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ANTICORPI MONOCLONALI

INTRODUZIONE Struttura e funzione degli anticorpi


Quando un antigene entra nell'organismo, esso stimola una risposta immunitaria. Il principale elemento di questa risposta comprende l'attivazione di linfociti B selezionati per produrre anticorpi capaci di legare l'antigene (immunit umorale). Il legame con l'anticorpo pu ridurre/inattivare l'attivit biologica dell'antigene (specialmente se si tratta di una tossina), ed inoltre "marca" l'antigene per la distruzione da parte di altri elementi del sistema immunitario. Un dato anticorpo si legher solo ad una specifica regione dell'antigene, detta epitopo (nell'esempio riportato l'antigene contiene tre epitopi). La maggior parte degli antigeni che si trovano in natura (proteine, virus, batteri) contengono centinaia, se non migliaia di differenti epitopi. Un tipico epitopo sulla superficie di una proteina comprende da cinque a sette residui amminoacidici. Una molecola di anticorpo (immunoglobulina) costituita da due catene proteiche "leggere" (L) identiche e da due, anch'esse identiche, catene proteiche "pesanti" (H), tenute insieme tutte sia da legami a idrogeno sia da ponti bisolfuro esattamente localizzati. Le regioni N-terminali delle catene L e H formano in ciascun anticorpo il sito di riconoscimento dell'antigene. I siti che riconoscono e fissano gli antigeni sono costituiti da tre regioni determinanti la complementariet (CDR) collocate nell'ambito delle regioni variabili (VH e VL) alle estremit N delle due catene H e delle due catene L. Le CDR costituiscono la parte della molecola anticorpale che presenta la massima variabilit della sequenza amminoacidica. Oltre alle regioni variabili (VH e VL), ogni catena L contiene una regione, o dominio, costante (CL), e ogni catena H ha tre regioni, o domini, costanti (CH1, CH2, CH3). Digerendo gli anticorpi con l'enzima papaina, si liberano tre frammenti: due identici (Fab)-ognuno dei quali contiene una catena L intatta congiunta da ponte bisolfuro alle regioni CL e CH1 della catena H- e uno diverso (Fc), il quale consta di due frammenti di catena H, ognuno contenente i domini CH2 e CH3, congiunti da un legame bisolfuro. Il frammento Fab conserva l'attivit legante l'antigene. Una volta avvenuto il legame antigene-anticorpo, in una molecola anticorpale intatta la porzione Fc suscita parecchie risposte immunitarie: Si attiva la cascata del complemento. I componenti di questo sistema disgregano le membrane cellulari, attivano i fagociti e generano segnali per mobilizzare altri componenti del sistema di risposta immunitaria. Prende corpo la citotossicit cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) provocata dal legame tra la porzione Fc dell'anticorpo e il recettore Fc di una cellula ADCC effettrice. In seguito al legame tra la regione Fab e un antigene solubile la porzione Fc di un anticorpo si pu fissare sui recettori Fc delle cellule fagocitiche, che inglobano e distruggono il complesso anticorpo-antigene.

Principi alla base della produzione di Anticorpi monoclonali


Ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico epitopo, prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali (monospecifici). Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo termine di anticorpi. 1

La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose). Molte delle risultanti cellule ibride manterranno l'immortalit, oltre a produrre grandi quantit dell'anticorpo monospecifico.

La tecnica degli ibridomi pu servire quindi a mantenere una scorta continua di anticorpo monospecifico puro, e l'obiettivo attuale consiste nel progettare e produrre anticorpi monoclinali umani dotati tanto di specifiche propriet immunoterapiche quanto di bassa immunogenicit potenziale.

PREPARATI DI ANTICORPI POLICLONALI


I preparati di anticorpi policlonali sono stati usati per decine di anni per indurre immunizzazione passiva contro malattie infettive e altri agenti dannosi, in particolare tossine (es.antisiero equino contro l'infezione da Corynebacterium diphteriae). I preparati di anticorpi sono generalmente somministrati per iniezione endovenosa. Mentre questo fornisce un'immediata protezione immunitaria, l'effetto transitorio, e di solito persiste per sole due o tre settimane (per esempio finch gli anticorpi non sono escreti).

