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INDICE

5. PURIFICAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI..........................................45


.........................................................................................................49
5.2 Gel filtrazione..............................................................................49
5.3 Cromatografia a scambio ionico ................................................................51
5.4 Cromatografia di affinità...........................................................................55

1. Introduzione

1.1 Sistema immunitario

Il sistema immunitario rappresenta un prodotto dell’evoluzione


estremamente specializzato e complesso. La sua funzione è quella di
proteggere l’organismo dall’attacco di agenti estranei (detti antigeni)
mediante la sintesi di molecole altamente specializzate quali gli anticorpi
e la generazione di elementi cellulari quali linfociti e fagociti che
contrastano e distruggono gli antigeni. Esso è costituito da numerosi
organi linfoidi e da differenti popolazioni cellulari con una varietà di
funzioni (fig. 1.1).

Fig. 1.1- Localizzazione dei principali linfonodi, timo e midollo osseo


femorale.
1.2 Anticorpi

Gli anticorpi sono una classe di glicoproteine del siero, il cui ruolo nella
risposta immunitaria specifica è di enorme importanza. Hanno la capacità
di legarsi in maniera specifica agli antigeni (microrganismi infettivi come
batteri, tossine, o qualunque macromolecola estranea). Vengono prodotti
nel sangue, in presenza di un antigene, da un particolare tipo di cellule,
le plasmacellule, derivanti dalla differenziazione dei linfociti B. Il legame
antigene-anticorpo è altamente specifico e consiste in una serie di
interazioni non covalenti, quindi reversibili (legame a idrogeno,legame
ionico,interazioni di Van der Waals,interazioni idrofobiche). L’anticorpo
riconosce una regione distinta dell’antigene detta epitopo o
determinante antigenico. Si distinguono, in linea di massima, due tipi
di epitopi: sequenziali e conformazionali. Gli epitopi sequenziali sono
caratterizzati da una specifica sequenza amminoacidica lineare, ad
esempio Arg-Glu-Ser. Quelli conformazionali sono tali in base alla loro
struttura tridimensionale.

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1.2.1 Struttura e meccanismo d’azione degli anticorpi

Nella struttura di un anticorpo possiamo distinguere due domini:

• Dominio di legame: regione che riconosce l’antigene;


• Dominio effettore: regione che induce la risposta immunitaria
al fine di distruggere l’antigene.

Strutturalmente è un tetramero costituito da due catene proteiche


pesanti H uguali fra loro e due catene proteiche leggere L anch’esse
uguali, tenute insieme da legami idrogeno e ponti disolfuro localizzati.
Queste interazioni fanno sì che le catene si dispongano nella
caratteristica forma a “Y”. Ciascuna catena è costituita da regioni
costanti (C) e da regioni variabili (V). Le regioni costanti sono comuni
a tutte le immunoglobuline appartenenti alla stessa classe e la loro
funzione è quella di avviare la risposta immunitaria. Le regioni variabili
sono specifiche per ogni anticorpo e contengono i siti che riconoscono e
fissano l’antigene. Dunque sono queste ultime che conferiscono
specificità al dominio di legame. Le regioni variabili sono collocate alle
estremità N-terminali delle due catene pesanti e delle due catene
leggere.

Fig.1.2- Struttura di un anticorpo.

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papai
na

pepsi
na
plasmin
a

La struttura degli anticorpi è stata compresa attraverso l’uso di enzimi


proteolitici quali:

• Papaina: scinde la molecola in tre frammenti, due uguali tra


loro, capaci di legare l’antigene, denominati Fab (fragment antigen
binding); il terzo è denominato Fc (frammento cristallizzabile) perché a
bassi valori di pH cristallizza facilmente.
• Pepsina: scinde la molecola in un frammento più grande,uno più
piccolo ed alcuni oligopeptidi. Il frammento di dimensioni maggiori è
simile al dimero del frammento Fab, quindi è detto F(ab’)2; il frammento
di dimensioni minori è una versione tronca del frammento Fc, quindi è
detto Fc’.
• Plasmina: scinde la molecola in due frammenti nella regione
compresa tra i ponti disolfuro del frammento Fc, generando così due
nuovi frammenti pFc e Facb.
I meccanismi attraverso cui gli anticorpi proteggono il nostro organismo
sono principalmente due:

• La neutralizzazione del patogeno, in cui il semplice legame


antigene-anticorpo blocca il processo di entrata nella cellula bersaglio;
• L’opsonizzazione, ovvero quel processo attraverso cui gli
anticorpi legano in superficie il microrganismo rendendolo visibile al
macrofago e permettendo così il processo di fagocitosi (citotossicità
cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC). Quest’ultimo meccanismo
può essere direttamente mediato dalla porzione Fc dell’anticorpo
riconosciuta dal fagocita, oppure mediato dall’intervento delle proteine
del complemento.
Altri meccanismi coinvolgono l’agglutinazione delle particelle
antigeniche;la precipitazione di antigeni solubili e, infine, la già citata

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attivazione del complemento, che determina la formazione di pori nelle
cellule microbiche e lisi cellulare. Dopo essere stato a contatto con un
dato antigene, l'organismo continua a produrre anticorpi specifici per un
dato periodo di tempo: dopo avere raggiunto un valore massimo, la
produzione decresce e infine si arresta. In alcuni casi, l'organismo
mantiene nel suo sangue alcuni anticorpi per quell' antigene: esso, cioè,
resta immunizzato in modo permanente.

Fig.1.3- Meccanismo d’azione degli anticorpi.

1.2.2 Classi di anticorpi


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Ogni anticorpo appartiene ad una delle 5 possibili classi di
immunoglobuline denominate rispettivamente IgG, IgA, IgM, IgD e IgE;
queste differiscono fra loro per la diversa composizione delle catene
pesanti (γ per le IgG, α per le IgA, µ per le IgM, δ per le IgD, ε per le IgE),
per l'eventuale configurazione delle subunità e per la diversa
distribuzione fisiologica. Le IgG sono gli anticorpi più importanti e più
abbondanti nel sangue (70-75 %). Si suddividono in quattro sottogruppi a
seconda di diversi sottotipi di catene γ. Sono monomeri con PM di
150.000 dalton. Le IgG sono gli anticorpi maggiormente impiegati
durante la risposta immunitaria secondaria, cioè sono prodotte
tardivamente e in maniera massiccia dai linfociti B differenziatisi in
plasmacellule. Sono potentissime opsonine, ossia si legano ai microbi con
grande efficienza e ne permettono la fagocitosi da parte dei macrofagi.
Hanno un'importante funzione nel proteggere il neonato durante i primi
mesi di vita: le IgG sono infatti in grado di passare la barriera placentare,
immettendosi nel sangue del feto. Le IgA sono anticorpi predominanti
nelle mucose; quelle presenti nel sangue (20-25 %) hanno un ruolo
marginale. Nelle secrezioni mucose che ricoprono l’apparato digerente e
respiratorio sono prodotte in forma dimerica, mentre quelle presenti nel
siero sono in forma monomerica. Rappresentano un importante mezzo di
difesa contro le infezioni locali.

Le IgA sono molto importanti anche per la trasmissione di una prima


forma di difesa dalla madre al lattante, che nei primi sei mesi di vita è
incapace di produrre anticorpi suoi.

Le IgM sono la classe di anticorpi predominanti nella risposta


immunitaria primaria, prodotte in occasione della prima infezione con
qualunque germe. Hanno due funzioni, che si rispecchiano nelle due
possibili conformazioni in cui vengono prodotte: in forma monomerica
rimangono ancorate ai linfociti B non ancora attivati e fungono da
recettore per l’antigene, ossia captano le molecole estranee con cui il
linfocita viene a contatto e trasmettono al suo interno un segnale che lo
attiva; in forma pentamerica vengono secrete nell'ambiente
extracellulare e svolgono un'importantissima funzione di opsonizzazione
e di attivazione del complemento.

Le IgD si ritrovano soltanto sulla superficie dei linfociti B immaturi,


assieme alle IgM, ed hanno come unica funzione quella di attivare i
linfociti B e di promuovere la loro maturazione verso lo stadio di
plasmacellule quando vengono a contatto con l'antigene per il quale sono
specifiche. Non si ritrovano IgD libere nel plasma (se non in tracce).

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Le IgE hanno fondamentalmente la funzione di proteggere l'organismo
dalle infezioni da parte di parassiti e soprattutto elminti. Esse sono anche
le principali responsabili di malattie allergiche quali l’asma, l’eczema o il
raffreddore da fieno.

Fig.1.4- Conformazioni delle immunoglobuline.

1.3 Anticorpi monoclonali e anticorpi policlonali


Gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici tra loro, in quanto
prodotti da cloni di uno specifico linfocita B o di una plasmacellula, e sono
in grado di riconoscere uno solo epitopo dell’antigene. Gli anticorpi
policlonali, invece, sono anticorpi prodotti da plasmacellule diverse, per
cui sono in grado di riconoscere diversi epitopi di uno stesso antigene.
Questa differenza permette di sfruttare entrambe le tipologie di anticorpi
per scopi diagnostici e terapeutici. Gli anticorpi policlonali sono utili per la
rilevazione di proteine con bassi livelli di espressione, proprio per la
caratteristica di riconoscere epitopi diversi. Preparati di anticorpi
policlonali sono stati usati per diversi anni per indurre immunizzazione
passiva contro malattie infettive ed altri agenti dannosi. Lo svantaggio di
tali preparati era quello di indurre effetti indesiderati, tra cui possibili
reazioni di ipersensibilità, le quali possono arrivare fino allo shock
anafilattico. Gli anticorpi monoclonali, essendo in grado di legare uno
specifico epitopo, sono raccomandati per la rilevazione di proteine
altamente espresse o per altre applicazioni dove è necessario legare il
target con esattezza per evitare i falsi positivi. Possono, inoltre, essere
utilizzati per la rilevazione di alterazioni della struttura proteica.
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L’incomparabile specificità degli anticorpi monoclonali, unita alla loro
relativamente facile produzione e alla possibilità di averne scorte
pressoché inesauribili, li rende interessanti strumenti in campo
biochimico e terapeutico. Riguardo le applicazioni terapeutiche, i primi
studi sono stati concentrati sulla terapia anticancro, ma i preparati di
anticorpi monoclonali trovano oggi diverse applicazioni cliniche, ad
esempio:

• nell’ immunosoppressione;
• nella profilassi del rigetto;
• nella terapia delle malattie autoimmuni;
• nella terapia di patologie cardiovascolari, asma, osteoporosi, ecc.

2. Gli ibridomi

Con il termine ibridoma intendiamo il prodotto della fusione tra un linfocita-B,


responsabile della produzione di un anticorpo, e una cellula tumorale del
midollo osseo, un mieloma. L'ibrido ottenuto avrà le caratteristiche di entrambi
i costituenti, infatti, in quanto prodotto da un singolo linfocita-B, sarà un
anticorpo (Ab) specifico , e dalla componente mielomica dipenderà la capacità
di crescere in continuo. L'importanza degli ibridomi risiede nella possibilità di
produrre anticorpi monoclonali in luogo di quelli policlonali per l'utilizzo
diagnostico dei quali è necessaria una prolungata fase di purificazione. Il
vantaggio consisterà nella maggiore specificità e nella possibilità di produzione
in grande quantità a partire da un clone isolato.La ricerca sui metodi di
produzione degli anticorpi monoclonali ebbe un sostanziale sviluppo a partire
dal 1975 grazie a Milstein e Kohler. Una volta prodotto, l'ibridoma, deve essere
isolato e mantenuto in coltura. Ogni ibridoma clonato ( isolato e messo in
coltura separatamente) produce uno specifico anticorpo (monoclonale) che
sarà in grado di reagire specificamente proprio con l'antigene che è stato
responsabile della sua stessa produzione. E' necessario selezionare linee
cellulari di mieloma che non secernono più la paraproteina, Ig del mieloma, per
evitare che l'ibrido dia luogo anche alla produzione dell'anticorpo della linea
tumorale. Una volta mescolati i linfociti e le cellule di mieloma bisogna
separare le cellule di mieloma non fuse e gli ibridi mieloma-mieloma da quelle
che invece hanno subito la fusione, la qual cosa è resa possibile dall'uso del
terreno HAT.

Schematicamente il processo di produzione di un anticorpo monoclonale


mediante un ibridoma può essere schematizzato così (fig. 2.1) :

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1.Immunizzazione
2.Scelta del mieloma
3.Fusione
4.Crescita selettiva dell'ibrido
5.Screening Ab
6.Clonazione
7.Caratterizzazione dell'anticorpo
8.Produzione anticorpo in vitro-vivo

Figura 2.1- Schema generale produzione ibridomi

1. Immunizzazione
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Consiste nella inoculazione dell'antigene , caratteristico per l'anticorpo che si
vuole ottenere, nel topo. Solitamente i protocolli di immunizzazione prevedono
una iniezione di richiamo 3-5 giorni prima della fusione. Oltre all'antigene
possiamo aggiungere un adiuvante ( fig.2.2) che si comporta da potenziante
non specifico della risposta immunitaria.

Adiuvante Composizione e utilizzo

Adiuvante di Freund completo Olio minerale contenente micobatteri inattivati al


calore (Mycobacterium tubercolosis o M. butyricum).
(FCA, Freund’s Complete
Adjuvant) Utilizzato come emulsione con antigeni in soluzione
acquosa.

Adiuvante di Freund incompleto Olio minerale.


(FIA Freund’s Incomplete Utilizzato come emulsione con antigeni in soluzione
Adjuvant) acquosa.

Allume Sali complessi d’alluminio. Esistono diverse versioni


dell’adiuvante: alcune sono vendute pronte all’uso
(per esempio Alhydrogel); altre si possono preparare
in laboratorio, mescolando vari sali, per esempio
NaHCO3 con solfato di potassio e alluminio.
L’antigene acquoso è adsorbito dal gel.

Bentonite Bentonite di sodio del Wyoming (montmorillonite) in


gel. L’antigene acquoso si adsorbe alla superficie.

Quil A Saponina derivata dalla Quillaja saponaria Molina


(albero del Sud America). Miscelato per formare un
complesso con l’antigene acquoso.

Muramil dipeptide (MDP) N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina. Mescolato


con l’antigene acquoso. Si utilizzano anche vari
derivati del MPD come adiuvanti.

Lipide A monofosforico (MPL) Utilizzato in varie formulazioni, spesso come


emulsionante con oli. L’antigene è incluso
nell’emulsione.

Bacillus pertossi Organismo ucciso mescolato all’antigene acquoso.

Figura 2.2- Adiuvanti

Le milze degli animali che producono una maggiore quantità di anticorpi


vengono rimosse, private del grasso che le circonda e frantumate.
Alternativamente se la concentrazione è bassa si può procedere con
un'iniezione di antigene senza adiuvante 3 giorni prima della fusione e 2
settimane dopo la prima immunizzazione. Successivamente una sospensione di
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linfociti splenici (circa 108) viene mischiato con una di cellule di topo ottenute
da un mieloma (circa 107). La miscela viene quindi incubata con
polietilenglicole per 8 minuti per favorire la fusione delle membrane cellulari.

2. Scelta del mieloma


L'ideale sarebbe quello di avere linee mielomatose
che non producano anticorpi in modo tale che gli
ibridomi diano luogo ad anticorpi solo derivati dalle
cellule B usate per la fusione. A questo proposito
una linea che viene spesso scelta è la MOPC 21,
tumore murino indotto con olio minerale, linea che
viene scelta per la mancanza di sintesi di una o di
entrambe le catene immunoglobuliniche.

La linea plasmacellulare murina deve quindi

• non produrre Ig perché non deve essere


prodotto il tipo anticorpale della linea
tumorale
• non deve essere in grado di produrre il
gene per l'enzima ipoxantina guanina Figura 2.3- Struttura
fosforibosil trasferasi (HGPRT,fig-2.3) HGPRT
un'enzima di recupero che permette di ottenere nucletidi purinici a
partire da purine libere derivate dalla degradazione degli acidi nucleici.

Posso selezionare le cellule che vengono private della


funzionalità di questo enzima facendole crescere in un
terreno in cui è presente la 6-tioguanina (fig.2.4). Quando la
funzionalità dell'enzima non è compromessa avviene la
trasformazione della 6-tiopurina in 6-tirosina-5-monofosfato
che provoca morte cellulare.

Figura 2.4- Struttura 6-


tioguanina
3. Fusione

Per avere la fusione vengono mescolate cellule spleniche e cellule di mieloma


in rapporto 1:2 , 1:5 si centrifuga e si aggiunge PEG 4000 al 45% dunque le
cellule vengono risospese in terreno e piastrate in multiwell da 24 o 96
pozzetti. Quando viene aggiunto il PEG, che si comporta da induttore della
fusione delle membrane cellulari, si formerà una membrana citoplasmatica
comune contenete due o più nuclei. I nuclei quindi in poco tempo si fonderanno
e daranno luogo a mitosi sincrone. La fusione di cellule di mieloma HGPRT

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negative e di cellule immuni di milza darà luogo in definitiva a cellule ibride di
diversi tipi: mieloma-mieloma, mieloma-milza, milza-milza (fig.e 2.5; 2.6).

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Figura 2.5- Schema Fusione

Figura 2.5- Fusione

4. Crescita selettiva dell'ibrido, terreno hat

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E' proprio per selezionare l'ibrido mieloma milza che uso un terreno selettivo
come l'HAT. (amminopterina, ipoxantina, timidina).

Aminopterina= antibiotico, inibisce le vie metaboliche di sintesi dei nucleotidi


bloccando l'enzima diidrofolato reduttasi quindi la riduzione di folato a
tetraidrofolato e la conseguente formazione di IMP, fondamentale per la
produzione di purine. L'azione di blocco dell'aminopterina si estene anche alle
pirimidine in quanto viene bloccata anche la metilazione di dUMP a dTMP.
Esiste un percorso alternativo per la sintesi di questi che prevede il riciclo dei
prodotti di degradazione degli acidi nucleici stessi.

Questa via alternativa (che diventa l'unica in presenza del blocco (dovuto
all'amminopterina) è accessibile se è presente una fonte esogena di precursori
come ipoxantina e timidina (fornite dall'hat). Le cellule di mieloma mancanti
della funzionalità dell'HGPRT non possono utilizzare questa via alternativa e
quindi tutte le cellule di mieloma non fuse e quelle fuse ma mieloma-mieloma
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muoiono per azione del blocco dell'aminopterina non potendo percorrere
questa altra strada. Se invece la cellula di mieloma è fusa con una cellula di
milza potrà contare su HGPRT, usare ipoxantina e timidina, dividersi e
moltiplicarsi.

Ipoxantina= infatti può essere usata come sorgente di purine in quanto grazie
all'azione dell'enzima HGPRT può formare IMP.

Quindi se blocco con l' aminopterina, le cellule normali possono sopravvivere


grazie al terreno HAT perchè contiene ipoxantina e timidina grazie alla normale
funzionalità dell' HGPRT.

Timidina= è aggiunta per risolvere il blocco dell'enzima diidrofolato reduttasi.

A questo punto le sospensione di cellule viene diluita e seminata in


micropiastre in modo che per ogni pozzetto ci sia statisticamente una cellula
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che possa quindi formare un clone e verranno quini coltivate in un mezzo di
coltura senza HAT. In questo modo ogni clone di linfocita B produrrà un unico
tipo di anticorpo. Per favorire la formazione dei cloni a partire da una singola
cellula sarà utile seminare le cellule in gel agarosio al quale vengono aggiunti
linfociti di un altro topo che coadiuveranno la crescita della cellula (feeder
layer). Dopo due settimane circa noteremo la formazione dei cloni.

Quindi sarà possibile procedere allo screening degli anticorpi specifici per
l'antigene immunizzante.

5. SCREENING Ab

È un momento importante nella produzione di un ibridoma perchè comporta


una ricerca dell'anticorpo che reagisce con l'immunogeno tra i medium di
ciascun pozzetto. Le tecniche più utilizzate sono essenzialmente tre: test di
immunofluorescenza, test radioimmunologico (RIA), test immunoenzimatico
(ELISA).

Test enzimoimmunologico (ELISA) : l’antigene (immunogeno) viene attaccato


od adsorbito ad un supporto in fase solida (polistirene). La fase solida viene
quindi lavata con tampone fosfato salino-Tween 20 per rimuovere l’antigene
non adsorbito. A ciascun pozzetto viene aggiunto il terreno in cui sono cresciuti
diversi ibridomi. Si legherà solo l’anticorpo specifico con reattività contro
l’antigene. L’anticorpo che non ha reagito verrà rimosso. Quindi se è presente
l’anticorpo specifico, sarà possibile visualizzare il complesso che questo forma
con l’antigene tramite l’utilizzo di un anticorpo marcato con un enzima.Tra gli
enzimi più utilizzati in tal senso ricordiamo: la perossidasi da rafano (HRPO),
che ossida il luminolo, producendo luce, la fosfatasi alcalina (AP) che converte
il p-nitrofenilfostato incolore in p-nitrofenolo giallo e la beta galattosidasi. In
seguito viene aggiunto il substrato per l’enzima. Dopo un dato tempo
necessario per lo sviluppo massimo del colore, la reazione enzimatica viene
bloccata, e viene determinata l’intensità del colore di ciascun campione che
darà una misura della quantità di enzima marcante attaccato, che è
proporzionale all’anticorpo specifico dell’ibridoma nel medium del
micropozzetto.

