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PRODUZIONE

MICROBICA DI AGENTI
TERAPEUTICI
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

CLONAZIONE DI GENI (cDNA) DI CENTINAIA DI


PROTEINE DIVERSE

POTENZIALI AGENTI TERAPEUTICI

SOLO UNA PARTE E’ STATA AUTORIZZATA


ALL’IMPIEGO CLINICO (SPERIMENTAZIONI)
ALCUNE DELLE PROTEINE DELL’UOMO PRODOTTE CON LA
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTI
PER CURARE VARI DISORDINI
ALCUNE DELLE PROTEINE
RICOMBINANTI AUTORIZZATE
ALL’IMPIEGO SULL’UOMO
DALLA U.S. FDA
SINTESI di INSULINA in una CELLULA PANCREATICA
CATENA A 30 aa
CATENA B 21 aa Unite da ponti S-S
ESONE 1 ESONE 2

PREPROINSULINA
PEPTIDE SEGNALE

PROINSULINA FORMA S-S


IN APPARATO DEL GOLGI
UN ENZIMA RIMUOVE 33aa
A
INSULINA
C B
PRODUZIONE DI INSULINA UMANA
IN E. coli

-SI PUO’ PRODURRE INSULINA UMANA NEI


BATTERI?

-E. Coli E’ INCAPACE DI MATURARE pre mRNA


EUCARIOTICI E PRODURRE LE CORRETTE
MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI
PRODUZIONE DI INSULINA
RICOMBINANTE IN E. coli

-Plasmidi separati codificano per


Catena A e B

-uso del promotore e di alcuni codoni iniziali LacZ (proteina di


fusione)

-le sequenze LacZ sono eliminate con trattamento con bromuro di


cianato (che taglia dopo una metionina)

-catene purificate e mescolate assieme, tramite un processo chimico


si formano legami S-S
UTILIZZO DI BATTERI PER
PRODURRE INSULINA
UMANA
AGENTI TERAPEUTICI
PRODOTTI DA
MICRORGANISMI
 PRODOTTI FARMACEUTICI:
-INTERFERONI UMANI
-ORMONE UMANO DELLA CRESCITA

 ENZIMI:
-DNAsi I
-ALGINATO LIASI

 ANTICORPI MONOCLONALI

 AGENTI TERAPEUTICI CONTRO L’HIV


INTERFERONI UMANI
 ANNI ’80: ISOLAMENTO DEL PRIMO
GENE DELL’IFN

 ESISTONO IFN DIVERSI:


CLASSIFICAZIONE IN 3 GRUPPI
DIVERSI
- IFN α
- IFN β
- IFN γ
 IFNα E IFNβ :
SINTETIZZATI DA CELLULE CHE HANNO
SUBITO L’ATTACCO DI VIRUS O DI RNA
VIRALE

 IFNγ
SINTETIZZATO IN RISPOSTA AGLI AGENTI
CHE STIMOLANO LA CRESCITA
CELLULARE

 IFNα : CODIFICATO DA PIU’ DI 15 GENI

 IFNβ E INFγ : CODIFICATI DA SINGOLI


GENI

I SOTTOTIPI DI IFNα POSSIEDONO


SPECIFICITA’ DIVERSE
POSSIBILI APPLICAZIONI
ALL’UOMO DI ALCUNI TIPI
DIVERSI DI IFN UMANO
MANIPOLAZIONE
GENETICA DIEGLI IFN
UMANI
COSTRUZIONE DI GENI IBRIDI DERIVATI DA
IFNα 2 E IFNα 3
PROTEINE CON NUOVE ATTIVITA’ IFN
(60) (92) (150)
RISULTATI IFN IBRIDI
 ATTIVITA’ SUPERIORE
INDUZIONE DI SINTESI CELLULARE DI
(2’-5’)- OLIGONUCLEOTIDE SINTETASI

ATTIVAZIONE DI UNA ENDORIBONUCLEASI


LATENTE CHE TAGLIA L’mRNA VIRALE

 MAGGIORE ATTIVITA’
ANTIPROLIFERATIVA
MANIPOLAZIONE GENETICA
DELL’ORMONE DELLA
CRESCITA UMANO

(His18, His21 e Glu174)

Mutagenesi sito-specifica
(inibito il legame del GH
A Zn2+)
DNasi I
 CURA DELLA FIBROSI CISTICA

