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Cromatografia

Scrittura del colore

Il termine cromatografia indica un insieme di


tecniche che hanno lo scopo di separare una
miscela nei suoi componenti, per permetterne il
riconoscimento qualitativo e quantitativo

Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo


l’analisi di miscele complesse come sono la
maggior parte dei campioni di natura organica
Cenni storici
 1903-1906: nascita “Cromatografia” grazie a
un botanico russo (M. Tswett)
 1938: introduzione della T.L.C. e della
cromatografia a scambio ionico
 1941: cromatografia di ripartizione liquido-
liquido
 1944: cromatografia su carta
 1950: cromatografia a fase inversa
 1951: gas-cromatografia
 1959: cromatografia a permeazione di gel
 1965: cromatografia liquida ad alte
prestazioni
Principi della cromatografia
-la differente velocità di migrazione dei componenti
costituenti una miscela (equilibrio dinamico)
-Fase mobile (MP), liquida o gassosa
-Fase stazionaria (SP), solida o liquida, stratificata su
vetro o alluminio o impaccata in una colonna
Fase fissa A Fase mobile
Fase fissa B Fase mobile
Fase fissa C Fase mobile
-Spostamento della fase mobile determina
l’avanzamento del soluto in essa contenuto mentre le
molecole che sono distribuite nella fase stazionaria
resteranno momentaneamente ferme
XM  Xs

Soluto X migrerà con una velocità proporzionale a Kx


o coefficiente di distribuzione tra le due fasi
(dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi)
Il coefficiente di distribuzione del componente X è
definito come: [X]s
K  X
[X]m K A ≠ K B ≠ KC
Quale componente
ha K maggiore?

Flusso del solvente


A: il campione viene iniettato
all’entrata della colonna
B  D: la fase mobile fa
spostare il campione attraverso
la fase stazionaria
A B C D
1
VA =
VM + VS KA

[A]S = 0 A non ha alcuna


affinità per la fase
fissa e si muove
con il fronte della
fase mobile

[A]M = 0 A non ha alcuna


affinità per la
fase mobile per
cui si distribuisce
completamente
nella fase fissa
senza spostarsi

Riportando il segnale in funzione del tempo si ottiene il


cromatogramma
Se [X]f=0 allora Vx è max e uguale alla Veluente e il
Volume dell’eluente necessario a eluire X è pari al
volume dello spazio interstiziale non occupato dalla
fase fissa detto volume interstiziale o Vm.
Se [X]f≠0 allora Vx è < di Veluente e il Volume
dell’eluente necessario a eluire X volume di
ritenzione VR sarà maggiore del Vm.

Allora VR-Vm = VR’ o volume netto di ritenzione


Tempo di
ritenzione

Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della


miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere
rivelato come picco dal detector.

tM = t0 = tempo morto
tR’ = tR - t0 = tempo netto di ritenzione, tempo trascorso
da un dato soluto nella fase stazionaria
Relazioni che quantificano l’interazione di un dato
soluto con la fase stazionaria
VR = t R . F V m = t0 . F
F (velocità di flusso)

FATTORE di CAPACITA’
V = velocità lineare media di migrazione di un soluto = L/tR
U = velocità lineare media di flusso della fase mobile = L/t0
V = u . (frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile)
V = u . [CM.VM/CMVM+CSVS]
V=u. 1
1 + CSVS/CMVM
1
L/tR = L/t0 . tR = t0 (1 + K VS/VM) = t0 (1 + K’)
1 + K VS/VM

tR  tM Fattore di ritenzione
K' o rapporto di
tM distribuzione di massa
k’ dipende:
•dalla T°
•dalla natura delle fasi
•dalle caratteristiche dell’impaccamento
•dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria

k’ non dipende:
•dalla lunghezza della colonna
•dal flusso

Usato per confrontare le prestazioni di colonne diverse


a parità di eluente

La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie:


riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere
fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa
delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B>
(tR)A.
k 'B ( tR )B  tM Fattore di
  separazione o
k' A ( tR )A  tM Ritenzione relativa
Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza di una
colonna (ampiezza dei picchi):
1) Altezza equivalente di piatto teorico H
2) Numero di piatti teorici N L
N
H L = lunghezza colonna
Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un
equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi.
Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di
equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola
separazione, N ha un significato puramente matematico.
Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità
di una separazione (migliore è la capacità di separazione della
colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna.
Si può dimostrare che
2
t  W
N  16 R 
W
W = larghezza del picco
Separazione ottimale

a) separazione con
scarsa risoluzione e
basso N

b) migliora la
risoluzione ma è
sempre basso N

c) ottima risoluzione e
buono N

I
Si può dimostrare che: 1    1 k B
R N  I
4    kB  1
risoluzione scarsa per scarsa
efficienza e scarsa selettività

buona risoluzione dovuta a


buona efficienza e buona
selettività
buona risoluzione dovuta a buona
selettività, ma efficienza non
troppo elevata

risoluzione scarsa dovuta ad una


basso selettività.

Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza


(picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da
una buona differenziazione del comportamento dei soluti
(selettività).
Interazione soluto-fasi
Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e
le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non
fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria
oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo
separativo le seguenti interazioni:

• legami a idrogeno
• interazioni dipolo-dipolo Meccanismi di separazione
• interazioni dipolo-dipolo indotto • ripartizione
• forze di Van der Waals • adsorbimento
• formazione di composti di • scambio ionico
interazione • esclusione
• attrazione coulombiana • affinità
• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente


decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere
presenti più tipi di interazione nello stesso processo
cromatografico
Cromatografia
Fase mobile: liquida Fase mobile: gassosa

CROMATOGRAFIA GAS-CROMATOGRAFIA
LIQUIDA (L.C.) (G.C.)

Fase fissa: solida Fase fissa: liquida

CROMATOGRAFIA di
ASSORBIMENTO (L.S.C.) CROMATOGRAFIA di
RIPARTIZIONE (L.L.C.)
Colonna/strato sottile
Colonna
CROMATOGRAFIA a Strato sottile
SCAMBIO IONICO (L.S.C.)
Colonna/strato sottile Carta

GEL CROMATOGRAFIA Fase mobile: fluido


Colonna/strato sottile supercritico

CROMATOGRAFIA di CROMATOGRAFIA LIQUIDA


AFFINITA’ SUPERCRITICA (S.F.C.)
RIPARTIZIONE
La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare
inerte (gel di silice) o è ad esso chimicamente legato; in questo
liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e
la fase mobile devono invece essere immiscibili.
Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra
le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi
di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o
liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile.

≡Si-OH + R-SiCl3 + 2 H2O ≡Si-O-Si(OH)2-R + 3 HCl

La cromatografia di ripartizione è
chiamata in fase normale se la fase
stazionaria è più polare della fase
mobile, mentre è chiamata fase
inversa se la fase stazionaria è meno
polare della fase mobile. Si tratta della
tecnica più comunemente impiegata
per la separazione di sostanze
organiche
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI
RIPARTIZIONEdi RIPARTIZIONE (L.L.C.)

