molto zuccherate, zuccheri presenti sono in alta
concentrazione e potrebbero disturbare nostra analisi quindi diluizione del campione prima di andarlo ad
analizzare

Mettiamo tappo nella vial che poi inseriamo nell’autocampionatore, la mettiamo nella posizione 1

Il metodo utilizzato per l’eluizione è una isocratica al 60% d’acqua nella linea A e 40% di metanolo nella
linea B (da 100% acqua a 60 % )

con una colonna di tipo C18 e un flusso di 0.2 ml al minuto

Compilare sample list, selezioniamo riga e schiacciamo start

La corsa durerà circa 10 minuti

Come si può osservare è eluito un picco abbastanza alto al tempo di ritenzione di 5 minuti e mezzo
presumibilmente questo picco è proprio quello della caffeina, ma per averne la certezza dobbiamo iniettare
uno standard di caffeina per decidere se segnale che vediamo per il nostro campione è effettivamente
corrispondente a quello dell'analita che stiamo andando a determinare.

91
Soluzione standard di caffeina alla concentrazione di 10 ppm in 100 mL.

Calcoliamo la quantità da pesare: ppm = mg/ V (L) → mg = ppm * V (L)

mg di caffeina da pesare = 10 * 0,1 = 1 mg

Andiamo a preparare soluzione di caffeina, andiamo a pesare 1 mg di caffeina in un matraccio da 10 ml con

una bilancia analitica, poi iniettiamo lo standard di caffeina

Per confermare che il picco a 5 minuti e 30 secondi nella bevanda di tipo cola è caffeina, lo standard di
caffeina dovrà avere lo stesso tempo di ritenzione

Come si può osservare anche nello standard di caffeina è uscito un picco a circa 5 min e 30 s quindi il picco
cromatografico che abbiamo osservato nella bevanda di tipo cola corrispondeva a quello della caffeina

Se andiamo a sovrapporre i due cromatogrammi della caffeina e della bevanda di tipo cola vediamo che
sono perfettamente sovrapponibili

92
Conclusioni

L’utilizzo dello standard di caffeina ha permesso l’identificazione di questo alcaloide purinico nella bevanda
a base di cola confrontando il tempo di ritenzione del relativo picco dello standard con quello nel campione
di cola

Caffeina presente come aromatizzante nelle bevande di tipo cola, la HPLC abbinata alla rilevazione UV in
particolare in questo caso a 280 nm si è rivelata efficacie per identificare la presenza di caffeina in bevande
tipo cola.

ESPERIENZA 19

Analisi tramite analisi gas cromatografica dell’acetato di isoamile (aroma di banana), al fine di
andare a determinare il grado di purezza

Scopo: analizzare il campione di acetato di isoamile recuperato dopo distillazione. L’analisi viene effettuata
tramite tecnica GC-MS, che permette di verificare la purezza del prodotto ottenuto. Per controllare che un
particolare aroma sintetico sia stato sintetizzato in maniera corretta e sia sufficientemente puro per essere
venduto e commercializzato come tale

Materiali:

• Campioni di aroma di banana

• Standard commerciale di aroma di banana
• Matracci tarati da 10 ml
• Solvente: acetato di etile
• strumentazione: GC-MS
• pipetta semi automatica di precisione

Reagenti:

frasi H Frasi P Rischio chimico

C4H8O2 H225, H319, H336 P210, P233, P240,
P305+P351+P338,
P403+P235

Procedimenti

è necessario andare a preparare il campione: diluire campione di aroma di banana con opportuno solvente
e andarlo ad analizzare

Comparazione con analisi dello standard commerciale di aroma di banana puro al 99%

Preparazione campione:

Etilacetato solvente da utilizzare per diluire nostro standard e campione

93
Prepariamo una soluzione a 500 ppm di aroma di banana, prendiamo un matraccio da 10 ml e andiamo ad
aggiungere solvente al matraccio utilizziamo acetato di etile come solvente perché aroma di banana è un
estere quindi utilizziamo un solvente che sia il più possibile simile.

