DIAGNOSI INDIRETTA

Dimostrazione di una risposta immunitaria

specifica nei confronti di batteri, miceti,
parassiti e virus

1
Cinetica della risposta anticorpale nell’infezione primaria e
nella reinfezione: ricerca di una specifica classe
anticorpale

2
 Infezione assente Infezione presente

Infezione assente, Infezione presente,

infezione pregressa o sovrapposta a infezione
immunizzazione pregressa o
immunizzazione

Metodo della coppia di sieri: possibili situazioni della titolazione di

anticorpi in campioni prelevati in fase acuta (a) e convalescente (c)3
 Reazioni sierologiche impiegate
per la diagnosi di infezione indiretta

Qualitative: rivelano anticorpi (Ig) specifici per

l’antigene saggiato e la classe (IgG o IgM).

Semiquantitative: titolano la quantità relativa di

anticorpi presenti nel siero (titolo anticorpale)
attraverso la tecnica di diluizione scalare per raddoppio
(titolazione mediante IF, agglutinazione…).

Quantitative: titolano la quantità di anticorpi attraverso

il confronto con standard di riferimento a
concentrazione nota (anti-HBsAg in mUI/ml; titolo
proteggente: 10 mUI/ml).

4
 INDAGINI SIEROLOGICHE

PER LA RIVELAZIONE DI ANTICORPI

 Immunodiffusione
 Agglutinazione
 Agglutinazione al latice
 Emoagglutinazione indiretta o passiva
 Agglutinazione passiva
 Fissazione del complemento
 Reazione di neutralizzazione
 Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione
 Immunofluorescenza
 Saggio immunoenzimatico
 Immunoblotting
5
Le reazioni di agglutinazione (se l’antigene è
corpuscolato/cellulare) e di precipitazione (se l’antigene è
solubile) saranno visibili solo se risultano ottimali i
rapporti tra antigene e anticorpo specifico.
6
Reazione di agglutinazione in provetta (per la
ricerca di anticorpi anti-batterici nel siero):
in genere è quantitativa su diluizioni scalari
del siero miscelato ad una sospensione del
batterio.

Reazione di Widal per anticorpi anti-

Salmonella typhi e S. paratyphi, reazione di
Wright per anticorpi anti-Brucella e reazione
di Weil-Felix per anticorpi anti-Rickettsie.

Agglutinazione su vetrino floccosa (tipo H) e

agglutinazione di aspetto granulare e meno
facilmente dissolvibile all’agitazione (tipo O)

7
 AGGLUTINAZIONE
su vetrino o per titolazioni in provetta

 Anticorpi anti-Salmonella typhi (antigene O) [GRUPPO D]

 Anticorpi anti-Salmonella typhi (antigene H)
 Anticorpi anti-Salmonella paratyphi (antigene A-O) [GRUPPO A]
 Anticorpi anti-Salmonella paratyphi (antigene B-O) [GRUPPO B]
 Anticorpi anti-Salmonella paratyphi (antigene C-O) [GRUPPO C]
 Anticorpi anti-Salmonella paratyphi (antigene A-H)
 Anticorpi anti-Salmonella paratyphi (antigene B-H)
 Anticorpi anti-Salmonella paratyphi (antigene C-H)
 Anticorpi anti-Brucella melitensis
 Anticorpi anti-Brucella abortus
8
Immunoprecipitazione: reazione di un antigene macromolecolare
solubile con siero immune o presunto tale (contenente anticorpi
specifici detti precipitine). Il precipitato insolubile, determinato dalla
formazione di un reticolo per aggregazione degli immunocomplessi, è
visibile all’interfaccia dei reagenti. E’ una reazione qualitativa e
quantitativa.

Immunodiffusione
radiale:
variante della
tecnica
di precipitazione 9
 IMMUNODIFFUSIONE

Anticorpi anti-Candida spp.

