DIAGNOSI DIRETTA

RICERCA DI ANTIGENI
DI PARASSITI

1
RICERCA DI ANTIGENI NELLE INFEZIONI DA PROTOZOI

“NOW ICT Malaria Test for Whole Blood”

SAGGIO IMMUNOCROMATOGRAFICO

Due anticorpi marcati con oro

colloidale sono immobilizzati sulla
strip: uno specifico per la proteina
II ricca di istidina di P. falciparum
e uno specifico per un antigene
comune (lattato deidrogenasi) a P.
falciparum, P. vivax, P. malariae e
P. ovale.

Sulla strip è immobilizzato anche

un controllo, che darà un segnale
se il saggio è stato condotto
correttamente.

2
RICERCA DI ANTIGENI NELLE INFEZIONI DA PROTOZOI

“NOW ICT Malaria Test for Whole Blood”

SAGGIO IMMUNOCROMATOGRAFICO

Il sangue intero (15 µl) viene deposto sulla carta

bibula impregnata con gli anticorpi.

Gli Ag presenti nel campione si legano agli Ab

coniugati anti-Ag malarici.

L’aggiunta di un reagente consente agli

immunocomplessi Ab coniugato + Ag di migrare
lungo la strip dove sono legati da Ab specifici,
formando, se il campione è positivo, una o due
linee colorate in rosa.
3
 RICERCA ANTIGENE DI PLASMODI

SVANTAGGI:
Positivo per mesi dopo la terapia eradicante
Non consente l’identificazione delle infezioni miste
Sensibilità non elevata
Non identifica specie diverse da P. falciparum
Risultato NEGATIVO  non esclude la malaria
 RICERCA DI ANTIGENI NELLE INFEZIONI
DA PROTOZOI

Giardia intestinalis e Cryptosporidium parvum: ricerca

dell’antigene di parete delle cisti attraverso saggio
immunoenzimatico mediante anticorpi monoclonali in campioni di
feci

6
 Osservazione
elettromicroscopica di
Giardia intestinalis
Saggio immunocromatografico per la rivelazione di
antigeni di Giardia intestinalis e Cryptosporidium spp.

7
 DIAGNOSI DIRETTA
RICERCA DI ANTIGENI
DI BATTERI

8
Ricerca di antigeni di Legionella pneumophila

9
 Ricerca di antigeni di Legionella pneumophila

Ag solubile di L.pneumophila
sierogruppo 1 nelle urine
viene catturato da Ab specifici
di coniglio adsorbiti su
membrana di nitrocellulosa e
viene rivelato da Ab di
coniglio coniugati a particelle
visualizzabili. 10
Ricerca di antigeni di Legionella pneumophila

11
Ricerca di antigeni di Legionella pneumophila

12
 DIAGNOSI DIRETTA

RICERCA DI ANTIGENI VIRALI

13
Metodi per la ricerca di antigeni virali

 Immunocromatografico

14
SAGGIO IMMUNOCROMATOGRAFICO
(nucleoproteina virus influenza A)

Ab-anti Flu A adsorbiti su membrana di

nitrocellulosa (sample line)
Ab di controllo sulla stessa membrana
(control line)
 Gli Ab sono coniugati a particelle
rivelatrici colorate seccate su un supporto
fibroso inerte
 La carta assorbente con il coniugato e la
membrana con le strisce sono combinate a
costruire lo strip test
 I complessi Ag-Ab anti-Flu A coniugato
sono catturati dagli Ab anti-Flu A
immobilizzati, formando una banda rosa
 Ab di controllo immobilizzati catturano un
coniugato rivelatore, formando una banda
rosa.
15
Control line è blu in condizioni normali
16
Saggio immunocromatografico per la ricerca
della nucleoproteina di virus influenza A
Directigen Flu A (Becton Dickinson)

Saggio immunocromatografico per la

ricerca di antigene di virus respiratorio
sinciziale Test-Pack® (Abbott)

17
Metodi per la ricerca di antigeni virali

 Saggio immunoenzimatico

18
19
20
 Saggio immunoenzimatico per HBsAg in
chemiluminescenza

Architect (ditta Abbott, Chicago, Illinois, USA)

Saggio di conferma (neutralizzazione) per HBsAg

21
Virus dell’immunodeficienza umana

22
 Giorno 0 Esposizione al virus HIV

Giorno 0-2 Il virus viene veicolato

dalle cellule dendritiche
ai linfonodi

Il virus replica nei

Giorno 4-11 linfociti
T CD4 + e viene
rilasciato
nel sangue

Dall’undicesimo giorno Il virus diffonde

ad altri organi
 HIV-1 Anticorpi
1 mil
HIV
HIV RNA

100,000 RNA +
_
10,000
Ab
1,000 P24 +

100 Esposizione
Sintomi
10
0 20 30 40 50
Giorni
Saggio immunoenzimatico con
rivelazione in fluorescenza (ELFA)
per la ricerca dell’antigene p24 di
HIV-1 nel siero o plasma umano