In fase normale

Fase stazionaria polare Fase mobile a bassa polarità


≡Si-O-Si(R)2-CN Solventi organici
≡Si-O-Si(R)2-NH2 Soluzioni acquose
(zuccheri, steroidi, amminoacidi,
proteine e peptidi)

In fase inversa

Fase stazionaria apolare Fase mobile molto polare


≡Si-O-Si(CH3)2 Soluzioni acquose o tamponate
≡Si-O-Si-CH2-(CH2)6-CH3 Miscele acqua/metanolo/acetonitrile

≡Si-O-Si-CH2-(CH2)16-CH3 (ammine, vitamine, idrocarburi, analgesici)


ADSORBIMENTO
La fase stazionaria è un solido in polvere (gel di silice o allumina);
sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono
stabilire legami deboli (reversibili!)
reversibili con le molecole della miscela
da separare (ma anche con le molecole d’acqua, disattivandolo). Si
parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-
solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile.

Per sostanze molto polari è preferibile


usare gel disattivati, mentre per
sostanze con bassa polarità si
preferiscono le silici non modificate.

Le fasi mobili più usate in ordine di


polarità crescente e quindi di potere
eluente sono:
Esano, isottano, cloroformio,
acetonitrile, metanolo, acqua.
SCAMBIO IONICO
La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte (resine
sintetiche) contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi
funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono essere
scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il
meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti
di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti
nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)
Resina a scambio cationico: -SO3H, -COOH
Resina a scambio anionico: -NH2, -N(CH3)2
La fase mobile è un tampone anionico (acetato) o cationico (tris)
contenenti ioni della stessa carica di quella dei campioni (capacità di
spostamento, pH, t °)

La cromatografia a scambio
ionico è impiegata per la
separazione di sostanze
ioniche o ionizzabili
(amminoacidi, nucleosidi,
nucleotidi)
Fase stazionaria: scambiatore cationico forte polistirene solfonato

Fase mobile: tampone citrato/acido citrico

Eluizione con gradiente di pH e forza ionica, ad esempio


citrato/acido citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na+ da 0,2 a 0,4M.

Gli aminoacidi vengono eluiti sequenzialmente quando i valori del


pH si avvicinano al loro punto isoelettrico:

a pH basso: acidi (es. Asp, Glu)


a pH neutro: neutri (es. Gly, Val)
a pH basico: basici (es. Lys, Arg)

Un analizzatore di amminoacidi contiene un sistema continuo di


registrazione dell'eluato: nel cromatogramma ad ogni picco
corrisponde un amminoacido.
ESCLUSIONE DIMENSIONALE
La fase stazionaria è un solido poroso o un gel di granulometria
definita (acrilammide o sephadex) per cui i campioni vengono
separati in base alla dimensione delle loro molecole.
Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei
pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un
certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori
ed escono dalla colonna in tempi brevi (la fase stazionaria si
comporta da setaccio, intervallo di PM).

Si parla di cromatografia di esclusione


dimensionale (SEC)
oGel permeazione (GPC) per la
separazione di sostanze insolubili in
acqua
oGel filtrazione (GFC) per la
separazione di sostanze solubili in acqua
La tecnica è impiegata per la
separazione di molecole di grandi
dimensioni (peptidi, proteine, polimeri)
AFFINITA’
In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico,
reversibili e molto specifiche,
specifiche in modo che le molecole da
separare interagiscano con la fase stazionaria a cui è
chimicamente legato un ligando specifico così da ottenere
l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di
cromatografia di affinità (AFC).
Ligandi tipici sono substrati di reazioni enzimatiche, inibitori,
cofattori, recettori, basi di sequenza complementari, ormoni,
anticorpi, ecc…
Le matrici più utilizzate sono l’agarosio, la poliacrilammide, il
destrano, la cellulosa; scarse interazioni aspecifiche, buone
proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili, stabilità a
variazioni di pH e di temperatura.

La cromatografia di affinità è
impiegata nella separazione di
molecole di interesse
prevalentemente biochimico
Cromatografia classica su colonna

Le colonne impiegate sono generalmente in


vetro e possono essere di varie dimensioni
secondo le esigenze.

Il riempimento della colonna può essere


costituito da materiale solido adsorbente,
finemente suddiviso, asciutto e scelto
opportunamente in base alla separazione da
effettuare (per LSC) oppure la colonna viene
riempita con supporto granulare inerte,
generalmente gel di silice, che viene
impregnato con solvente opportuno e che
costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una
resina a scambio ionico per cromatografia
ionica.

Il solvente scelto, contenente la miscela da


separare, viene fatto fluire attraverso la
colonna.
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta
pressione è frutto dell’evoluzione tecnologica delle tecniche di
cromatografia su colonna.
I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione,
ma le fasi stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con
materiali di granulometria molto fine (3-10 m) e controllata: in
tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile
e fase stazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo.
Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga
fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con
impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente
diventa molto lento.

Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di


50-150 atm, diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min,
sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi ragionevolmente brevi.
HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica:
velocità, risoluzione e sensibilità superiori

C
A B

A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d


= 100 m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)
B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 m, D = 1-3 mm, L = 50-
100 cm)
C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L
= 10-50 cm)
d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna
LC classica:
1) dimensione delle particelle e Cercando di aumentare la velocità del
diametro interno della colonna molto solvente, diminuiscono efficienza e
maggiori che nella HPLC risoluzione a causa del limitato
2) velocità di flusso molto basse trasporto di massa nei pori profondi e
3) tempi di analisi lunghi nei lunghi canali interparticellari.

HPLC: Per favorire il flusso della fase mobile è


1) impaccamento di dimensioni quindi necessario l’uso di pompe ad
molto inferiori, compresso in alta pressione. Efficienza aumentata di
colonne sottili 10-100 e tempi di separazione
2) contropressioni maggiori diminuiti (miglioramento nei termini di
3) tempi d’ analisi contenuti trasporto di massa della fase
stazionaria e della fase mobile).

La pressione dipende da diversi paramentri:


η = viscosità del solvente
V = velocità lineare di flusso
L = lunghezza della colonna
1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar

K = costante legata alle caratteristiche fisiche del 1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2
riempimento della colonna
d = diametro della colonna
Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con
diametro interno di 1-5 mm.
Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o
da particelle o impurezze presenti nel campione e nel solvente. È per
questo che è necessario proteggere l’ingresso della colonna principale
con una pre-colonna che contiene la stessa fase stazionaria della
colonna principale, ma è più corta e può venire periodicamente sostituita.