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Figura 2.6- Schema ELISA

Test di immunofluorescenza: Il legame dell'anticorpo monoclonale


all'antigene è messo in evidenza con un secondo anticorpo anti-Ig marcato
con sostanze fluorescenti le quali mostrano la capacità di emettere fotoni di
lunghezza d'onda visibile se eccitate con radiazioni di lunghezze d'onda
adeguate.

Figura 2.7

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Test radioimmunologico: è un test più sensibile del precedente, per
evidenziare il legame suddetto viene usato sempre un secondo anticorpo ma
marcato con l'isopoto 125 (radiattivo) dello Iodio . La quantità di radioattività
sarà proporzionale all'anticorpo dell' ibridoma (fig. 2.8).

Figura 2.8- RIA

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6_Clonazione

I pozzetti della piastra da microdosaggio originale il cui mezzo fornisce


all'immunodosaggio risposta positiva (colorazione) possono contenere una
miscela di cellule di fusione. Tali cellule perciò vengono diluite con mezzo di
coltura e inoculate in pozzetti vergini, onde impiantare linee cellulari da cellule
individuali (cloni). Dopo avere coltivato i cloni se ne saggia il mezzo
nuovamente per stabilire quali linee cellulari (ibridomi) producano molecole di
anticorpi monoclonali atte a riconoscere l'antigene bersaglio. Se si isola più di
un ibridoma specifico si effettuano ulteriori saggi per stabilire se i diversi cloni
producano anticorpi contro il medesimo determinante antigenico. La tecnica
per diluizione al limite (di meno di una cellula per coltura) o l’uso di terreni di
coltura semisolidi come l’agar, permette agli ibridi di crescere con una densità
talmente bassa che ogni crescita si può considerare derivante da un singolo
clone. La procedura della riclonazione permette l’eliminazione della
contaminazione di varianti, dei cloni che non producono anticorpi, e le cellule
che hanno perso la capacità di produrre anticorpi a causa della perdita di
cromosomi. Se si permette che la crescita continui, le varianti degli ibridi
possono sovracrescere gli ibridomi desiderati. Una volta individuati i pozzetti
positivi, le cellule vengono diluite in una elevata quantità di terreno di coltura
che viene ridistribuito in diversi pozzetti. Questa operazione ripetuta più volte
permette di ottenere in un pozzetto una singola cellula, da cui poi si origina
una colonia di cellule; questo procedimento corrisponde al clonaggio della
cellula producente un singolo anticorpo. Sulle diverse colonie cellulari si ripete
lo screening più volte, in quanto le cellule producenti anticorpi possono non
essere stabili e portare ad un decadimento del titolo di anticorpi, ed inoltre
nello stessso pozzetto si possono trovare cellule ibridizzate che non producono
nulla. Quest’ultime sono pericolose in quanto proliferano velocemente e
tendono a sostituirsi alle prime. Quando le cellule produrranno un titolo
costante di anticorpi, si potrà essere certi di aver selezionato un clone. La
clonazione deve essere fatta quanto più velocemente possibile per eliminare
varianti ed ibridi non producenti anticorpi. Un clone stabile viene mantenuto
con la subclonazione. La ripetizione delle tecniche di clonaggio aumenta la
probabilità che le cellule risultanti siano monoclonali ma è comunque
necessario eseguire dei controlli per accertarsi di aver ottenuto la
monoclonalità. A questo scopo si preparano subcloni di linee ibridomi e si
calcola la percentuale di cellule che secernono anticorpi con la specificità
appropriata che deve essere vicina al 100%.

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3. PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

3.1 Introduzione
Gli anticorpi, oltre all’importanza che rivestono nella naturale risposta
immunitaria, si sono dimostrati uno strumento molto valido per la ricerca
grazie alla loro specificità nell’identificare particolari molecole o cellule con
conseguente possibilità di separarle da una miscela. Una volta individuati i
cloni producenti l’anticorpo monoclonale a reattività desiderata, si passa alla
produzione su larga scala. Questa può essere effettuata espandendo la coltura
dell’ibridoma in vitro e raccogliendo il surnatante. In alternativa, si può
ricorrere a metodi in vivo, attraverso l’inoculazione dell’ibridoma in topi che
abbiano derivazione genetica uguale a quella dell’ibridoma per la produzione di
liquido ascitico. Nel caso in cui gli mAb non vengano subito purificati, sia il
surnatante che l’ascite possono essere conservati a -20 °C. Al fine di garantire
un elevato grado di purezza, impedendo quindi qualsiasi forma di
contaminazione batterica, è necessario effettuare prelievo e conservazione in
forma sterile o aggiungendo 0.2% di NaN3.

3.2 Produzione di mAb in vitro


Per ottenere elevate rese di mAb è necessario far crescere in coltura liquida gli
ibridomi fino a saturazione. L’eventuale morte delle cellule dovuta alla loro
eccessiva concentrazione nel mezzo di coltura, non dovrebbe alterare la
quantità dell’ mAb poiché gli Ab risultano in genere resistenti alle proteasi
rilasciate in seguito a morte cellulare. I surnatanti contengono una quantità di
Ab specifici variabile da 5 a 20 µg\ml e possono raggiungere i 50 µg\ml. La
contaminazione proteica più rilevante è dovuta alle proteine sieriche bovine nel
siero utilizzato per la coltura. Per ovviare a questo inconveniente esistono in
commercio terreni sintetici a basso contenuto proteico in grado di sostenere la
crescita degli ibridomi.

3.2.1 Terreni di coltura


Gli ibridomi possono crescere in coltura di sospensione o stazionaria, essendo
cellule ancoraggio-indipendenti. La quantità di anticorpo prodotta dipende dalla
concentrazione delle cellule ottenute e dal periodo di tempo sufficienti a
raggiungere quantità di anticorpo in cui rimangono vitali e produttive.

La crescita in vitro e il rendimento degli ibridomi vengono assicurati da diversi


fattori:

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a) elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, Sali minerali) contenuti
nel mezzo

b) fattori di crescita (presenti nel siero)

c) rimozione dei residui metabolici

d) stabilità del pH

e) temperatura

f) adeguata diffusione di ossigeno

Rispondono a questi requisiti due tipologie di terreni: DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s
medium) e RPMI-1640. Queste due formulazioni differiscono tra loro per il contenuto in
amminoacidi e vitamine. Per la crescita ottimale le cellule richiedono un valore di pH del mezzo
compreso tra 7,2 e 7,4. Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo più ad incubatori
con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 (Fig. 3.2.1 ) e terreni contenenti NaHCO3. In
soluzione acquosa il bicarbonato dissocia, va incontro ad idrolisi basica tende a riformare l’acido
debole di partenza) e poi si ha rilascio di CO2. La CO2 presente nell’incubatore tende a
controbilanciare questo aumento, mantenendo così il giusto pH del terreno. Quando non è
disponibile un incubatore a CO2 ,si può in alternativa utilizzare un tampone organico, come
l’HEPES; questo consente di mantenere le cellule nel terreno di coltura per periodi piuttosto lunghi
fuori dall’incubatore. Numerosi terreni commerciali sono dotati di un sistema tampone misto
HEPES\CO2 al fine di incrementare le capacità tamponanti del terreno. I terreni liquidi non
contengono antibiotici, siero ed L-glutammina, poiché molto instabili; questi vanno perciò aggiunti
prima dell’uso. La glutammina costituisce una delle fonti principali di carbonio per molte cellule in
coltura ed è in grado di fornire precursori per la biosintesi e per la sintesi proteica. Inoltre
costituisce un’importante fonte energetica mediante il ciclo di Krebs, insieme a glucosio e piruvato.
Il siero è una miscela complessa di proteine plasmatiche, come transferrina e albumina, fattori di
crescita, minerali e ormoni. Il siero di uso più comune nelle colture cellulari è il siero fetale di
bovino o vitello (FBS o FCS). Il siero umano è usato solo per particolari scopi e non è
commerciale. Spesso, tuttavia, al fine di ottenere elevata purezza, gli ibridomi vengono fatti
crescere in terreni con quantità ridotte di siero o serum-free anche se non sempre riescono bene a
svilupparsi o produrre l’anticorpo in tale mezzo.

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Figura 3.2.1- Incubatore a CO2

3.2.2 I metodi di coltura


Si possono crescere e mantenere ibridomi nelle colture i stazionarie, in
sospensione, o in perfusione.

 Nella coltura stazionaria (per esempio T flask), le cellule ed i terreni


non sono agitati.

 Nella coltura in sospensione (per esempio, roller bottles o splinner


flask), il mantenimento della sospensione è garantito dalla continua
agitazione delle cellule e dei mezzi. Ciò consente di fornire uno scambio
migliore di gas. Uno svantaggio potenziale delle colture in sospensione è
che alcuni ibridomi sono sensibili a forze di taglio (interazione del liquido
in movimento sulla cellula) che si sviluppa in una coltura agitata. Usando
questi metodi le concentrazioni massime di cellule non eccedono
generalmente il milione di cellule per ml, così da essere considerate
colture a bassa densità.

 Nelle colture a perfusione (per esempio, bioreattori a fibra cava),


tramite l’utilizzo di una membrana selettiva, le cellule vengono
mantenute in compatimenti separati dal serbatoio del terreno. Queste
sono continuamente perfuse dal terreno, ma non sono esposte a forze di
taglio. I sistemi a perfusione risultano più efficaci sia nel rifornimento di
sostanze nutrienti sia nella rimozione dei cataboliti. Si ottengono colture
ad alta densità che si avvicinano a 107-108 cells/ml.

 Nella coltura in serie, le cellule ed i terreni sono inoculati in coltura e


non sono maneggiati fino alla raccolta. La vitalità della coltura è limitata
dal consumo dei nutrienti o dall’accumulo di residui metabolici. Si può
usare la tecnica in serie nelle colture sia stazionarie che in sospensione.
La tecnica di alimentazione in serie consiste nella periodica aggiunta di
terreno fresco. Poiché le sostanze nutrienti sono continuamente
aggiunte, la durata della coltura ad alimentazione in serie è prolungata e
22
può essere sostenuta per parecchie settimane. La durata della coltura è
limitata dall’accumulo dei residui metabolici. Le cellule raggiungono una
concentrazione più alta che in una coltura in serie.

 Nella coltura continua, che consente alle cellule di rimanere vitali per
mesi, poiché non vi è un limite né dell’apporto nutritivo, né dell’accumulo
di cataboliti, il terreno fresco è aggiunto continuamente, mentre il
terreno esausto è rimosso con o senza le cellule. Il sistema a coltura
continua si può applicare sia a colture in sospensione che in perfusione.
Lo sviluppo degli ibridomi nella coltura continua in perfusione trae
vantaggio massimo da una cinetica di produzione di secondo ordine per
la maggior parte degli ibridomi: anche se una certa quantità di anticorpo
è prodotta durante la fase di crescita logaritmica cellulare, la maggior
parte dell’anticorpo anticorpo è prodotta quando le cellule si trovano
nella fase stazionaria, poiché non stanno consumando l'energia per la
replicazione.

La coltura di cellule animali è diventata il metodo d’elezione per la produzione


di anticorpi monoclonali ad uso farmaceutico. La rimozione delle cellule dal
mezzo contenente gli anticorpi è portata a termine mediante centrifugazione o
filtrazione e normalmente si fa anche un’ultrafiltrazione per concentrare il
filtrato, che viene poi sottoposto a diverse purificazioni di tipo cromatografico.
A seconda dell’utilizzo previsto, l’anticorpo può essere coniugato a specifiche
molecole “segnale”, come radionuclidi o tossine. Alla fine vengono aggiunti al
prodotto degli agenti stabilizzanti come tamponi, glicina o albumina. Il prodotto
viene poi liofilizzato e venduto confezionato in atmosfera di gas inerte.

23
3.2.3 Metodi in vitro
In base alle differenti linee cellulari di ibridoma coltivate in vitro, si può
riscontrare una vasta gamma di parametri nella produzione di mAb. Questa
risulta essere, per l'appunto, dipendente dalla linea cellulare dell'ibridoma, dal
metodo di coltura utilizzato, dal tipo di terreno utilizzato e dai protocolli usati.

3.2.3.1 Requisiti essenziali per la preparazione dei terreni di


coltura

La preparazione dei terreni di coltura richiede l’utilizzo di acqua bi distillata o


tridistillata (ancor meglio se prima deionizzata e poi bi distillata).
E’ importate sottolineare che tutti i procedimenti che coinvolgono le colture
cellulari , e di conseguenza anche la preparazione dei terreni, devono essere
necessariamente effettuati con materiale sterile utilizzando una cappa a flusso
laminare (fig.3.2.3.1) che consente di ottenere un ambiente sterile. La cappa a
flusso laminare viene utilizzata per proteggere sia il prodotto dalla

24
contaminazione che l’operatore. La protezione dell’operatore e’ assicurata
dalla barriera di aria frontale, in grado di impedire il passaggio di aerosol
dall’interno all’esterno dell’unita’ e viceversa.
Le pareti della cappa possono essere in acciaio inox o in cristallo temperato. Lo
schermo frontale, sempre in vetro, resistente agli UV, può essere inclinato per
facilitare la visione e la manipolazione all’interno dell’area di lavoro. E’ quasi
sempre previsto un pannello asportabile per la chiusura dell’apertura frontale,
su cui e’ in genere montata una lampada germicida UV per la sterilizzazione
della camera di lavoro durante la notte. La lampada UV e’ abilitata al
funzionamento solo quando il pannello di chiusura e’ posizionato correttamente
nella zona frontale della cabina.

Figura 3.2.3.1- Cappa per colture cellulari


La cappa possiede un flusso laminare
discendente che limita l’ingresso di
microrganismi.

3.2.3.2 Classificazione dei metodi in vitro

Diversi sono i metodi di coltura cellulare, essi possono essere distinti in:

 Colture cellulari, stazionarie, in matracci


Per colture stazionarie è possibile utilizzare matracci (T flask o fiasche) o
in alternativa piastre. Entrambe le tipologie di contenitori vengono
realizzate con particolari materie plastiche, previamente trattate al fine
di garantire la proliferazione e l’adesione cellulare sulla superficie. Esse
vengono inoltre commercializzate in confezioni sigillate e sterilizzate. Le
25
fiasche (T flask) per colture cellulari standard (fig.3.2.3.1a) sono
disponibili in una varietà di formati, con zone di crescita dai 12.5 cm 2 ai
300 cm2, e volumi variabili dai 5 ai 400 ml.. Le cellule ed i terreni
vengono seminati nelle fiasche e mantenuti in un incubatore a CO 2. E’
necessario mantenere la fiasca sdraiata su una delle facce maggiori
sulla cui superficie cresceranno le cellule. Le T flask sono caratterizzate
dalla presenza di tappi che possono essere mantenuti chiusi al di fuori
dell’incubatore o anche all’interno di incubatori a “secco”. Tuttavia e’
possibile acquistare fiasche i cui tappi sono dotati di un filtro, che
permette gli scambi gassosi pur mantenendolo chiuso, diminuendo cosi’
il pericolo di contaminazioni accidentali. La densità di semina iniziale
richiesta per la proliferazione delle cellule, al fine di ottenere un risultato
finale riproducibile e veloce, varia in relazione alle diverse linee cellulari;
il tempo fra la fine della proliferazione delle cellule, l'inizio del
decremento della vitalità cellulare ed il livello di massima produzione
dell'anticorpo è ibridoma dipendente.I tempi di incubazione sono di 7-10
giorni prima della raccolta. La concentrazione di mAb è tipicamente tra
10-100 µg/ml. Poco o nessun controllo è richiesto e il contenuto del flask
può essere raccolto quando il terreno vira al giallo (diventa acido) con
colonie di cellule vitali al 5-10% circa. Le fiasche sono di semplice utilizzo
e richiedono minima perizia tecnica. Sono relativamente economiche e
sono accatastabili, il che minimizza i requisiti di spazio all’interno
dell’incubatore. Lo svantaggio principale legato alle colture in fiasche è
che le concentrazioni di mAb ottenute sono notevolmente basse, con
una produzione di piccole quantità di mAb. Per tali ragioni i T flask
dovrebbero essere considerati solo per piccole produzioni di mAb, in
questo caso le concentrazioni basse di mAb sono soddisfacenti.

26
Figura 3.2.3.1a – Fiasche per colture cellulari
standard

Le piastre, utilizzate anch’esse per colture stazionarie, possono essere distinte


in piastre Petri e piastre multipozzetto (meglio conosciute come multiwell)
(figure 3.2.3.1a e 3.2.3.1b). Le prime sono generalmente rotonde le seconde, al
contrario, sono piastre quadrate suddivise in diversi pozzetti (da 6 a 96) a
volume variabile a seconda del numero di pozzetti. Nei pozzetti della piastra da
96 vengono di solito inoculati circa 200 μL di sospensione cellulare. Dal
momento che le piastre sono dotate di un coperchio non a tenuta, il rischio di
contaminazioni è maggiore, e pertanto queste richiedono una maggiore
manualità nel trattamento.

Figura 3.2.3.1 a- Piastre Petri Figura 3.2.3.1 b- Multiwells


da 6 e da 96 pozzetti

27
Colture cellulari in condizioni dinamiche

Condizioni di coltura dinamica, per la produzione di anticorpi


monoclonali, vengono realizzate attraverso l’utilizzo di spinner flask
(fig.3.2.3.1c-d) o roller bottles (fig.3.2.3.1e) . La coltura in spinner flask
viene realizzata per creare condizioni dinamiche che favoriscano
l’apporto uniforme di nutrimenti e ossigeno. Le concentrazioni di mAb
ottenute con questi due metodi sono in genere superiori rispetto alle
tecniche di coltura stazionarie, variando da circa 10-220 µg/ml e la
durata media della coltura è maggiore (circa 12 giorni). I volumi della
coltura sono tipicamente inferiori o uguali ai 2l. I vantaggi e gli svantaggi
sono simili a quelli descritti per i T flask, ma le roller bottles e gli spinner
flask richiedono uno spazio maggiore nell’incubatore e sono inoltre più
costose.

Figure 3.2.3.1. c-d – Spinner flask

28
Figura 3.2.3.1. e- Roller Bottles

Colture cellulari in Sacchetti Gas-Permeabili


I sacchetti gas permeabili sono in commercio: presterilizzati, flessibili, monouso
e permeabili al gas. Questi sacchetti sono di semplice utilizzo grazie alla
presenza di orifizi e tubi fissati con morsetti che permettono l’inoculazione di
cellule e terreni, sia in fase di produzione che in raccolta. Il sacchetto, inoculato
con le cellule ed il terreno, viene disposto all’interno di un incubatore a CO2 e viene
trattato come una coltura in serie. Il terreno viene raccolto alla concentrazione
plateau di mAb o quando la vitalità delle cellule cade al 10% circa (fig. 2.3.1 f).

Rispetto ai T flasks standard, i sacchetti hanno una maggiore superficie di


diffusione per l'ossigeno e la CO2, migliorando così l'ossigenazione delle cellule.
Non vi è un incremento della densità delle cellule
rispetto ai T flasks, ma sembra che vi sia una
produzione superiore di mAb per cellula, inoltre la
vitalità delle cellule è mantenuta per periodi di
tempo più lunghi. I sacchetti di coltura presentano
altri vantaggi rispetto alle piastre o le T flasks: i
sacchetti sono sistemi completamente chiusi, ciò
riduce la contaminazione microbica e possono
essere disposte orizzontalmente sul piano
dell'incubatrice o essere appese, riducendo così lo
Figura 3.2.3.1 f-
Sacchetto Gas- spazio richiesto.
Permeabile
Colture cellulari in bioreattori ad onda ( Wave
Bioreactor)

Il bioreattore ad onda (Wave bioreactor) è costituito da un sacchetto


(cell bag) plastico e flessibile, presterilizzato con radiazioni gamma e può
essere utilizzato una sola volta. Cellbag viene parzialmente riempito con
il mezzo di coltura e viene posta sull’unità di base del bioreattore. La
29
parte alta del sacchetto, priva di liquido, è aerata continuamente.
L'agitazione generata dal meccanismo di oscillazione permette il
trasferimento e la miscelazione dell’ossigeno. L'azione dell'onda aumenta
la superficie aria-liquido per il trasferimento dell'ossigeno, mescola il
liquido nel bioreattore e sospende le cellule con basse forze di taglio. Il
sacchetto è dotato di due filtri dell'aria, uno in ingresso e uno in uscita,
di una siringa per il campionamento e di un tubo connettore per
l’aggiunta ed il prelievo. Non è richiesto il flusso laminare né per le
eventuali aggiunte, né per le campionature. La velocità di oscillazione è
regolata da un pannello digitale; è presente una pompa d’aria elettrica
che mantiene il sacchetto aerato e richiede 2 bar di pressione. Quando
viene usato in sistemi ad alimentazione seriale, il volume del terreno può
essere aumentato gradualmente, con aumento contemporaneo della
densità cellulare. La densità raggiunta dalle cellule è di 7 x 106
cellule/ml.