L'immunizzazione passiva pu essere usata come profilassi (es. somministrazione di anticorpi diretti contro tossine di serpenti a persone che debbano viaggiare in luoghi dove tali serpenti si trovino comunemente) o come terapia (es. somministrazione di anticorpi antiveleno immediatamente dopo il morso di un serpente).

Preparazione di un antisiero
I preparati di anticorpi usati per indurre immunit passiva possono essere ottenuti da fonti animali o umane. I preparati di origine animale sono in genere chiamati "antisieri", mentre quelli di origine umana sono detti "immunoglobuline". In entrambi i casi gli anticorpi predominanti sono le IgG. Gli antisieri sono generalmente prodotti per mezzo dell'immunizzazione di animali sani con appropriati antigeni. Piccoli campioni di sangue sono successivamente prelevati dall'animale e su questi si fa un'analisi quantitativa della presenza degli anticorpi desiderati (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). Il sangue viene raccolto usando una tecnica aseptica all'interno di contenitori sterili (in presenza di eparina o altro anticoagulante). La frazione anticorpale viene quindi purificata dal siero per mezzo di successive precipitazioni (etanolo e ammonio solfato) o di cromatografia ad alta risoluzione. Dopo questa purificazione si determina il titolo degli anticorpi, solitamente per mezzo di saggi biologici o immunologici. Spesso si aggiungono stabilizzanti come NaCl (0.9% w/v) o glicina (23% w/v). Come per tutti i preparati farmaceutici, ogni aspetto della preparazione di un antisiero devono sottostare alle regole di buona fabbricazione (GMP). Molte autorit regolatorie pubblicano linee guida che delineano le procedure di questi derivati del sangue.

Preparati di anticorpi policlonali di origine umana o animale usati per indurre immunit passiva contro specifici agenti biologici
Antibody Anti-D immunoglobulin Botulism antitoxin Diphteria antitoxin Diphteria immunoglobulin Haemophilus influenzae immunoglobulins Hepatitis A immunoglobulin Hepatitis B immunoglobulin Snake venom antisera Spider antivenins Tetanus antitoxin Tetanus immunoglobulin Source Human Horse Horse Human Human Human Human Horse Horse Horse Human Specificity Specificity against rhesus D antigen Specificity against toxins of type A, B or E Clostridium botulinum Antibodies raised against diphteria toxoid Antibodies exhibiting specificity for diphteria toxoid Antibodies raised against surface capsular polysaccharide of H.I. Specificity against hepatitis A surface antigen Specificity against hepatitis B surface antigen Antibodies raised against venom of various poisonous snakes Antibodies raised against venom of various spiders Specificity against toxin of Clostridium tetani Specificity against toxin of Clostridium tetani

Gli antisieri si sono dimostrati preziosi nel trattamento di molte patologie, ma possono anche indurre particolari effetti indesiderati, tra cui particolarmente degna di nota la loro capacit di 3

indurre reazioni di ipersensibilit, le quali possono arrivare fino allo shock anafilattico con la morte del paziente. A causa di questi rischi i preparati di anticorpi di origine umana (immunoglobuline) sono di solito i preferiti come agenti di immunizzazione passiva. Le immunoglobuline sono purificate dal siero (o dal plasma) di donatori umani con metodi similari a quelli usati per purificare gli anticorpi di origine animale. Sebbene reazioni di ipersensibilit possano verificarsi anche dopo somministrazione di preparati a base di immunoglobuline, l'incidenza di questi eventi nettamente minore rispetto al caso di preparati di origine animale. I preparati di anticorpi policlonali in uso terapeutico possono essere raggruppati secondo il loro target in: Anticorpi diretti contro specifici patogeni microbici o virali Anticorpi diretti contro tossine microbiche Anticorpi diretti contro il veleno di ragni e serpenti (antiveleno)