La fase stazionaria più comune è costituita da particelle microporose di


silice ad elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area
superficiale (alcune centinaia di m2/g). Questa fase stazionaria viene
generalmente impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più
comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando
fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie
della silice.
Fasi polari comuni Fasi non polari comuni

R = (CH2)3NH2 ammino R = (CH2)17CH3 ottadecile

R = (CH2)3CN ciano R = (CH2)7CH3 ottile

La C18 (anche indicata con ODS) è la


fase stazionaria di gran lunga più
utilizzata in HPLC
• sistema di iniezione costituito da una
• pompa con pressione valvola a più vie e da un circuito a
fino a 400 Atm, volume fisso, o loop, nel quale si
flusso stabile tra 0.1 mette il campione
e 10 ml/min

• colonna
cromatografica ed
eventuale
precolonna
• rivelatore per
monitorare gli
eluati
• riserva di solventi: uno o più
solventi che possono essere • PC per gestire il
utilizzati singolarmente o in sistema e i dati
miscela
Eluizione isocratica e a gradiente

Con 1 solo solvente o con Variazione continua della


una miscela di solventi di composizione del solvente per
composizione costante. aumentare la forza eluente. Una
forza eluente crescente è
necessaria per eluire i soluti più
fortemente trattenuti e per
migliorare le separazioni.

SOLVENTE
DEBOLE

SOLVENTE
FORTE

FORZA
INTERMEDIA

GRADIENTE
DI SOLVENTE
Sistemi di rivelazione
• Sensibilità adeguata al problema
• Buona stabilità e riproducibilità
• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di
grandezza
• Tempi di risposta rapidi
• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più
classi di soluti

Rivelatore LOD (ng) Selettività Utilizzabile in gradiente?

Assorbimento UV 0.1-1 selettivo SI

Indice di rifrazione 100-1000 generale NO

Fluorescenza 0.001-0.01 selettivo SI

Elettrochimico 0.01-1 selettivo NO

Conduttimetrico 0.5-1 selettivo NO

Assorbimento IR 1000 selettivo SI

Spettrometro di massa 0.1-1 generale SI


GAS-CROMATOGRAFIA
In gascromatografia (Martin e Synge 1941 e poi
James e Martin 1952) la fase mobile è un gas che
fluisce in una colonna in cui è posta la fase
stazionaria.

I meccanismi di separazione dei componenti la


miscela sono determinati dalla fase stazionaria,
poiché quella mobile funziona solamente da gas di
trasporto(carrier).

Condizione indispensabile per operare un’analisi


gascromatografica su una miscela è che essa sia in
grado di passare in fase vapore alla temperatura di
lavoro.
VANTAGGI DELLA GC SVANTAGGI DELLA GC
•Poco costosa Non applicabile all’analisi di
•Altamente sensibile (10-9 - 10-13 macromolecole, sostanze termolabili,
g/mL) altamente polari o idrofile

•Robusta
•Riproducibile
•Rapida
•Separazione di mix complesse
(100 analiti in GC-capillare)

Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria =


solido adsorbente)
Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria =
liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato
sulle pareti della colonna)
A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il
gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i
componenti lungo la colonna.
Trattamento del campione

Derivatizzazione: usata per sostanze altobollenti

• Reagenti sililanti
HMDS esametildisilazano (zuccheri)
TMCS trimetilclorosilano (acidi carbossilici)
BSA bistrimetilsililacetamide (alcoli, ammine, acidi carbossilici,
fenoli, steroidi, alcaloidi)
BSTFA bistrimetilsililtrifluoroacetamide (come BSA froma deivati poù
volatili)

• Reagenti acilanti
TFAA anidride trifluorometansolfonica (alcoli, fenoli, ammine)
PFPA anidride pentafluoropropionica (alcoli, fenoli, ammine)
HFBA anidride eptafluorobutirrica (tioli)

• Reagenti alchilanti
TMPAH idrossido di trimetilanilinio (COOH, NH2, OH, barbiturici, sedativi,
basi xantiniche, alcaloidi fenolici)
BF3 in etanolo (acidi grassi dei trigliceridi)
PFBBr pentafluorobenzilbromuro (acidi, fenoli, tioli e solfonammidi)
SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO

He, Ar, N2
SISTEMA DI INIEZIONE
FUNZIONI:

- Introduzione del campione

- Evaporazione del campione

- Ingresso del gas di trasporto

- Collegamento alla colonna


L’entrata deve essere ad una
temperatura sufficientemente elevata
da permettere l’evaporazione
istantanea del campione e abbastanza
grande da permettere al vapore di
espandersi senza essere spinto indietro.

Nelle colonne impaccate, il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del
gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della
miscela (T° 50-100°C).
Nelle colonne capillari, la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a
100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole.
COLONNE
Per gas-cromatografia “canalicoli”
dell’impaccata
Le impaccate (acciaio, vetro o
rame) contengono particelle
solide inerti di appropriata
granulometria, eventualmente
imbevute della fase stazionaria
liquida (diametro = 0.75 - 4
mm; lunghezza = 6 m) .
WCOT= wall-coated-open-tubular
Le capillari sono tubi molto più
sottili e lunghi (diametro = 0.1 -
0.75 mm; lunghezza = 15-300 SCOT= support-coated-open-tubular
m) in cui la fase stazionaria è
depositata sulle pareti interne.
Queste ultime hanno un elevato unico “canalone”
numero di piatti teorici (anche della capillare
300.000) grazie alla loro elevata
lunghezza.
Le fasi stazionarie più usate in I supporti inerti più usati in GC di
GC di adsorbimento sono: ripartizione sono:
Gel di silice Terra di Diatomee
Allumina Teflon
Carbone attivo Microsfere di vetro
Carbone grafitizzato Le fasi stazionarie più usate
Microparticelle sferiche di carbone (ancorate, legate) sono:
Zeoliti Idrocarburi
Sali inorganici Esteri e poliesteri
Polieteri
Ammidi, ecc….

Influenza della temperatura sulla corsa cromatografica

• Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore


corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti
della miscela.
• Per miscele particolarmente complesse con punti di ebollizione
troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica.
• Per tali miscele un
temperatura troppo
alta consentirebbe una
buona separazione dei
componenti altobollenti
ma ammasserebbe
quelli più
bassobollenti.