CONFIGURAZIONE DEI SISTEMI WAVE

I sistemi Wave Bioreactor sono disponibili in diverse configurazioni che


consentono il controllo di alcuni parametri chiave. Questi possono essere
controllati dagli strumenti integrati in WAVE bioreactor e/o da strumenti
esterni, ossia da moduli WAVEPOD (disponibili con diverse funzionalità) e
autonomi. Per alcuni parametri, sono disponibili diverse opzioni di controllo. Ad
esempio il pH del mezzo di coltura può essere controllato mediante:

 il controllo on-line del pH attraverso la misurazione del pH e la


regolazione del pH con aggiunte di acidi e basi.

 Controllo indiretto del pH attraverso la regolazione della concentrazione


di CO2

SCHEDE TECNICHE RELATIVE AD ALCUNI MODELLI DI WAVE


BIOREACTOR

SCHEDA TECNICA SISTEMA WAVE BIOREACTOR 2/10

Un sistema WAVE BIOREACTOR 2/10 è costituito da:

- WAVE Bioreactor 2/10

- Supporto cellbag

- Cellbag presterilizzato mono uso

- Regolatore di perfusione
30
- Moduli strumenti esterni

Illustrazione di Wave Bioreactor 2/10

DESCRIZIONE
1 Unità di base Bioreactor
2 Pannello anteriore con comandi
3 Display LCD
4 Unità di oscillazione
5 Supporto Cellbag
6 Regolatore di perfusione (opzionale)

SCHEDA TECNICA SISTEMA WAVE BIOREACTOR 5/20

Un sistema WAVE BIOREACTOR 5/20 è costituito da:

- WAVE Bioreactor 5/20

- Supporto cellbag

- Cellbag presterilizzato mono uso

- WAVEPOD (opzionale)

- Moduli strumenti esterni (opzionale)

Illustrazione di Wave Bioreactor 5/20

31
DESCRIZIONE
1 Unità di base Bioreactor
2 Soffietti di protezione, meccanismo oscillante
3 Unità di oscillazione
4 Supporto Cellbag
5 Pannello a sfioramento rimovibile

SCHEDA TECNICA CELLBAG

Illustrazione cellbag:

DESCRIZIONE
1 Asta Cellbag
2 Linee di inoculazione/raccolta
3 Filtro dell’aria in uscita
4 Filtro dell’aria in entrata
32
5 Oxywell2TM
6 Punto di campionamento senza ago
7 Raccordo Luer di ricambio/sonda pH opzionale

SCHEDA TECNICA WAVEPOD

Il modulo strumento WAVEPOD integra la strumentazione associata


a Wave Bioreactor 20/50. Questo comprende i controlli di pH,
ossigeno disciolto e miscelazione dei gas di CO2/O2. Per ottenere la
funzionalità desiderata è possibile istallare contemporaneamente
in WAVEPOD fino a quattro moduli strumenti. WAVE Bioreactor può
essere azionato dal pannello a sfioramento di WAVEPOD.

Illustrazione WAVEPOD

DESCRIZIONE
1 Postazione 1- modulo pH
2 Postazione 2- modulo ossigeno disciolto (DO)
3 Postazione 3- modulo pompa aria
4 Postazione 4- moduli CO2e O2
5 Pannello a sfioramento

Sistemi di coltura CELLine

I dispositivi di coltura CELLine (figura 3.2.3.1g) sono basati su tecnologia di


compartimentalizzazione delle membrane. Le cellule ed i mAb secreti sono
mantenuti in uno scompartimento centrale di piccolo-volume, che è separato

33
attraverso una membrana semipermeabile da quello superiore di più grande
volume che contiene il terreno. Una membrana permeabile al gas sulla parte
inferiore dello

scompartimento delle cellule provvede all’ossigenazione ed allo scambio di


CO2. All’ingresso del compartimento contenente il terreno vi è un largo orifizio
con un tappo a vite ed un altro orifizio è posizionato all’ingresso dello
scompartimento delle cellule con setto a vite accessibile da una pipetta. I

Figura 3.2.3.1g- Sitemi di coltura CELLine: destrizione della tecnologia a


compartimentalizzazione
sistemi sono costruiti con polistirene trasparente, sono presterilizzati e
monouso. Il produttore segnala che se viene usato siero, i costi sono ridotti
considerevolmente perché il siero è presente soltanto nello scompartimento
delle cellule. Le cellule raggiungono alte densità, e le concentrazioni di mAb,
significativamente più alte, sono ottenute in un piccolo volume, rispetto ad
altre tecniche di coltura stazionarie. I sistemi sono facili da maneggiare e le
unità sono collegate ed accatastabili per minimizzare i requisiti di spazio
nell'incubatrice a CO2. Le cellule sono inoculate attraverso una pipetta nello
scompartimento delle cellule ed il terreno è versato nello scompartimento
centrale. Circa sette giorni dopo l’inoculazione, il terreno è rimosso dallo
scompartimento centrale del nutriente e una parte della sospensione cellulare
è raccolta dallo scompartimento. Il terreno fresco è aggiunto sia allo
scompartimento del terreno che a quello delle cellule. Questo processo è
ripetuto approssimativamente ogni tre giorni.

Colture cellulari in bioreattore miniPERM®

Figura 3.2.3.1h- Bioreattore miniPERM®

34
Il bioreattore miniPERM® (fig.3.2.3.1 h) è un minifermentatore modulare da
laboratorio, utilizzato per colture di ibridomi e altre linee cellulari, ideale per la
produzione di proteine e anticorpi. Questo è costituito da due compartimenti:
il modulo di produzione (40 mL) ed il modulo dei nutrienti (400 mL)
separati da una membrana da dialisi semipermeabile che consente il
trasferimento di gas e dei nutrienti, ma non consente il passaggio di cellule e
prodotti ad alto peso molecolare. In questo modo i nutrienti e i gas disciolti
passano dal modulo dei nutrienti a quello di produzione, così come i cataboliti
vengono trasferiti nel modulo dei nutrienti dove vengono diluiti. Dall’altra
estremità del modulo di produzione è presente una membrana in silicone gas-
permeabile per l’ottimale scambio di ossigeno e anidride carbonica. Sul
modulo di produzione sono presenti dei connettori che sono usati per
l'inoculazione delle cellule e l'accumulazione del campione. Il modulo dei
nutrienti è provvisto di tappo a vite con membrana integrata in grado di
equilibrare la pressione con l’esterno. Il bioreattore miniPERM®è fornito sia
nella versione sterile monouso, che nella versione in cui il modulo dei nutrienti
è autoclavabile e riutilizzabile (il modulo di produzione è sempre monouso).

Questo è progettato per ruotare su un dispositivo all'interno di un incubatore a


CO2 che mantiene le cellule nel modulo di produzione in sospensione ed agita
il mezzo nutriente per facilitare il passaggio delle sostanze nutrienti e dei
metaboliti attraverso la membrana di dialisi. Il miniPERM® è dotato di un
sistema di coltura ad alimentazione seriale con la possibilità di raccogliere
periodicamente il prodotto dal modulo di produzione. I vantaggi di questo
sistema includono: sviluppo delle cellule ad alte densità (107 cell/ml); alta
concentrazione di mAb; alta purezza del prodotto dovuta alla riduzione o alla
rimozione del siero dallo scompartimento nutriente; facilità di utilizzo; capacità
di effettuare le colture per un periodo di tempo relativamente lungo; capacità
di riutilizzare alcuni componenti. “miniPERM®” è adatto per colture contenenti
siero e colture serum-free.

Colture cellulari in bioreattori a fibra cava (HFB)

35
I bioreattori a fibra cava (fig. 3.2.3.1 i) originariamente sviluppati da
Knazek, sono apparati per colture cellulari, progettati per simulare il
sistema capillare in vivo, fornendo un ambiente simil-fisiologico alle
cellule coltivate. Consentono quindi di mantenere l’ibridoma in coltura
per lungo tempo. Grazie al continuo ricircolo del terreno di coltura e al
passaggio in un apparato per lo scambio gassoso, vengono garantiti un
costante apporto nutritivo, la rimozione di cataboliti ed il mantenimento
di valori ottimali di pH. Le concentrazioni di anticorpo ottenute sono
dell’ordine di grandezza di un liquido ascitico. È inclusa all'interno del
circuito del bioreattore una bottiglia di terreno; una pompa a velocità
variabile per mantenere un flusso di terreno continuo e unidirezionale;
una cartuccia HFB; e terreni che permettono lo scambio di ossigeno e
CO2. La maggior parte dei sistemi ha degli orifizi in cui sono presenti i
campioni di terreno per il monitoraggio. Le HFBs, il percorso del fluido e il
terreno, sono presterilizzati e monouso. Tutti i sistemi hanno un modulo
di controllo dello strumento per la regolazione della portata dei fluidi ed
un altro caratteristico per ogni sistema. I bioreattori consistono
tipicamente in fasci di fibre vuote posti in una cartuccia di plastica,
attraverso la quale i terreni di coltura perfondono continuamente nello
spazio intracapillare. Le cellule si sviluppano nello spazio extracapillare
che circonda le fibre. Le pareti delle fibre vuote servono da membrane
semipermeabili di ultrafiltrazione. Il cut-off, in base al peso molecolare, è
dato dalla dimensione del poro della membrana, il quale è abbastanza
ridotto da trattenere le cellule e lasciar passare il mAb che viene escreto
nello spazio extracapillare, mentre il gas, le sostanze nutrienti ed i residui
metabolici diffondo liberamente attraverso la membrana secondo le
differenze di pressione e le pendenze idrostatiche di concentrazione. Gli
orifizi di raccolta permettono l'accesso nello spazio extracapillare per
l’esame delle cellule e la raccolta di mAb.

36
Figura 3.2.3.1 h- Bioreattore a fibra cava

3.3 Metodi di mAb in vivo


La produzione degli anticorpi monoclonali può essere anche condotta
mediante iniezione degli ibridomi nella cavità peritoneale di ratti
istocompatibili (fig 3.3.1), che servono dunque da camera di
fermentazione vivente. Crescendo, le cellule di ibridoma trapiantate,
cominceranno a secerne l’anticorpo monoclonale nel liquido ascitico a
concentrazioni più elevate (1-25 mg/ml) rispetto ai metodi di coltura in
vitro. L’innesco nella cavità peritoneale è spesso realizzato attraverso
una iniezione intraperitoneale di pristano (0.1- 0.2 ml), un adiuvante
immunogenico, capace di indurre reazioni granulomatose e di interferire
con il drenaggio di liquido peritoneale. Di solito, 10- 14 giorni dopo
l’innesco, viene iniettata una sospensione di ibridomi nella cavità
peritoneale, ciò porta allo sviluppo di un tumore, ad accumulo di liquido
ascitico e a distensione addominale. In seguito all’accumulo di liquido è
necessario effettuare un immediato drenaggio ( volume di liquido non
superiore al 20 % del peso corporeo). Esso conterrà grandi quantità di
anticorpi antigene-specifici. Molti dei primi preparati di anticorpi
monoclonali venivano prodotti in questo modo, tra questi OKT-3, il primo
anticorpo monoclonale approvato per l'uso terapeutico dalla Food and
Drug Administration. Questo metodo, nonostante consenta di ottenere
elevate concentrazioni di anticorpo, presenta però degli svantaggi quali
l'alto costo e il fatto che il prodotto sia contaminato da significativi livelli
di lipidi ed altre sostanze presenti nel peritoneo del topo.

37
Figura 3.3.1

3.4 Recenti innovazioni produttive


E' stata messa a punto una tecnica più rapida per la produzione di
anticorpi monoclonali umani contro l'influenza, ma ora è allo studio la
creazione di anticorpi anche contro altre infezioni come antrace,
pneumococco e epatite C. Con questa nuova tecnica, i tempi di
produzione degli anticorpi monoclonali si sono ridotti a poche settimane,
contro i tre mesi necessari alla tecnica attuale. Quando l'organismo è
colpito da un agente infettivo, il sistema immunitario inizia a produrre
anticorpi ma solo una piccola parte di questi si lega all'agente patogeno e
lo neutralizza. Ed è questo problema che limitava la produzione di
anticorpi monoclonali con le tecniche tradizionali. La nuova tecnica è
stata messa a punto da un team di ricercatori della Oklahoma Medical
Research Foundation (OMRF) e della Emory University, diretti da Patrick
Wilson, J. Donald Capra e Jens Wrammert. Wilson ha spiegato: " Il
problema è che non si può identificare e scegliere in modo semplice le
cellule che producono gli anticorpi contro i patogeni che si vuole
combattere". Esiste un altro metodo più rapido, che consiste nel creare
anticorpi ibridi con cellule B, ma esiste il rischio di incompatibilità fra le
proteine di questi anticorpi ibridi e l'organismo. La nuova tecnica invece
consiste nell'isolamento di plasmacellule dal sangue di persone vaccinate
contro l'influenza, delle quali vengono poi clonati i geni per gli anticorpi.
Le plasmacellule sono l'elemento centrale della reazione iniziale ad
un'infezione o ad una vaccinazione, ma hanno una vita breve, di pochi
giorni. I ricercatori hanno trovato un modo per catturare le plasmacellule
circolanti poco tempo dopo la vaccinazione, intercettando quelle che
producevano anticorpi anti-influenza specifici, cioè circa l'80% delle
plasmacellule isolate. La risposta di questi anticorpi è molto rapida e
mirata e potrebbero essere prodotti anche a partire dalla risposta
immunitaria di persone che hanno un'infezione, anche cronica, in corso.

3.5 Vantaggi e limiti metodi in vivo ed in vitro.

38
Sin dagli anni ’80 ebbero grande sviluppo i metodi in vitro, un’ottima
alternativa tecnologica alla produzione di anticorpi monoclonali in ascite
di topo. Le colture cellulari sono più VELOCI e SPECIE-SPECIFICI, non
richiedono l’uso di animali e possono essere utilizzati in svariati campi di
applicazione (ricerca, diagnosi, terapia ecc). Tuttavia, i sistemi in vitro
valutano gli effetti di un composto in un ambiente isolato, privo di
influenze ormonali, immunitarie o neuronali, non consentendo, quindi, di
ricreare un ambiente che mimi le interazioni dell’intero organismo. Il
metodo in vivo, sebbene consenta di ottenere elevate concentrazioni
dell’anticorpo prodotto, risulta essere più veloce, poco costoso e facile
solo su piccola scala, ma all’aumentare della quantità di mAb da
produrre, il metodo in vitro può diventare competitivo nonostante gli alti
costi di ottimizzazione dati dalla selezione dei cloni e l’uso di terreni di
crescita addizionati di siero che rendono il prodotto finale più difficile da
purificare. Inoltre vi sono dei limiti alla produzione di mAB in ascite,
soprattutto se il prodotto è destinato all’uso umano. Nei topi, infatti, si
sviluppano spesso importanti anomalie clinico-patologiche come
conseguenza della crescita del tumore all’interno della cavità peritoneale
e dell’accumulo del fluido ascitico. La progressione delle anomalie è
ibridoma-dipendente; possono essere osservate profonde differenze fra
le linee cellulari, dovute allo sviluppo degli ibridomi o alla secrezione di
potenti sostanze bioattive secrete dall’ibridoma o dal topo.

4.TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Un problema alquanto rilevante per quanto concerne l'utilizzo degli


anticorpi monoclonali, è la loro suscettibilità al sistema immunitario
umano il quale li riconosce come agenti estranei, quindi da neutralizzare
e/o eliminare. Si è stimato che una singola iniezione di anticorpi
monoclonali murini provoca una risposta immunitaria nel 50-80% dei
pazienti, e si rileva la presenza di anticorpi umani anti murini (HAMA)
entro 14 giorni dalla somministrazione. Inoltre, frequenti
somministrazioni aumentano di gran lunga la risposta, anche negli
individui che si erano dimostrati insensibili alla prima dose.

Conseguentemente alla risposta HAMA avremo:

39
• clearance accelerata
• Riduzione efficacia anticorpi monoclonali
• preclusione di somministrazioni ripetute

L'unica plausibile soluzione al problema per ovviare a queste non


trascurabili conseguenze, è l' utilizzo di anticorpi monoclonali di origine
umana. I linfociti umani produttori di anticorpi possono potenzialmente
essere resi immortali per mezzo di EBV(epstain-Barr virus):è l'agente
eziologico della mononucleosi infettiva e ha la capacità di infettare
linfociti sia in vitro che in vivo inducendo cosi una trasformazione
neoplastica. Però, nonostante l'EBV sia capace di indurre trasformazione
cellulare, pochi linfociti B presentano il recettore di superficie per questo
virus, e quindi la maggior parte di essi risulta immune all'infezione.
Comunque anche dopo un'eventuale trasformazione, molti producono
anticorpi IgM a bassa affinità, e le cellule sono spesso instabili. Altre
possibili soluzioni ma pur sempre poco efficienti sono la fusione di
linfociti umani con linee cellulari linfoblastoidi umane o con cellule di
mieloma murino.

Fortunatamente la tecnologia del Dna ha portato ad una positiva


conclusione fornendo un incisivo metodo per ridurre l'immunogenicità
innata degli anticorpi monoclonali murini. La clonazione dei geni di tutti i
sottotipi di immunoglobuline umane ha permesso la produzione di vari
anticorpi ibridi ad immunogenicità ridotta. I limiti di natura murina dei
mAb sono stati superati smontando l'immunoglobulina murina,
conservando le regioni variabili murine ma utilizzando sequenze umane
per la parte costante, ottenendo cosi un anticorpo immunogenico, più
adatto per impieghi in vivo.

4.1 Anticorpi chimerici


Conservano la specificità di legame ma assomigliano maggiormente ad
un anticorpo umano naturale. Sono costituiti dalla fusione molecolare
della regione variabile del mAb murino con la regione costante di una IgG
umana. La molecola ibrida è risultata meno immunogenica del mAb di
partenza (la porzione murina rappresenta circa il 5% della molecola) e
più efficiente nell’interazione con il sistema immune umano, grazie alla
presenza di un dominio Fc di origine umana. Gli impieghi clinici dei mAb
chimerici hanno tuttavia evidenziato ancora un effetto antigenico,
imputabile alla regione variabile murina.

L'"ibridazione" degli anticorpi monoclonali di topo e di ratto è stata


ulteriormente sviluppata, rispetto alla formazione delle molecole
40
chimeriche appena viste, sostituendo negli anticorpi umani solo le CDR
(regioni determinanti la complementarietà) degli anticorpi monoclonali di
roditore. Poiché possiedono affinità di legame per l'antigene simile a
quella degli anticorpi monoclonali di roditore originali, gli anticorpi
"umanizzati" potrebbero dimostrarsi utili come agenti terapeutici.

L'umanizzazione degli anticorpi monoclonali umani si può realizzare così.


Partendo da una linea di ibridomi di roditore, si possono isolare i cDNA
per le catene L e H. La PCR servirà ad amplificare le regioni variabili di
tali cDNA. Gli inneschi oligonucleotidici adoperati per la suddetta
amplificazione sono complementari alle sequenze delle estremità 5' e 3'
del DNA che codifica le regioni variabili, dove le sequenze nucleotidiche
si conservano in grado elevato da un gene anticorpale all'altro. In base
alla sequenza nucleotidica dei cDNA delle regioni leggere e pesanti (VL e
VH) si possono delimitare i confini delle CDR. Di solito si stabilisce
immediatamente dove incominciano e terminano le CDR, giacché queste
regioni presentano sequenza altamente variabile, laddove la sequenza
delle regioni dell'intelaiatura tende relativamente a conservarsi. Sulla
base della sequenza dei DNA che codificano le CDR di roditore si
sintetizzano sei coppie di inneschi PCR oligonucleotidici. Ciascuna coppia
di inneschi è concepita per iniziare la sintesi del DNA di una delle CDR di
roditore: tre provenienti dalla catena L, tre dalla catena H. Inoltre ogni
innesco comprende alla estremità 5' 12 nucleotidi in più, complementari

41
alle regioni fiancheggiatrici interne al DNA dell'intelaiatura umana al
quale è indirizzato il DNA delle CDR di roditore.

Amplificazione delle sequenze di cDNA codificanti per le catene L e H ; le sequenze sono


fiancheggiate da 12 nucleotidi in più complementari al DNA umano.

A questo punto si utilizza la mutagenesi mirata agli oligonucleotidi per


sostituire, una alla volta, le sequenze DNA complete di ognuna delle CDR
umane con il DNA amplificato originante dai roditori. Così facendo, per
sostituire tutte le CDR occorrono sei cicli di mutagenesi mirata agli
oligonucleotidi. Il procedimento "trapianta", di fatto, le CDR di roditore
dentro l'intelaiatura dell'anticorpo umano. Successivamente si clonano i
cDNA delle regioni variabili umanizzati in vettori di espressione che
vengono poi introdotti in cellule ospiti idonee, di solito cellule di E. Coli o
di mammifero, in modo da produrre gli anticorpi. Con questa tecnica
sono già stati umanizzati oltre 50 anticorpi monoclonali diversi; la
tecnologia è senza dubbio efficace e diffusamente applicabile, tuttavia è
costosa e lunga. Una strategia promettente è comunque costituita da
genoteche combinatorie a espressione fagica, costruite con mRNA
42
provenienti da cellule B umane di donatori non immunizzati(phage
display).