Immunoglobuline anti-D
Oltre agli antigeni dei maggiori gruppi sanguigni (es. A e B), noto un certo numero di altri alloantigeni (antigeni diversi tra individui della stessa specie) eritrocitari. Uno di questi l'antigene Rhesus (Rh), di cui esistono una serie di prodotti genici correlati; il pi importante antigene Rh conosciuto come antigene "D". In un feto proveniente da madre Rh-negativa e padre Rh-positivo, gli eritrociti saranno Rh positivi. Sebbene durante la gravidanza entrino nella circolazione materna piccole quantit di sangue fetale, queste non sono sufficienti per stimolare una forte reazione immunologia da parte della madre. Al momento del parto, invece, una significativa quantit di cellule del sangue fetale entra a contatto con la circolazione materna, e questo provoca l'immunizzazione della madre contro l'antigene Rh. Questo fatto mette in pericolo la salute del feto durante le successive gravidanze, poich gli anticorpi anti-Rh materni possono attraversare la placenta ed entrare nella circolazione fetale. Il legame degli anticorpi anti-Rh agli eritrociti fetali pu indurre emolisi, con conseguente eritroblastosi fetale del neonato. Questa situazione pu essere evitata mediante la somministrazione di anticorpi anti-Rh a madri Rh-negative immediatamente dopo la nascita di un neonato Rhpositivo. Gli anticorpi somministrati legano gli eritrociti fetali Rh-positivi e li marcano per la distruzione prima che venga innescata la reazione immunologia della madre. Di solito si somministra una dose di 200-300 g di anticorpi immediatamente dopo il parto. I preparati utilizzati sono purificati dal siero o dal plasma di individui Rh-negativi che siano stati immunizzati contro l'antigene D Rhesus. I preparati di anticorpi purificati possono essere commercializzati come liquidi (validit di due anni se conservati al freddo) o come liofilizzati (validit fino a cinque anni).

Immunoglobuline normali
Le immunoglobuline normali sono preparati di anticorpi purificati dal plasma, dal siero, o dalla placenta di donatori normali e sani. Il sangue ottenuto da questi individui conterr una vasta gamma di anticorpi specifici (prodotti nel corso degli anni, ogni volta che il sistema immunitario dell'individuo si sia trovato in contatto con vari antigeni, sia "naturalmente" -infezioni- che artificialmente -vaccini-). I preparati di immunoglobuline normali sono di solito purificati dal materiale raccolto da 1000 o pi donatori; tali preparati contengono in genere anticorpi contro difterite, morbillo, poliomielite, 4

epatite A, rosolia e varicella. Le immunoglobuline normali possono dunque essere usate per indurre immunizzazione passiva contro queste malattie.

Immunoglobuline contro Epatite B e tetano


Le immunoglobuline contro l'epatite B sono un esempio di preparato di anticorpi noto per contenere anticorpi diretti contro uno specifico patogeno, in questo caso il virus dell'epatite B. Le immunoglobuline per l'epatite B sono purificate dal siero o dal plasma di donatori che presentano alti tassi di anti-hepatitis B surface antigen (HbsAg) antibodies. Le IgG rappresentano pi dell'80 % delle proteine totali nel prodotto. Come altri preparati di immunoglobuline, possono essere commercializzate come liquidi o liofilizzati. Le immunoglobuline per l'epatite B vengono somministrate a persone entrate in contatto con il virus dell'epatite B, compresi i neonati le cui madri siano entrate recentemente in contatto con il virus. Le immunoglobuline contro il tetano sono un esempio di preparati di anticorpi usati per indurre immunit passiva contro una tossina microbica. L'antitossina tetanica somministrata abitualmente in caso di ferite soggette ad infezione tetanica. Il preparato di anticorpi viene purificato da pools di siero o plasma di donatori umani che siano stati immunizzati contro la tossina del tetano.