• Al contrario, una
temperatura troppo
bassa, non consentirebbe
di separare quelli
altobollenti.
Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo lineare, e prevede
le seguenti tappe:
Isoterma iniziale: indica quanto tempo si rimane a una determinata
temperatura.
Fase di rampa: si stabilisce la temperatura da raggiungere e con
quale velocità.
Isoterma finale: indica il tempo che si deve restare alla
temperatura più alta.
Raffreddamento: si attua dopo la fine della registrazione del
cromatogramma
45°

145°

programma di T
Sistemi di rivelazione
• Sensibilità adeguata al problema
• Buona stabilità e riproducibilità
• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di
grandezza
• Tempi di risposta rapidi
• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più
classi di soluti

Rivelatore Selettività

Termoconducibilità TCD Non selettivo


Insostituibile per l’analisi dei gas
Ionizzazione di fiamma Poco selettivo

Azoto-fosforo (NPD) o a fiamma alcalina selettivo

A Cattura di elettroni (ECD) Selettivo


Organofosforici, diossine, benzodiazepine
Spettrometro di massa generale
Limite di linearità
è la concentrazione massima al
Intervallo di linearità di là della quale il segnale non è
range di concentrazioni più proporzionale alla
compresa tra il limite di concentrazione (con una
rivelabilità e il limite di tolleranza del 5%).
linearità. Intervallo di
risposta
Limite di dinamico
rivelabilità intervallo di
è la concentrazioni
entro il quale il
concentrazione rivelatore
minima che dà risponde, anche
una risposta se non in maniera
doppia del lineare
rumore di fondo

Limite intervallo
di risposta
dinamico; oltre
questa
concentrazione non
si possono fare
misure
Riassumendo

• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente


stabili, non ionici

Gascromatografia

• analiti non volatili o poco volatili, ionici,


ionizzabili o non ionici, termicamente instabili

Cromatografia liquida
La Radiazione Elettromagnetica è costituita da un campo
magnetico e da un campo elettrico oscillanti su due piani
perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda.
Parametri che descrivono la natura ondulatoria dell’onda:
-Lunghezza d’onda : distanza tra i due massimi o tra i due
minimi.
-Ampiezza d’onda: in valore assoluto la distanza tra la
direzione di propagazione dell’onda e il punto di max o di
min.
-Frequenza : numero di onde che passano un dato punto
nell’unità di tempo.
La descrizione quantitativa delle interazioni tra la
radiazione e la materia è possibile solo se si considera la
radiazione come formata da quantità discrete, chiamate
FOTONI. L’energia dei fotoni è proporzionale alla
frequenza della radiazione.
SPETTROSCOPIA
E’ la disciplina che studia l’INTERAZIONE delle radiazioni
elettromagnetiche con gli stadi quantici di energia della
materia.
In virtù di questa interazione, si determina una variazione
dell’energia che può interessare nuclei, elettroni, atomi o
molecole.
assorbire la radiazione > il suo contenuto energetico
(SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO)
emettere la radiazione < il suo contenuto energetico
(SPETTROSCOPIA di EMISSIONE)
diffondere la radiazione (SPETTROSCOPIA RAMAN)

Tutti questi tipi d’interazione possono avvenire solo per


determinate l della radiazione incidente e quindi solo per
determinate . h = E’-E” differenza di energia tra i due
stati del sistema.
SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO
Processo mediante il quale una sostanza rimuove selettivamente
alcune frequenze dalla radiazione elettromagnetica.
Lo spettro non è altro che la rappresentazione grafica delle
transizioni energetiche permesse (Regole di selezione) sotto
forma di righe.

1. Transizioni elettroniche ETOT = Ee + Ev + Er + Et


2. Transizioni vibrazionali
Een
3. Transizioni rotazionali
4. Transizioni traslazionali
Ee1
E vn
E v2
E v1 Ern
Ee0 E v0 Er0

, E


TRANSIZIONI
Rotazionali Vibrazionali Elettroniche
Onde Radio
Variazioni di energia
troppo deboli per
essere osservate se
non sotto un intenso
campo magnetico
STATI di SPIN Visibile, Ultravioletto,
INDOTTI Raggi X
MAGNETICAMENTE
EPR (elettroni)
NMR (nuclei)
Infrarosso

Infrarosso lontano,
microonde
La legge dell’assorbimento o Legge di Beer

E’ la legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento


delle radiazioni elettromagnetiche in generale e con particolare
riferimento alle soluzioni.
A=.b.C
A = assorbanza o frazione di energia assorbita
b = cammino ottico (cm), spessore della soluzione
attraversata dal raggio
c = concentrazione (mol/L) della specie in esame
 = assorbività o coefficiente di estinzione molare o di
assorbimento molecolare (IUPAC), cioè l’assorbanza a
concentrazione e spessore unitari.
(, dal solvente, dalla natura chimica della specie che
assorbe; non dipende in generale dalla temperatura)
Se  è costante e b (cammino costante) allora l’equazione
assume la forma A = kc e quindi del tipo y = mx.
Altro modo per descrivere il fenomeno dell’assorbimento consiste
nell’usare la definizione di Trasmittanza
T = 
T = trasmittanza
I0 = intensità della radiazione incidente
I = intensità della radiazione che esce dal campione

Questa grandezza è legata all’Assorbanza secondo la relazione:


A = log 1/T = log I0/I
Se T% = 100T
A = log 100/T% = 2-log T% oppure T% = 102-A
A varia tra 0 e infinito mentre T% varia tra 0 e 100.
Fattori che possono determinare deviazioni dalla linearità:
-Concentrazione della soluzione (10-2/10-7), se troppo concentrata
si può avere una variazione dell’indice di rifrazione e quindi di ,
così come si possono formare coppie ioniche o complessi o
aggregati.
-Variazioni di pH, perché influenza l’equilibrio tra due forme della
stessa sostanza, aventi  diverso ad una stessa .
-Temperatura, perché influenza sempre un eventuale equilibrio;
tuttavia variazione nell’ordine di ±5 °C non comportano particolari
problemi.
-Solvente, perché la polarità del solvente influisce sulla
distribuzione elettronica nella molecola analizzata. Ad es solventi
polari o con alta costante dielettrica esercitano un effetto
batocromo.
-Co-presenza di fenomeni di fluorescenza (emissione) e diffusione
della radiazione.
-Fattori strumentali (ampiezza della banda passante)
Spettri di assorbimento e scelta della lunghezza d’onda
per la misura dell’assorbanza

Una sostanza assorbe in modo diverso


le varie radiazioni, cioè a diverse 
corrispondono vari .
Lo spettro di assorbimento che si
ottiene è uno spettro a bande
caratterizzato dalla presenza di massimi
(picchi di assorbimento) e minimi.
Ogni sostanza ha un suo spettro
caratteristico ed è proprio individuando
la posizione dei massimi caratteristici
che si realizza l’analisi qualitativa.
L’analisi quantitativa viene invece fatta
scegliendo un’opportuna , detta
lunghezza d’onda analitica, scelta in
modo che corrisponda ad un max o ad
un min.
Transizioni elettroniche e cromofori

L’assorbimento nel campo UV- π π*


VIS è dovuto a transizioni
elettroniche da orbitali di n π*
legame a orbitali di non-legame
o di anti-legame a più alto Le prime sono caratteristiche
contenuto energetico e questo è dei sistemi insaturi e le seconde
possibile solo se la radiazione di eteroatomi con doppietti
possiede un’energia pari al E liberi; sistemi di questo tipo
tra i due livelli. sono indicati come cromofori.