Phage display:

1. le catene pesanti e leggere delle regioni variabili (rispettivamente


VH e VL) possono essere unite tramite un tratto di DNA sintetico che
codifica un peptide di connessione (linker). L’uso del linker impedisce la
dissociazione delle due catene, che altrimenti non sarebbero legate
covalentemente;
2. il costrutto viene quindi amplificato nuovamente con primer
contenenti siti di restrizione appropriati per la successiva digestione con
endonucleasi (Xbal, SFiI, NotI e IndIII ) e ligazione in un vettore fagico
adatto per l’esposizione, per esempio pGZ-1;
3. questo viene introdotto in cellule ospiti idonee, di solito cellule di
E. Coli o di mammifero, in modo da produrre gli anticorpi; questo vettore
consente sia l’espressione delle due catene, separate dal linker, sulla
superficie del fago, come prodotto di fusione con una proteina fagica
dell’involucro (gene III), sia l’espressione della proteina solubile. La
disponibilità della tecnologia del phage-display ha consentito di ottenere
anticorpi monoclonali interamente umani. La tecnologia del phage-
display è attualmente il metodo più diffuso per selezionare frammenti
anticorpali ricombinanti con elevata affinità.

43
1. Le sequenze codificanti per le catene H ed L, amplificate tramite
PCR, vengono tagliate con gli enzimi di restrizione SfiI e NotI ed
assemblate: le due sequenze sono separate da una regione
codificante per un peptide linker, che consente il giusto
orientamento dei frammenti.

2. Il costrutto viene inserito in un fagmide (pGZ-1), un vettore ibrido


derivato dalla fusione di fagi e plasmidi

3. Il costrutto viene fuso con l’estremità N-terminale del gene III del
fago, che codifica per 5 copie di una proteina del capside; in tal
modo si ha un fagmide di fusione. Oltre a codificare per il capside,
la pIII (geneIII) è essenziale per il riconoscimento del pilo batterico
(F) e del fago nella cellula ospite. La produzione dei fagi è garantita
44
da un fago helper selvatico che, coinfettando la stessa cellula,
fornirà proteine necessarie alla maturazione delle particelle
fagiche. A monte del costrutto è presente un peptide leader che,
in seguito a distacco, su intervento di una peptidasi codificata
dall’ospite lascia una nuova regione ammino terminale in cui
vengono esposte le sequenze dei peptidi ospiti.
4. Replicazione in E. coli.
5. Il fago entra nelle cellule di E. coli attraverso il pilo F. In seguito
alla replicazione, il DNA viene impacchettato nel capside ed
espulso attraverso la membrana di E. coli. Durante la trascrizione
dei geni del capside viene espresso anche il costrutto accoppiato al
gene III.
6. Una tripletta di basi amber che codifica per un codone di fine
traduzione TGA. La mutazione amber viene annullata in ceppi di E.
coli soppressori in cui esiste un tRNA che la riconosce come
codificante: una parte rilevante della traduzione del costrutto non
si arresterà in corrispondenza della mutazione e sarà così prodotta
la proteina di fusione In ceppi non soppressori, tuttavia, tutta la
traduzione si interromperà all’amber generando la sola proteina
anticorpale solubile.
In ceppi soppressori, il costrutto viene esposto sulla superficie del
fago M13, in fusione alla proteina III, creando una proteina
chimerica di fusione; la particella fagica viene selezionata in
funzione delle sue capacità d’interazione con una proteina target
(per questa ragione viene inserita la sequenza codificante per
l’anti-anticorpo o tag). Per la purificazione sono inserite sequenze
di sei istidine (his6) che, sono inserite per purificare per affinità su
colonne di Nickel.

5. PURIFICAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

Dopo aver ottenuto, un campione di ibridomi o un campione di liquido ascitico,


gli anticorpi desiderati devono essere estratti. I contaminanti presenti nel
campione di coltura cellulare possono essere principalmente componenti come
fattori di crescita, ormoni, e transferasi. Al contrario, il campione in vivo può
contenere gli anticorpi dell’ospite, proteasi, nucleasi, acidi nucleici e virus. In

45
entrambi i casi possono essere presenti altre secrezioni degli ibridomi come le
citochine. Può essere presente anche una contaminazione batterica e, di
conseguenza, endotossine secrete dai batteri. A seconda della complessità dei
mezzi necessari in coltura cellulare, e quindi contaminanti in oggetto, un
metodo (in vivo o in vitro) può essere preferibile agli altri.
Il campione a questo punto viene preparato per la purificazione.
Le cellule, detriti cellulari, lipidi, e materiale coagulato vengono prima rimossi,
in genere mediante filtrazione con un filtro da 0,45 micron. Queste particelle di
grandi dimensioni possono provocare un intasamento nelle fasi di purificazione
successive. Inoltre, la concentrazione del prodotto nel campione può non
essere sufficiente, soprattutto nei casi in cui l'anticorpo desiderato è quello
prodotto da una linea cellulare a bassa secrezione. In tal caso il campione
viene quindi condensato tramite ultrafiltrazione o dialisi .
Purificazione

I metodi di purificazione comprendono tecniche di precipitazione che sfruttano


le diverse caratteristiche degli anticorpi rispetto alle altre proteine e tali
processi di purificazione saranno più lunghi e costosi quando l’anticorpo
proviene dal liquido ascitico (a causa delle numerose proteine endogene
murine che questo contiene), rispetto a quello che proviene dalle colture in
vitro.

Per ottenere elevati gradi di purezza, cioè per quei anticorpi di uso clinico sono
necessari due o più strategie di purificazione ed esse vanno scelte in funzione
delle proprietà specifiche dell’anticorpo ed al bilancio tra velocità, risoluzione,
capacità e recupero.

46
1) Tecniche di precipitazione, separa gli anticorpi in base al grado di
solubilità a diverse concentrazioni saline
2) gel filtrazione, che separa gli anticorpi in base alle dimensioni
3) cromatografia a scambio ionico, che sfrutta le differenze di carica tra
le Ig e le altre proteine;
4) cromatografia d'affinità, che sfrutta le specifiche interazioni tra
anticorpo e ligando.

5.1 Tecniche di precipitazione

Alcuni sali, solventi e polimeri organici provocano la precipitazione di Ig in soluzione,


formando così un aggregato visibile insolubile che è recuperato tramite
centrifugazione e successivamente risospeso nel tampone appropriato. Le Ig in
soluzione sono circondate da uno strato di idratazione strettamente legato, perturbato
dalle tecniche di precipitazione. Queste sono solubili in un range di valori di
concentrazione salina, ma diventano insolubili a valori più alti o più bassi. Le alte
concentrazioni saline allontanano lo strato di idratazione della proteina, favorendo
l'interazione delle parti idrofobiche delle Ig con regioni simili delle altre molecole,e
quindi causando un “raggruppamento di molecole” e la loro precipitazione.

47
Questo fenomeno, detto salting-out, consente la precipitazione reversibile degli
anticorpi monoclinali; in questa tecnica gli ioni più efficaci sono gli anioni a carica
multipla insieme a cationi monovalenti; i più usati sono solfato d'ammonio e di sodio.
Si può anche usare, in maniera analoga l’ acido caprilico( ottanico) che viene utilizzato
soprattutto per Ig provenienti da siero e liquido ascetico, ma a differenza del solfato di
ammonio, l’acido caprilico non concentra le immunoglobuline che quindi rimarranno in
soluzione.

La precipitazione delle immunoglobuline tende ad essere più efficiente al punto


isoelettrico in quanto si riduce al minimo la repulsione elettrostatica tra le molecole.
Le tecniche di precipitazione sono economiche e di facile esecuzione, ma spesso
vengono utilizzate solo come passo preliminare in un protocollo di purificazione a più
passaggi, perchè il prodotto non è sufficientemente puro.

Inoltre le tecniche di precipitazione sono influenzate dalla temperatura, pH e


concentrazione del campione. Questi parametri devono essere controllati per garantire
la riproducibilità dei risultati.
La maggior parte delle tecniche di precipitazione non sono adatti per la preparazione
su larga scala.
Non tutte le proteine sono facili da riportare in soluzione, il rendimento può quindi
essere ridotto.

La risolubilizzazione delle proteine

Molte proteine sono facilmente risolubilizzate in una piccola quantità di buffer da


utilizzare per il
successivo step cromatografico. Tuttavia, può essere necessario un agente di
denaturazione per proteine meno solubili. Questi agenti devono sempre essere rimossi
48
per consentire completo ripiegamento delle proteine e di massimizzare il recupero di
massa e di attività.

5.2 Gel filtrazione

Meccanismo: una colonna di particelle di gel è in equilibrio con un solvente


adatto alle molecole da separare. Le molecole più grandi, completamente
escluse dai pori, rimangono nel volume vuoto (o volume escluso) e passano
attraverso gli spazi interstiziali, mentre le molecole più piccole si distribuiscono
nel solvente presente sia all'interno sia all'esterno del setaccio molecolare e
attraversano quindi la colonna a velocità più bassa.

Per ciascun tipo di gel il coefficiente di ripartizione Kd (tra il solvente interno e


quello esterno al gel) di un determinato soluto è funzione del peso molecolare
del soluto stesso. Se la molecola del soluto è così grande da essere esclusa dal
solvente interno al gel, Kd è uguale a 0 e la parti-cella, non trattenuta, viene
fluita. velocemente Se invece il soluto è abbastanza piccolo da essere
liberamente permeabile alle particelle di gel, Kd = 1 (cioè la particella
partiziona egualmente tra interno ed esterno).

E' proprio la variabilità di Kd tra questi due estremi che rende possibile, nei vari
gel, la separazione di soluti in un ristretto campo di pesi molecolari.

49
Le matrici usate comprendono destrani a legami crociati, legami ottenuti da
reazione con epicloridrina (Sephadex), agarosio (Sepharose, Bio-Gel A,
Savagac), poliacrilammide (Bio-Gel P), poliesteri, gel di silice,
poliacrilomorfolina e polistireni.

Queste matrici funzionano sotto forma di gel idratato, ma spesso sono vendute
sotto forma di polvere secca, che deve essere idratata prima di impaccare la
colonna. L’idratazione si ottiene in genere mescolando una parte di polvere con
dieci di soluzione tamponata, e lasciando che la matrice assorba tampone per
parecchie ore, mescolando di tanto in tanto.

L’impaccamento della colonna si ottiene, in estrema sintesi, sospendendo la


matrice in tampone ed aggiungendola delicatamente all’interno della colonna.
Il rubinetto d’uscita deve essere aperto, così che ci sia flusso di liquido nella
colonna mentre la resina decanta e si assesta (dopo avere versato tutta la
matrice, si continua ad aggiungere tampone).E’ importante effettuare
l’impaccamento in un’unica fase ed evitare di intrappolare bolle d’aria nel gel,
per evitare variazioni nella uniformità della matrice.

50
Risoluzione: nella gel filtrazione, la risoluzione dipende dalle dimensioni delle
particelle di gel, dalle dimensioni dei pori, dalla lunghezza e dal diametro della
colonna e dal volume del campione, che in questo sistema è particolarmente
critico. Generalmente si consiglia di usare volumi di campione <5% del volume
totale della resina impaccata.

La gel filtrazione separa le molecole in base alle dimensioni e di solito si usa


secondo metodi convenzionali o in HPLC. La sola gel filtrazione non è molto
efficace per la purificazione di IgG, ma può essere impiegata a questo scopo in
combinazione con altri metodi, come la cromatografia a scambio ionico.

5.3 Cromatografia a scambio ionico

In questo tipo di cromatografia, l’adsorbimento delle particelle sulla fase


stazionaria è determinato da interazioni di tipo elettrostatico (gruppi con
cariche di segno opposto). Le proteine, possiedono gruppi ionizzabili e il fatto
che essi possano portare una carica netta positiva o negativa può essere
utilizzato nella separazione di miscele che li contengano. La carica netta che
questi composti presentano dipende dal loro pK e dal pH della soluzione
secondo l'equazione di Henderson-Hasselbalch.

51
Negli scambiatori anionici (come la DEAE nello schema a lato) la resina espone
gruppi carichi positivamente (in generale, gruppi basici) che attraggono
molecole cariche negativamente, e ne favoriscono l’adsorbimento sulla fase
solida, mentre le molecole neutre o cariche po-sitivamente vengono eluite nel
tempo morto della colonna. Gli scambiatori cationici possiedono invece gruppi
carichi negativamente (acidi) e attraggono, quindi, molecole cariche
positivamente.

Si parla anche di scambiatori ‘forti’ o ‘deboli’, in riferimento al pK dei gruppi


carichi attaccati alla resina: uno scambiatore forte ha un pK molto alto (per le
basi) o molto basso (per gli acidi), tale per cui rimane ionizzato in un largo
intervallo di pH.

La conoscenza delle caratteristiche di anticorpi e frammenti aiuta notevolmente


nella
scelta delle condizioni corretta purificazione, soprattutto per quanto riguarda
l'eliminazione
di contaminanti noti.

52
Se il P.I. dell'anticorpo è sufficientemente diverso da quello dei
contaminanti,possiamo minimizzare la contaminazione utilizzando uno
scambiatore cationico(carica negativa) ad un pH sopra il pI delle impurità e
inferiore a quello degli anticorpi. Questo assicurerà che l’anticorpo (carica
positiva) si leghi alla colonna e le impurità (a carica negativa, acidi nucleici e
endotossine) passino attraverso.

Più alta è la forza ionica, maggiore è la competizione degli ioni in soluzione con
la proteina. Per questo, solitamente le proteine vengono eluite in gradiente di
pH oppure di forza ionica: a seconda della loro carica netta complessiva più o
meno elevata, proteine diverse scenderanno in punti diversi del gradiente.

Molti scambiatori ionici sono costituiti da matrici di cellulosa modificata


chimicamente: ad es. la carbossimetilcellulosa (CM-cellulosa) e la DEAE-
cellulosa. Analoghi ai derivati della cellulosa sono i derivati del destrano e
dell'agarosio (Sephadex e Sepharose). Questi scambiatori sono affini ai
53
materiali impiegati nella gel filtrazione e presentano quindi limiti d'esclusione.
Pertanto uniscono al processo di scambio ionico quello di filtrazione
molecolare, migliorando così la risoluzione complessiva soprattutto nella
separazione di proteine ad elevato peso molecolare e di acidi nucleici. Vice
versa, per la separazione di molecole piccole sono preferibili supporti poco
porosi o con bassi limiti di esclusione.

Resina Supporto Gruppo funzionale Tipo

DEAE Sepharose Agarosio - Scambio


(Pharmacia) CH2CH2N+H(CH2CH3 anionico
)2 (debole)
DEAE Bio-Gel A (Bio-Rad)
dietilaminoetil (DEAE)

QAE Sephadex C50 Destrano Dietil-(2-idrossipropil) Scambio


(Pharmacia) aminoetil (un ammina anionico (forte)
quaternaria)

CM Sepharose (Pharmacia) Agarosio -CH2COO- Scambio


cationico
Carbossimetil
(debole)

SP Sephadex C50 Destrano -(CH2) 3SO3- Scambio


(Pharmacia) cationico (forte)
Sulfopropil

54
Nella scelta di una resina per lo scambio ionico è opportuno considerare anche
la forma ionica (cioè, qual è il controione normalmente presente nella fase
stazionaria) e la dimensione delle particelle. Molte resine per scambio ionico
sono disponibili in diverse forme ioniche, ed è possibile convertire una forma
ionica nell’altra (‘scambiare’ il controione). Diversi controioni avranno diverse
affinità per una resina, e sarà quindi più o meno facile per le molecole del
campione spiazzare questi controioni per legarsi.

I sistemi di cromatografia a scambio ionico sia convenzionali che HPLC o FPLC


(fast protein liquid chromatography) utilizzano la carica superficiale delle Ig per
separarle dalle altre componenti. A ph neutro, la maggior parte delle Ig ha
carica negativa, quindi legherà matrici anioniche con carica positiva. Queste
possono poi essere eluite dalla matrice innalzando la concentrazione salina o
variando il valore di ph del tampone.

5.4 Cromatografia di affinità

La purificazione tramite cromatografia d'affinità non si basa sulle differenze


nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni
altamente specifiche delle molecole biologiche.

Per questo la cromatografia d'affinità è in grado, almeno in teoria, di


raggiungere una purificazione completa in una singola tappa, anche partendo
da miscele complesse.

Questa tecnica sfrutta l’interazione specifica ma reversibile, tra l’anticorpo da


purificare e un ligando attaccato covalentemente ad un supporto inerte.

Nel caso degli anticorpi monoclonali il ligando è un antigene, oppure una


proteina che lega anticorpi (molti ceppi batterici producono proteine che
legano mAb).

55
Se, in condizioni sperimentali corrette, si introduce in una colonna contenente il
ligando la miscela contenente il composto da purificare, solo quel composto si
legherà alla colonna, mentre gli altri componenti, rimasti nella fase mobile, si
potranno rimuovere con un semplice lavaggio. Il componente interessato sarà
poi recuperato rimuovendolo dal ligando con un'opportuna eluizione.

La tecnica è quasi esclusivamente preparativa e necessita di accurate


conoscenze sulla struttura e sulla reattività della molecola da separare, tali da
permettere la scelta di un giusto ligando.

La matrice ideale da utilizzare nella cromatografia


di affinità deve possedere le seguenti
caratteristiche:

- contenere gruppi reattivi numerosi ed essere


stabile nelle condizioni in cui avviene l’attacco;

- essere stabile nelle condizioni di interazione della


macromolecola e nella successiva eluizione;

- non adsorbire aspecificamente altre


macromolecole

- possedere buone capacità di flusso.

56
In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente costituite da
derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio (Sepharose 4B e 6B, Bio-Gel
A), gel di poliacrilammide (Bio-Gel P) e cellulosa.

Adsorbimento ed eluizione.

La colonna cromatografica viene impaccata con la matrice a cui è legato il


ligando; quindi viene equilibrata con un tampone che favorisce il massimo di
interazione con l’anticorpo da purificare. Una volta applicato il campione, la
colonna viene lavata con lo stesso tampone (per allontanare i composti
contaminanti legati aspecificamente) prima di operare l’eluizione vera e
propria, che può essere specifica o aspecifica.

Tabella 5.1 Condizioni per l’eluizione di anticorpi da colonne d’affinità

Condizioni di eluizione Modalità d’azione

Glicina-HCl, pH 2,2-2,8 Modifica la conformazione e distrugge


le interazioni elettrostatiche

2-8 M urea Fortemente denaturante

57
5-6 M guanidina cloridrato

3,5 M sodio tiocianato


*
4 M potassio tiocianato Agenti caotropici
2-5 M MgCl2, KI, NaI

50% etilenglicole, pH 11,5 Distrugge le interazioni idrofobiche


10% (v/v) diossano a pH acido

Nell’eluizione aspecifica, la macromolecola può essere staccata dalla fase


stazionaria cambiando il pH o la forza ionica: una variazione di pH provoca una
dissociazione dei gruppi del ligando o della macromolecola coinvolti nel loro
attacco; una variazione della forza ionica, non necessariamente accompagnata
da una di pH, provoca anch'essa un'attenuazione del legame tra proteina e
ligando; solitamente si usa a questo scopo NaCl o sali caotropici, o ancora
guanidina e urea; si hanno però problemi di denaturazione della proteina.
Anche la modificazione della temperatura provoca una eluizione aspecifica, in
quanto la sua diminuzione tende a ridurre le interazioni idrofobiche.

L’eluizione specifica si ha per aggiunta di substrato o inibitori reversibili oppure


per aggiunta di composti dotati di maggiore affinità per il ligando. La glicina in
HCl a pH 2-3 è l'eluente di elezione ad esempio per rompere l'interazione
antigene-anticorpo, in questo caso l'anticorpo viene denaturato
reversibilmente. Un altro metodo di eluizione comporta l'aggiunta di ligando
libero, ma questa soluzione può essere molto costosa e se il legame è piuttosto
forte possono essere necessarie elevate concentrazioni di ligando libero. Il
materiale così eluito conterrà anche gli agenti impiegati per l'eluizione che
dovranno essere successivamente rimossi. I problemi più rilevanti derivanti da
questo tipo di cromatografia riguardano la bassa capacità degli adsorbenti, il
ruolo dei legami aspecifici, la scelta del gruppo chimico da legare (tra un
ligando di maggiori dimensioni e uno di minori dimensioni è più opportuno
scegliere quello di maggiori dimensioni) e la stabilità del legame ligando-
matrice o ligando-braccio spaziatore, che è relativa e determina una
progressiva perdita di ligando.

*
Gli agenti caotropici sono usati per ottenere la disgregazione della struttura cellulare; in questo caso ci riferiamo alla
struttura proteica
58
6. APPLICAZIONI TERAPEUTICHE

6.1 Applicazioni terapeutiche anticorpi monoclonali


Gli anticorpi monoclonali rappresentano degli importanti strumenti in campo
biochimico e terapeutico: costituiscono la più grande categoria di sostanze
biofarmaceutiche attualmente in studio. I primi studi si sono concentrati sul
loro uso nel campo della diagnostica per immagini(come agenti traccianti)e in
terapia, in particolare in campo oncologico,con risultati chiaramente positivi nel
trattamento del melanoma, carcinoma del colon, leucemia e linfomi, ma oggi i
preparati di anticorpi monoclonali sono utilizzati in svariati campi della
medicina.
59
6.2 Terapia anticancro
La comparsa di una massa tumorale è normalmente associata ad un aumento
dell’espressione di antigeni di superficie riconosciuti come estranei dal sistema
immunitario dell’organismo ospite. I principali elementi che costituiscono
quest’ultimo sono:

 Linfociti T in grado di riconoscere e distruggere le cellule maligne

 Cellule Natural Killer (NK) che inducono la lisi delle cellule tumorali

 Macrofagi capaci di distruggere le cellule tumorali, soprattutto mediante


il rilascio di enzimi lisosomiali e di citochine tra cui la TNF(tumor necrosis
factor).