Antiveleno per serpenti e ragni


Preparati di anticorpi policlonali diretti contro le tossine di serpenti e ragni velenosi sono usati nella cura di individui che siano stati morsi o punti da serpenti o ragni. In molti casi l'immediata somministrazione dell'appropriato antisiero evita una morte certa. Il veleno dei serpenti costituito in larga parte da complesse miscele proteiche, alcune delle quali presentano attivit enzimatica. In genere l'antisiero per il veleno dei serpenti viene preparato iniettando a cavalli sani il veleno (di solito inattivato) o una miscela di veleni (preparati monovalenti o polivalenti). Gli anticorpi risultanti vengono poi purificati secondo lo schema rappresentato in seguito. Produzione di un antisiero per uso terapeutico per indurre immunizzazione passiva

Immunizzazione di grandi animali (es. cavalli)

Raccolta del plasma contenente gli anticorpi

Purificazione iniziale (precipitazione)

Aggiunta di stabilizzanti, conservanti e regolazione della potenza

Purificazione con cromatografia ad alta risoluzione (es.scambio ionico)

Filtrazione sterile e infialamento asettico

Prodotto liquido

Liofilizzazione

Prodotto in polvere

ANTICORPI MONOCLONALI
La tecnologia degli anticorpi monoclonali si sviluppata negli anni '70, quando Kohler e Milstein riuscirono a fondere cellule mielomatose immortali con linfociti B produttrici di anticorpi. Una parte degli ibridi ottenuti risultava essere stabile, con caratteristiche cancerose e capace di produrre anticorpi. Queste cellule, dette ibridomi, rappresentavano dunque una inesauribile fonte di anticorpi monospecifici (monoclonali).

Formazione e selezione delle cellule ibride


Il primo passo della produzione di una linea cellulare ibrida che produca un unico anticorpo l'inoculazione, nel topo o nel ratto, dell'antigene contro il quale si desidera venga prodotto l'anticorpo. Dopo parecchie inoculazioni e in capo ad un periodo di alcune settimane si saggiano gli animali per stabilire se hanno o meno sviluppato la risposta immunitaria. In caso affermativo essi vengono uccisi e se ne asporta la milza (che ospita i linfociti, le cellule che producono gli anticorpi), la si lava e trita, e si agita poi dolcemente per liberare le singole cellule, alcune delle quali saranno cellule B produttrici di anticorpi. Si mescola la sospensione di cellule spleniche con una sospensione di cellule di cellule mielomatose geneticamente prive dell'enzima ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi (HGPRT -). La miscela delle sospensioni cellulari viene mescolata con glicole polietilenico al 35% per alcuni minuti e successivamente trasferita a un mezzo di coltura contenente ipoxantina, amminopterina e timidina (mezzo HAT). Il trattamento con polietilenglicole facilita la fusione tra le cellule, ma anche cos gli eventi di fusione sono rari e casuali. Nella miscela esisteranno alla fine cellule mielomatose, cellule spleniche, cellule di fusione mieloma-milza, cellule di fusione mieloma-mieloma e cellule di fusione milza-milza. Il mezzo HAT, invece, permette la crescita delle sole cellule di fusione mieloma-milza, perch nessun'altra in grado di proliferarvi. Le cellule spleniche e quelle di fusione milza-milza non sono in grado di crescere in alcun mezzo. Le cellule mielomatose e quelle di fusione mieloma-mieloma, del tipo HGPRT - non sono in grado di utilizzare l'ipoxantina come precursore per la biosintesi delle purine guanina e adenina, che sono, naturalmente, essenziali alla sintesi degli acidi nucleici. Esse dispongono per di un percorso alternativo, naturale, per sintetizzare le purine, che si serve dell'enzima diidrofolato-riduttasi. E' per questo che si comprende nel mezzo l'amminopterina, che inibisce appunto l'attivit della diidrofolato-riduttasi. In definitiva le cellule HGPRT - mielomatose e di fusione mieloma-mieloma non sono capaci di sintetizzare nel mezzo HAT le purine e, di conseguenza, periscono. Quanto alle cellule di fusione milza-mieloma, esse sopravvivono nel mezzo HAT perch le cellule di milza contribuiscono con l'HGPRT funzionale, che pu utilizzare l'ipoxantina esogena del mezzo anche quando la produzione di purine affidata alla diidrofolato-riduttasi sia bloccata dall'amminopterina, e perch, inoltre, sono attive le funzioni della divisione cellulare delle cellule mielomatose. Si fornisce la timidina per superare il blocco della produzione di pirimidine causato dall'inibizione della diidrofolato-riduttasi ad opera dell'amminopterina. Da 10 a 14 giorni circa dopo il trattamento di fusione nel mezzo HAT saranno sopravvissute solamente, crescendovi, le cellule di fusione milza-mieloma. Tali cellule vengono allora distribuite nei pozzetti delle piastre da microdosaggio e fatte crescere in mezzo di coltura completo senza HAT.

