DIAGNOSI DIRETTA

La coltivazione dei virus

1
Coltivazione di virus in animali

2
TOPI LATTANTI CON PARALISI
FLACCIDA INFETTATI CON
VIRUS COXSACKIE
(4 GG DOPO INFEZIONE) (A)

B C
SEZIONE ISTOLOGICA DI MUSCOLO
SCHELETRICO MURINO:
MIOSITE FOCALE (B)

SEZIONE ISTOLOGICA DI MUSCOLO

CARDIACO UMANO:
CASO DI MIOCARDITE FATALE (C)

3
100x
 Viene utilizzata in condizioni
particolari (ricerca scientifica e
produzione di vaccini contro i virus
influenzali).

Il virus viene inoculato in determinati

punti dell’uovo allo scopo di infettare
Coltivazione di virus le cellule delle cavità (cavità
nell’uovo embrionato amniotica, allantoidea e sacco
vitellino) e della membrana
corionallantoidea.

Il virus neoprodotto si riversa nei

liquidi delle cavità e può essere
rivelato mediante emoagglutinazione
e/o dalla comparsa di lesioni sulla
membrana corionallantoidea.

4
COLTIVAZIONE IN UOVA
EMBRIONATE DI POLLO

5
 COLTIVAZIONE IN
UOVA EMBRIONATE
DI POLLO

6
Lesioni circoscritte provocate
sulla membrana corionallantoidea
dell’embrione di pollo da:
A) virus vaccinico; B) virus herpes
7
simplex; C) poxvirus.
 ESAME COLTURALE CONVENZIONALE
PER VIRUS

1) Riconoscimento degli effetti citopatici: identificazione

provvisoria

2) Microscopia elettronica, applicazione di sonde

immunologiche (immunofluorescenza) e impiego di
metodi molecolari: identificazione definitiva

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 VANTAGGI E SVANTAGGI DELL’ESAME
COLTURALE CONVENZIONALE
 Consente l’amplificazione dei virioni.
 Permette di svelare virus differenti, anche non
sospettati, nel campione.

 Permette di svelare virus non ancora noti o noti ma

non ancora associati ad una sindrome clinica.

 Necessità di competenze tecniche specifiche ed

esperienza.

 Costo elevato.
 Tempi lunghi per l’identificazione del virus.
 Non coltivabilità in vitro di tutti i virus noti.
9
Coltivazione di virus
in colture cellulari

10
Allestimento di colture cellulari primarie

11
 Allestimento di colture cellulari

Cappa a flusso laminare 12

Allestimento di colture cellulari

13
 TIPI DI COLTURE CELLULARI

 Colture cellulari primarie

 Colture cellulari secondarie
 Colture cellulari in linea continua

14
15
 CELLULE RENALI DI FIBROBLASTI UMANI CELLULE EPITELIALI
SCIMMIA (COLTURA UMANE IN LINEA
(COLTURA PRIMARIA) SECONDARIA) CONTINUA

ingrandimento 60x

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 Terreni di coltura

- Soluzione bilanciata di sali inorganici, solitamente

tamponata con fosfati e bicarbonato

- Aminoacidi

- Siero

- Vitamine

- Glucosio (o galattosio)

- Rosso fenolo (indicatore di pH biologicamente inerte)

- Fattori aggiuntivi secondo il tipo di linea cellulare

- Antibiotici (penicillina 100 U/ml e streptomicina 100 µg/ml;

gentamicina 100 µl/ml)

- Antimicotici (amfotericina B 5 µg/ml) 17

 Colture cellulari
per l’isolamento di virus

Fibroblasti embrionali umani: MRC5

Cellule di intestino embrionale umano: INTESTINE 407
Cellule di rene di scimmia verde africana: VERO
Cellule di rene di scimmia Rhesus: LLC-MK2
Cellule di carcinoma epidermoide della laringe: HEp2

18
 PRINCIPALI COLTURE CELLULARI UTILIZZATE PER
L’ISOLAMENTO DI VIRUS DI INTERESSO MEDICO
Tipi di colture Esempi Virus

Primarie Rene di scimmia influenza, parainfluenza, enterovirus

Rene di coniglio HSV
Rene embrionale umano adenovirus, enterovirus, poliomavirus

Diploidi Fibroblasti CMV, VZV, HSV, BKV, rhinovirus,

enterovirus, adenovirus, VRS

Continue HEp-2 VRS, adenovirus, HSV, BKV, parainfluenza,

enterovirus
MDCK influenza
LLC-MK2 parainfluenza
RD echovirus
Intestine 407 enterovirus, adenovirus, parotite
VERO enterovirus, arbovirus, HSV, BKV,
adenovirus, rosolia 19
 Inoculazione del campione clinico: esame
colturale convenzionale

Campione
clinico

Inoculazione su
colture private
del terreno a 37°C per 45 min.