 IDROLIZZA LUNGHE CATENE


POLIMERICHE DI DNA IN
OLIGONUCLEOTIDI MOLTO PIU’ CORTI

 SOMMINISTRAZIONE PER AEROSOL

 IMPIEGO CLINICO APPROVATO DALLA


US FDA
ALGINATO LIASI

 POTENZIALE IMPIEGO NELLA


CURA DELLA FIBROSI CISTICA

 DEPOLIMERIZZA L’ALGINATO
ESCRETO DAI CEPPI MUCOIDI DI
Pseudomonas aeruginosa
ALGINATO

POLISACCARIDE POLIMERO COSTITUITO


DA CATENE DEGLI ZUCCHERI
 β -D-MANNURONATO

 α -L-GULURONATO (LEGAMI
TRASVERSALI INTRA/INTERCATENARI,
Ca2+ DIPENDENTI)

FORMAZIONE DI UN GEL ELASTICO


ALGINATO LIASI
 ISOLATO IL GENE DA Flavobacterium
(BATTERIO DEL SUOLO, GRAM-)

 COSTRUZIONE IN E. coli DI UNA


BANCA DI CLONI DI Flavobacterium

SCREENING DI CLONI POSITIVI


(PRODUTTORI DI ALGINATO LIASI)
SCREENING
 MEZZO SOLIDO CON ALGINATO E
CALCIO
 CLONI PRODUTTORI DI ALGINATO
LIASI

ALONE INTORNO ALLA COLONIA


MATURAZIONE IN E. coli DEL
PRECURSORE DELL’ALGINATO
LIASI DI Flavobacterium

PRECURSORE 69 KDa

TAGLIO PROTEOLITICO

40 kDa
ALGINATO LIASI DA
40kDa
 AMPLIFICATO PER PCR ED
INSERITO IN UN VETTORE
PLASMIDICO DI Bacillus
subtilis
 TRASFORMAZIONE DI B.
subtilis CON IL VETTORE
PLASMIDO

 CLONI POSITIVI

 SAGGIO ATTIVITA’
ANTICORPI
MONOCLONALI COME
AGENTI TERAPEUTICI
 1970-79: IMMUNIZZAZIONE
PASSIVA
Prevenzione del rigetto immunitario
degli organi trapiantati.
Criterio logico: somministrazione di
un anticorpo specifico che si
legasse a specifici linfociti per
diminuire la risposta immunitaria
diretta contro l’organo trapiantato
Anticorpo monoclonale del
topo OKT3
 Primo agente immunosoppressore
approvato dalla US FDA per il
trapianto nell’uomo
 Si lega al recettore CD3 delle
cellule T
 Immunizzazione efficace ma
effetti secondari:
- Febbre
- Rash cutaneo
Anticorpi monoclonali
coniugati
chimicamente
 STRATEGIE PER MIGLIORARE LA
POSSIBILITA’ DI UN FARMACO DI
RAGGIUNGERE IL SITO
BERSAGLIO:

1. Incapsulare il farmaco nei


liposomi

2. Incorporare i geni di certe tossine


entro linfociti atti a infiltrare i
3. SISTEMI DI INDIRIZZAMENTO DEL
FARMACO
A) Coniugare alcuni farmaci ad
anticorpi monoclonali specifici
(Es. Ag. Tumorale + Anticorpo
monoclonale)
B) Coniugare all’anticorpo
monoclonale un enzima che
trasformi il profarmaco
inattivo nel farmaco attivo.
PRODUZIONE DI AGENTI
TROMBOLITICI IMMUNOTERAPICI
 CRITERIO LOGICO
ELABORAZIONE DI AGENTI TROMBOLITICI CAPACI
DI DEGRADARE ESCLUSIVAMENTE LA FIBRINA
DEI COAGULI
AGENTE TROMBOLITICO
IMMUNOTERAPICO
STRATEGIA
CONIUGAZIONE CHIMICA DELL’ATTIVATORE
TISSUTALE DEL PLASMINOGENO CON UN
ANTICORPO MONOCLONALE ANTIFIBRINA
PRODUZIONE DI ANTICORPI
MONOCLONALI UMANI
 TECNICHE CONVENZIONALI:
- IBRIDOMA: fusione di una cellula di
mieloma murino con un linfocita
umano produttore di anticorpi >
difficoltà di realizzazione
(cromosomi umani instabili,
mancanza di linee cellulari di
mieloma umano, problemi etici…)
PRODUZIONE DI ANTICORPI
MONOCLONALI UMANI
 NUOVE STRATEGIE:
- Trapianto di cellule staminali
dal sistema immunitario
umano in topi scid (severe
combined immunodeficiency
mice) (“UMANIZZAZIONE DEL
S.I. DI TOPI)
PRODUZIONE DI ANTICORPI
MONOCLONALI UMANI
- Topi transgenici che
producono immunoglobuline
umane dopo l’immunizzazione
con un particolare antigene.