Identificazione di specifiche linee cellulari ibride produttrici di anticorpi


Il compito successivo consiste nell'identificare le cellule ibride che producono anticorpi contro l'antigene immunizzante. Uno dei procedimenti comuni di selezione utilizza il mezzo di coltura, che contiene gli anticorpi secreti. Lo si raccoglie dai pozzetti che contengono cellule in crescita e lo si 7

aggiunge nel pozzetto di un'altra piastra da microdosaggio preliminarmente rivestita con l'antigene bersaglio. Se il mezzo di coltura contiene un anticorpo (anticorpo primario) che riconosce un epitopo dell'antigene vi si legher, e i successivi lavaggi non lo allontaneranno. Ai pozzetti della piastra si aggiunge un secondo anticorpo (anticorpo secondario) specifico degli anticorpi murini (di topo): si legher a qualsiasi anticorpo primario fissato sull'antigene. Prima di adoperarlo nell'immunodosaggio si coniuga il secondo anticorpo con un enzima che trasforma un substrato incolore in un composto colorato. La presenza di colorazione in uno dei pozzetti dimostrer che il mezzo di coltura conteneva un anticorpo specifico per l'antigene. Ove il mezzo di coltura non avesse contenuto anticorpi specifici dell'antigene in esame il primo lavaggio avrebbe lavato tutti gli anticorpi, e in questo caso l'anticorpo successivamente agiunto non avrebbe avuto modo di legarsi e sarebbe stato eliminato dal secondo lavaggio. Nei pozzetti in cui le cose si svolgono in questo modo la soluzione del substrato rimane incolore. I pozzetti della piastra da microdosaggio originale il cui mezzo fornisce all'immunodosaggio risposta positiva (colorazione) possono contenere una miscela di cellule di fusione. Tali cellule perci vengono diluite con mezzo di coltura e inoculate in pozzetti vergini, onde impiantare linee cellulari da cellule individuali (cloni). Dopo avere coltivato i cloni se ne saggia il mezzo nuovamente per stabilire quali linee cellulari (ibridomi) producano molecole di anticorpi monoclonali atte a riconoscere l'antigene bersaglio. Se si isola pi di un ibridoma specifico si effettuano ulteriori saggi per stabilire se i diversi cloni producano anticorpi contro il medesimo determinante antigenico. Ciascun clone produttore di anticorpi monoclonali pu essere mantenuto in coltura pi o meno indefinitamente, inoltre si possono congelare i campioni in azoto liquido per potere disporre in seguito di una fonte di cellule. Produzione di un anticorpo monoclonale (Mab)
Iniezione dell'Ag purificato