Calcoliamo la quantità da prelevare:

ppm = mg/ V (L) → mg = ppm * V (L)

mg di caffeina da pesare = 500 * 0,01 = 5 mg

Ma il campione è un liquido ed è molto volatile! Non possiamo pesare, quindi dobbiamo calcolare il volume
da prelevare tenendo conto della densità.

Densità = 0,876 g/ml (0,876 mg/µl)

Quindi: 5,7 µl

Mettere un po’ di solvente nel matraccio da 10 ml arrivando quasi alla tacca, dopodichè aggiungiamo 5.7 µl
di standard di aroma di banana che corrispondono circa a 5 milligrammi.

Per andare ad aggiungere 5 microlitri utilizzeremo una pipetta semiautomatica di precisione in cui si va a
settare il volume che si vuole prelevare con una rotellina, utilizziamo apposite punte, immergiamo punta
all’interno dello standard e faccio cadere nel matraccio, chiudo matraccio e miscelo. Soluzione a 500 ppm di
aroma di banana è pronta

Facciamo la stessa cosa con il campione, andremo ad effettuare analisi sia dello standard sia del campione
per poi eseguire una comparazione.

Analisi

Utilizzeremo un gas cromatografo interfacciato con uno spettrometro di massa, il gas cromatografo è la
prima parte di strumento in cui è alloggiata la colonna gas cromatografica, andremo ad aggiungere nostro
campione da un’apposita porta che è l’iniettore, campione poi andrà verso colonna dove analiti
interagiranno con fase stazionaria colonna, si separeranno tra di loro e verranno inviati al sistema rivelatore
che è un spettrometro di massa ed è l’altra parte della strumentazione.

• Colonna: SLB5 di silice fusa (30 m x 0,25 mm; film 0,25 µm)
• Fase stazionaria: fenil-metil-silossano (al 5% di fenile)
• Fase mobile: Elio (He)
• Flusso della fase mobile: 1 mL/min
• Programmata di temperatura:
1. 60°C per 3 minuti
2. 20°C/minuto fino a 280°C
3. 280°C per 2 minuti
• Tempo di analisi: 19 min
• Rivelatore MS impostato in scansione (Full scan) al fine di avere uno spettro di massa completo

94
 Colonna gas cromatografica

Andiamo ad eseguire analisi, partendo da standard.

Dobbiamo preparare siringa per analisi, siringa è in vetro ed effettueremo un’analisi manuale prelevando 1
µL di campione, abbino siringa con campione che è soluzione dello standard, fatta questa operazione circa
una decina di volte stare attenti a prelevare circa 1 µL di campione, una volta che strumento è pronto a
ricevere il campione andiamo ad inserire siringa all’interno dell’iniettore spingendo l’ago fino in fondo,
inietto, tolgo siringa e schiaccio start su gascromatografo, così facendo corsa cromatografica è partita e una
volta terminata potremo processare risultato.

Risultati:

otterremo sul destkop del pc il gas cromatogramma dello standard di aroma di banana a 500 ppm, si può
osservare un unico picco gas cromatografico al tempo di ritenzione di 3,50 min, questo perché standard è
dichiarato puro al 99%

possiamo controllare che effettivamente il picco sia acetato di isoamile, per fare ciò andiamo a cliccare sul
picco nel gascromatogramma e sotto comparirà il suo spettro di massa quindi sua impronta digitale,
conoscendo la molecola siamo in gradi capire se questo spettro di massa corrisponde al nostro analita,

95
inoltre possiamo anche andare a chiedere al database di fare un confronto con gli spettri di massa presenti
nella libreria dello strumento per capire se è effettivamente aroma di banana

Per determinare la purezza del campione in esame dobbiamo andare ad integrare il nostro segnale e
calcolare la % relativa