 Anticorpi che mediante il legame con gli antigeni di superficie marcano le


cellule tumorali per la distruzione.

La target therapy (terapia mirata),in campo oncologico, ha rivoluzionato


l’approccio alla malattia. In particolare l’anticorpo monoclonale è capace di
riconoscere e reagire con una cellula tumorale presente tra oltre 100000
cellule sane vicine, quindi è possibile portare l’agente antineoplastico
direttamente sulla cellula cancerosa: la produzione di anticorpi capaci di legarsi
selettivamente al tessuto tumorale, in seguito all’identificazione di specifici
antigeni presenti sul tumore, riduce la tossicità e ne aumenta l’efficacia, ma lo
spettro d’azione è limitato a quelle neoplasie che dipendono da specifiche
alterazioni molecolari. Il riuscire a colpire la cellula tumorale in modo specifico
rappresenta un’importante speranza per migliorare la prognosi e la qualità
della vita del paziente,riducendo gli effetti collaterali causati nel corso della
chemioterapia sistemica. E’ importante precisare che l’applicazione di queste
tecniche non è facile,anche perché ogni paziente andrebbe trattato con uno
specifico anticorpo monoclonale, considerando che gli epitopi espressi dalla
cellula neoplastica variano nei diversi soggetti.

La distruzione delle cellule tumorali mediata da anticorpi avviene mediante più


meccanismi sia diretti che indiretti:

 Il legame alla cellula tumorale da parte dell’anticorpo può indurre una


risposta infiammatoria provocando la distruzione della cellula tumorale
da parte del sistema immunitario. Le cellule NK (natural killer) e i
macrofagi esprimono recettori di superficie che si legano alla porzione Fc
dell’anticorpo; questo cosi, una volta legato all’antigene tumorale,dirige
questi elementi del sistema immunitario direttamente alla superficie del

60
tumore inducendo una risposta citotossica anticorpo mediata(ADCC
Antibody Dependent Cell Cytotoxicity).

 Gli anticorpi inoltre attivano il complemento, che è in grado di lisare le


cellule tumorali direttamente (CDC Complement Dependent Cytotoxicity).

 Un altro meccanismo diretto è dovuto alla capacità dell’anticorpo


monoclonale di indurre apoptosi.

 L’anticorpo monoclonale può legarsi a un fattore di crescita critico o a un


recettore per un fattore di crescita, interferendo così con la crescita o
regolazione della cellula tumorale.

 L’impiego di anticorpi anti-idiotipo, in grado di mimare l’antigene


tumorale, può indurre un’attiva risposta immunitaria antineoplastica. Gli
anticorpi anti-idiotipo sono diretti contro regioni variabili uniche (idiotipi)
di altri anticorpi. Le regioni variabili degli anticorpi anti-idiotipo che
riproducono siti antigenici tumorali, possono essere utilizzati come
vaccini contro l’antigene in oggetto, per stimolare la risposta anticorpale.

Gli anticorpi monoclonali nella terapia anti-cancro possono essere utilizzati


come tali (interessanti per l’assenza di effetti di tossicità) o coniugati a
molecole tossiche quali tossine (che vengono internalizzate per endocitosi e
rese disponibili all’interno della cellula cosi da poter esplicare il loro effetto
tossico), radioisotopi (principale applicazione è quella della diagnostica per
immagini), nonché farmaci che verranno dunque rilasciati selettivamente al
tumore. E’possibile infatti accoppiare chemioterapici antitumorali (adriamicina,
amminopterina, metotrexato e alcaloidi della vinca) ed anticorpi monoclonali
specifici per le proteine situate sulla superficie delle cellule tumorali, ma solo
un numero limitato di molecole può essere coniugato ad ogni anticorpo. In
alternativa è possibile somministrare, ad esempio per via iniettiva, pro-farmaci
inattivi, che vengono attivati solo alla superficie del tumore grazie ad enzimi
che verranno accoppiati all’anticorpo monoclonale diretto contro antigeni
specifici sulla superficie della cellula bersaglio. Questo metodo è stato
chiamato Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) o Antibody-
directed catalysis (ADC). Chiaramente, trattandosi di un meccanismo di natura
catalitica, verranno attivate molte molecole del pro-farmaco in questione e
molti degli agenti citotossici-attivi rilasciati nella superficie del tumore
entreranno nelle cellule tumorali per diffusione semplice o per trasporto attivo
mediato da carrier. I profarmaci usati dovranno essere poco costosi,
biodisponibili, stabili alla degradazione chimica/enzimatica in vivo, mentre gli
enzimi attivatori dovranno essere stabili in condizioni fisiologiche, manifestare
un ragionevole numero di turn over in vivo e avere attività indipendente da
cofattore.

61
Finora sono stati approvati una decina di prodotti a base di anticorpi
monoclonali, di uso esclusivamente ospedaliero, come agenti terapeutici
anticancro. Il primo è stato il RITUXIMAB (MABTHERA®),approvato dalla FDA
per il trattamento dei linfomi non Hodgkin (1997); in seguito sono stati
approvati IBRITUMOMAB-ITTRIO90 (ZEVALIN®) e TOSITUMOMAB-IODIO131
(BEXXAR®) nel 2003. Il GEMTUZUMAB (MYLOTARG®) è stato approvato nel
2000 per la leucemia mieloide acuta e nel 2001 è stato approvato
l’ALEMTUZUMAB(MABCAMPATH®) per la leucemia linfocitica cronica. Uno solo
al momento è stato approvato per la cura del carcinoma mammario
metastatico, il TRASTUZUMAB(HERCEPTIN) nel 1998, mentre diversi sono quelli
approvati per il trattamento del cancro colon-retto: CERUXIMAB (ERBITUX®)
nel 2004 e PANITUMUMAB (VECTIBIX®) nel 2006.

6.3 Anticorpi anti-cd 20


RITUXIMAB (Mabthera®)-CHIMERICO

E’ un anticorpo monoclonale chimerico murino/umano costituito da una


immunoglobulina glicosilata le cui regioni costanti sono di origine umana
(IgG1kappa), mentre quelle variabili della catena leggera e di quella pesante
sono di origine murina. Rituximab è diretto contro l’antigene transmembranico
CD20, una fosfoproteina non glicosilata presente sui linfociti pre-B e sui linfociti
B maturi. L’antigene viene espresso su oltre il 95% dei linfomi non Hodgkin a
cellule B. Esso si trova nelle cellule B normali e neoplastiche ma non è presente
sulle cellule staminali emopoietiche, sulle cellule pro-B, sulle plasmacellule
normali, o su altri tessuti normali;non viene internalizzato dopo il legame con
l’anticorpo, non circola libero nel sangue e quindi non compete con il legame
degli anticorpi. Il Rituximab agisce attaccando sia i linfociti B maligni e sia
quelli normali ma, poiché l’organismo è in grado di sostituire rapidamente
quelli danneggiati, si riduce il rischio di effetti collaterali da linfocitopenia o
comunque si rendono più tollerabili. Il legame dell’anticorpo alla proteina
bersaglio determina la lisi dei linfociti B, e ne blocca la crescita patologica. Il
dominio Fab del rituximab si lega all’antigene CD20 sui linfociti B e il dominio
Fc può attivare le funzioni effettrici del sistema immunitario. I meccanismi
possibili della lisi cellulare mediata dall’effettore comprendono la citotossicità
complemento-mediata (CDC) e la citotossicità anticorpo dipendente(ADCC)
che, come abbiamo visto precedentemente, prevede l’attacco alla cellula
neoplastica tramite il frammento Fc e l’attivazione di cellule natural killer (NK).
Si è anche dimostrato che il legame di rituximab all’antigene CD20 sui linfociti
B induce la morte cellulare per apoptosi. E’stato approvato dalla FDA nel
1997,disponibile in Italia dal 1998 per il trattamento dei linfomi non-Hodgkin
follicolari in stadio avanzato, resistenti alla chemioterapia, o nei casi di recidiva
tumorale dopo chemioterapia. E’ indicato anche nel trattamento del linfoma
62
non-Hodgkin, CD20 positivo, diffuso a grandi cellule B, in associazione a
chemioterapia. Gli studi clinici, volti a valutare la percentuale di risposta al
tumore,il follow-up della durata della risposta e l’intervallo prima della
progressione della malattia, hanno dimostrato che MABTHERA® ha un buon
profilo di tollerabilità, accompagnato da un tasso di risposta positivo e da una
durata della risposta sufficientemente prolungata. Si è evidenziata una
percentuale di risposta globale nella popolazione del 48%, mentre nei pazienti
precedentemente trattati con trapianto di midollo osseo, la risposta globale è
stata del 78% contro il 43% dei pazienti non sottoposti a trapianto; la
combinazione rituximab più chemioterapia piuttosto che la sola chemioterapia,
aumenta la percentuale di risposta del tumore con un significativo
prolungamento della sopravvivenza senza progressione della patologia. I
pazienti sono stati randomizzati a ricevere CHOP (ciclofosfamide,
doxorubicina,vincristina,prednisone)oppureCHOP+rituximab.
Dopo un anno l’83% dei pazienti che avevano ricevuto CHOP + rituximab erano
sopravvissuti rispetto al 68% di coloro che avevano assunto solo CHOP.
Inoltre ad un anno il 69% del gruppo CHOP + rituximab era libero da malattia
contro il 49% dei pazienti del gruppo CHOP. La soluzione di MABTHERA®
preparata per l’infusione è chimicamente e fisicamente stabile per 24h a
temperatura compresa tra 2 e 8 °C, ma dal punto di vista microbiologico deve
essere utilizzata immediatamente. Si somministra per infusione endovenosa
tramite un deflussore dedicato, in un ambiente con immediata disponibilità di
strutture per la rianimazione. Poichè alcuni pazienti potrebbero sviluppare una
reazione allergica al farmaco, la prima dose di rituximab viene somministrata
molto lentamente al fine di ridurre tale rischio.

Nel marzo 2001, la Roche, industria farmaceutica che commercializza il


rituximab in Europa, ha comunicato di aver ricevuto 20 segnalazioni di gravi
reazioni avverse mucocutanee con 8 decessi (sindrome di Stevens-Johnson,
necrolisi tossica epidermica, pemfigo paraneoplastico). Inoltre esso dovrebbe
essere usato con cautela in pazienti con patologie cardiovascolari, in quanto
sono stati riportati casi di riacutizzazione di angina, aritmie e scompenso
cardiaco. Effetti collaterali legati all’infusione (inclusa la sindrome da rilascio di
citochine) sono stati riportati di frequente e includono febbre, nausea, vomito,
reazioni allergiche. I pazienti con elevata massa tumorale o con elevato
numero di cellule neoplastiche circolanti,possono essere esposti ad un rischio
maggiore di sindrome da rilascio di citochine particolarmente grave,
caratterizzata da dispnea, broncospasmo, ipossia, oltre che da febbre, orticaria,
angioedema. In alcuni pazienti, dopo il primo ciclo di MABTHERA® si
sviluppano anticorpi antichimerici umani (HACA): la loro presenza può essere
associata ad un peggioramento delle reazioni infusionali o allergiche, nel corso
dei cicli successivi. Segnalati anche casi di neutropenia tardiva e di grave
tossicità cutanea. Studi di farmacocinetica su pazienti con linfoma non-
Hodgkin, trattati con una singola dose di rituximab nel range 10-500 mg/m 2 di
63
superficie corporea,hanno indicato che i livelli sierici e l’emivita di rituximab
sono stati proporzionali alla dose (nei pazienti trattati con rituximab 375
mg/m2, l’emivita media è stata di 76,3 h dopo la prima infusione e di 205,8 h
dopo la quarta). La media della Cmax dopo la prima infusione è stata di 205,6 e
464,7µg/mL , rispettivamente, con concentrazioni sieriche di rituximab
statisticamente molto più elevate nei pazienti responsivi rispetto a quelli non-
responsivi.

6.4 Anticorpi radioconiugati-radioimmunoterapia

La radio immunoterapia è un metodo moderno per il trattamento mirato di


determinati tipi di neoplasie come i linfomi non-Hodgkin. Infatti ancora oggi,
nonostante l’avvento di nuovi e più efficaci farmaci citotossici e di nuove
strategie terapeutiche, la gestione del paziente affetto da linfoma rimane un
evento difficile e complesso, con un elevato numero di pazienti che sfugge alla
capacità di controllo terapeutico della malattia, andando incontro a recidiva o
morte. L’elevata radiosensibilità ed immunogenicità del linfoma lo rendono
particolarmente adatto al trattamento con anticorpi monoclonali impiegati
come vettori di agenti citolesivi, quali i radionuclidi, e aprono nuove e
interessanti prospettive nelle applicazioni di tecniche radioimmunoterapiche.
La radio immunoterapia determina la distruzione delle cellule neoplastiche
attraverso due distinti meccanismi fisiopatologici. Il primo, innescato dalla
reazione antigene-anticorpo, prosegue con l’internalizzazione dell’anticorpo
radioattivo all’interno della cellula tumorale e conseguente danneggiamento
del DNA .Il secondo, di natura aspecifica, sfrutta l’emissione radioattiva
indiretta sulle cellule tumorali: sia su quelle provviste di antigene, sia su quelle
che, nell’ambito della stessa popolazione neoplastica, risultano prive di
antigene e quindi non altrimenti raggiungibili dall’anticorpo; questa azione in
profondità è chiamata cross-fire effect ed è un elemento essenziale per
l’efficacia della terapia. L’attività dell’immunoconiugato marcato è innanzitutto
dovuta alla radioattività emessa dal radionuclide legato all’anticorpo, ma
l’anticorpo stesso può contribuire alla distruzione del tumore attraverso diversi
meccanismi biologici. La formazione dell’immunocomplesso può infatti
provocare sia l’attivazione della cascata del complemento che l’induzione di
64
una citotossicità anticorpo –dipendente, attraverso l’azione effettrice di cellule
che si legano alla regione costante Fc. Gli anticorpi inoltre legandosi agli
antigeni di superficie, causano un segnale apoptotico nelle cellule linfomatose.
La possibilità di ottenere con tecniche di ingegneria genetica, un numero
pressoché illimitato di anticorpi con diverse caratteristiche e differente target,
la messa a punto di nuove tecniche di marcatura e la possibilità di veicolare
direttamente sul tumore il radio farmaco, così da colpire selettivamente le
cellule maligne e risparmiare dall’azione lesiva i tessuti sani, rappresentano i
fondamenti di questo approccio terapeutico. Sono stati approvati due anticorpi
monoclonali di origine murina radio coniugati: IBRITUMOMAB e TOSITUMOMAB,
per il trattamento di linfomi non-Hodgkin. Il successo della terapia è
ovviamente condizionato dalle caratteristiche dell’antigene associato alle
cellule B. In generale l’antigene target ideale dovrebbe rispondere a
determinati requisiti tra cui quello di essere espresso solo dalle cellule maligne,
di avere una elevata densità di espressione sulla superficie delle cellule, di non
essere espresso nelle diverse varianti e infine di non staccarsi dalla superficie
delle cellule maligne, o non essere secreto in circolo. L’antigene CD20 è un
buon target,in quanto espresso solo dalla linea cellulare B,non è schermato e,
dopo legame con l’anticorpo, non viene internalizzato. Gli anticorpi monoclonali
marcati con un determinato radionuclide sono particolarmente adatti a
veicolare direttamente all’interno del tumore dosi radioattive killer. L’attività
antitumorale si esplica attraverso l’emissione continua ed esponenzialmente
decrescente di radiazioni a basso rateo. In questo senso la radio
immunoterapia si differenzia sostanzialmente dalla radio terapia esterna che,
al contrario, somministra in un breve lasso di tempo alti ratei di dose. Studi di
laboratorio hanno dimostrato che l’apoptosi, indotta da una prolungata
esposizione a radiazioni a basso rateo, è un importante mediatore di
citotossicità. Il radionuclide adatto alla radio immunoterapia deve essere un
beta-emittente e deve avere un’emissione gamma a bassa energia; dovrebbe
inoltre avere un’emivita di diversi giorni tale da consentire la somministrazione
di un’elevata dose al tumore . Lo iodio( 131I), non ha caratteristiche ottimali a
causa dell’emissione beta a bassa energia e dell’emissione gamma ad alta
energia; inoltre lo iodio in caso di internalizzazione del complesso anticorpale
viene liberato per dealogenazione e rimesso in circolo. Nonostante tali limiti è
un radioisotopo molto utilizzato per la semplicità delle procedure di
marcatura,prontamente disponibile,relativamente economico e di facile
coniugazione. La marcatura con il beta-emittente ittrio –90 (90Y) rispetto a
quella con I, ha il vantaggio di una dosimetria più favorevole, in quanto ha
un’emissione beta di più elevata energia e sufficientemente penetrante, che lo
rendono più efficace nel trattamento di tumori di grandi dimensioni. Altre
caratteristiche vantaggiose sono l’assenza di danno tiroideo da iodio libero e il
profilo più sicuro, rimanendo coniugato persino dopo l’endocitosi. Di contro la
disponibilità di 90Y è bassa e il costo è elevato.

65
90Y-IBRITUMOMAB TIUXETANO( ZEVALIN® ) -MURINO

E’ un anticorpo monoclonale della classe IgG1kappa ricombinante murino,


legato covalentemente al tiuxetano, un chelante dell’ittrio-90. ZEVALIN® è la
prima radio immunoterapia disponibile sul mercato. Prodotto con tecniche di
ingegneria genetica, a partire da una linea cellulare ovarica di criceto cinese,
esso è fornito sottoforma di kit per radiomarcare l’ibritumomab tiuxetano con
90
Y. La preparazione combina la capacità selettiva dell’anticorpo monoclonale
anti –CD20 con il potere citotossico del radioisotopo ittrio-90, allo scopo di
distruggere le cellule tumorali, laddove queste non hanno risposto alla terapia
con rituximab o in casi di ricaduta. L’isotopo 90Y è un puro β-emittente, con
una penetrazione media della radiazione nei tessuti di circa 5mm, da cui deriva
la sua capacità di distruggere sia le cellule bersaglio che quelle vicine. L’ittrio-
90 decade per emissione di particelle β ad alta energia con un ‘emivita fisica di
64,1 h (2,67 giorni). Il farmaco ha un meccanismo d’azione nuovo rispetto agli
altri farmaci con la stessa indicazione, tuttavia i risultati clinici sono simili: non
ci sono differenze significative nella durata della risposta e nel tempo di
progressione della malattia, inoltre non è dimostrato che l’uso di ibritumomab
aumenti la sopravvivenza. L’anticorpo coniugato possiede una costante di
affinità apparente per l’antigene CD20 corrispondente a circa 17nM. Il legame
è molto specifico, senza alcuna reattività crociata con altri leucociti o con altri
tipi di tessuto umano. Approvato dalla FDA nel Marzo 2002, ZEVALIN®
radiomarcato con 90Y è indicato per il trattamento di pazienti adulti affetti da
linfoma non-Hodgkin follicolare, a cellule B CD20 positivo, recidivo o refrattario
al rituximab. L’Agenzia Italiana del Farmaco nel Giugno 2005 ha approvato
l’autorizzazione all’immissione in commercio. Il regime terapeutico ZEVALIN®
impiega un pretrattamento con un anticorpo non marcato, il rituximab che
risulta necessario per eliminare le cellule B circolanti e saturare così i punti di
legame periferici. Rituximab, legandosi al CD20 dei linfociti circolanti e presenti
nei tessuti normali, ottimizza la biodistribuzione di ibritumomab radiomarcato,
portando in modo specifico la radiazione a livello del linfoma. La penetrazione
media della radiazione nei tessuti di circa 5 mm permette di trattare tumori
voluminosi o poco vascolarizzati. Anche le cellule maligne non accessibili
all’anticorpo possono essere distrutte dalla radiazione ionizzante emessa
dall’immunoconiugato. In questo regime terapeutico, rituximab è
somministrato a una dose inferiore rispetto a quella approvata per il suo uso in
ionoterapia. La soluzione di ZEVALIN® preparata, deve essere somministrata
per infusione endovenosa lenta della durata di 10 minuti. Si raccomanda l’uso
immediato dopo la radiomarcatura (è stata dimostrata la stabilità fisica e
chimica del radiomarcato per 8 ore a 2-8 °C e al riparo dalla luce). Il
trattamento con ZEVALIN® radiomarcato con 90Y provoca la deplezione delle
cellule B CD20 positive normali, ma gli studi di farmacocinetica hanno
dimostrato che si tratta di un effetto temporaneo. La sicurezza e l’efficacia
terapeutica del trattamento con ZEVALIN® ,in confronto al rituximab, sono
66
state valutate nell’ambito di studi clinici multicentrici che hanno evidenziato un
indice di risposta globale significativamente più alta (80% versus 56%)nei
soggetti trattati con ZEVALIN® . Le proprietà farmacocinetiche valutate su
pazienti sotto regime terapeutico ZEVALIN® (pretrattamento con rituximab +
ibritumomab tiuxetano 90Y)hanno evidenziato una mediana dell’emivita serica
di ZEVALIN® radiomarcato con 90Y pari a 28h. Visto che l’ittrio-90 forma un
complesso stabile con ibritumomab tiuxetano, la biodistribuzione del
radiomarcato è comparabile a quella dell’anticorpo. Il regime terapeutico
ZEVALIN® può causare effetti indesiderati, tra cui grave e rara citopenia, di
norma irreversibile, infezioni (per lo più di natura batterica), emorragia durante
lo stato trombocitopenico e reazioni allergiche(broncospasmo e angioedema).
Sono possibili tumori secondari causati dalla dose di radiazioni derivante
dall’esposizione terapeutica.