Isolamento delle cellule della milza

Cellule di mieloma

Fusione delle cellule

Selezione delle cellule di ibridoma in mezzo HAT

Inseminazione di singole cellule nei micropozzetti

Cellule in coltura Gli Ab vengono secreti nel mezzo di coltura

Saggio del mezzo di coltura per ricercare MAb che reagisce con l'antigene

Propagazione dei cloni positivi


Congelamento di uno stock di cellule Isolamento di MAb dal mezzo di coltura

La produzione degli anticorpi monoclonali pu essere anche condotta mediante iniezione degli ibridomi nella cavit peritoneale di ratti, che servono dunque da camera di fermentazione vivente. Crescendo, le cellule di ibridoma trapiantate producono anticorpi. Molti dei primi preparati di anticorpi monoclonali venivano prodotti in questo modo, tra questi OKT-3, il primo anticorpo monoclonale approvato per l'uso terapeutico dalla Food and Drug Administration. Questo metodo presenta per degli svantaggi quali l'alto costo e il fatto che il prodotto sia contaminato da significativi livelli di varie proteine murine. Di conseguenza la coltura di cellule animali diventata il metodo di elezione per la produzione di anticorpi monoclonali ad uso farmaceutico. La rimozione delle cellule dal mezzo contenente gli anticorpi portata a termine mediante centrifugazione o filtrazione, e normalmente si fa anche una ultrafiltrazione per concentrare il filtrato, che viene poi sottoposto a diverse purificazioni di tipo cromatografico. A seconda dell'utilizzo previsto, l'anticorpo pu poi essere coniugato a specifiche molecole "segnale" (es. radionuclidi o tossine). Alla fine vengono aggiunti al prodotto degli agenti stabilizzanti come tamponi, glicina o anche albumina. Il prodotto viene poi liofilizzato e venduto confezionato in atmosfera di gas inerte.

Produzione di anticorpi monoclonali mediante coltura di cellule animali


Fermentazione degli ibridomi Filtrazione (rimozione cellule) Ultrafiltrazione del filtrato (concentrazione)

Eventuali processi Addizionali (es. coniugazione di tossine)

Cromatografia addizionale (es. gel filtrazione)

Cromatografia di affinit

Preparato liquido Formulazione del prodotto finale Filtrazione sterile e infialamento asettico

Liofilizzazione

Preparato in polvere

Applicazioni terapeutiche degli anticorpi monoclonali


L'incomparabile specificit degli anticorpi monoclonali, unita alla loro relativamente facile produzione e alla possibilit di averne scorte pressoch inesauribili, li rende interessanti strumenti in campo biochimico. In campo terapeutico essi rappresentano di gran lunga la pi grande categoria di sostanze biofarmaceutiche attualmente in studio, e centinaia di queste preparazioni si trovano correntemente sotto sperimentazione pre-clinica e clinica. Negli anni '80 si focalizzata l'attenzione sul loro uso sia come agenti traccianti (diagnostica per immagini) o come diretti agenti terapeutici. I primi studi sono stati concentrati sul cancro, ma i preparati di anticorpi monoclonali vengono oggi usati in una gran variet di campi della medicina. Applicazioni cliniche degli anticorpi monoclonali in commercio Immunizzazione passiva Diagnostica per immagini (es. cancro, malattie infettive, patologie cardiovascolari) Terapia del cancro e delle patologie cardiovascolari Prevenzione della reazione immunitaria di rigetto nei trapianti di organi Diagnosi di gravidanza e di malattie a trasmissione sessuale Purificazione di prodotti industriali Rilevazione di molecole in tracce nei prodotti alimentari, agricoli e industriali

IMMUNOLOGIA DEI TUMORI


Come noto, la trasformazione di una cellula nello stato canceroso normalmente associata all'aumento dell'espressione di antigeni di superficie riconosciuti come estranei dal sistema immunitario dell'organismo ospite. La presenza di antigeni tomore-specifici implica che il sistema immunitario dovrebbe essere capace di riconoscere e distruggere le cellule trasformate (immunosorveglianza). Il sistema immunitario risponde alla presenza di alcuni tumori causando la loro parziale o completa regressione. I maggiori immunoelementi antitumorali includono: Linfociti T, capaci di riconoscere e lisare cellule maligne Cellule natural killer (NK) che, come alcune cellule T, possono indurre la lisi delle cellule tumorali Macrofagi, in grado di distruggere le cellule tumorali, prevalentemente mediante il rilascio di enzimi lisosomiali e metaboliti reattivi dell'ossigeno alla superficie della cellula tumorale. I macrofagi inoltre producono il Tumor Necrosis Factor, che uccide le cellule tumorali: a) mediante legame con il recettore TNF di superficie, che comporta tossicit diretta alla cellula b) promovendo la sintesi di citochine addizionali che possono, indirettamente, condurre alla distruzione del tumore mediante l'attivazione di altri elementi dell'immunit Anticorpi che, mediante il legame agli antigeni cellulari di superficie, marcano le cellule tumorali per la distruzione. Le cellule NK e i macrofagi esprimono recettori cellulari di superficie che si legano alla regione Fc dell'anticorpo. In questo modo l'anticorpo legato all'antigene tumorale dirige questi elementi del sistema immunitario direttamente alla superficie del tumore. Gli anticorpi attivano anche il complemento, che capace di lisare direttamente le cellule tumorali. 10