37°C in 5% CO2
Aggiunta di
terreno di
mantenimento MAX 14 GG
20
21
 Osservazione microscopica delle
colture cellulari inoculate

 Registrazione della comparsa di eventuali

modificazioni nei monostrati cellulari.

 Comparsa dell’effetto citopatico.

22
COLTURA DI CELLULE DI RENE DI SCIMMIA
23
EFFETTO CITOPATICO DI VIRUS COXSACKIE B5 IN
CELLULE VERO DOPO 72 ORE DALL’INOCULAZIONE 24
EFFETTO CITOPATICO DI VIRUS COXSACKIE B5 IN
CELLULE VERO DOPO 96 ORE DALL’INOCULAZIONE
25
 COLTURA DI CELLULE DI RENE DI
SCIMMIA CON ECP DA VIRUS
HERPES SIMPLEX ?

COLTURA DI CELLULE
DI RENE DI SCIMMIA

26
 COLTURA DI FIBROBLASTI EMBRIONALI UMANI
CON ECP DA VIRUS VARICELLA/ZOSTER ???

COLTURA DI FIBROBLASTI
EMBRIONALI UMANI

COLTURA DI FIBROBLASTI EMBRIONALI

UMANI CON ECP DA CITOMEGALOVIRUS ??

27
 COLTURE DI CELLULE HEp2
CON ECP DA VRS ???

COLTURE DI CELLULE HEp2 CON ECP

DA VIRUS del MORBILLO ???

COLTURE DI CELLULE HEp2 CON ECP

DA VIRUS PARAINFLUENZA ???

28
 METODI PER L’IDENTIFICAZIONE DI
AGENTI VIRALI CITOPATOGENI

MICROSCOPIA ELETTRONICA

IMMUNOFLUORESCENZA

NEUTRALIZZAZIONE dell’infettività virale

SAGGI MOLECOLARI (REAZIONE

POLIMERASICA A CATENA, PCR)
29
 MICROSCOPIA ELETTRONICA per
l’identificazione di un agente citopatogeno
adenovirus

Picornavirus-simili (Enterovirus?)30
IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA E INDIRETTA

31
Identificazione di un agente citopatogeno attraverso la
rivelazione di un antigene virale mediante
immunofluorescenza

Inoculazione dell’estratto di
coltura con effetto citopatico

«Shell vial» con monostrato di

a 37°C cellule allestito sul vetrino
per 18 ore
presente al fondo della provetta

Immunofluorescenza con anticorpo

monoclonale anti-antigene virale (es. p72 di CMV)
Osservazione al
microscopio a fluorescenza
POSITIVO
IDENTIFICAZIONE: (es. Citomegalovirus) 32
 IDENTIFICAZIONE DI CITOMEGALOVIRUS IN
FIBROBLASTI EMBRIONALI UMANI ATTRAVERSO
IMMUNOFLUORESCENZA (ANTICORPO
MONOCLONALE ANTI-PROTEINA IMMEDIATA
PRECOCE P72)

EFFETTO
CITOPATICO

33
 COLTURE DI CELLULE HEp2
CON ECP DA VRS ???

COLTURE DI CELLULE HEp2 CON ECP

DA VIRUS PARAINFLUENZA ???