25
26
27
Metodi per la ricerca di antigeni virali

 Agglutinazione

28
AGGLUTINAZIONE AL LATTICE

Gli antigeni sono in

grado di legare
particelle di lattice
ricoperte di anticorpi
specifici

29
AGGLUTINAZIONE AL LATTICE

positivo

negativo

30
Metodi per la ricerca di antigeni virali

 Immunofluorescenza

31
Immunofluorescenza
 Esito positivo per la presenza di antigene di virus HSV-1
attraverso immunofluorescenza indiretta su raschiato cutaneo.
Osservazione al microscopio a fluorescenza.
33
 RIVELAZIONE E IDENTIFICAZIONE DI ANTIGENI VIRALI DIRETTAMENTE NEL
CAMPIONE CLINICO PER RICERCA DI VIRUS RESPIRATORI
REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

centrifugazione Sedimento di citocentrifugazione

cellule derivate
dal campione
“spots” di cellule su vetrino
TAMPONE
FARINGEO Mab Mab Mab
anti-FluA + anti-Para 1 +
FluB anti-Adenovirus Mab
Para 2 + anti-RSV
Para 3
fissazione -Incubazione a 37°C
delle cellule -Lavaggi

Applicazione di anticorpi Rivelazione della reazione antigene-

monoclonali specifici anticorpo mediante applicazione di anticorpi
anti-topo coniugati con fluorocromo ( )

- Incubazione a 37°C Osservazione al

- Lavaggi microscopio a
- Montaggio dei vetrini fluorescenza

Colore azzurro degli “spots” di

cellule dovuto al colorante di
contrasto “Evan’s Blue” 34
Esito positivo per la presenza di antigene di virus respiratorio sinciziale
attraverso immunofluorescenza indiretta su cellule epiteliali esfoliate.
35
Osservazione al microscopio a fluorescenza.
 Preparazione dei leucociti per
antigenemia di citomegalovirus

5 ml di sangue con anticoagulante +1 ml destrano 6%

a 37°C per 30 min.
Sovranatante di leucociti + PBS
a 200 g per 10 min.
Sedimento di leucociti + soluzione di lisi dei globuli rossi

a temp. amb. per 5 min.

+ PBS
a 200 g per 10 min.
Sedimento di leucociti + PBS
a 200 g per 10 min.
CONTA36DEI
Sedimento di leucociti + 1 ml PBS LEUCOCITI
 Preparazione degli spot
Conta dei leucociti in camera Kova

cellule/ml x 1 ml x 0,8 X ml di PBS

= da aggiungere alla
2 x 10 6 cellule/ml sospensione di leucociti

Citocentrifugazione di 100 µl/spot

a 90 g per 3 min

2 x 10 5
cellule/spot
Fissazione e 37
permeabilizzazione
 Immunofluorescenza per antigene pp65 di
citomegalovirus

Ab anti-topo FITC
MAb anti-pp65
-Incubazione a 37°C
-Lavaggi

- Incubazione a 37°C
- Lavaggi
- Montaggio del vetrino

Osservazione al
microscopio a
fluorescenza
38
 ANTIGENEMIA DI CITOMEGALOVIRUS

 Sangue periferico (leucociti polimorfonucleati)

(in provetta sterile con eparina)

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 DIAGNOSI DIRETTA

RICERCA DI ANTIGENI FUNGINI

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 Ricerca di antigeni solubili di Cryptococcus neoformans
in: siero, liquor, lavaggio broncoalveolare, urine
(sistema PastorexTM Cryptoplus)

È un saggio qualitativo e semi-

quantitativo che mediante
agglutinazione rileva il
polisaccaride capsulare di
Cryptococcus neoformans (il
glucutonossilomannano) nei liquidi
biologici

• Glucuronoxilomannano: largamente utilizzato in saggi di agglutinazione passiva.

• False positività riferibili a fattore reumatoide sono eliminabili previo trattamento con
pronasi o utilizzo di un anticorpo monoclonale specifico.
• False positività riferibili ad infezioni da Trichosporon spp.
Saggio immunoenzimatico quantitativo per
la ricerca di antigeni parietali (mannani) di
Candida

Platelia™ Candida Ag Plus è un saggio

immunoenzimatico tipo sandwich in
micropiastra, che consente la rilevazione
dell’antigene mannano di Candida circolante
nel siero o plasma umano.

L’anticorpo monoclonale (Acm) di topo, EBCA-

1, diretto contro le a 1-5 oligomannosidi di I calibratori presenti nel sistema
Candida, viene utilizzato per: consentono la costruzione di una
curva per la quantificazione
• sensibilizzare i pozzetti della micropiastra dell’antigene.
e legarsi all’antigene mannano,
• rilevare l’antigene legato alla micropiastra
sensibilizzata (coniugato: Acm marcato con
perossidasi).
Saggio immunoenzimatico per la ricerca di
galattomannano Platelia® Aspergillus EIA

• Platelia™ Aspergillus EIA è un saggio

immunoenzimatico a sandwich su
micropiastra, one step, in grado di rilevare
il galattomannano nel siero umano.

• Il saggio utilizza anticorpi monoclonali di

ratto EBA-2 diretti contro l’antigene
galattomannano di Aspergillus. Gli anticorpi
monoclonali sono utilizzati per rivestire i
pozzetti della micropiastra, per legare
l’antigene e per rilevare l’antigene legato
alla micropiastra sensibilizzata (anticorpi
monoclonali anti-GM legati con perossidasi).
Concludendo…

La ricerca di antigeni di microrganismi e virus è:

- un saggio diagnostico rapido;

- è di ausilio (es. ricerca di antigeni di plasmodi della
malaria) per i saggi diagnostici di riferimento;
- ha limiti di sensibilità correlati al metodo impiegato;
- puo’ rilevare nel campione microrganismi/virus non
coltivabili;
- in alcuni casi consente l’identificazione del
microrganismo/virus;
- in generale, è un saggio poco dispendioso.

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