Anticorpi anti-Aspergillus fumigatus
Anticorpi anti-Aspergillus niger
Anticorpi anti-Aspergillus nidulans
Anticorpi anti-Aspergillus terreus
Anticorpi anti-Aspergillus flavus

AGENTI DI MICOSI SISTEMICHE

Anticorpi anti-Histoplasma capsulatum
Anticorpi anti-Coccidioides immitis
Anticorpi anti-Paracoccidioides brasiliensis
10
DIAGNOSI SIEROLOGICA DI INFEZIONI BATTERICHE
Reazione di agglutinazione in micropiastra

Salmonella typhi; S. parathypi A e B:

ricerca di anticorpi totali (non si differenziano
IgG e IgM).
E’ una reazione di agglutinazione (reazione di
Widal) in micropiastra in cui si cimentano
diverse diluizioni di siero del paziente con una
sospensione standardizzata di batteri vivi
(salmonelle).
Si aggiunge un colorante vitale che penetra nella
cellula batterica ed è utile per evidenziare
maggiormente la reazione di agglutinazione
attraverso l’intensità di colore.

(Fino a diluizioni 1/40 il test si considera

negativo; da 1/80-1/160 dubbio; >1/160
positivo.)

11
REAZIONE DI INIBIZIONE
DELL’EMOAGGLUTINAZIONE

Anticorpi anti-virus rosolia

12
Anticorpi anti-virus influenza
Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione su 3 coppie di sieri: file
A e B, file C e D, file E e F, rispettivamente. Fila G: controllo antigene
4, 2, 1 UE, fila H controllo globuli rossi 13
 APPLICAZIONI DELL’IMMUNOFLUORESCENZA
PER LA RICERCA DI ANTICORPI ANTI…..

• Treponema pallidum
• Legionella pneumophila
• Borrelia burgdorferi
Esito positivo Esito negativo

• CMV, EBV, HSV, VZV, Virus rosolia, Virus parotite,

SARS-CoV

•Toxoplasma gondii
• Plasmodi
• Tripanosomi
14
• Schistosomi
 DIAGNOSI SIEROLOGICA DI INFEZIONI BATTERICHE

Immunofluorescenza (IFI) su vetrino

Applicata a:

Rickettsia conori (IgG, IgM)

Treponema pallidum (FTA-ABS [fluorescent

treponemal antibody absorption], se è positiva VDRL
e/o TPPA)
batteriche
Borrelia burgdorferi

Coxiella burnetii (IgG, IgM)

Bartonella henselae, Bartonella quintana (IgG, IgM)

Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci,

Chlamydiophila pneumoniae (IgG, IgM)

Legionella pneumophila (solo IgG; distingue sierotipo

1 da sierotipi 2-8)

Si può fare una determinazione semi-quantitativa

sui campioni risultati positivi per la ricerca di
anticorpi. 15
SAGGIO IMMUNOENZIMATICO per la rivelazione di
anticorpi nella diagnosi di laboratorio delle infezioni
da batteri, miceti, parassiti e virus
in piastra a 96 pozzetti

16
Andamento dei marcatori sierologici nell’infezione acuta
17
da virus dell’epatite B.
Andamento dei marcatori sierologici nell’infezione cronica
da virus dell’epatite B 18
 Saggio immunologico chemiluminescente a cattura di
microparticelle (CMIA) per la ricerca di anticorpi
anti-HBcAg

Il campione e le microparticelle paramagnetiche rivestite con rHBcAg (antigene c di HBV

ricombinante) vengono messi a contatto. L'anti-HBcAg presente nel campione si lega alle
microparticelle e la miscela di reazione viene lavata. Nella seconda fase, viene aggiunto
l’anticorpo coniugato marcato con acridinio. Dopo lavaggio, vengono aggiunte le soluzioni di
attivazione (pre-trigger e trigger).
La reazione chemiluminescente risultante viene misurata come unità di luce relativa
(RLU). Esiste una relazione diretta tra la quantità di anti-HBcAg nel campione e le RLU
rilevate. La presenza o l'assenza di anti-HBcAg nel campione viene determinata
confrontando il segnale chemiluminescente nella reazione con il segnale di cut-off
determinato da una precedente calibrazione. Se il segnale chemiluminescente nel campione
19
è maggiore o uguale al segnale di cut-off, il campione è considerato reattivo per l'anti-
HBcAg.
Saggio ELFA (enzyme linked fluorescent
Saggio immunoenzimatico con rivelazione
assay) di
in Ifluorescenza
livello per la diagnosi
di
infezione da HIV
SAGGIO DI QUARTA GENERAZIONE