Sono state registrate anche reazioni cutanee e mucocutanee. I pazienti che


hanno ricevuto anticorpi murini prima del trattamento con ZEVALIN® devono
essere valutati per la possibile presenza di anticorpi umani antimurini(HAMA):
in caso positivo, si possono verificare reazioni allergiche o da ipersensibilità,
quando trattati con ZEVALIN® o altre proteine di origine murina. Il farmaco
deve essere manipolato e somministrato solamente da personale qualificato
provvisto delle dovute autorizzazioni governative, e abilitato all’uso e alla
manipolazione di radionuclidi in un contesto clinico. La sua preparazione, l’uso,
il trasferimento, l’immagazzinamento, e lo smaltimento sono soggetti alle
disposizioni e/o alle relative autorizzazioni da parte delle autorità ufficiali locali
di competenza.

131I.TOSITUMOMAB (bexxar ®)-MURINO

Un altro anticorpo radio coniugato è il tositumomab, immesso nel mercato nel


2003, con indicazioni terapeutiche ristrette al trattamento chemioterapico del
linfoma non- Hodgkin refrattario al trattamento con il rituximab. Dal punto di
vista strutturale è costituito da un anticorpo monoclonale murino (IgG2a)
legato, mediante legame chimico,allo iodio-131 (131I). Si produce da una linea
cellulare murina (ibridoma). Anche in questo caso il target è la proteina CD20,
espressa sulla superficie delle cellule B. L’anticorpo riconosce un epitopo
localizzato sul dominio extracellulare di CD20.

BEXXAR ®, come ZEVALIN ®, è un regime radio immunoterapeutico, che


associa la capacità dell’anticorpo monoclonale di individuare il bersaglio con
l’azione terapeutica della radiazione. L’anticorpo specifico anti-CD20,
tositumomab, si lega alle cellule tumorali, fungendo da veicolo per lo iodio
radioattivo (emivita 8.02 giorni) che le distrugge. L’emissione incrociata di
radiazioni β e γ da parte di BEXXAR ® può uccidere le cellule normali e quelle
tumorali del linfoma non –Hodgkin non accessibili all’anticorpo non
radiomarcato. L’elevato percorso spaziale delle radiazioni di questo
67
radionuclide, attraverso l’effetto cross-fire aumenta il danno, oltre che della
cellula bersaglio, anche di quelle circostanti (cellule tumorali non raggiungibili
dall’anticorpo non coniugato). E’ stata valutata l’efficacia di BEXXAR® in uno
studio clinico che ha coinvolto pazienti con linfoma non Hodgkin follicolare
refrattario al rituximab e recidivante dopo chemioterapia: il 63% di questi ha
risposto a trattamento con BEXXAR® con una durata media della risposta di 25
mesi, il 29% ha presentato una risposta completa (nessun segno clinico della
malattia). Una sperimentazione condotta su 76 pazienti con linfoma follicolare
di stadio III o IV, chemio resistenti o recidivanti dopo chemioterapia, ha
evidenziato una risposta positiva nel 95% dei pazienti dopo una sola settimana
di trattamento e una completa remissione della malattia nel 75% dei soggetti.
La percentuale di sopravvivenza libera da progressione della malattia a cinque
anni è stata del 59% e del 77% in coloro che avevano avuto una risposta
completa. Lo studio ha dimostrato che, contro il linfoma follicolare (sesta causa
di morte in USA per tumore), si è rivelata efficacissima e con minimi effetti
collaterali una sola settimana di regime terapeutico BEXXAR® , il cui uso era
stato già approvato dalla FDA nel 2003, ma solo come ultima terapia possibile
in caso di fallimento dei precedenti trattamenti; in questo studio invece, per la
prima volta BEXXAR® è stato usato come primo protocollo terapeutico di
scelta e i risultati sono stati molto promettenti. Il regime con BEXXAR®
prevede un singolo ciclo terapeutico: non sono state valutate sicurezza di
molteplici cicli di trattamento né la combinazione di tale regime terapeutico
con altre forme di irradiazione o di chemioterapia. Si somministra per infusione
lenta in vena e le dosi sono decise in maniera personalizzata per ogni malato. Il
regime terapeutico Bexxar®, come ZEVALIN®, per migliorare la distribuzione
dell’anticorpo marcato (tositumomab coniugato con iodio-131), impiega un
pretrattamento con l’anticorpo monoclonale non marcato (tositumomab)
somministrato per infusione in un’ora, prima dell’anticorpo radioconiugato. E’
sufficiente una settimana di trattamento e come unico effetto collaterale
importante si ha la riduzione dell’ematocrito nelle settimane successive. Una
temporanea riduzione dei globuli bianchi può evidenziarsi poche settimane
dopo il trattamento, ma la conta leucocitaria si normalizza generalmente
nell’arco di 3-4 settimane. L’infusione è di solito ben tollerata. Tra i più comuni
effetti avversi non ematologici sono stati registrati astenia, febbre, nausea,
suscettibilità alle infezioni, oltre a reazioni allergiche, quali broncospasmo,
angioedema, rash cutaneo. Il trattamento con BEXXAR® è stato anche
associato ad un rischio di ipotiroidismo e, a causa della componente murina, di
risposta HAMA.

6.5 Radioimmunoterapia: la tecnica avidina-biotina


La radioimmunoterapia è la cura dei tumori attraverso anticorpi carichi di
radiazioni intelligenti che colpiscono le cellule maligne ma risparmiano quelle
68
sane. La sua completa applicazione è tuttavia frenata dal problema dei
cosiddetti “anticorpi dispersi”, cioè l’anticorpo marcato si lega al tumore solo in
una piccola percentuale mentre il restante continua a circolare nel sangue e
finisce con il disperdersi nell’organismo. I ricercatori dello IEO (Istituto Europeo
di Oncologia) di Milano hanno messo a punto una tecnica grazie alla quale si
evita la dispersione dell’anticorpo. Questa nuova tecnica prende il nome di
PAGRIT (Pre-Targeted Antibody Guided Radio Immuno Therapy) e sfrutta
l’interazione naturale tra due molecole, avidina-biotina, grazie alla quale è
possibile caricare di radioattività solo quegli anticorpi che si posizionano sul
tumore. L’avidina, proteina presente nell’albume dell’uovo, ha un peso
molecolare di 66kD ed è composta da quattro subunità identiche ognuna delle
quali presenta un sito di legame per la biotina. La biotina (vitamina H) è una
proteina di 244 D è disponibile commercialmente con diversi linkers, che
facilitano le interazioni con le diverse proteine.

Lo schema terapeutico della nuova tecnica radioimmunoterapica si realizza in


tre fasi:

Il primo giorno il paziente riceve un'iniezione


endovenosa di anticorpi monoclonali
precedentemente legati a molecole di biotina. Questi
anticorpi andranno a localizzarsi sul loro bersaglio (il
tumore) nell'arco di 24-48 ore.

24-48 ore dopo la prima somministrazione, il


paziente riceve un'altra infusione endovenosa, questa
volta di avidina: grazie alla fortissima affinità fra
queste due molecole, l'avidina si lega alla biotina già
presente sul tumore, mentre quella rimasta in circolo
viene metabolizzata a livello epatico. L'avidina, ha 4
siti di legame, 4 piccole "tasche" in cui potrà
nuovamente inserire altre molecole di biotina.

69
Il terzo giorno, quando gli anticorpi non legati al
tumore sono stati eliminati, il paziente riceve l'ultima
iniezione, questa volta di biotina precedentemente
marcata con un isotopo radioattivo. La biotina
radioattiva è dunque "calamitata" dall'avidina
presente nel tumore, e raggiunge in pochi minuti il
suo target specifico, provocandone la distruzione. La
biotina radioattiva non legata al tumore viene
rapidamente eliminata attraverso i reni.

Finora questo tipo di radioimmunoterapia è stata applicata solo su casi gravi di


tumore in stadio avanzato, dopo che erano risultate inefficaci le altre terapie. I
tipi di tumore che paiono più sensibili a questa terapia sono quelli del cervello
ed i linfomi. Anche se il trattamento è stato ben tollerato e privo degli effetti
collaterali, propri di altre terapie tradizionali, è doveroso sottolineare che si
tratta ancora di una terapia sperimentale, indicata solo per alcuni tipi di
neoplasie e solo quando il tumore non supera i 2 centimetri di diametro.
Il sistema di pretargeting a base di avidina-biotina rappresenta un modello di
radioimmunoterapia mirata molto promettente per la terapia del cancro. In
teoria è applicabile a tutti i tipi di tumore per i quali siano disponibili anticorpi
specifici. Anche se complesso, il sistema non è difficile da usare. Richiede,
però, strutture idonee all'utilizzo di radioisotopi.

6.6 Anticorpi anti-cd 33


L’antigene CD-33 è presente sulla maggior parte delle cellule emopoietiche, in
più dell’ 80% dei blasti leucemici dei soggetti affetti da leucemia mieloide
acuta e nella maggior parte delle mielodisplasie. La terapia ha come bersaglio
questo antigene e si attua con il GEMTUZUMAB, MYLOTARG, un anticorpo
monoclonale umanizzato legato covalentemente ad un derivato semisintetico
della calicheamicina, un potente antibiotico con azione citotossica. L’azione
terapeutica è svolta proprio da questo antibiotico che, veicolato tramite
l’anticorpo all’interno dei lisosomi dei mieloblasti, viene rilasciato e, entrato nel
nucleo, causa rottura del DNA e conseguente morte cellulare. Come risultato
quindi avremo la morte delle cellule leucemiche, mentre le cellule staminali
emopoietiche sane continueranno nel rifornimento delle cellule sangiugne,
senza essere state intaccate dall’intervento dell’antibiotico. MYLOTARG è stato
approvato nel 2000 dalla FDA per il trattamento delle recidive della leucemia
mieloide acuta,positiva per il CD33. Il piano terapeutico convenzionale prevede
due o tre somministrazioni, con intervallo compreso tra 14 e 28 giorni. La dose
raccomandata è di 9mg/m2, somministrata per via endovenosa. I danni epatici
e la mielosoppressione rappresentano le tossicità primarie. Sono anche stati
riportati anemia, trombocitopenia, infezioni e reazioni allergiche.
70
Internalizzazione di un coniugato farmaco-anticorpo: Il coniugato, dopo
il legame all’antigene, viene endocitato attraverso una via dipendente dalla
clatrina. Nel lisosoma subisce un taglio che rilascia l’agente citotossico.

6.7 Anticorpi anti-cd52


L’antigene CD52 è una proteina espressa ad alta densità su tutti i linfociti B e
T, su monociti, macrofagi, eosinofili.

MabCampath è un farmaco antitumorale, indicato per il trattamento di


pazienti affetti da leucemia linfocitica cronica (LLC). La LLC è un tumore dei
linfociti (un tipo di globuli bianchi del sangue). MabCampath è utilizzato nei
pazienti cui non si adattano terapie combinate comprendenti fludarabina (un
altro farmaco usato nel trattamento della leucemia). Il medicinale può essere
ottenuto soltanto con prescrizione medica. MabCampath deve essere
somministrato sotto la supervisione di un medico esperto nell’uso della terapia
oncologica. Ai pazienti devono essere somministrati steroidi, un antistaminico e
un antidolorifico prima della dose iniziale e prima di ciascun aumento della
dose. Inoltre, medicinali antibiotici e antivirali devono essere somministrati nel
corso della terapia e dopo la terapia. MabCampath è somministrato per
infusione della durata di due ore circa. Durante la prima settimana di
trattamento, MabCampath deve essere somministrato in dosi crescenti: 3 mg il
1° giorno, 10 mg il 2° giorno e 30 mg il 3° giorno, purché ciascuna dose sia ben

71
tollerata. Questa modalità di somministrazione è detta “intensificazione della
dose”. In seguito, la dose raccomandata è di 30 mg al giorno, somministrati tre
volte alla settimana (a giorni alterni), fino a un massimo di 12 settimane. I
pazienti vanno monitorati nel corso del trattamento sia per osservarne la
risposta, sia per controllare i livelli ematici di piastrine (i costituenti del sangue
che aiutano la coagulazione) e neutrofili (i globuli bianchi che combattono
l’infezione): se sono troppo bassi, il trattamento deve essere sospeso o
interrotto. Per ulteriori dettagli, si rimanda al Riassunto delle caratteristiche del
prodotto (anch’esso accluso all’EPAR).

ALEMTUZUMAB, il principio attivo di MabCampath, è un anticorpo


monoclonale. Nella LLC si producono troppi linfociti. Alemtuzumab è stato
concepito per legarsi a una glicoproteina (un proteina ricoperta con molecole di
zucchero) denominata CD52 che si trova sulla superficie dei linfociti. In seguito
al legame, il linfocita muore e in tal modo si tiene sotto controllo la LLC.
MabCampath è stato esaminato in quattro studi principali, su di un totale di
446 pazienti affetti da LLC. Uno studio ha interessato 297 pazienti mai trattati
in precedenza. Lo studio poneva a confronto l’efficacia di un trattamento di
dodici settimane con MabCampath con quella di un trattamento di un anno con
clorambucile (altro farmaco antitumorale). Il principale indicatore dell’efficacia
era l’intervallo di tempo alla progressione della malattia o al decesso del
paziente. Gli altri tre studi condotti hanno interessato in tutto 149 pazienti che
avevano già ricevuto altri trattamenti. In questi studi, MabCampath non è stato
posto a confronto con altri trattamenti. Lo studio principale ha riguardato 93
pazienti che non rispondevano più al trattamento con fludarabina. Il principale
indicatore dell’efficacia era la risposta complessiva al trattamento. Nei pazienti
che non avevano ricevuto alcun precedente trattamento, MabCampath si è
dimostrato più efficace rispetto al clorambucile. Per i pazienti trattati con
MabCampath, l’intervallo medio intercorrente prima del peggioramento della
malattia o del decesso del paziente era di 14,6 mesi, rispetto a 11,7 mesi per i
pazienti trattati con clorambucile. Nello studio principale condotto su pazienti
già trattati in precedenza, la percentuale di pazienti che ha risposto
parzialmente o completamente al trattamento con MabCampath è stata pari al
33%. Analoghi risultati sono stati osservati negli altri due studi condotti su
pazienti già trattati in precedenza. Si manifestano effetti indesiderati nel 97%
circa dei pazienti mai trattati in precedenza e in circa l’80% di quelli già
precedentemente trattati. Gli effetti indesiderati più comuni (osservati in oltre
1 paziente su 10) sono: infezioni, ipotensione (bassa pressione arteriosa),
nausea, orticaria, eruzioni cutanee, febbre, brividi, basso contenuto di cellule
del sangue (granulociti, piastrine e globuli rossi), anoressia (perdita di
appetito), mal di testa, dispnea (difficoltà di respirazione), vomito, diarrea,
prurito, iperidrosi (sudorazione eccessiva) e affaticamento. Per l’elenco
completo degli effetti indesiderati rilevati con MabCampath, si rimanda al foglio
illustrativo. MabCampath non deve essere somministrato a persone che
72
potrebbero essere ipersensibili (allergiche) ad alemtuzumab, alle proteine del
topo o a uno qualsiasi degli altri componenti. MabCampath non deve essere
utilizzato in pazienti:

 con infezione attiva, che si è propagata in tutto l’organismo;

 con infezione da HIV;

 che hanno tumori attivi secondari;

 in gravidanza.

Il comitato per i medicinali per uso umano (CHMP) ha concluso che l’efficacia di
MabCampath è stata dimostrata, sebbene non vi sia notizia di studi che
abbiano messo direttamente a confronto MabCampath con trattamenti
combinati, comprendenti fludarabina, ampiamente impiegati per il trattamento
di pazienti affetti da LLC. Il CHMP ha deciso pertanto che i benefici di
MabCampath sono superiori ai suoi rischi nel trattamento di pazienti affetti da
LLC a cellule B per i quali non è adatto un trattamento chemioterapico con
fludarabina. Il comitato ha raccomandato il rilascio dell'autorizzazione
all'immissione in commercio per MabCampath. L’autorizzazione di
MabCampath è stata rilasciata inizialmente in “circostanze eccezionali” in
quanto, per ragioni scientifiche, non è stato possibile ottenere informazioni
complete sul medicinale. Dal momento che la casa farmaceutica ha fornito le
informazioni supplementari richieste, la suddetta condizione è decaduta il 4
luglio 2008.

6.8 Anticorpi anti-her-2neu


Il gene codifica per una proteina transmembrana di 185 kDa che è il sottotipo 2
del recettore per il fattore di crescita dell’epidermide umano (HER2).Questo è il
recettore media la crescita cellularela cui espressione del gene HER2 è
aumentata del 25-30% nel tumore al seno.

Il trastuzumab si usa soprattutto per il trattamento delle pazienti affette da


carcinoma mammario avanzato, recidivante o diffuso ad altri organi (carcinoma
mammario secondario).Derivato dall’anticorpo umanizzato mumMAb 4D5.
Il trastuzumab può essere somministrato sia da solo sia in combinazione con
alcuni chemioterapici. Sono in corso degli studi miranti a verificare se il
trastuzumab è in grado di ridurre le possibilità di recidiva del carcinoma
mammario, dopo il trattamento iniziale Il trastuzumab agisce interferendo con
una delle modalità di crescita e divisione delle cellule del carcinoma
mammario. Allo stato attuale sembra che solo uno su cinque (20%) casi di
tumore della mammella sia sensibile a questo farmaco. Il fattore di crescita
umano dell’epiderma è una proteina prodotta naturalmente dal corpo umano,
73
che in alcuni casi si attacca ad un’altra proteina (HER2 o CerbB2) che si trova
sulla superficie delle cellule neoplastiche. Questo legame stimola la
moltiplicazione delle cellule neoplastiche.
Il trastuzumab blocca tale azione attaccandosi alla proteina HER2, impedendo
in tal modo al fattore di crescita umano dell’epiderma di raggiungere le cellule
neoplastiche e, di conseguenza, impedendone la divisione e la crescita. Il
trastuzumab agisce anche da stimolatore delle cellule immunitarie
dell’organismo per aiutarle a distruggere le cellule neoplastiche.I meccanismi
d’azione attraverso i quali il farmaco esplica la sua azione antitneoplastica sono
molteplici:

 blocco dei segnali di crescita trasdotti dal recettore HER-2neu. Questa


interazione impedisce al fattore di crescita epiteliale di interagire con il
proprio recettore posto sulle cellule tumorali e ne blocca quindi la
proliferazione;

 coinvolgimento delle cellule del sistema immunitario nella distruzione


delle cellule tumorali bersaglio,attraverso la citotossicità anticorpo-
dipendente cellulo-mediata;

 down-regulation del fattore di crescita dell’endotelio vascolare e di altri


fattori di moltiplicazione dei vasi sanguigni;

 potenziamento della chemioterapia,attraverso la prevenzione dei


processi di ricaptazione del DNA daneggiato dai farmaci citotossici.

Il trastuzumab è efficace solo nelle donne con un livello elevato di proteina


HER2, mentre i suoi effetti sono meno evidenti nelle altre pazienti. Sono
disponibili diverse modalità di determinazione del livello di HER2. Attualmente
il dosaggio della proteina HER2 non si esegue ancora di routine su tutte le
pazienti affette da tumore della mammella, ma vi si fa ricorso di solito quando
l’oncologo ritiene che il trastuzumab possa rappresentare un’opzione
terapeutica per un caso specifico.
Il dosaggio della proteina HER2 può essere eseguito in occasione del
trattamento chirurgico di prima istanza oppure su campioni di cellule
neoplastiche prelevati da biopsie o reperti operatori precedenti. La
farmacocinetica del trastuzumab è stata studiata in pazienti affetti da
carcinoma mammario metastatico e in fase iniziale. E’ stata rilevata una
farmacocinetica dose dipendente dopo somministrazione i.v. di concentrazioni
comprese nel range di 10-500 mg, una volta a settimana. L’emivita è di circa
28 giorni e il periodo di eliminazione è fino a 24 settimane. L’effetto
indesiderato più frequente è una reazione similinfluenzale che si verifica nel
corso della prima infusione.
74
Il trastuzumab somministrato da solo riduce la massa tumorale in una
minoranza di casi, mentre ne blocca la crescita in altre. Sono attualmente in
corso degli studi per valutare gli effetti del farmaco somministrato in
combinazione con alcuni chemioterapici. Se associato in particolare con
paclitaxel (Taxol®), il trastuzumab migliora la risposta alla chemioterapia e
potrebbe prolungare anche la sopravvivenza.