34
 Identificazione di un agente citopatogeno
VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE o PARAINFLUENZA ?

Inoculazione del sopranatante/estratto della

coltura cellulare con effetto citopatico

a 37°C
Per 18 ore

Immunofluorescenza con Immunofluorescenza con

anticorpo monoclonale anticorpo monoclonale
anti-VRS anti-parainfluenza

POSITIVO NEGATIVO
35
IDENTIFICAZIONE: VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE
 IDENTIFICAZIONE DI VRS ATTRAVERSO
IMMUNOFLUORESCENZA (ANTICORPO
MONOCLONALE SPECIFICO ANTI-
PROTEINA DI FUSIONE)

EFFETTO
CITOPATICO

36
 COLTURA DI CELLULE DI RENE DI
SCIMMIA CON ECP DA VIRUS
HERPES SIMPLEX ?

COLTURA DI CELLULE
DI RENE DI SCIMMIA

37
Identificazione e tipizzazione di agente citopatogeno.
Virus herpes simplex?

Inoculazione del sovranatante/estratto della

coltura cellulare con effetto citopatico

a 37°C
per 18 ore

Immunofluorescenza con Immunofluorescenza con

anticorpo monoclonale anticorpo monoclonale
anti-HSV tipo 1 anti-HSV tipo 2

POSITIVO NEGATIVO

IDENTIFICAZIONE: Virus herpes simplex tipo 1 38

 IDENTIFICAZIONE DI VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1
ATTRAVERSO IMMUNOFLUORESCENZA (ANTICORPO
MONOCLONALE SPECIFICO) IN FIBROBLASTI EMBRIONALI UMANI
39
REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE
DELL’INFETTIVITA’

40
41
ESAME COLTURALE RAPIDO: RIVELAZIONE DEGLI ANTIGENI VIRALI
MEDIANTE REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA
INDAGINE SINGOLA

Allestimento di Inoculo di un Fissazione delle Incubazione a 37 °C

coltura cellulare campione clinico cellule su vetrino Lavaggi

Applicazione di un Rivelazione della reazione

Tubo con Il monostrato cresciuto su Il monostrato inoculato è antigene-anticorpo mediante
anticorpo monoclonale
vetrino sul vetrino è mantenuto a 37°C, mantenuto a 37°C, 5% CO2, applicazione di un anticorpo
specifico
fondo 5% CO2 per 18 ore anti-topo coniugato con un
fluorocromo ( )

-Incubazione a 37 °C
-Lavaggi
-Montaggio del vetrino

Colore azzurro dovuto

al colorante di contrasto
Osservazione al microscopio a
fluorescenza

42
Metodo colturale rapido per la ricerca di citomegalovirus

Inoculazione del campione clinico

a 37°C Shell vial con monostrato di

per 18 ore fibroblasti embrionali umani

Immunofluorescenza con anticorpo

monoclonale anti-p72 di CMV
Osservazione al
microscopio a fluorescenza
POSITIVO
RIVELAZIONE E CONTEMPORANEA
43
IDENTIFICAZIONE: CITOMEGALOVIRUS
Immunofluorescenza con anticorpo
44
monoclonale anti-p72 di CMV
 ESAME COLTURALE RAPIDO: RIVELAZIONE DI ANTIGENI DI
VIRUS RESPIRATORI MEDIANTE IMMUNOFLUORESCENZA
INDAGINE MULTIPLA

Allestimento Inoculo di un
di colture campione clinico
cellulari

Vetrino per colture I monostrati cresciuti su I monostrati inoculati

cellulari suddiviso in 8 settori vetrino vengono mantenuti vengono mantenuti a 37°C,
da struttura in plastica a 37°C, 5% CO2 5% CO2 per 18 ore
(“chamber slide”)
FLU A FLU B PARA 1 PARA 2

Fissazione dei - Incubazione a 37°C

monostrati su vetrino - Lavaggi

PARA 3 ADENO RSV Rivelazione della reazione antigene-anticorpo

Applicazione di anticorpi mediante applicazione di un anticorpo anti-
monoclonali specifici topo coniugato con fluorocromo ( )

- Incubazione a 37°C
- Lavaggi
- Montaggio del vetrino

Colore azzurro dovuto al

colorante di contrasto
Osservazione al microscopio a
fluorescenza 45
virus influenza A virus parainfluenza 2

adenovirus virus respiratorio sinciziale

46
Concludendo…
L’esame colturale è un saggio diagnostico che consente:

- di appurare la vitalità dei microrganismi presenti nel campione;

- di appurare l’infettività dei virus presenti nel campione;
- è utile a scopo diagnostico, scientifico e per la messa a punto di
nuovi antibiotici e antivirali;
- con saggi di approfondimento consente l’identificazione dei
microrganismi e dei virus;
- consente di svelare co-infezioni virali;
- è un metodo di riferimento per svelare nuovi agenti eziologici;
- richiede tempi di durata variabile per l’esecuzione;
- Il costo è più elevato di altri saggi diagnostici.