Individua anticorpi anti HIV-1 gruppo M ed O, anticorpi anti HIV-2 e antigene p24

20
21
22
Rivelazione di anticorpi IgG, IgM e/o IgA anti-virus
Diagnosi sierologica delle infezioni da virus
pneumotropi, neurotropi, cardiotropi, delle
infezioni congenite e delle malattie
esantematiche
Saggio automatizzato in chemiluminescenza

23
Diagnosi sierologica delle infezioni da virus pneumotropi, neurotropi, cardiotropi,
delle infezioni congenite e delle malattie esantematiche.

SAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA

RIVELAZIONE DI IGG, IGM (E/O IGA) ANTI-
 VIRUS INFLUENZA A  CITOMEGALOVIRUS
 VIRUS INFLUENZA B  VIRUS HERPES SIMPLEX
 VIRUS PARAINFLUENZA 1, 2 e 3  VIRUS VARICELLA/ZOSTER
 VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE  VIRUS EPSTEIN-BARR
 ADENOVIRUS  VIRUS HERPES UMANO 6
 VIRUS PAROTITE  VIRUS ROSOLIA
 VIRUS MORBILLO  ENTEROVIRUS
 PARVOVIRUS B19  VIRUS SARS-CoV
 VIRUS DENGUE
 VIRUS WEST NILE
24
 VIRUS CHIKUNGUNYA
 Avidità delle IgG

L’avidità di un anticorpo nei confronti di un antigene è la

capacità che ha l’anticorpo stesso di formare con l’antigene
legami stabili

Adattamento tra determinanti antigenici e

sito di legame degli anticorpi
25
INTERPRETAZIONE: INFEZIONE da
CITOMEGALOVIRUS

26
27
 Avidità delle IgG anti-virus rosolia

Segnale ottenuto con reattivo dissociante (UREA)

X 100 = % INDICE DI AVIDITA’
Segnale ottenuto senza reattivo dissociante

RISPOSTA PRIMARIA RISPOSTA SECONDARIA

AVIDITA’ ANTICORPALE
BASSA MEDIA ALTA
Maturazione della risposta immune

• Una bassa percentuale di IgG ad alta avidità indica in genere

un’infezione primaria in atto o recente
• Un’alta percentuale di IgG ad alta avidità indica un’infezione pregressa,
anche se in presenza di IgM va valutata caso per caso (anamnesi,
informazioni cliniche, altre eventuali indagini di laboratorio)
28
 Virus dell’epatite C - genoma

Proteina Proteine del proteasi/elicasi RNA polimerasi-

del pericapside RNA dipendente
capside
c22 33c c-100

5’ 3’

core E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5

NTR: 340
nucleotidi
regione
ipervariabile

Strutturali Non strutturali

29
 INNO-LIA HCV Score
Line Immuno Assay
Saggio di conferma anti-HCV
Il saggio si basa sulla presenza in 6 punti (linee) di antigeni delle regioni
core, E2 ipervariabile (HVR), NS3 elicasi, NS4A, NS4B e NS5A adesi a
una strip di nylon. In aggiunta vi sono 4 linee di controllo: controllo
streptavidina, controlli positivi 3+ (anti-IgG umane), 1+ (anti-IgG umane) e
cut-off ± (anti-IgG umane).
Il principio è quello di un saggio immunoenzimatico.
La strip è incubata con il siero e, se gli anticorpi sono presenti, si legano
agli antigeni. Poi viene aggiunto un siero contenente anti-IgG umane
complessato a fosfatasi alcalina. L’incubazione con il substrato determina lo
sviluppo di una banda colorata, che è proporzionale all’entità di anticorpi
legati.