Andiamo a calcolare le aree sottese ai segnali: -

• Ogni segnale avrà il proprio valore di area

• Calcoliamo il valore di area totale (somma delle aree relative di tutti i segnali presenti)
• Calcoliamo la % di area relativa:

andiamo poi ad aprire gascromatogramma del campione e osserveremo che presenta più segnali e non uno
unico come lo standard precedentemente analizzato , selezioniamo zona di interesse andiamo a constatare
che picco maggiormente presente nel gascromatogramma è uno che presumibilmente corrisponde a
acetato di isopentile, possiamo interrogare libreria strumento e verificare che quel picco è acetato di
isopentil alcol

come capire se è puro o no?

Andiamo ad alzare nostra linea di base e quindi a controllare che non siano presenti altri segnali, possiamo
andare a identificare loro identità

Primo segnale verifichiamo sua identità: composto che deriva da solvente utilizzato per diluire campione

Secondo segnale: composto che deriva dal solvente utilizzato

Terzo segnale: deriva dal solvente

Possiamo quindi fare un confronto con il nostro standard, sovrapponiamo i cromatogrammi.

Si può osservare che coincidono quasi al 100%, in entrambi i casi non sono presenti altri analiti perché non
abbiamo altri picchi cromatografici quindi possiamo concludere che campione di aroma di banana è stato
distillato correttamente ed è puro al 100%

96
Analizziamo un secondo campione, maggiormente evidenti altri segnali rispetto a campione analizzato in
precedenza, oltre a segnale principale dell’aroma di banana vediamo altri segnali che possiamo andare a
verificare se sono impurità dovuti a una mal distillazione

Primo segnale è acido acetico butil estere quindi derivato acido acetico che è presente perché acido acetico
uno dei reagenti utilizzati per reazione quindi in questo caso possiamo affermare che nostro aroma di
banana non è puro poiché è ancora presente uno dei due reagenti

Altro piccolo segnale che eluisce dopo nostro analita, verifichiamo identità e possiamo osservare che
corrisponde alla presenza dell’iso pentil alcool che era l’altro reagente utilizzato per sintesi aroma di
banana

Sono presenti due reagenti

Quanto è puro campione?

Integriamo i picchi, calcoliamo area sottesa a ciascun segnale, somma aree tre segnali corrisponderà al
100%, potremmo fare proporzione per sapere a quale % corrisponde area aroma di banana, otteniamo
93,37% di purezza non commerciabile, deve essere ripetuta distillazione

Purezza altro campione: 100% ,unico picco, commerciabile

97
ESPERIENZA 20

Determinare quantitativamente i polifenoli in un campione di te

Principio: i composti fenolici vengono determinati quantitativamente mediante tecnica spettrofotometrica

seguendo il metodo di Folin-Ciocâlteau. Si utilizza il reattivo di Folin-Ciocâlteau (giallo) costituito da una
miscela di acidi ossidanti: acido fosfotungstico (H3PWO40) e fosfomolibdico (H3PMo12O40).

Questi composti in presenza di polifenoli formano una miscela di ossidi (W8O23 e Mo8O23) che in
soluzione risultano azzurro/blu

Si usa un reattivo perché non tutti i polifenoli presentano un assorbimento nel campo dell'UV e del visibile
quindi per essere determinati in maniera quantitativa selettiva tutti insieme si usa reattivo

Avremo informazioni su quantità totale e non su quella dei singoli polifenoli

Materiali:

• Matraccio da 100 ml
• Bilancia tecnica
• Provette Eppendorf
• Micropipetta di precisione
• Bustina di te verde
• Cuvette
• Scatola con coperchio
• Spettrofotometro a doppio raggio
• reattivo di Folin-Ciocâlteau

Reagenti:

Frasi H Frasi P Rischio chimico

Acido gallico 315 - 319 - 335 261 -305+351+338

Acido fosfotungstico 314 280305+351+338 - 310

Acido fosfomolibdico 272 - 314 220 - 280 - 305+351+338

- 310

Carbonato di sodio 319 260 - 305+351+338

Na2CO3

Procedimenti

Per fare una determinazione di tipo quantitativo dobbiamo preparare uno standard di riferimento nel
nostro caso utilizzeremo acido gallico di cui abbiamo preparato una soluzione madre a 1000 ppm in acqua
in un matraccio da 100 ml.