6.9 Anticorpi anti-egfr


1. Che cos’è Erbitux?

Erbitux è una soluzione per infusione (flebo in vena) contenente il principio


attivo cetuximab.

2. Per che cosa si usa Erbitux?

Erbitux è utilizzato per il trattamento dei seguenti tipi di tumori:

 tumore metastatico del colon o del retto (intestino crasso). “Metastatico”


significa che il tumore si è diffuso ad altre parti del corpo. Erbitux è usato
nei pazienti le cui cellule tumorali presentano sulla superficie una
proteina detta recettore del fattore di crescita

epidermica (EGFR) e contengono un gene “di tipo selvaggio” (non


mutato) chiamato “KRAS”. Erbitux è indicato in associazione con altri
farmaci antitumorali oppure da solo se un precedente trattamento
antitumorale con oxaliplatino e irinotecan non ha dato risposta e il
paziente non è in grado di ricevere irinotecan;

 carcinomi “a cellule squamose” di testa e collo. Questi tipi di


carcinomi colpiscono le cellule del tessuto che riveste la bocca o la gola
oppure altri organi, come la laringe. Nel carcinoma localmente avanzato
(quando il tumore è cresciuto ma non si è diffuso), Erbitux è
somministrato in combinazione con radioterapia (terapia radiante). Nel
tumore recidivante (che ricompare in seguito a un precedente
trattamento) o metastatico, Erbitux è indicato in associazione ad una
combinazione di farmaci antitumorali “a base di platino” (tra cui farmaci
quali cisplatino o carboplatino).

Il medicinale può essere ottenuto soltanto con prescrizione medica.

3. Come si usa Erbitux?

75
Erbitux va somministrato esclusivamente da medici esperti nell’uso dei farmaci
antitumorali. Prima della somministrazione di Erbitux per la prima volta, il
paziente deve ricevere un antistaminico e un corticosteroide per evitare
reazioni allergiche. Ciò è raccomandato anche per tutte le infusioni successive.
Erbitux va somministrato una volta alla settimana. La prima infusione viene
somministrata a una dose di 400 mg per metro quadro di superficie corporea
(calcolata in funzione dell’altezza e del peso del paziente) e dura due ore. Le
infusioni successive sono di 250 mg/m2 e durano un’ora ciascuna. In
monoterapia o in associazione con altri farmaci antitumorali, il trattamento con
Erbitux deve essere proseguito per il tempo necessario in funzione della
risposta terapeutica. Quando Erbitux è somministrato in concomitanza con
radioterapia, il trattamento con Erbitux deve iniziare una settimana prima
dell’inizio della radioterapia e va proseguito fino al termine della radioterapia.

4. Come agisce Erbitux?

Il principio attivo di Erbitux è cetuximab, un anticorpo monoclonale, ovvero un


anticorpo (un tipo di proteina) concepito per riconoscere una struttura specifica
(antigene) presente su alcune cellule dell’organismo e legarsi ad essa. Il
cetuximab è stato concepito per legarsi al recettore del fattore di crescita
epidermica (EGFR), che può essere presente sulla superficie di alcune cellule
tumorali. Di conseguenza, le cellule tumorali non possono più ricevere i
messaggi necessari per crescere, progredire e diffondersi. Tra il 79 e l’89% dei
tumori colorettali e più del 90% dei tumori a cellule squamose di testa e collo
esprimono l’EGFR sulla superficie delle loro cellule.

5. Quali studi sono stati effettuati su Erbitux?

Per i casi di tumore metastatico del colon o del retto, Erbitux è stato studiato
nel corso di cinque studi principali:

 due studi hanno interessato 1 535 pazienti, che in precedenza non


avevano ricevuto chemioterapia,

e hanno analizzato gli effetti dell’aggiunta di Erbitux alla terapia di


associazione a base di irinotecan od oxaliplatino;

 tre studi hanno interessato 2 199 pazienti in cui la malattia era


peggiorata durante un precedente trattamento comprendente
irinotecan, oxaliplatino o entrambi, o ai quali non potevano essere
somministrati tali medicinali.

Per i casi di tumore di testa e collo, Erbitux è stato studiato nel corso di due
studi principali:

76
 il primo studio ha interessato 424 pazienti affetti da tumore localmente
avanzato e ha analizzato gli effetti dell’aggiunta di Erbitux alla
radioterapia;

 il secondo studio ha interessato 442 pazienti con tumore recidivante o


metastatico e ha analizzato gli effetti dell’aggiunta di Erbitux alla
combinazione di farmaci antitumorali a base di platino.

Tutti gli studi hanno esaminato la durata del periodo di vita senza
peggioramento del cancro o il tempo di sopravvivenza dei pazienti. La maggior
parte degli studi ha valutato separatamente i risultati nei pazienti con tumore
con gene KRAS di tipo selvaggio rispetto ai pazienti con tumore con gene
mutato. Nelle cellule tumorali il gene KRAS stimola la crescita tumorale quando
esso è mutato.

6. Quali benefici ha mostrato Erbitux nel corso degli studi?

Negli studi relativi al tumore del colon o del retto, i pazienti i cui tumori
presentavano il gene KRAS di tipo selvaggio e che assumevano Erbitux sono
sopravvissuti più a lungo senza peggioramento della malattia:

 nei pazienti che non erano mai stati sottoposti a chemioterapia in


precedenza, i pazienti erano sopravvissuti più a lungo senza
peggioramento della malattia quando erano stati trattati con Erbitux in
aggiunta a chemioterapia. Questo comprendeva chemioterapia con
irinotecan (l’intervallo medio è stato di 9,9 mesi rispetto a 8,7 mesi) e
con oxaliplatino (l’intervallo medio è stato di 7,7 mesi rispetto a 7,2
mesi);

 il primo studio in pazienti che erano già stati sottoposti a chemioterapia


non ha esaminato le mutazioni del gene KRAS, mentre negli altri due
studi, i pazienti con tumore con gene KRAS di tipo selvaggio sono
sopravvissuti più a lungo senza peggioramento della malattia quando
Erbitux era somministrato in associazione alla propria terapia. I pazienti
che non avevano risposto al trattamento con oxaliplatino né con
irinotecan sono sopravvissuti in media 3,6 mesi con Erbituxil fino al
peggioramento della malattia, rispetto a 1,9 mesi per i pazienti trattati
soltanto con la miglior terapia di supporto (cura dei sintomi ma non del
tumore stesso). I pazienti che non avevano dato risposta al trattamento
con oxaliplatino sono sopravvissuti in media 4,0 mesi con Erbitux e
irinotecan fino al peggioramento della malattia, rispetto a 2,6 mesi con
irinotecan da solo.

Per quanto riguarda il tumore di testa e collo localmente avanzato, i pazienti


sono sopravvissuti più a lungo fino al peggioramento della malattia
aggiungendo Erbitux alla radioterapia (in media 24,4 mesi rispetto ai 14,9
77
mesi). Nel tumore di testa e collo recidivante o metastatico, la sopravvivenza
era risultata maggiore aggiungendo Erbitux alla combinazione di farmaci
antitumorali a base di platino (in media 10,1 mesi rispetto ai 7,4 mesi).

7. Qual è il rischio associato a Erbitux?

Gli effetti indesiderati più comuni associati a Erbitux (osservati in più di un


paziente su 10) sono reazioni cutanee quali eruzioni, ipomagnesemia (bassi
livelli di magnesio nel sangue), reazioni correlate all’infusione (fra cui febbre,
brividi, capogiri e difficoltà a respirare), mucosite (infiammazione della mucosa
della cavità orale) e valori elevati di taluni enzimi epatici. Eruzioni cutanee si
verificano in oltre l’80% dei pazienti. Per l’elenco completo degli effetti
indesiderati rilevati con Erbitux, si rimanda al foglio illustrativo. Erbitux non
deve essere usato in soggetti che sono ipersensibili (allergici) al cetuximab.
Sono possibili gravi reazioni durante l’infusione, per cui in questa fase il
paziente va tenuto sotto stretta osservazione.

8. Perché è stato approvato Erbitux?

Il comitato per i medicinali per uso umano (CHMP) ha deciso che i benefici di
Erbitux sono superiori a suoi rischi nel trattamento di pazienti affetti da
carcinoma colorettale metastatico con espressione di EGFR, con gene KRAS di
tipo selvaggio e di pazienti con tumore a cellule squamose di testa e collo. Il
comitato ha raccomandato il rilascio dell’autorizzazione all’immissione in
commercio per Erbitux.

PANITUMUMAB (VECTIBIX)

 Approvato della FDA nel 2006 indicato nel trattamento del cancro
metastatico del colon-retto, EGFR positivo.

 Anticorpo monoclonale umano ottenuto sfruttando la tecnologia


XenoMouse che ha reso possibile la produzione di anticorpi
monoclonali completamente umani.

 Miglioramento della vita in quanto studi hanno dimostrato una


regressione della massa tumorale fino al 50%.

 Efficacia terapeutica simile al Cetuximab; il primo in vitro dimostra


maggiore affinità per il recettore,il secondo ha la caratteristica di
innescare azione citotossica anticorpo-mediata.

 Migliore farmacocinetica con possibilità di somministrazione


mono-,bi-,tri- settimanali con rischio di tossicità inferiore.

 Effetti collaterali: tossicità dermatologica,fibrosi polmonare, alterazioni


a carico dell’apparato gastrointestinale.

78
6.10 Anticorpi anti-vegf

 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) è una proteina naturale che


regola il processo dell’angiogenesi nelle sue diverse tappe.

 Elevata secrezione di questa proteina si verifica dove c’è un’intesa


proliferazione cellulare neoangiogenese tumorale.

 Terapia effettuata con Bevacizumad (AVASTIN).

 Farmaco il cui principio attivo è il Bevacizumab,anticorpo monoclonale


con regioni leganti l’antigene derivate dall’anticorpo murino muMAb
VEGFA461.

 Viene prodotto con tecniche di DNA ricombinante in cellule ovariche di


criceto cinese.

 Azione specifica sul VEGF in quanto previene il legame di tutte le


isoforme del fattore angiogenico ai recettori relativi presenti sulla
superficie delle cellule endoteliali inibendo la neoangiogenesi tumorale
inibendo il tumore o le metastasi.

 Approvato dalla FDA nel 2004 viene utilizzato per il trattamento di prima
linea nei pazienti affetti da tumore metastatico al colon e al retto.

 Studi clinici hanno valutato la combinazione con altri chemioterapici(5-FU


e AF) i cui risultati hanno evidenziato un incremento della sopravvivenza
globale

 Posologia: 5 mg/Kg 1 volta ogni due settimane i.v. per pazienti con
carcinoma al retto e al colon; 10 mg/Kg i.v. per pazienti affetti da
carcinoma mammario.

 Stabilità fisica e chimica dimostrata per 48 ore ad una temperatura


compresa tra i 2 e 30 °C; emivita 20 gg.

 Effetti indesiderati: ipertensione, astenia, disordini gastrointestinali e


nausea. Riscontrate anche emoraggie a carico di vari organi.

 Altre applicazioni: malattie oculari ad impronta vasogenica, emoraggica


ed essudativa in cui la via di somministrazione è la via intraoculare;
azione inibitoria della genesi vascolare della malattia.

79
6.11 Immunosoppressione
Le patologie che coinvolgono il sistema immunitario costituiscono un
significativo problema di carattere sanitario. Tali patologie includono una verità
di malattie a base autoimmune ,quali artrite reumatoide, morbo di Crohn,
psoriasi ecc. Farmaci immunosoppressori possono essere impiegati per
attenuare la risposta immune nel trapianto d’organo e nelle malattie
autoimmuni. In questo ambito, la terapia con anticorpi, finalizzata a creare uno
stato di immunosopressione ha registrato qualche successo. Le prime strategie
avevano l’intento di uccidere queste cellule utilizzando sia meccanismi effettori
naturali degli anticorpi, sia agenti citotossici (immunotossine).
Successivamente, c’è stato uno spostamento di indirizzo della terapia
anticorpale verso l’utilizzo di anticorpi bloccanti, che non uccidono le cellule.
Mediante l’uso di anticorpi in grado di interferire nei normali processi cellulari
l’obiettivo è potere riprogrammare le cellule nelle reazioni autoimmuni per
bloccarle; in modo simile si può pensare di fare accettare al sistema
immunitario tessuti estranei trapiantati. Queste funzioni bloccanti degli
anticorpi richiedono che essi siano ancora in grado di legare l’antigene, ma che
non attivino il complemento o il recettore Fc sulle cellule effettrici e, in qualche
caso sono state realizzate modificazioni a carico delle sequenze nelle regioni
costanti degli anticorpi, critiche per le funzioni effettrici. Preparazioni a base di
anticorpi (sia mono che poli-clonali) diretti contro le cellule T-reattive
costituiscono importanti terapia di supporto e forniscono un’opportunità unica
per colpire, in modo selettivo specifiche cellule immuno-reattive permettendo
trattamenti più mirati.

6.12 Profilassi del rigetto


La terapia di induzione con anticorpi era quella di somministrare ai pazienti un
anticorpo specifico,che si legasse a ceri linfociti,diminuendo la risposta
immunitaria diretta contro l’organo trapiantato. Due sono gli obiettivi della
terapia anticorpale di induzione:ritardare l’uso di farmaci immunosoppressori
più tossici o intensificare la terapia immunosoppressiva iniziale nei pazienti ad
alto rischio di rigetto. La terapia di induzione con anticorpi si impiega in circa il
70%dei soggetti trapiantati. L’uso è stato favorito da diversi fattori,quali
l’introduzione di anticorpi monoclonali chimerici o umanizzati, non antigenici e
con emivita serica prolungata ,e di anticorpi diretti contro il recettore dell’IL-2
(IL-2 R), più sicuri. Gli anticorpi usati in terapia di induzione possono essere
divisi in due gruppi : anticorpi che depletano i linfociti T e anticorpi
immunomodulatori.

80
6.13 Anticorpi anti –cd3
MUROMONAB-CD3 (orthoclone okt3)- murina

Muromonab-CD3 è stato il primo anticorpo monoclinale ad essere approvato


dalla FDA americana, come agente immunosoppresore nella profilassi del
rigetto. E’un prodotto di origine murina, lanciato negli anni 80’ come anticorpo
monoclonale terapeutico di prima generazione. Agisce legandosi
specificatamente a un componente del complesso recettoriale sulla superficie
cellulare, denominato CD3, dei linfociti T umani, inibendo tutte le funzioni di
queste cellule, che giocano un ruolo primario nel rigetto acuto. Come
preparazione di anticorpi monoclonale, ORTHOCLONE OKT3 in vivo reagisce
con la maggiore parte dei linfociti T del sangue periferico e dei tessuti, ma non
risulta che reagisca con altri elementi emopoietici o altri tessuti. Il legame
dell’anticorpo alla molecola CD3induce una rapida internalizzazione del
recettore dei linfociti T, prevenendo così un successivo riconoscimento
dell’antigene. La somministrazione di muromonab -CD3 è seguita da
deplezione della maggior parte delle cellule T dal torrente sanguigno e dagli
organi linfatici periferici. Al termine della terapia, le cellule T riappaiono
rapidamente e raggiungono entro una settimana i livelli di pre-trattamento.
Tuttavia in alcuni pazienti è stato osservato un numero crescente di linfociti
CD3 positivi prima della fine del trattamento con ORTHOCLONE OKT3. La
ricomparsa di linfociti CD3positivi è attribuibile allo sviluppo di anticorpi anti
muromonabCD3, che ne bloccano la capacità di legare l’antigene l’uso ripetuto
di ORTHOCLONE OKT3 determina immunizzazione del paziente contro i
determinanti di origine murina dell’anticorpo (risposta HAMA) e questo può
neutralizzare e prevenire la sua efficacia immunosoppressiva.
L’immunosoppressione non è esente da svantaggi, ogni qual volta riceva
un’immunosoppressione intensa il paziente vede aumentare il rischio di subire
infezioni e/o neoplasie. Sono state riportate reazioni gravi talvolta fatali a livello
sistemico cardiovascolare e del sistema nervoso centrale. Il principale effetto
collaterale è la sindrome da rilascio da citochine prevenuta da preventiva
somministrazione di glucocorticoidi.

6.14 Anticorpi anti cd25


Daclizumab e Basiliximab sono anticorpi monoclonali diretti contro la subunità
alfa del recettore dell’IL2 (antigene CD25)espresso sulla superficie dei linfociti
T in risposta a uno stimolo antigenico. La produzione si realizza sempre in un
linea cellulare di mieloma,opportunamente trasformata con plasmidi
contenenti le sequenze per le regioni variabili di topo geneticamente fuse con
quelle umane. L’indicazione approvata è, per entrambi, la profilassi del rigetto
81
acuto in pazienti adulti e pediatrici sottoposti a trapianto renale e allo genico. Il
legame ad alta affinità dell’anticorpo all’IL2R ne impedisce il legame con l’IL2,
segnale per la proliferazione dei linfociti T passaggio critico nella risposta
immunitaria cellulare coinvolta nel rigetto allo genico. Entrambi gli anticorpi
anti CD25,somministrati per iniezione o infusione endovenosa, vengono
associati alla ciclosporina e ai corticosteroidi. Per quanto riguarda gli effetti
indesiderati sono state osservate alterazioni strutturali renali e della
funzionalità epatica;alterazioni dell’apparato respiratorio,muscolo scheletrico e
gastrointestinale. Di rado gravi reazioni di ipersensibilità.

6.15 Anticorpi anti cd3 di nuova generazione


ChAglyCD3 e hOKT3yl sono anticorpi monoclonali umanizzati e ingegnerizzati,
in grado di legare specificamente il complesso proteico di membrana CD3
presente sulle cellule T umane. L’umanizzazione minimizza l’instaurarsi di
risposta AMA ;le mutazioni prevengono il loro legame ai recettori Fc e sono
determinanti per il legame dell’anticorpo sulle cellule T attivate ma,non su
quelle native. Le modifiche nella struttura anticorpale prevengono le
complicazioni legate all’attivazione delle cellule T e associate alla terapia anti
CD3 di prima generazione. L’azione anti CD3 dell’anticorpo impedisce la piena
risposta immunitaria e ha aperto nuove prospettive per il trattamento del
diabete. Ad eccezione di fastidi digestivi reazioni cutanee e anemia, non è stato
riscontrato alcun grave effetto indesiderato.

6.16 Anticorpi anti tnf ALFA


INFLIXIMAB

Infliximab è un anticorpo monoclinale chimerico murino/umano ad azione


inibitoria specifica nei confronti di una citochina proinfiammatoria, il fattore di
necrosi tumorale alfa,che gioca un ruolo centrale nel sistema immunitario
come mediatore dell’infiammazione locale. Infliximab è stato geneticamente
ingegnerizzato per fusione della regione variabile dell’anticorpo murino 2(lega
con alta specificità il TNFalfa umano) con la regione costante di una
immunoglobulina umana (Ig G 1K),impiegando la tecnica del DNA
ricombinante .Legandosi sia la forma trimerica che quella monomerica,
Infliximab rallenta o addirittura impedisce, la formazione dei complessi
trimolecolari biologicamente attivi del TNFalfa ,processo che porta alla perdita
di attività biologica della citochina. Infliximab inoltre può determinare lisi
cellulare attraverso l’attivazione classica del complemento. E’ indicato per il

82
trattamento di soggetti adulti affetti da diverse patologie su base immunitaria.
In combinazione con metotrexato ,Infliximab è indicato per il miglioramento
della funzionalità e la riduzione dei sintomi dell’artrite reumatoide. Nel morbo
di Crohn il trattamento con infliximab riduce l’infiltrazione di cellule
dell’infiammazione delle aree dell’intestino coinvolte e la presenza in queste
sedi di marker dell’infiammazione,come la proteina C reattiva. Nel trattamento
della psoriasi Infiximab determina un netto miglioramento delle chiazze della
pelle anche in casi gravi. Un aspetto importante da considerare è la
immunogenicità , dal momento che la porzione variabile dell’anticorpo che reca
il sito di legame con il TNFalfa è costituita da proteine murine. La possibilità di
sviluppare anticorpi anti Infliximab (risposta AMA)limita l’efficacia del farmaco
e aumenta il rischio di reazioni infusionali. Il trattamento con Infliximab è stato
associato ad infezioni talvolta gravi come tubercolosi e setticemia e i pazienti
devono essere monitorati prima durante e dopo il trattamento.

ETANERCEPT

Un agente terapeutico che manifesta un meccanismo d’azione simile


all’Infliximab pur non essendo un anticorpo monoclonale. E’ una proteina di
fusione prodotta in un sistema di espressione di mammifero (cellule CHO)
attraverso la tecnologia del DNA ricombinante. Etanercpet è il dimero di una
proteina chimerica,sintetizzata geneticamente mediante fusione di due
identiche catene monometriche del recettore 2 del TNF umano, responsabile
del legame con il ligando, con il dominio Fc dell’immunoglobulina umana Ig G
1. Etanercpt è efficace in analogia ad Infliximab, nel trattamento di disordini
reumatologici ed è indicato per la riduzione dell’infiammazione associata
all’artrite reumatoide.