ENTRAMBI I METODI SONO


PIUTTOSTO LABORIOSI
Production of Human Monoclonal
Antibodies by E. coli
 Hybridoma cells grow relatively slow and
require expensive media.
 To circumvent this problem human
monoclonal antibodies are grown in E. coli.
 The produce involves:
 mRNA is isolated from the B cell.
 cDNA is synthesized from the mRNA by the
enzyme reverse transciptase.
 Both heavy and light chains are amplified
separately from the cDNA using PCR.
 The amplified products are cut with
restriction enzymes and cloned into Lambda
vector.
Production of
Human
Monoclonal
Del cDNA amplificato
Antibodies by
E. coli
Production of Human Monoclonal
Antibodies by E. coli
 During cloning different light and heavy
chains are cloned.
 The DNA of one heavy and one light chain
are cloned into the same vector.
 Many different combinations of H and L
chains are cloned together in the same
vector.
 Lambda is not useful for producing large
amounts of proteins.
 The L and H chains are excised from
Lambda and cloned into an E. coli plasmid
and the recombinant plasmid transformed
Production of
Human
Monoclonal
Antibodies by
E. coli
Dal batteriofago λ

Raccolta del frammento


Fv che lega l’antigene
da E. coli
Production of Human Monoclonal
Antibodies by E. coli

 E. coli will produce large amounts


of monoclonal antibodies which
are harvested.
 These monoclonal antibodies can
be used for:
Diagnostic purposes e.g detection of
HIV by ELISA.
Therapeutically for the treatment of
infection.
AGENTI TERAPEUTICI
CONTRO L’HIV
 INFEZIONE DA HIV
I FASE: INTERAZIONE gp12O-CD4

CELLULA
BERSAGLIO
HIV DISTRUGGE LE CELLULE
TH IN PIU’ MODI DIVERSI:

 LISI, LIBERAZIONE DI HIV

 SINTESI DI gp120

 FORMAZIONE DI SINCIZI
STRATEGIE
TERAPEUTICHE
 ANTICORPI CONTRO CD4
BLOCCO
IN VITRO
 ECCESSO DI PROTEINA CD4 DELL’
LIBERA INFEZIONE!!!

 PROTEINA DI FUSIONE:
IMMUNOADESINA
IMMUNOADESINA

PORZIONE CD4 PORZIONE Fc


DI IG
 LEGA gp120
 BLOCCA HIV
 SI FISSA SU CELLULE
RECETTRICI DI ANTICORPI
 PERSISTE NEL PLASMA
IL LEGAME
IMMUNOADESINA CON HIV
LIBERO O CON CELLULE DA
ESSO INFETTATE

ATTIVAZIONE ADCC
(CITOTOSSICITA’ CELLULO-
MEDIATA-ANTICORPO-
DIPENDENTE)

DISTRUZIONE HIV E CELLULE


ALTRE STRATEGIE
TERAPEUTICHE CONTRO HIV

SISTEMA DI INDIRIZZAMENTO PER


UCCIDERE SPECIFICAMENTE
CELLULE INFETTATE DA HIV

PROTEINA DI FUSIONE
(CD4 + ESOTOSSINA A
DI Pseudomonas)
ESOTOSSINA A DI
Pseudomonas (66 KdA)
 3 DOMINI:
- I: LEGAME CON LA CELLULE

- II: INTRODUZIONE PROTEINA


DENTRO LA CELLULA

- III: ATTIVITA’ CITOTOSSICA


(ADP-RIBOSILAZIONE)
Costruzione proteina di
fusione CD4-esotossina A di
Pseuodomonas

DOMINIO I DI ESOTOSSINA A
SOSTITUITO CON CD4
PROPRIETA’ DELLA
PROTEINA DI FUSIONE
 ATTIVITA’ CITOTOSSICA
 CAPACITA’ DI LEGARE gp120
 PENETRAZIONE NELLA
CELLULA INFETTATA DA HIV

INATTIVAZIONE DI EF-2
(MORTE CELLULARE!)