Calcoliamo la quantità di acido gallico (polvere) che deve essere pesata:

98
ppm = mg/ V (L) → mg = ppm * V (L)

mg di acido gallico da pesare = 1000 * 0,1 = 100 mg

La soluzione viene quindi preparata in acqua. Questa sarà la nostra soluzione madre.

Quindi prepareremo varie diluizioni che ci serviranno per fare la curva di taratura, prepariamo 5 piccole
provette Eppendorf che sono provette di plastica in cui andremo a preparare diluizioni, ne faremo 5 diverse
a 10, 25, 50, 75, 100 ppm

Prelevando quantità diverse dalla soluzione madre e diluendo in acqua, il volume totale di ciascuna
soluzione sarà 1 ml

Per ricavare volume da prelevare dalla soluzione madre si utilizza formula C1V1=C2V2

• C1 = concentrazione soluzione madre

• V1= volume da prelevare dalla soluzione madre (mL) = INCOGNITA
• C2 = concentrazione della soluzione che si vuole preparare
• V2= volume della soluzione che si vuole preparare

Soluzioni standard

• Prima soluzione aggiunta di 10 µL della soluzione madre di acido gallico utilizzando una
micropipetta di precisione si prelevano 10 µL e si inseriscono nella prima eppendorf
• Per la seconda si utilizzano 25 µL
• Per la terza 50 µL
• Per la quarta 75 µL
• Per l’ultima 100 µL

Quindi basta impostare ogni volta nel modo corretto la micropipetta

Fatto ciò le soluzioni vanno portate tutte e 5 a 1 ml di volume totale quindi si aggiunge acqua distillata
andando a sottrarre al volume di 1 ml il volume che abbiamo appena aggiunto nelle 5 diverse Eppendorf

Quindi partendo dalla soluzione + concentrata, quella a 100 ppm dove abbiamo aggiunto 100 µL della
soluzione di acido gallico aggiungeremo 900 µL di acqua in modo da arrivare a 1000 µL ovvero 1 ml, la
soluzione viene chiusa e miscelata manualmente

Per la soluzione a 75 ppm utilizzeremo 925 µL di acqua, chiudiamo e misceliamo

Per soluzione a 50 ppm aggiungeremo 950 µL di acqua

Per la soluzione a 25 ppm aggiungeremo 975 µL di acqua

Per la soluzione a 10 ppm 990 µL di acqua

Campione

Fatto ciò possiamo occuparci del nostro campione che è un campione di te verde (2g) per cui è stata fatta
un’infusione, è stato utilizzato un campione di the verde in bustina ed è stata fatta un’infusione con 200 ml
di acqua a una temperatura di circa 90 gradi.

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Prima di fare analisi su campione di the dobbiamo diluirlo, utilizzeremo per la diluizione acqua distillata,
facciamo 2 diverse diluizione 1:5 e 1:10

Nel primo caso diluiamo 5 volte ovvero preleveremo 200 µL del te aggiungeremo 800 µL di acqua (1:5)

Nel secondo caso useremo 100 µL campione e aggiungeremo 900 µL di acqua (1:10)

Utilizzeremo sempre le pipette di precisione

Le diluizioni vengono fatte in triplicato in modo da avere un risultato finale il più vicino possibile a quello
reale

Analogamente alle diluizioni standard anche le diluizioni del campione vanno tappate e miscelate
manualmente