Strategie per la rivelazione e la distruzione dei tumori


La chiara identificazione degli antigeni associati a un tumore faciliterebbe la produzione di anticorpi capaci di legarsi selettivamente al tessuto tumorale. Tali anticorpi potrebbero essere usati per scoprire e/o distruggere le cellule tumorali. I preparati di anticorpi possono essere somministrati inalterati o (pi comunemente) dopo la loro coniugazione con radioisotopi o tossine.Il legame di anticorpi monoclonali inalterati alla superficie di un tumore dovrebbe indurre un aumento della distruzione delle cellule tumorali.

Questo approccio, comunque, non ha dato i risultati sperati, dato che i preparati di anticorpi monoclinali usati erano di origine murina. La regione Fc di questi anticorpi un attivatore molto debole delle funzioni immunitarie umane. Gli sviluppi della tecnica, permettendo la produzione di anticorpi monoclonali umani, potranno, in futuro, rendere questo approccio terapeutico ancora pi interessante. Gli anticorpi monoclonali non coniugati sono particolarmente interessanti poich non danno effetti tossici, come invece accade per gli anticorpi legati a tossine o a traccianti radioattivi. Diversi studi clinici hanno valutato lattivit di anticorpi monoclonali coniugati con isotopi traccianti, che sono di solito usati come potenziali agenti antitumorali. Il razionale di questa terapia sta nel selettivo rilascio dellagente radioattivo direttamente al sito del tumore. Una applicazione affine degli anticorpi antitumorali radiomarcati quella della diagnostica per immagini (immunoscintigrafia). In questo caso il radioisotopo utilizzato deve essere -emittente (cosicch la radioattivit possa penetrare allesterno attraverso il corpo). Uno dei radioisotopi pi usati il 99Tc, che ha sufficiente energia di emissione e una emivita relativamente breve (6 ore), che minimizza i danni conseguenti allesposizione del paziente. Dopo la somministrazione, il 99Tc si concentrer al sito del tumore, che sar facilmente visualizzato usando un adatto equipaggiamento per la rivelazione dei raggi . Tra gli anticorpi monoclonali radiomarcati per la diagnostica dei tumori ci sono quelli legati allIndio, capaci di legare le cellule di tumori ovarici e del colon-retto, approvati dalla FDA nel 1992. In Europa lEMEA ha pi recentemente autorizzato limmissione in commercio di due agenti di diagnostica per immagini: CEA SCAN e Technemab-K-1 (marcati con 99Tc), che non consistono nellintero anticorpo murino, ma solo del frammento legante lantigene.

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CEA-SCAN un frammento Fab di uno specifico anticorpo monoclonale murino diretto contro lantigene oncofetale umano (Carcino-Embryonic Antigen), espresso ad alti livelli da alcuni tumori, soprattutto del tratto gastrointestinale. Technemab-K-1 riconosce un antigene specifico presente sulla superficie dei melanomi, ed usato per visualizzare lestensione e la presenza di metastasi in casi accertati di melanoma. Produzione industriale di CEA-SCAN

Iniezione nella cavit intraperitoneale del topo di 5x106-1x107 cellule di ibridoma

Raccolta dopo 14-30 giorni dallinoculazione

Stoccaggio a 80 C se il processo non viene condotto immediatamente

Centrifugazione e filtrazione (0.2) del fluido contenente gli anticorpi

Purificazione degli anticorpi (due cromatografie a scambio ionico ed una per affinit)

Digestione con pepsina: si ottengono frammenti F(ab)2 ed Fc

Purificazione finale dei frammenti Fab mediante gel filtrazione

Riduzione di F(ab)2 usando cisterna come agente riducente

Aggiunta di eccipienti (saccarosio), filtrazione e infialamento asettico

Liofilizzazione del prodotto finito

Gli anticorpi monoclonali antitumorali possono essere anche usati per rilasciare tossine al sito del tumore. Dopo il legame alla superficie cellulare, la tossina coniugata allanticorpo spesso internalizzata via endocitosi. Si presume che, prima di essere distrutta, la tossina sia resa disponibile allinterno della cellula, cos da poter esplicare il suo effetto tossico.