C=C, C≡C, C=O, C≡N, C=S, N=O, N=N, polieni, aromatici, ecc…
Effetto dei sostituenti

Effetto Batocromo: diminuisce il E della transizione, alzando il contenuto


energetico dell’orbitale legante o diminuendo quella dell’orbitale anti-legante o non-
legante. Il picco (l’assorbimento) viene spostato a  maggiori (sostituenti e- ricchi o
donatori).
Effetto Ipsocromo: effetto opposto al precedente; aumenta il E e quindi
diminuisce la  dell’assorbimento (sostituenti e- poveri o elettronegativi).
Effetto Ipercromico: risulta aumentato  o per aumento della probabilità che
avvenga quella data transizione o per aumento della superficie del cromoforo;
aumenta l’assorbanza ma rimane costante la  a cui il composto assorbe.
Effetto Ipocromico: effetto opposto al precedente; diminuzione di  e quindi
dell’assorbanza.
Rivelatore UV a  fissa
Vantaggi e svantaggi
Il principale vantaggio è il basso costo.
Inoltre l’elevata intensità della radiazione
della lampada a Hg permette di ottenere
elevata sensibilità per composti che
assorbono a 254 nm.
Il principale svantaggio è determinato
dalla scarsa selettività dovuta alla
necessità di lavorare a  fissa.

Vantaggi
- Versatilità: possibilità di selezionare  da
Rivelatore UV a  variabile 190 a 800 nm.
- Elevata sensibilità: potendo scegliere la 
ottimale (max assorbanza) per un
analita.
- Selettività: quando si hanno
sovrapposizioni di picchi si può variare la
 in modo tale da minimizzare
l’assorbimento degli interferenti.
- Possibilità di utilizzare gradiente di
eluizione, scegliendo una  alla quale la
miscela solvente non assorbe.
Dopo un’ora
Separazione di una
tossina proteica, della
tossina coniugata con la
biotina e dell’avidina
(fattore antinutrizionale)

Avidina
Glicoproteina
dell’albume che
impedisce
l’assorbimento
della biotina

Biotina (IUPAC)
Vitamina H o I
(tedesca)
Vitamina B7
(anglosassone)
Vitamina B8
(francese)
Spettrometro di Massa
Lo spettrometro di massa può fornire informazioni qualitative e quantitative
sui componenti della miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere uno
spettro di massa, le molecole portate in fase gassosa, vengono ionizzate.
Gli ioni sono quindi accelerati per mezzo di un campo elettrico e vengono
poi separati in base al loro rapporto massa/carica (m/z).
L’accoppiamento HPLC-MS è una tecnica relativamente “giovane” e sempre
più utilizzata.
Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS può servire come rivelatore
universale (o comunque come un rivelatore che risponde ad un’estesa
gamma di soluti) e sensibile.
L’accoppiamento HPLC/MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60),
ma soltanto dalla metà degli anni ’70 appaiono le prime pubblicazioni
scientifiche.
Le difficoltà di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si
utilizzano solventi molto diversi, in funzione del tipo di analisi, (es.
acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi in LC sono molto
elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Per
accoppiare le 2 tecniche sono pertanto necessarie opportune interfacce
che oltre a ridurre i flussi dovranno consentire anche la
vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.
1) il sistema di entrata

2) la sorgente ionica, il cuore dello spettrometro, in cui le molecole


neutre vengono trasformate in ioni e si frammentano

3) l’analizzatore, in cui gli ioni vengono separati in funzione del rapporto


massa/carica (m/z)

4) il rivelatore, in cui gli ioni vengono raccolti ed i segnali inviati, dopo


amplificazione, al registratore che converte le informazioni contenute
nei segnali in uno spettro.

Campo
fascio magnetico
analita ionico analizzatore

Camera di
Campo elettrico
ionizazione
acceleratore
Spettrometro di Massa a Quadrupolo Iperbolico
1) M + e- M+ + 2e-

M1 + M3+
2) M+
M2+ M4 +
Ogni, etc.
molecola ha una frammentazione unica e
caratteristica che, come una vera e propria impronta
digitale, ci permette di identificare e di risalire alla
molecola madre.
Abbondanza relativa

Normalizzazione dei picchi

50 100 150 200 massa relativa


1)Formazione ione molecolare (parente)
2)Formazione ioni di frammantazione
3)Formazione di ioni di riarrangiamento (trasposizione)

AB + e- [AB]+. + 2e-

PM
[AB]+. [A]+ + [B].
catione radicale
Informazioni sulla struttura
[A] +
[C] + [D]
+

catione molecola neutra (identificazione dei


[AB]+. [EF]+. + [D] composti)
ione radicale molecola neutra

La presenza di picchi isotopici, aventi quindi rapporto


m/z = M+ + 1 (o 2, 3, 4, ecc…)
con intensità proporzionale all’abbondanza isotopica naturale
Tre requisiti (necessari, ma non sufficienti) perché un
picco sia effettivamente lo ione molecolare:
- Picco a massa più alta
- Ione ad elettrone dispari (ione radicalico)
- Spiegare tutti gli ioni più importanti nella zona delle masse
alte dello spettro in base a perdite logiche di specie neutre.

Grado di insaturazione (n° di anelli + n° di = legami) =


X–½Y+½Z+1
CxHyNzOn

C 6H6 6 - 3 + 1 = 4 (1 anello + 3 = legami)

CO

C 7H5 O 7 – ½ 5 + 1 = 5,5
Regola dell’azoto
Ione molecolare pari = 0, 2, 4, …. n° di N
Ione molecolare dispari = 1, 3, 5, ….n° di N
(azoto ha massa pari ma valenza dispari)

Analisi dei picchi isotopici


- M+2: stessa intensità di M 1 atomo di Br
- M+2: 33% intensità di M 1 atomo di Cl
- M+2: 4% intensità di M 1 atomo di S
- M+2, M+4, M+6,….. 2, 3,….atomi di Br, Cl,..
Frammentazione

Ioni neutri non vengono rivelati ma possono essere


individuati indirettamente dalla differenza di massa tra
lo ione molecolare e lo ione frammento vicino.
Es.
- Perdite di 1, 2, 3 sono plausibili
- Perdite tra 4-14 no
- Perdita di 15 palusibile (CH3)
- Perdite tra 21-25 no

Tipi di ionizzazione
Elettronica (E.I.)
Chimica (C.I.)
I. di campo (F.I.)
Disassorbimento di campo (F.D.)
1)E.I.
Gli ioni vengono generati per interazione con e- ad alta
energia emessi da un filamento di tungsteno o renio
portato all’incandescenza per riscaldamento elettrico.
(Alta frammentazione, bassa intensità dello ione molecolare)

2)C.I.
Gli ioni vengono generati per interazione con ioni derivanti
dalla ionizzazione elettronica di un gas reagente (metodo
soft di ionizzazione); metano, isobutano, ammoniaca.
(Oltre alla ionizzazione si ha il trasferimento di un protone per cui
si formerà [MH]+; minore frammentazione)

3)F.I. e F.D.
in entrambi i metodi gli ioni sono generati da un forte
campo elettrico che si instaura a causa della forte
differenza di potenziale tra due elettrodi (metodo soft di
ionizzazione); cambia il sistema di introduzione del
campione che nell’F.D. è deposto direttamente in soluzione
sull’anodo (miglioramento dell’efficienza, picco [M]+ o [MH]+
intensi)
E.S.I. Electro spray ionization

E’ il metodo di ionizzazione che più di frequente si trova


accoppiato all’LC, potendo utilizzare campioni liquidi o
solidi, scarsamente volatili o termolabili (soft ionization).
Molecole con PM relativamente alto
Presenza di legami deboli e labili
Elevata sensibilità

Il campione liquido viene


spruzzato sotto pressione e le
goccioline caricate dal potenziale
applicato al capillare.
Nella camera di evaporazione, il
gas e il riscaldamento fanno
evaporare e desolvatare le
goccioline cariche. Aumenta la
densità di carica fino
all’esplosione in goccioline più
piccole caricate positivamente o
negativamente.
Quattro barre cilindriche parallele
due caricate positivamente e due
negativamente collegate a due a
due ad un generatore di
potenziale elettrostatico e a un
generatore di radiofrequenze
(variabile nel tempo).