Analisi

Per andare a determinare polifenoli con tecnica spettrofotometrica dovremo utilizzare un reagente in
grado di rendere i polifenoli visibili in spettrofotometria, reattivo di Folin-Ciocâlteau che è una soluzione
gialla di acido fosfotungstico (H3PWO40) e fosfomolibdico (H3PMo12O40) che reagiranno con i polifenoli
per dare una colorazione azzurra, come catalizzatore della reazione è necessario un ambiente basico quindi
utilizzeremo una soluzione di carbonato di sodio

Nelle nostre cuvette in cui andremo a eseguire la reazione andremo a mettere 250 µL di campione e 250
µL di soluzione standard quindi per ciascuna Eppendorf che abbiamo preparato utilizzeremo una cuvetta
per fare reazione

Ci sarà una cuvetta in più che sarà il nostro bianco perché dobbiamo controllare che i reagenti non
interferiscano con analisi

• Per bianco 250 µL di acqua

• Seconda cuvetta 250 µL di soluzione acido gallico a 10 ppm
• nella terza 250 µL della soluzione acido gallico a 25 ppm
• nella quarta 250 µL soluzione acido gallico a 50 ppm
• quinta 250 µL soluzione acido gallico a 75 ppm,
• sesta 250 µL soluzione acido gallico a 100 ppm

Andiamo poi a inserire nelle cuvette relative le diluizioni che abbiamo eseguito sul campione partendo da
diluizione 1 a 5 e poi da 1 a 10 al fine di ottenere un confronto utilizziamo lo stesso quantitativo per le
soluzioni standard per il campione

Fatto ciò andiamo ad aggiungere 1 ml per ciascuna cuvetta di reattivo che è stato preventivamente diluito
10 volte

Una volta aggiunto il reattivo nelle cuvette relative alla curva di calibrazione facciamo stessa cosa nelle
cuvette che contengono i campioni.

Si può notare che nel bianco il reattivo rimane di colore giallo mentre nelle cuvette dove abbiamo acido
gallico in alta concentrazione es cuvetta da 100 ppm colore sta già cambiando quindi acido gallico sta già
reagendo con reattivo

100
Per favorire la reazione andiamo ad aggiungere 2 ml di carbonato di sodio al 10% in acqua Na2CO3 , questo
servirà ad andare a rendere ambiente basico e velocizzare reazione

Possiamo decidere di aggiungere 1 ml prima in ogni cuvetta e poi aggiungere un altro ml andando sempre
in sequenza e cercando di mantenere sempre la stessa sequenza nelle operazioni

In realtà il reattivo è fotosensibile quindi reazione va eseguita al buio, nostra scatola verrà coperta con
coperchio e lasciata al buio per 30 minuti e in questo tempo avverrà completa reazioni tra polifenoli
presenti nel campione e reattivo .

Aggiungiamo carbonato anche a campioni di the

Inoltre importante eseguire reazione andando ad aggiungere al campione prima reattivo e poi carbonato se
no reazione non avviene

• 250 µL di the diluito 1:5 + 1mL di reattivo di Folin-Ciocâlteau + 2mL Na2CO3 10%
• 250 µL di the diluito 1:5 + 1mL di reattivo di Folin-Ciocâlteau + 2mL Na2CO3 10%
• 250 µL di the diluito 1:5 + 1mL di reattivo di Folin-Ciocâlteau + 2mL Na2CO3 10%
• 250 µL di di the diluito 1:10 + 1mL di reattivo di Folin-Ciocâlteau + 2mL Na2CO3 10%
• 250 µL di di the diluito 1:10 + 1mL di reattivo di Folin-Ciocâlteau + 2mL Na2CO3 10%
• 250 µL di di the diluito 1:10 + 1mL di reattivo di Folin-Ciocâlteau + 2mL Na2CO3 10%

Possiamo subito notare come la soluzione a 10 ppm risulti chiara, mentre quella a 100 ppm di acido gallico
risulti già colorata in azzurro