30
 INNO-LIA HCV Score
Line Immuno Assay
Saggio di conferma anti-HCV

31
 INNO-LIA HCV Score
Line Immuno Assay
Saggio di conferma anti-HCV

32
Western blotting: saggio di conferma per la
rilevazione di anticorpi anti-HIV
separazione elettroforetica
Polo negativo

L’antigene
viene
Stacking
denaturato in
presenza di
SDS ed agenti
riducenti. Le
proteine
migrano
verso il polo
Running
positivo e si
separano in
base al peso
molecolare
Polo positivo
33
 Separazione elettroforetica

Marcatori di
peso
molecolare

34
Separazione elettroforetica

35
Separazione elettroforetica

36
Trasferimento su membrana

37
Preparazione delle strisce di nitrocellulosa

38
Preparazione delle strisce di nitrocellulosa

La membrana viene tagliata in strisce verticali

Ogni striscia contiene tutte le proteine
separate mediante elettroforesi
39
Immunoblotting

40
Immunoblotting

41
Interpretazione dei risultati

42
43
 WESTERN BLOT per anticorpi anti-HIV

Western blot profili: 1 controllo positivo

Esito positivo:
2 controllo debole positivo
almeno una banda
3 controllo negativo
per GAG, ENV e POL
4-11 campioni di siero 44
WB per ricerca
anticorpi
anti-HIV 1-2

CONTROLLO SIERO

CONTROLLO HIV 2

45
WB per ricerca
anticorpi
anti-HIV 2

46
 SIFILIDE

Agente eziologico: Treponema pallidum

Appartiene alla famiglia
delle treponematacee,
batteri di forma elicoidale,
mobili, a divisione
trasversale.

Trasmissione:
- contagio sessuale
- via verticale
- via parenterale
- contatto diretto con le lesioni

47
La sifilide
La fase primaria o iniziale è caratterizzata da lesioni
cutanee/ulcere nel sito di penetrazione della spirocheta.
Sebbene le spirochete diffondano nel sangue (tanto da
raggiungere il SNC causando sintomi neurologici e
meningite), l’ulcera è il sito primario di moltiplicazione.
Spesso riescono a sopravvivere alla fagocitosi.

Nella fase secondaria compaiono lesioni cutanee

prominenti disseminate su tutta la superficie corporea.
Si può verificare remissione spontanea (fase latente o
clinicamente silente), oppure la malattia può evolvere
(dopo assenza di sintomi da alcuni anni a decenni)
verso la fase tardiva in cui possono essere coinvolti tutti
gli organi e tessuti (circa 1/3 dei pazienti non trattati).
Le lesioni granulomatose (gomme) possono essere
rinvenute nelle ossa, nella cute, nel SNC (neurosifilide) e
in altri tessuti (sifilide cardiovascolare).
Nella lesione iniziale e in quelle secondarie sono
presenti numerosi microrganismi che rendono il
paziente altamente infettivo.
48
 La diagnosi presuntiva si basa sui segni clinici

la DIAGNOSI DI CERTEZZA si basa sulla DIAGNOSI DI LABORATORIO

DIAGNOSI DIRETTA
- Ricerca di Treponema pallidum o di sue componenti (acido
nucleico)

DIAGNOSI INDIRETTA
- Dimostrazione di una risposta immune specifica

49
Esame microscopico
Campioni: essudato da lesione = sifiloma in sifilide primaria; liquido
aspirato da papule in sifilide secondaria; liquor in sifilide terziaria e
congenita

Microscopia in campo oscuro: osservazione motilità o immobilizzazione

dei Treponemi con anticorpi

Esame colturale

NON E’ COLTIVABILE IN TERRENI ABIOTICI

Saggio di infettività in testicolo coniglio (RIT): prova biologica in vivo

(gold standard=100% sensibilità ossia sviluppa lesioni da inoculi con un solo
treponema)

50
 Ricerca dell’acido nucleico (DNA)
La PCR ricerca la sequenza del gene polA che codifica la
DNA polimerasi-I

Campioni: sangue periferico; siero; essudato da ulcera

primaria; aspirato da lesioni cutanee in sifilide secondaria;
liquor in sifilide terziaria e sifilide congenita; materiali
bioptici