Gli ioni subiscono l’azione combinata dei due campi. Per un certo valore
del rapporto Potenziale elettrostatico/radiofrequenza solo ioni aventi un
determinato rapporto m/z riescono a passare oltre al quadrupolo e
arrivare al rivelatore. Occorre fare una scansione, cioè far variare il
potenziale elettrostatico e la radiofrequenza ma mentenere costante il
loro rapporto.
Semplicità costruttiva range di masse più stretto
Minor costo minore risoluzione
Tollera pressioni maggiori (LC, GC)
Maggiore velocità di scansione
CUMARINA Warfarin (Cumadin®)
(1,2-BENZOPIRONE)
Attività: anticoagulante
Interferisce con le funzioni
della vitamina K, coinvolta
nell’attivazione
Dei fattori della coagulazione del
sangue

O O

H3CO

HO O O
H3CO O O
7-idrossicumarina (Umbelliferone)
6,7-dimetossicumarina (Scoparone)
Attività: chemoprevenzione del cancro
Attività: antiossidante, vasorilassante, antiasmatico

O O O O
O O

Psoralene (furanocumarina lineare) Angelicina (furanocumarina angolare)


Attività: cura di eczemi e psoriasi
Attività: antiinfiammatoria
Analisi GC-MS della 5,7-dimetossicumarina standard

OCH3

O O
H3CO

M+ - CH3 = 191
M+ - CO = 178
M+ - CH3CO = 163

M+ - CH3CO – CH3 = 148

M+ - CH3CO – CO = 135

M+ - CH3CO – CH3CO = 120


Identificazione della 5,7-dimetossicumarina nell’ESTRATTO in METANOLO

OCH3

O O
H3CO

5,7-dimetossicumarina
Cromatografia

Cromatogramma

tempo di ritenzione area del picco


(spettro di massa)

Analisi qualitativa Analisi quantitativa


ANALISI QUALITATIVA
-tr sostanza X e tr sostanza
nota (standard)
-Iniettare una certa quantità
(10-20%) della sostanza
presunta, pura, nel
campione in esame: se il
picco di X risulta aumentato
vi è buona probabilità di
aver individuato l’identità
dell’incognito.
-Stessa cosa viene ripetuta
usando condizioni
sperimentali diverse; se
anche in questo caso
l’arricchimento fa
aumentare il picco allora
siamo quasi certi
dell’identità della sostanza.
-Se ho accoppiato uno spettrometro di massa si può evitare
questa procedura macchinosa.
ANALISI QUANTITATIVA
 L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle
aree dei picchi, dal momento che esiste proporzionalità diretta tra
la misura effettuata e la concentrazione che la determina (almeno
in certi range).
 Sono metodi comparativi cioè basati sulla relazione matematica
tra il parametro misurato (risposta o segnale) e la concentrazione
dell’analita.
 Quindi richiedono la calibrazione mediante soluzioni
standard.
 Dopo opportuna elaborazione delle aree, si risale alla
concentrazione percentuale dei componenti.
 Il calcolo dell’area del picco viene fatta direttamente dal
computer e viene stampata sul cromatogramma.
 Alla base comunque ci sono delle regole per mezzo delle quali è
possibile risalire alle aree dei picchi.
 Necessità di determinare quantitativamente tutti i componenti di
una miscela o solo alcuni o al limite uno solo (necessità quindi di
avere risolti tutti i picchi, solo alcuni, uno solo).
Ritagliare il picco e
pesarlo, confrontandolo con massa
picco
il peso di 1 cm2 della stessa
carta.
-Metodo laborioso area
picco
-Precisione
massa
1 cm2
Metodi geometrici
-Gaussiana
-Triangolazioni
Importante è la
pulizia del picco
(simmetria e
mancanza di
sovrapposizioni)
Si applica il metodo della
gaussiana calcolando l’ampiezza
del picco a metà altezza e
considerando i due picchi come
separati.

In questo caso l’ampiezza a metà


altezza è ricavabile dalle semi-
ampiezze.
L’integrazione elettronica
ricostruisce la funzione
matematica del picco maggiore,
ne calcola l’area e la sottrae
all’area totale (area del picco
minore)
I metodi per la calibrazione possono essere divisi in due gruppi:
 Uso di Standard Esterni (analizzati separatamente dal
campione).
 Uso di Standard Addizionati ad ogni campione (Standard
Interni o aggiunti).
Standard esterni
Una serie di standard di questo tipo è
costituita da unità che contengono
quantità note e differenti di analita.
 Si inietta un volume noto e preciso
del campione e si registra il
cromatogramma; poi, si prepara una
soluzione a concentrazione nota del
componente da determinare e si
inietta lo stesso volume, registrando
il cromatogramma.

S(A)c/S(A)s = Cc/Cs Cc = Cs . S(A)c/S(A)s


-E’ importante fare in modo che le concentrazioni comparate
(campione e standard) non differiscano troppo tra loro.
-Occorre una grande accuratezza e riproducibilità nel misurare il
volume da iniettare.
-Iniezioni ripetute, sia del campione che dello standard, e poi fare
una media delle aree
-Le iniezioni vanno effettuate in un intervallo di tempo piuttosto
breve per evitare le deviazioni dovute a variazioni ambientali o
strumentali.