ADALIMUMAB (humira) -umano

Un altro prodotto diretto contro il TNFalfa è Adalimumab,anticorpo monoclinale


interamente umano (IgG 1) creato con la tecnologia del phage display, che
permette la selezione da un ampio repertorio di anticorpi, di uno specifico per u
antigene a differenza dell’In cui la componente murina incrementa il potenziale
immunogeno e limita l’uso a lungo termine, la natura umana di adalimumab
consente l’ottenimento di una risposta a lungo termine, con una basso grado di
immunogenicità. Il legame specifico dell’ adalimumab con TNF alfa dà luogo ad
un addotto voluminoso, costituito da tre molecole di adalimumab complessate
con tre trimeri di TNF alfa. Anche in questo caso il legame è selettivo con il TNF
alfa e bloccando la sua interazione con i recettori ne neutralizza le funzioni.
Adalimumab è in grado inoltre di determinare lisi delle cellule immuni
attraverso meccanismi anticorpo mediati e complemento mediati. E indicato
nell’artrite reumatoide e psoriasica e morbo di Crhon. Gli effetti avversi più
comunemente riportati comprendono infezioni delle vie respiratorie, urinarie,
fungine superficiali, herpes, influenza.

83
6.17 Anticorpi anti –tnf ALFA di nuova generazione
CERTOLIZUMAB PEGOL (cimzia)- FRAMMENTO FAB

Certolizumab è un singolo frammento Fab di un anticorpo monoclonale anti


TNF alfa umanizzato. Per estendere l’emivita ad un valore comparabile a quello
dell’intera molecola anticorpale, il frammento Fab è stato pugilato. Il sito di
pegilazione è in corrispondenza della cerniera tiolica. La pegilazione
comparabile con la somministrazione per via sottocutanea, aumenta l’emivita
del farmaco e sono in via di sperimentazione protocolli di somministrazione a
cadenza bi-settimanale e mensile.

Certolizumab pegol è dotato di affinità per il TNF alfa e ne neutralizza gli effetti
pato-fisiologici,ma sebbene leghi sia la forma solubile che transmembranica
della citochina,non induce apoptosi dei linfociti e dei monoliti nel sangue
periferico. Il farmaco è risultato complessivamente ben tollerato: gli effetti
collaterali gravi sono stati rari e distribuiti uniformemente tra i gruppi di
trattamento. In generale si osservano mal di testa, dolori addominali,
nausea,febbre, eruzioni cutanee e soprattutto al sito di iniezione, infezioni, fino
a possibili setticemia e tubercolosi.

6.18 Anticorpi anti il- 6r di nuova generazione


TOCILIZUMAB (actemra)-umanizzato

L’artrite reumatoide è una malattia infiammatoria autoimmune caratterizzata


da una iperattività di citochine infiammatorie come il TNFalfa,IL1,IL6. La terapia
con anti TNFalfa ed anti IL1 ha già dimostrato di possedere una certa efficacia
nel trattamento di questa patologia.L’Il6 rappresenta un altro target molecolare
nel trattamento dell’artrite reumatoide. Tocilizmab è un anticorpo monoclinale
umanizzato diretto contro i recettori dell’IL-6. Il legame ad alta affinità
dell’anticorpo ai recettori dell’IL-6 impedisce il legame della citochina pro-
infiammatoria ai suoi recettori e ne neutralizza gli effetti.

6.19 Anticorpi anti-cd11a


EFALIZUMAB (raptiva)- umanizzato

84
Efalizumab è un anticorpo monoclinale umanizzato ricombinante prodotto da
cellule ovariche di criceto cinese, con tecniche di ingegneria genetica.
Sequenze umane (Ig G1k) sono state inserite in luogo di quelle
murine,preservando solo le CDR originarie,importanti per il riconoscimento
dell’antigene. Efalizumab ha come bersaglio la subunità CD 11° dell’LFA-1
(antigene associato alla funzione dei linfociti), una proteina di adesione della
superficie delle cellule leucocitarie. Il legame specifico di Efalizumab
all’antigene CD 11a previene il legame tra LFA-1 e ICA-1 ,interferendo con
l’adesione dei linfociti T ad altri tipi di cellule LFA-1 è presente sui linfociti T
attivati. Gli effetti collaterali sono di norma lievi. Le reazioni avverse più
frequentemente osservate durante la terapia sono state sintomi simil-
influenzali acuti e dose-correlati.

6.20 Anticorpi anti –ALFA 4 integrine


NATALIZUMAB (tysabri)-umanizzato

Natalizumab è un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato prodotto in


una linea cellulare murina mediante la tecnologia del DNA ricombinante. È un
inibitore selettivo delle alfa4 subunità delle integrine umane alfa4 beta1 ed
alfa4beta7, espresse sulla superficie di tutti leucociti, ad eccezione dei
neutrofili. Natalizumab si lega al’integrina alfa4beta1 bloccando così
l’interazione con il suo recettore complementare VCAM-1, molecola di adesione
delle cellule vasali ,critica per il passaggio delle cellule T dalla periferia
all’interno del sistema nervoso centrale, e con i ligandi osteopontina 23 e CS-1.
l’alterazione di tali interazione molecolari impedisce la migrazione dei leucociti
mononucleati attraverso l’endotelio fino al tessuto parenchimale infiammato.
Un ulteriore meccanismo d’azione di Natalizumab può consistere nella
soppressione delle reazioni infiammatorie in atto nei tessuti
ammalati,mediante l’inibizione dell’interazione dei leucociti che esprimono
alfa4 con i loro ligandi nella matrice extracellulare e sulle cellule del
parenchima. In tal modo Natalizumab può sopprimere l’attività infiammatoria
presente nell’area malata ed inibire un’ulteriore migrazione nei tessuti
infiammati di cellule del sistema immunitario. TYSABRI è indicato come
monoterapia per il trattamento di pazienti con sclerosi multipla recidivante-
remittente. Gli effetti indesiderati più comuni associati a Natalizumab sono
stati: infezione (delle vie urinarie,del naso e della gola),orticaria (rash), mal di
testa, vertigini, vomito, nausea, artralgia, brividi, piressia e stanchezza.
TYSABRI non va usato nei pazienti che potrebbero essere ipersensibili (allergici)
al Natalizumab o ad uno qualsiasi degli altri componenti,nei pazienti con PML e
nei pazienti a rischio di contrarre un’infezione.

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7.ALTRE APPLICAZIONI IN CAMPO
FARMACEUTICO
7.1 Anticorpi anti-gpiib/iiia
ABCIXIMAB (ReoPro®) frammento Fab

Abciximab è un singolo frammento Fab di un anticorpo monoclonale chimerico


murino/umano prodotto a partire dall’anticorpo monoclonale murino 7E3. La
proteina chimerica (IgG1k-7E3) originaria è una proteina ricombinante
costituita dalle regioni variabili del topo e dalle regioni costanti dell’uomo e
viene secreta nel mezzo di coltura da una cellulare di ibridomi, in cui sia stato
precedentemente inserito il
gene chimerico. Il
frammento Fab si ricava per
digestione della proteina
chimerica con la papaina. Il
prodotto finale è costituito
per il 50% circa da sequenze
murine e per il rimanente da
sequenze di origine umana.
E’ diretto contro il recettore
glicoproteico GPIIb/IIIa
situato sulla superficie delle piastrine umane. Questi recettori glicoproteici di
membrana appartiengono alla famiglia delle integrine, maggiormente coinvolti
nell’aggregazione piastrinica. Si ritiene che Abciximab comporti un
impedimento sterico e modifiche conformazionali a livello del recettore
glicoproteico, con il conseguente blocco dell’accesso al recettore delle grandi
molecole di adesione, e quindi
della capacità delle piastrine di
legarsi. Inoltre, l’ Abciximab si
lega al recettore della
vitronectina presente sulle
piastrine e sulle cellule
endoteliali. Il recettore della
vitronectina è responsabile delle
proprietà pro-coagulanti delle
piastrine e delle proprietà
proliferative delle cellule
endoteliali e muscolari lisce della
parete vasale. A causa della
86
duplice specificità, Abciximab blocca più efficacemente il meccanismo di
amplificazione della generazione di trombina conseguente all’attivazione
piastrinica, rispetto ad altri composti che inibiscono solo il recettore GPIIb/IIIa.
Approvato dalla FDA nel 1994 REOPRO® è formulato in soluzione acquosa
tamponata (pH 7.2), non contiene conservanti ed è indicato per mono
somministrazioni. Deve essere impiegato subito dopo la diluizione. Il livello del
blocco dell’ 80% dei recettori è stato scelto come obiettivo per la dimostrazione
dell’efficacia farmacologica di REOPRO®. L’ Abciximab dovrebbe essere
utilizzato solo una volta: non si dispone di dati da indagine sistematica
concernenti la reiterazione del trattamento. Previene l’occlusione delle arterie
coronariche e le complicanze da angioplastica e impianto di stent. E’ un
potente inibitore dell’aggregazione piastrinica. La funzione piastrinica viene
ripristinata generalmente entro 48 ore, anche se il REOPRO® rimane in circolo
per 15 giorni o più legato alle piastrine. A causa della componente murina, la
somministrazione di Abciximab può causare la formazione di anticorpi umani
antichimerici. La risposta HACA, che può portare a manifestazioni allergiche, o
reazioni di ipersensibilità, è stata osservata in circa il 5-6% dei pazienti. Altri
effetti indesiderati comprendono complicanze emorragiche, trombocitopenia,
nausea, ipotensione, dolore toracico, febbre.

7.2 Anticorpi anti-proteina f di rsv


PALIVIZUMAB – (synagis®) – umanizzato

Palivizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato (classe IgG1k) prodotto in


linee cellulari stabili di mieloma murino. Per l’umanizzazione, sequenze
codificanti le CDR dell’anticorpo murino mAb1129 sono state introdotte in
sequenze di DNA codificanti le regioni variabile (Fab) e costante (Fc) di una
immunoglobulina umana. E’ diretto contro un epitopo nel sito antigenico A
della glicoproteina F, una delle due maggiori glicoproteine dell’envelope del
virus sinciziale respiratorio (RSV), e manifesta una potente attività
neutralizzante e inibitoria dei meccanismi di fusione nei confronti del RSV, sia
ceppi del sottotipo A, che in quelli del sottotipo B. Il legame di Palivizumab alla
glicoproteina F sulla superficie virale impedisce al virus di infettare le cellule, e
inibendo la fusione delle cellule indotta da virus, determina una potente attività
neutralizzante nei confronti dell’RSV. Rappresenta il primo anticorpo approvato
dalla FDA per la profilassi di una malattia infettiva. In Europa è stato approvato
nel 1999. E’ indicato per la prevenzioni di affezioni gravi del trattamento
respiratorio inferiore, che richiedono ospedalizzazione, provocate da RSv, nei
bambini ad alto rischio di malattia. In questi, l’RSV puo causare bronchiolite e
polmonite grave, con rischio di ospedalizzazione; mentre nei bambini che
godono di buona salute, l’RSV provoca una infezione lieve delle vie aeree
superiori. Synagis® viene somministrato per iniezione intramuscolare una volta
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al mese durante la stagione a rischio per il RSV, che ha l’incidenza massima tra
novembre e aprile. Commercializzato in polvere e solvente per soluzione
iniettabile, dopo la ricostruzione la stabilità è stata dimostrata per tre ore. I dati
di sicurezza dimostrano che Palivizumab è in genere sicuro e ben tollerato. La
maggior parte degli effetti indesiderati è stata di carattere transitorio e di
gravità da lieve a moderata. Anticorpi anti- Palivizumab sono stati riscontrati
approssimativamente, nell’1% dei pazienti durante la prima fase della terapia,
determinando una risposta HAHA clinicamente non rilevante. Gli effetti
indesiderati piu comuni comprendono febbre, reazioni in sede di iniezione,
nervosismo; di rado possono verifiacarsi episodi di difficoltà respiratoria,
reazioni da ipersensibilità, rash, disturbi gastrointestinali, diminuzione del
numero di globuli bianchi e alterazione dei test di funzionalità epatica. E’ in
fase di valutazione l’uso nei bambini con fibrosi cistica.

7.3 Anticorpi anti-ge


OMALIZUMAB (xolair®)-umanizzato

Omalizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato prodotto


con la tecnologia del DNA ricombinante in una linea cellulare
ovarica di criceto cinese
(CHO). L’anticorpo è una
IgG1k, contenente regioni di
supporto umane insieme a
regioni determinanti la
complementarietà di un
anticorpo murino (MAE11)
diretto contro le IgE. L’asma
allergica è scatenata dal
legame di IgE allergene-
specifiche al proprio
recettore (FcεRI), che
innesca il rilascio di istamina
e l’inizio della cascata
infiammatoria. L’individuo
che soffre di asma allergica,
a contatto con un allergene, produce un eccesso di IgE. La regione Fc della
catena pesante dell IgE si lega con alta affinità ai recettori situati sulla
membrana plasmatica di mastociti, basofili ed altre cellule. L’allergene che
interagisce con il suo sito di legame sulle IgE legate alle cellule, si lega
indirettamente al recettore attraverso un legame a ponte (cross-linking) e
attiva le cellule. Omalizumab legando con alta affinità il dominio Fc della IgE
previene il legame delle IgE al recettore espresso su mastociti e basofili.
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L’anticorpo lega lo stesso dominio sulla IgE che interagisce con il recettore
specifico e il complesso ad alta affinità (IgE-anti IgE) che origina, privo di
affinità per il recettore, riduce la quantità di IgE libera che può innescare la
cascata allergica; Omalizumab neutralizza in tal modo, le IgE libere nel siero e
blocca l’attivazione cellulare indotta da allergene. Inoltre, Omalizumab riduce il
rilascio di istamina ed il numero dei recettori situati sui mastociti e basofili.
Approvato dalla FDA nel 2003, xolair® è il primo farmaco biologico disponibile
per il trattamento dell’asma. E’ indicato per il controllo dell’asma allergica
grave e persistente, di accertata natura IgE mediata, in pazienti adulti e
adolescenti. Inoltre non è stato osservato nessun effetto rebound sul livello di
IgE dopo il periodo di eliminazione del farmaco. In generale, xolair® è ben
tollerato, è dispensato sotto forma di polvere e solvente per soluzione
iniettabile ed il prodotto deve essere utilizzato subito dopo la ricostituzione.
L’effetto collaterale piu frequente è stato rappresentato dalle reazioni al sito di
infezione, comprendenti dolore, gonfiore, eritema, prurito e cefalea. La maggior
parte delle reazioni è stata di lieve o moderata gravità. Tra gli effetti collaterali
non comuni, sono stati riportati infezioni parassitarie, alterazioni dell’apparato
respiratorio e gastrointestinale.

7.4 Anticorpi anti-vegf


RANIBIZUMAB (lucentis®) – frammento anticorpale

Il Ranibizumab è un frammento anticorpale umanizzato, derivato dall’anticorpo


monoclonale anti-VEGF bevacizumab, rispetto al quale ha delle proprietà
peculiari, quali il piccolo raggio ed il minor peso molecolare. Si riproduce in
cellule di Escherichia coli, impiegando la tecnologia del DNA ricombinante. E’
diretto contro il fattore di crescita endoteliale vascolare umano A (VEGF-A),
maggiore responsabile della formazione dei neovasi sottoretinici, causa
principale di perdita della funzione visiva nei pazienti affetti dalla forma
essudativa della degenerazione maculare. Nello spazio extracellulare,
Ranibizumab si lega con elevata affinità alle diverse isoforme del VEGF-A,
prevenendone così il legame ai recettori specifici VEGFR-1 e VEGFR-2. Il
legame del VEGF-A ai suoi recettori porta ad una proliferazione delle cellule
endoteliali, ad una neovascolarizzazione, e ad un aumento della permeabilità
vasale, che si ritiene contribuiscano alla progressione della forma neovascolare
della degenerazione maculare senile. Il blocco delle funzioni del VEGF-A
esercitato dal Ranibizumab comporta inibizione della crescita neovascolare e
riduzione della permeabilità vasale. Le piccole dimensioni del frammento
Ranibizumab, rispetto alla molecola intera bevacizumab, consentono una
ottimale capacità di penetrare tutti gli strati della retina e di diffondere nello
spazio sottoretinico, dopo somministrazione intravitreale. La somministrazione
per tale via ha l’obbiettivo di massimizzare l’effetto inibitorio del VEGF-A, senza
89
interferire con il suo ruolo fisiologico nei tessuti extraoculari. Approvato dalla
FDA nel 2006, è indicato per il trattamento della degenerazione neovascolare
essudativa correlata all’età. I risultati degli studi clinici hanno dimostrato che
quasi tutti i pazienti trattati con LUCENTIS® hanno mantenuto la loro acuità
visiva. Il 34-40% dei pazienti trattati ha manifestato un miglioramento
clinicamente significativo della visione, definita come aumento di 15 o più
lettere a 12 mesi. Nell’occhio, i più comuni effetti indesiderati causati da
Ranibizumab, o dalla procedura di iniezione, comprendono: emorragia della
congiuntiva e retinica, dolore all’occhio, corpuscoli o macchie nella visione,
aumento della pressione intraoculare, cataratta. Gravi eventi avversi correlati
alla procedura iniettiva si sono presentati in meno dello 0.1% delle iniezioni
intravitreali, tra cui il distacco della retina, cataratta traumatica.

7.5 Anticorpi in fase di sviluppo


DENOSUMAB (già AMG162)- umano

Il Denosumab è un anticorpo monoclonale interamente umano (IgG2),


sintetizzato in laboratorio, diretto contro il ligando del recettore attivante il
fattore nucleare kappa B, o RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B
ligand), mediatore primario del riassorbimento dell’osso. Il RANKL è una
citochina appartenente alla famiglia dei ligandi per TNF, responsabile della
riduzione del tessuto osseo mediata dagli osteoclasti, e quindi
dell’indebolimento e della fragilità ossee, in numerose condizioni
fisiopatologiche, quali osteoporosi, artrite reumatoide, metastasi delle ossa.
RANKL, legandosi al suo recettore RANK, espresso su cellule della linea
osteoclastica, stimola la differenziazione, l’attivazione e la sopravvivenza degli
osteoclasti e ne inibisce l’apoptosi. In condizioni fisiologiche, viene prodotta
l’osteoprotegerina (OPG), una citochina appartenente alla famiglia dei recettori
per il TNF, che agendo come un recettore solubile per il RANKL, ne modula gli
effetti. Alterazioni nel rapporto OPG/RANK/RANKL sono critiche nella patogenesi
del danno osseo di molte malattie, in quanto l’OPG, legando ad alta affinità il
RANKL, ne previene il legame con il suo recettore, localizzato sia sulla
superficie degli osteoclasti, che dei loro precursori. Il legame di OPG a RANKL,
impedendo la formazione e l’attivazione degli osteoclasti, aiuta a controllare il
processo di riassorbimento osseo. Denosumab, mimando l’azione dell’OPG,
inibisce specificatamente gli effetti del ligando di RANK, senza interferire con il
processo di formazione delle ossa, favorendo, inoltre, l’attivazione dei processi
di protezione endogeni. Il blocco risulta in una diminuzione del riassorbimento
osseo e in un aumento della densità minerale ossea. Negli studi condotti
Denosumab è risultato ben tollerato, senza alcuna differenza significativa, nel
verificarsi di effetti avversi, tra anticorpo, alendronato e placebo. Come effetti

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avversi non comuni, sono stati riportati anticorpi anti-denosumanb; infezioni;
neoplasie.

7.6 MNAC13 –umanizzato


MNAC13 è un anticorpo monoclonale umanizzato con azione bloccante il
fattore di crescita delle cellule nervose (NGF, nerve growth factor), uno dei
mediatori chiave del dolore. Nel trattamento del dolore cronico, sia la proteina
NGF che il suo recettore ad alta affinità (TrkA) rappresentano due bersagli
terapeutici estremamente importanti, dal momento che il sistema NGF/TrkA,
funzionando a monte di diversi meccanismi molecolari coinvolti nel processo
infiammatorio, costituisce un vero e proprio sistema di controllo della diffusione
dell’infiammazione a livello delle terminazioni nervose. Da un punto di vista
funzionale, i neuroni nocicettivi mostrano durante il processo infiammatorio
livelli aumentati di NGF; inoltre, la sensitizzazione dei nocicettori periferici è
ampiamente dipendente dalla disponibilità di NGF. Il legame specifico
dell’anticorpo al recettore TrkA è responsabile dell’azione inibitoria nei
confronti del fattore di crescita NGF. MNAC13, sostituendosi alla proteina NGF,
ne impedisce il legame con il suo recettore, riducendo la trasmissione e la
percezione del dolore. Nella prospettiva di una utilizzazione clinica, la
produzione della versione umanizzata dell’anticorpo risulta vantaggiosa, poiché
permette di ridurre il rischio di risposte immunitarie avverse da parte del
paziente. Tra i potenziali vantaggi della molecola MNAC13 sono da sottolineare
l’elevata specificità di azione e il profilo di tollerabilità, traducibili in un’elevata
efficacia terapeutica e un eccellente compliance alla terapia da parte del
paziente.

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