Soluzione 100 ppm soluzione 10 ppm

campione di te diluito 1:5 campione di te diluito 1:10

Colorazione sarà tanto più intensa quanti più polifenoli conterrà

Chiudiamo scatola per 30 minuti per poi andare ad analizzare nostri campioni allo spettrofotometro

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Andando a misurare intensità colorazione ovvero l'assorbimento della radiazione che va ad attraversare
queste soluzioni otterremo un assorbimento che sarà tanto più elevato tanto + l'intensità della colorazione
sarà elevata
Andando a correlare assorbimento con concentrazione otterremo curva di calibrazione

Misure dei campioni

Spettrofotometro a doppio raggio, ovvero all’interno della camera di misura ci sono 2 postazioni, una
utilizzata per il campione mentre l’altra è sempre utilizzata per il riferimento ovvero utilizzeremo come
riferimento acqua perché nostri campioni e nostre soluzioni standard sono sempre dispersi in acqua

Andremo ad effettuare auto zero dello strumento utilizzando cuvette con una parte opaca e una
trasparente, il raggio spettrofotometro dovrà attraversare parte trasparente, mentre parte opaca non verrà
attraversata dal raggio quindi bisogna posizionare in modo corretto cuvetta facendo si che raggio punti
verso zona trasparente.

Posizioniamo una cuvetta nella cella di riferimento e l’altra cuvetta contenente acqua nella cella che
conterrà nostro campione

Misure vanno fatte con camera di misura chiusa

Si può passare ad effettuare auto zero, che è una calibrazione dello strumento che saprà poi che lo spettro
dell’acqua è lo zero e quindi poi campioni verranno analizzati e i picchi di assorbimento che noi vedremo
saranno quelli dati effettivamente dall’analita e non da interferenti presenti all’interno del solvente acqua

Spettrofotometro ha un’altra camera in cui è montata sorgente a lampada alogena e una lampada al
deuterio, nel momento in cui si va a effettuare lo spettro nel campo del visibile si utilizza la lampada
alogena mentre per uv lampada al deuterio .

Nel nostro caso abbiamo campioni colorati che assorbono nel visibile quindi utilizzeremo solo lampada
alogena

Lo spettro del visibile da 400 a 800 nm

All’interno dello spettrofotometro vi è un monocromatore che fa si di andare a selezionare le lunghezze

d’onda necessarie per analisi.

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Possiamo andare ad effettuare un primo spettro per capire qual è il max di assorbimento dei nostri
campioni e una volta selezionati il o i max di assorbimento per effettuare un’analisi quantitativa andremo a
impostare il monocromatore solo su quella specifica lunghezza d’onda in modo da essere selettivi e sensibili
in quella zona per ottenere analisi quantitativa corretta.

Quindi da pc si va a selezionare opzione auto zero per calibrare strumento dopodichè effettueremo uno
spettro del nostro bianco dove si vedrà solo linea di base, andando poi a confrontare questo spettro con
quello del campione andremo a capire dove abbiamo max di assorbimento

Prima di effettuare nostre misure andiamo quindi a determinare il max di assorbimento nel campo che ci
interessa del campione, per fare ciò utilizziamo come riferimento una delle soluzioni standard ad esempio
la più concentrata cioè a 100 ppm, posizioniamo cuvetta all’interno dello spettrofotometro e andiamo a
effettuare misura dello spettro nel campo del visibile

Strumento misura già spettro a partire da 800 nm e abbiamo primo max di assorbimento intorno ai 760 nm
quindi curva scende, risale, 2 max di assorbimento intorno ai 700 nm, ma rimane più basso del primo
individuato quindi per fare un’analisi quantitativa il più possibile selettiva e precisa utilizzeremo come
riferimento primo max di riferimento intorno ai 760 nm

Abbiamo impostato spettrofotometro per andare a effettuare una misurazione a una lunghezza d’onda
fissa, dopo aver individuato max di assorbimento a 760 nm, impostiamo strumento in modo che ci vada a
leggere assorbanza di ciascuno dei nostri campione a lunghezza d’onda di 760 nm