 Costruzione di rette di taratura o calibrazione


Si preparano diverse soluzioni (da 3 a 5) a concentrazioni note e
crescenti dell’analita e si riportano su un grafico A/[] i valori letti
sul cromatogramma; si dovrebbe ottenere una retta passante per
lo zero (se ci sono deviazioni significative allora si aumenta il
numero delle soluzioni standard).
Si inietta la soluzione campione e si registra il valore dell’area. Si
interpola la concentrazione incognita del campione.
Le soluzioni standard devono simulare al meglio la matrice del campione,
e quindi devono contenere tutti i reattivi (e nelle stesse concentrazioni)
contenuti nella soluzione campione. Questo comporta ricontrollare le
rette di taratura ogni volta che le soluzioni dei reattivi vengono preparate
di fresco.
-Conoscenza della matrice
-I vari componenti la matrice non causino interferenza con il campione
Standard aggiunti
Anche in questo caso possiamo distinguere due metodiche:
 Metodo delle aggiunte standard o multiple
Consiste nel preparare soluzioni dell’analita contenenti volumi noti
e crescenti di soluzione standard della stessa specie da analizzare.
Vi sono diversi modi per attuare il metodo delle aggiunte:
a) Introdurre una certa quantità di soluzione incognita in più
matracci (3-4), aggiungere in ogni matraccio volumi diversi di
soluzione standard (a concentrazione da 10 a 100 volte maggiore)
e poi portare a volume con la soluzione incognita. Quindi di
riportano in un grafico A/[] i valori ottenuti dalle diverse soluzioni.
Sol. STANDARD
1 mL 2 mL 3 mL 4 mL

1 2 3 4
A

Cx sarà data A4

dall’intercetta Y = mx
A3
sull’asse delle x Y = mx + q
(differenza tra i due A2
zeri) cambiata di
segno e sarà inferiore A1
rispetto alle
concentrazioni degli A0
standard. C agg
0 C1 C2 C3 C4
0 Cx C1+Cx C2+Cx C3+Cx C4+Cx C eff

In realtà il metodo, rapido e pratico, non è del tutto rigoroso, perché il contenuto di
analita varia leggermente all’interno delle diverse soluzioni così come la
concentrazione finale dello standard aggiunto.
Es. nel matraccio 1 abbiamo miscelato 99 mL a concentrazione C x e 1 mL
a concentrazione ad es 1000 ppm, mentre matraccio 4 abbiamo
miscelato 96 mL a concentrazione Cx e 4 mL a concentrazione 1000 ppm.
Quindi gli incrementi effettivi differiscono leggermente.

Infatti ammettendo che


Cx = 20 ppm e che 1 ppm = 1 mg/L = 1 g/mL allora Cx = 20 g/mL

Quantità dell’analita X nei diversi matracci:

-20 g/mL . 99 mL = 1980 g = 1,98 mg


-20 g/mL . 98 mL = 1960 g = 1,96 mg
-20 g/mL . 97 mL = 1940 g = 1,94 mg
-20 g/mL . 96 mL = 1920 g = 1,92 mg

Quantità dello standard aggiunto nei diversi matracci:

1000 g/mL . 1 mL = 1000 mg = 1,00 mg


1000 g/mL . 2 mL = 2000 mg = 2,00 mg
1000 g/mL . 3 mL = 3000 mg = 3,00 mg
1000 g/mL . 4 mL = 4000 mg = 4,00 mg

Queste quantità si trovano alla fine nei matracci da 100 mL


L’incremento in termini di massa ad es per il matraccio 1 è pari a 1
mg, ma in termini di concentrazione sarà:
(1,98+1,00) (mg)
(1000) (mL/L) = 29,8 (mg/L o ppm)
(100) (mL)

(1,00) (mL) 1000 (mg/L)


29,8-20,0 = 9,8 ppm e non 10 ppm = 10,0 (mg/L o ppm)
(100) (mL)

Lo stesso ragionamento può essere applicato ad es al matraccio 4, il cui


incremento in termini di concentrazione sarà:
(1,92+4,00) (mg)
(1000) (mL/L) = 59,2 (mg/L o ppm)
(100) (mL)

59,2-20,0 = 39,2 ppm e non 40 ppm

Possiamo però calcolare lo scarto % e vedere che per ogni matraccio


rimane costante:
Matraccio 1 Matraccio 4
9,8-10 39,2-40
100 = -2,0 % 100 = -2,0 %
10 40
b) Per evitare l’approssimazione del metodo precedente, si può aggiungere
in ogni matraccio un volume noto ed esatto Vx della soluzione dell’analita a
concentrazione incognita Cx e aliquote (in mL) di soluzione standard
crescenti indicate con n1, n2, n3, ecc…; alla fine si porta al volume finale V t
(ad es. 100 mL) con un solvente opportuno.
n +V
1 x n +V 2 n +V x n +V
3 x
A = K Cni con K = b
4 x

Cni = concentrazione data dal


campione e da un’aggiunta
iesima dello standard.

Vx Cx ni C s
A=K +
A Vt Vt
Y = mx + q
A4 VxCx Cs
A=K + K ni
A3 Vt Vt
A2 VxCx Cs
A=0 0=K + K nx
Vt Vt
A1
Cs
A0 Cx = (-nx)
Vx
nX n1 n2 n3 n4
Metodo delle aggiunte standard
Vantaggi e Svantaggi N.B.
Permette di effettuare l’analisi
quantitativa in matrici complesse
o incognite Prima di effettuare la curva di
taratura o di applicare il metodo
Si può applicare a tutte le tecniche delle aggiunte è necessario
analitiche sia spettrofotometriche, analizzare il bianco.
elettrochimiche e cromatografiche
Il bianco ideale è costituito dalla
soluzione conteente tutti i
E’ necessario un a curva di componenti il campione ad
calibrazione per ogni analita da eccezione dell’analita stesso.
determinare
In questo modo si può ottenere il
E’ necessario un volume maggiore segnale relativo ad una
rispetto a quello impiegato con la “concentrazione zero” dell’analita.
retta di taratura con standard
esterno

E’ un metodo per estrapolazione,


teoricamente meno preciso
rispetto al metodo di
interpolazione della retta di
taratura con standard esterno
Metodo dello standard interno
Questo metodo viene usato prevalentemente in cromatografia. Consiste nel
preparare una serie di soluzioni standard contenenti concentrazioni note e
variabili dell’analita e le stesse quantità di un’altra sostanza (standard
interno). Si costruisce una curva di calibrazione riportando in ascisse il
rapporto ponderale o di concentrazione dell’analita e dello standard (Pa/Pis o
[X]/[IS]) e in ordinate il rapporto delle aree (Aa/AIS).
Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno alla soluzione a
concentrazione incognita e si effettua la determinazione.
Dal rapporto delle aree si risale quindi tramite l’equazione della retta al
rapporto dei pesi o delle
concentrazioni. AA/AIS
Conoscendo la quantità
2,0
di standard interno
aggiunto, è possibile
1,5

risalire alla quantità di


analita.
1,0
0,5

[a]/[IS]
0

0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 P A/PIS


PA/PIS si ricava per interpolazione dal grafico
QIS è la quantità di standard interno aggiunta (in peso)

Esempio
Se la quantità di standard interno aggiunta è 200 mg e il rapporto tra le
aree ottenuto dal cromatogramma è 1 per interpolazione dal grafico
precedente si ricava che il rapporto PA/PIS risulta essere 1,25.
Quindi dalla relazione sopra citata ricaviamo che la quantità di analita
sarà:
1,25 x 200 = 250 mg
Se poi vogliamo conoscere la concentrazione basta considerare il volume
di campione a cui è stato aggiunto lo standard.

