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PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA

Anamnesi e sintomi forniscono il primo indizio per la


diagnosi di un’infezione virale.
I risultati ottenuti in laboratorio consentono di:
1) confermare la diagnosi mediante l’identificazione
dell’agente eziologico virale
2) definire il decorso della malattia
3) monitorare la malattia dal punto di vista
epidemiologico
4) indirizzare il medico per la gestione del paziente
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PROCEDURE DI LABORATORIO PER LA
DIAGNOSI DI INFEZIONI VIRALI

1)Osservazione al microscopio elettronico del virus

2) Isolamento e identificazione

3) Dimostrazione di componenti virali (proteine,


enzimi, acidi nucleici)

4) Valutazione della risposta immunitaria umorale


(sierologia)

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4) VALUTAZIONE DELLA R.I. UMORALE

Importanti per:

1.infezioni acute in soggetti immunocompetenti


2.diagnosi di infezioni dovute a virus di difficile
isolamento
3.Infezioni in cui la R.I. coincide con comparsa dei
sintomi (Rosolia, Epatite A ecc.)
4.virus che causano malattie a lento decorso dopo la
sieroconversione (HIV, HTLV-I, virus della rabbia)

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4) VALUTAZIONE DELLA R.I. UMORALE

Importanti ancora per:


5. scopi epidemiologici
6. valutazione del decorso di un’infezione
7. infezione 1aria o reinfez. (f. acuta o cronica)

Non applicabile:
1. quando i sintomi sono precedenti alla R.I.
(diagnosi retrospettiva non utile al paziente)
2. in soggetti immunodepressi occorre valutare
caso per caso Dr. Massimo Giorgi unipi -2008
CRITERI X DIAGNOSTICARE INFEZIONE
PRIMARIA (acuta o recente):

Diagnosi classica su doppio campione siero


1. SIEROCONVERSIONE
(dimostrazione di avvenuta sintesi di Ac
specifici tra siero acuto e siero convalescente)
2. AUMENTO DEL TITOLO di Ac SPECIFICI
(>= 4X) tra siero acuto e convalescente
Diagnosi rapida su unico campione (classe Ig)
DIMOSTRAZ. IgM SPECIFICHE
(presenza transitoria dall’inizio a poche
settimane dopo l’infezione)
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DIAGNOSI di INFEZIONE SECONDARIA
(reinfezione o riattivazione):

diagnosi classica su doppio campione siero


AUMENTO DEL TITOLO di Ac SPECIFICI
(>= 4X) tra siero acuto e convalescente

diagnosi rapida su unico campione (classe Ig)


DIMOSTRAZ. IgM SPECIFICHE
(assenza o presenza appena rilevabile)

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Tipico Profilo Sierologico dopo
Infezione Acuta

Notare che in una reinfezione, le IgM possono essere


assenti o presenti transitoriamente a basso livello
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Il decorso di un’infezione può essere determinato
valutando un PROFILO SIEROLOGICO (presenza e
titolo di Ac diversi diretti contro Ag virali diversi)
Es. Mononucleosi infettiva da EBV

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Es. epatite acuta da HBV
LIMITI DELLA SIEROLOGIA

* Possibilità di risultati falsi positivi o falsi negativi

* Formazione di i.c. in circolo (es. Epatite B) che


impediscono di evidenziare di Ac

* Possibilità di reazioni crociate tra virus differenti

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I saggi SIEROLOGICI
Utilizzati per la determinazione, identificazione e
quantificazione di antigeni virali e anticorpi in un
campione

Basati sulla formazione di I.C. L’avvenuto legame Ag-Ac


è evidenziato tramite diverse modalità di rilevazione:
•Inibizione dell’Emoagglutinazione (IEA)
•Neutralizzazione
•Fissazione del complemento
•Immunofluorescenza
•Test ELISA
•Immunoblot (Western Blot)
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LE REAZIONI SIEROLOGICHE

Caratteristiche

• Riconoscimento specifico Ag –Ac (I.C.)

• Rilevano, dirett. o indirettamente, la


formazione di un I.C.