Autozero effettuato utilizzando come riferimento acqua e ora effettuiamo misura dei nostri campioni
comprensivo del bianco

1) Partiamo da bianco di reazione per andare a verificare che non ci siano interferenze nei nostri
reagenti, quindi quando diamo start allo strumento non vedremo uno spettro di assorbimento ma
ci restituirà solamente un numero che corrisponde all’assorbanza del nostro campione a lunghezza
d’onda di 760 nm .
Per bianco A= 0.03 vuol dire che nostri reagenti non interferiscono con analisi

Effettuiamo 2 letture su ciascuno dei campioni di riferimento quindi su ciascuna delle nostre soluzioni
standard mentre effettueremo una singola lettura su campioni di the

2) prima soluzione standard e andando a effettuare lettura otteniamo 0.14 già vediamo differenza
rispetto a reagenti singoli, questa differenza è data dalla presenza di acido gallico alla
concentrazione di 10 ppm

Assorbanza sarà tanto più elevata quanti più polifenoli ci saranno nel campione

3) Analizziamo soluzione 25 ppm assorbanza di 0.24

Risultati verranno utilizzati per costruire curva di calibrazione in base alla quale poi andare a quantificare il
contenuto di polifenoli all’interno dei campioni

Analizzando campioni di te osserviamo già visivamente che te diluito 1 a 10 sia effettivamente più chiaro
del the diluito 1 a 5

1) The diluito 1 a 10 A= 0.3479

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 2) The diluito 1 a 5, quindi più concentrato, A > 0.6158

Ricordarsi di considerare i fattori di diluizione

Risultati

Radiazione UV = eccitazione degli elettroni di valenza da un orbitale occupato ad uno non occupato, π π*
oppure n π*

Radiazione Visibile = stesso fenomeno, ma osservabile dall’occhio umano

Molecola assorbe una parte di questa radiazione che la colpisce, spettrofotometro misura entità di questo
assorbimento, questa misura ci può dare idea della quantità di molecola all'interno del campione

attraversando campione radiazione verrà modificata perché campione sarà in grado di assorbire una parte
della radiazione incidente

La differenza di queste due energie ci da l'assorbimento del campione ovvero quanta energia della
radiazione incidente è in grado di assorbire il nostro campione

Assorbimento tanto più elevato quanto più è alta concentrazione di una determinata molecola

Valori di assorbanza aumentano all'aumentare della concentrazione perché secondo la legge lambert beer
sono direttamene proporzionali tra loro, per curva di calibrazione useremo excel dove costruiremo un
grafico con in ascissa valori di concentrazione delle soluzioni standard e in ordinata valori segnale che
abbiamo ottenuto

Disegnando otterremo dei punti e una curva che si avvicina in questo caso ad una retta, questa retta di
calibrazione avrà una determinata equazione che si potrà utilizzare per determinare la concentrazione di
polifenoli all'interno del nostro campione ma la potremo utilizzare solo se avremo verificato che ci sia una
linearità di risposta andando a visualizzare il valore di R al quadrato della nostra curva, + R si avvicina a 1 più
nostra curva assomiglia a una retta quindi in questo caso possiamo affermare che abbiamo una risposta
lineare nel range di concentrazioni che abbiamo utilizzato

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Analisi del campione noi otterremo valore di y assorbanza andando quindi a ricavare x da equazione retta
otterremo concentrazione dei polifenoli totali all'interno del nostro campione di te. moltiplicando poi per il
fattore di diluizione che era 5 o 10 otteniamo valore di polifenoli totali espressi come acido gallico
equivalenti nel nostro campione di infuso di te
𝑦−0.0592
In questo caso x= 0.0077

Moltiplicando poi per il fattore di diluizione che era 5 o 10 otteniamo valore di polifenoli totali espressi
come acido gallico equivalenti nel nostro campione di infuso di te.

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