51
 METODI INDIRETTI
Dimostrazione di una risposta immune specifica

Si dividono in:

- saggi non treponemici (screening): (anticorpi antilipoidei*

in siero/plasma/liquor)

* Rivelano anticorpi (reagine) espressi contro materiale lipoideo

rilasciato da cellule danneggiate dell’ospite e contro materiale
lipoproteico tra cui cardiolipina rilasciata da Treponema pallidum

- saggi treponemici (conferma): (TPHA/ TPPA: siero, liquor)

- Includono anche i saggi TPI, FTA-ABS

52
VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) Anticorpi reaginici
sviluppati contro i
saggio di microflocculazione su vetrino per la ricerca
lipidi liberati dalle
di anticorpi anti-cardiolipina (reaginici) nel siero e nel
cellule danneggiate
liquido cerebrospinale durante le fasi iniziali
della malattia e
presenti sulla
superficie cellulare
dei treponemi.

Cardiolipina o aptene
di Wasserman:
antigene non
treponemico di
natura lipoidea
associato al soma
batterico; è presente
in molti tessuti umani
ed animali.
La cardiolipina usata
nella VDRL è
ottenuta da
53
miocardio di bue.
Sui sieri positivi, utilizzando diluizioni a raddoppio. si esegue il
saggio

semi-quantitativo

(titolo: + alta diluizione del siero che dà reazione chiaramente

positiva)

Es: infezione recente = incremento 4 volte del titolo in 2 campioni

prelevati a distanza di 2 settimane

(serve anche per monitoraggio post-terapia)

54
 SAGGI TREPONEMICI

– TPHA o TPPA (Treponema pallidum haemoagglutination o

passive agglutination)

– FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody-adsorption test)

– TPI (Treponema pallidum immobilization test)

- ELISA (saggi commerciali automatizzati)

I saggi treponemici NON sono correlati con l’evoluzione della

malattia e NON sono utili per il monitoraggio della terapia
perché rimangono positivi per anni o tutta la vita

55
FTA-ABS: saggio di immunofluorescenza indiretta dove
l’antigene è costituito da una sospensione di treponemi
(ceppo Nichols) uccisi fissati su vetrini che si mettono a
contatto con il siero del paziente e poi si aggiunge un
anticorpo anti-immunoglobuline umane coniugato con
fluoresceina (sistema rivelatore)

56
Esito positivo Esito negativo
TPHA o TPPA (Treponema pallidum haemoagglutination o passive
agglutination)

– reazione di emoagglutinazione passiva nella quale l’antigene è

costituito da globuli rossi di montone (o particelle solide
sintetiche) alla cui superficie sono adsorbiti antigeni
treponemici

– prevede un pre-adsorbimento del siero con treponemi non

patogeni

57
 SAGGIO QUALITATIVO: Il siero viene
cimentato in un pozzetto con particelle
sensibilizzate e in un altro pozzetto con
particelle non sensibilizzate (utilizzate come
controllo precipitano per gravità)

SIERO 1 SIERO 2

SENS.

NON
SENS.

pos neg
pos Se ci fosse agglutinazione si
allestisce un saggio
QUANTITATIVO

58
 Saggio quantitativo: diluizioni seriali al raddoppio

n° 1 2 3 4 5 6 7 8
tampon
25 25 25 25 25 25 25
en µl
sérum
1/20 en 25 25 * * * * * * **
µl
HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75
1/ 1/ 1/
Dilution 1 / 320 1 / 640 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240
80 160 1280
Lecture + + + + + - - -
TITOLO risultante 1 a 1280, diluizione in cui è ancora possibile verificare una
agglutinazione netta. 59
Concludendo:

- la diagnosi indiretta rivela le «tracce» (anticorpi) che un

microrganismo/virus ha lasciato nel nostro corpo a seguito
dell’attivazione del sistema immunitario;
- i saggi impiegati sono rapidi;
- può distinguere la fase acuta dell’infezione
dall’acquisizione di immunità;
- in generale, si avvale di saggio poco costosi;
- quando possibile, è importante associarla alla diagnosi
diretta…

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