• 2 reagenti: un siero (anticorpi) e un antigene (ad


es. proteine virali).
Almeno uno dei due deve essere a
concentrazione nota

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LE REAZIONI SIEROLOGICHE
Applicazioni

• Disponendo di un antigene noto è


possibile dimostrare in quel siero la
presenza di anticorpi specifici per
quell’antigene

• Disponendo di un siero contenente un


anticorpo noto è possibile dimostrare in
quel materiale la presenza di un antigene
riconosciuto dall’anticorpo

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Reazione di Emoagglutinazione

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Emoagglutinazione
Fase 1:Diluizioni seriali del virus vengono incubate
con una quantità fissa di G.R.
virus agglutinante virus non agglutinante

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Emoagglutinazione
Fase 2: Se il virus agglutina, i G.R. sedimentano formando un
ampia area. Diversamente formano un sedimento compatto
virus agglutinante virus non agglutinante

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Emoagglutinazione
Fase 2: In sintesi

virus agglutinante virus non agglutinante

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Emoagglutinazione

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Inibizione dell’Emoagglutinazione

Principio:

Se in un siero sono presenti Ac contro un


virus agglutinante, quando lo metto a
contatto con il virus, questo perde la sua
capacità e l’ulteriore aggiunta di G.R. non
provoca agglutinazione.

Se il siero non contiene Ac contro il virus,


questo è libero di agglutinare i G.R.

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Inibizione dell’Emoagglutinazione

Il titolo anticorpale corrisponde


alla più alta diluizione in cui si
osserva ancora inibizione dell’EA

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Test di NEUTRALIZZAZIONE

Basata sulla proprietà degli anticorpi neutralizzanti di


interferire e bloccare l’infettività del virus (di solito
bloccano il legame con il recettore)
Un set di anticorpi viene mescolato ad una
preparazione virale; l’infettività del virus viene
misurata su cellule indicatori.
Permette la definizione dei diversi sierotipi di un
virus:
( HSV1 e HSV2, Poliovirus 1, 2 e 3, Coxsackie A e
B)
Utile sia in diagnostica che per lo sviluppo di vaccini
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Test di NEUTRALIZZAZIONE

dopo 5 giorni

cellule KB

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Fissazione del
complemento
IMPORTANTE: occorre scomplementare il siero del paziente
Presenza di Ac nel siero Assenza di Ac nel siero

Complemento fissato Complemento libero


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Fissazione del Complemento

Fissazione del Complemento in Micropiastra. Le righe 1 e


2 sono ottenute con campioni di siero rispettivamente in
fase acuta e convalescente. (usate diluzioni 1 a 2 dei
sieri). L’incremento del titolo è significativo e indica una
recente infezione.
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Test ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• Struttura del supporto di matrice inerte


dove avviene il test ELISA

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Test ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• 1° step: si aggiunge il siero del paziente

Si forma l’immunocomplesso
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Test ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
2° step: A) Ab α IgG (IgM) umane se si ricercano gli Ab
B) Ab α Ag specifico se si ricercano gli Ag virali
Questi Ab sono coniugati con un enzima che catalizza una
reazione colorimetrica (di solito una perossidasi)

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Test ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
3° step: aggiunta del cromogeno, substrato della
reazione catalizzata dalla perossidasi.
L’intensità della colorazione è proporzionale alla quantità di
Ab (o Ag) specifici presenti nel siero.
La lettura è effettuata tramite uno fotometro a lunghezza
d’onda determinata (tra 450 e 650 nm)

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TEST ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Virologia Applicata E.A.


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ELISA for HIV antibody

Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity

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IMMUNOFLUORESCENZA
per la ricerca degli Ab

• Come principio è analoga al test ELISA

Si legge al microscopio a
fluorescenza a data λ

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IMMUNOBLOT (Western Blot)

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Western Blot

HIV-1 Western Blot


• Lane1: Positive Control
• Lane 2: Negative
Control
• Sample A: Negative
• Sample B:
Indeterminate
• Sample C: Positive

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