PA
• Q IS
PIS
 CA
VC
Lo standard interno deve soddisfare certi requisiti:
-Non essere presente nella miscela da analizzare
-Essere ben risolto dagli altri componenti
-Avere un tr diverso ma non troppo lontano da quello dell’analita
-Essere strutturalmente simile al composto da analizzare in modo
che la risposta strumentale sia uguale o simile.
-Non contenere impurezze
-Non reagire con i vari componenti della miscela analizzata
Tipicamente i grafici dose/risposta approssimano una linea retta
Nella pratica, raramente tutti i dati sperimentali sono allineati
perfettamente lungo una linea retta; per questo occorre trovare la retta
migliore che interpola i punti sperimentali attraverso un’analisi di
regressione lineare usando il metodo dei minimi quadrati.
Viene cioè calcolata l’equazione della retta che minimizza la somma dei
quadrati delle distanze verticali tra i punti e la retta stessa.
L’equazione è chiamata equazione di regressione ed è del tipo y = mx + q
dove m, il coefficiente angolare, è chiamato coefficiente di regressione.
Tale retta, considerata la migliore, passa anche per il centroide o centro di
gravità che corrisponde al punto (Xmedio, Ymedio), valori corrispondenti ai
valori medi di tutti i dati sperimentali xi e yi.

.
Y

.
.
.
X
Per stabilire fino a che punto la retta trovata possa essere usata al fine di
prevedere un valore di Y conoscendo un determinato valore di X, e
viceversa, cioè per stabilire se la retta è realmente la migliore, si calcola il
coefficiente di determinazione o di correlazione lineare r2.
r2 può assumere valori in valore assoluto compresi tra 0 e 1.
Se r2 = 1 allora esiste una relazione lineare perfetta tra x e y, per cui ad
ogni valore di x corrisponde uno e un solo valore di y.
Se r2 = 0 allora non esiste alcuna relazione lineare tra x e y.
Valori compresi tra 0 e 1 indicano la “bontà” dell’equazione di regressione
calcolata.
Difficilmente le rette di calibrazione hanno valori di r 2 inferiori a 0,98 e in
ogni caso mai al di sotto dello 0,95.
Determinazione quali-quantitativa
Resveratrolo
OH HO

HO

OH
Famiglia Fitoalexine
OH OH

-Forma trans
Antiossidante naturale presente
-Forma cis nell’uva, nel succo d’uva e nel vino
rosso
-Forma glicosilata (3)

-GC-MS: derivatizzazione con bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetammide


-HPLC: in fase normale con eluizione isocratica o in fase inversa con
eluizione a gradiente
-Nel 1999 LC-MS (E.S.I.) in modalità di ione negativo (C 18 – eluente:
MeOH/CH3COONH4 (55/45 v/v) 20mM)

-LC-MS (C.I.) in modalità di ione positivo (C18 – eluente: MeOH/HCOOH)


m/z=229 [M+H]+
Spettro di
frammentazione del
resveratrolo derivatizzato
ottenuto per C.I.
m/z = 444
(10 g/L)

Spettro di
frammentazione del
resveratrolo ottenuto con
electro spray ionization
m/z = 227
(200 pg/L)
Determinazione per HPLC-UV del trans e cis resveratrolo in
preparazioni commerciali e sua stabilità alla luce e alla temperatura

-HPLC Gilson a due pompe con miscelatore


-Colonna C18 5 M, lunghezza 250 mm, ID 4,6 mm
-eluizione isocratica
-eluente miscela acqua/acetonitrile
-Flusso 1 mL/min
-Prove eseguite in triplicato
-Iniezione di 20 L

Scelta della  analitica


-Trans: 306 nm e 320nm
Ottimizzazione % Acetonitrile
-Cis: 295 nm
Conc. % T(min) T(min) T(min) media d.s. K’ log K’
v/v 20 L in triplicato di una
soluzione preparata
diluendo 100 L della
20 26,06 25,932 25,899 25,96 0,085 10,74 1,03 soluzione Standard A in
matraccio da 100 mL
(5,53 g/mL)
25 12,969 12,99 12,971 12,977 0,0116 4,87 0,69
con metanolo
30 7,915 7,926 7,924 7,922 0,00586 2,6 0,41 Soluz. Standard A
10,53 mg/10 mL
35 5,662 5,661 5,467 5,657 0,00839 1,56 0,19

40 4,528 4,493 4,501 4,507 0,0183 1,04 0,02

Area 1 Area 2 Area 3 Area 4 media µg/mL d.s. c.v.%


73473 78487 78508 77971 77448,2 2.63 2242.241 2.9
176717 165339 181583 171204 173912.8 5.26 6086.796 3.49
Retta di Calibrazione
256045 264057 232595 256686 249043.4 7.90 13945.235 5.59
Costruita da diluizione
337036 347257 323089 325493 337031.8 10.53 12891.18 3.82
Soluz. Standard A
25, 50, 75 e 100 L
Portati a 10 mL con
metanolo
400000

350000 y = 32475x - 4165,8


2
R = 0,9985
300000

250000

media aree
Stabilità
200000 del trans-resveratrolo esposto a lampada

150000 fluorescente
100000

50000

0
0 2 4 6 8 10 12
conc (microg/mL)
T µg/m
Stabilità a -20 Area
°C al1 buio
Area 2 Area 3 Media Stabilità
(h) L a t.a. con lampada
C%
40 Watt
169919 170317 185594 175276,7 0 5,53 100
10
152532 155695 155569 154598,7100 2 5,14 93
8
Conc. (microg/mL)

80
144593 149506 154731 149610 4 4,95 89,5
6
60

Conc %
4 167122 138376 133066 146188 6 4,88 88,4
40
2
134775 139712 132314 135600,3 8 4,5 81,4
20
0
0 50 100 123140
150 127316
200 132081
250 127512,3 0 12 4,24 76,7
Tempo (giorni) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72
104440 110505 108410 107785 24 3,6 65,1 T (h)

77743 80766 73183 77230,67 36 2,45 44,4

Stabilità a t.a. con lampada


100 Watt
Stabilità a t.a. al buio
100

10 80
Conc%
Conc.(microg/mL)

8 60

6 40

4 20

2 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
0 50 100 150 200 250
T (h)
Tempo (giorni)
Stabilità a t.a. con lampada
UV 254 nm

100

80
Conc%

60
CONCLUSIONI
40

20
Il trans-resveratrolo è
risultato stabile sia a -20 °C
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 che a t.a. quando mantenuto al
riparo dalla luce, unica causa di
T (h)
isomerizzazione.

Stabilità a t.a. con lampada Questa si verifica sempre


UV 365 nm quando la soluzione è esposta a
radiazioni provenienti da fonti
120
diverse.
100
Inoltre è proporzionale al
80
tempo di esposizione, alla
Conc %

60
potenza e alla  usata.
40

20

0
0 50 100 150 200 250 300
T(m in)