Drug-based immunotherapy
Oltre al rilascio selettivo di tossine e radioisotopi al sito del tumore, gli anticorpi possono anche essere usati per il rilascio di farmaci al tumore. Si possono accoppiare chemioterapici antitumorali (adriamicina, amminopterina, metotrexato e alcaloidi della vinca) ad anticorpi monoclonali specifici per le proteine situate alla superficie delle cellule tumorali. Solo un numero limitato di molecole, per, pu essere coniugato ad ogni molecola di anticorpo, e questo riduce notevolmente il carico del rilascio di farmaco.

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Un approccio alternativo consiste nellutilizzare enzimi attivatori di un profarmaco accoppiati ad anticorpi monoclonali diretti contro antigeni specifici della superficie della cellula bersaglio. Profarmaco inattivi possono cos essere somministrati, per esempio, per via iniettiva, ed essere attivati solo alla superficie del tumore. Questo metodo stato chiamato Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) o Antibody-directed catalysis (ADC). A causa della sua natura catalitica, ogni anticorpo-enzima coniugato attiver molte molecole del profarmaco in questione, e molti degli agenti citotossico-attivi rilasciati alla superficie del tumore entreranno nelle cellule tumorali per diffusione semplice o per trasporto attivo mediato da carrier. I profarmaci usati per questa terapia dovrebbero essere poco costosi, prontamente biodisponibili e stabili alla degradazione chimica/enzimatica in vivo. Gli enzimi dovrebbero essere stabili in condizioni fisiologiche, manifestare un ragionevole numero di turnover in vivo e avere attivit indipendente da cofattore. Enzimi mammiferi sarebbero verosimilmente meno immunogenici di enzimi microbici. Tuttavia, luso di un profarmaco capace di essere attivato da un enzima mammifero potrebbe dare dei problemi nel caso in cui lenzima endogeno (umano) fosse capace di attivare il farmaco in siti distanti dal tumore.

Anticorpi antitumorali di prima generazione: perplessit


Nonostante la raffinatezza dellapproccio anticorpo-mediato per la rivelazione/distruzione dei tumori, i primi studi clinici hanno creato diverse perplessit. Diversi fattori hanno contribuito alla scarsa performance terapeutica, in particolare contro i tumori solidi. Molti di questi fattori sono direttamente o indirettamente collegati al fatto che la prima generazione di questi farmaci usava preparati di interi anticorpi monoclonali di origine murina. Tra questi fattori abbiamo: Insufficiente informazione esistente sugli antigeni associati ai tumori Gli anticorpi monoclonali murini inducono una risposta immunitaria quando somministrati agli umani Gli anticorpi penetrano difficilmente allinterno delle masse tumorali Gli anticorpi monoclonali murini mostrano un relativamente breve emivita quando sono somministrati alluomo Si ha uno scarso riconoscimento del dominio Fc degli anticorpi murini da parte dei meccanismi effettori umani

ANTIGENICITA' DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI MURINI


Limmunogenicit degli anticorpi rimane una delle limitazioni associate alla somministrazione di anticorpi monoclonali murini a soggetti umani. Nella maggior parte dei casi una singola iniezione di anticorpi monoclonali murini provocher una risposta immunitaria nel 50-80% dei pazienti, e generalmente si rivela la presenza di anticorpi umani anti murini (HAMA) entro 14 giorni dalla somministrazione, e ripetute somministrazioni (per esempio a scopo terapeutico) aumenteranno significativamente la risposta, anche in quegli individui che erano stati insensibili alla prima dose. La risposta immunitaria provocher la distruzione immediata delle seguenti dosi di anticorpi somministrate. In pratica, quindi, lefficacia terapeutica degli anticorpi monoclonali murini viene limitata alla prima o, al massimo, alla seconda dose somministrata. 13

Una strategia scontata per ovviare al problema dellimmunogenicit consisterebbe nella produzione ed uso di anticorpi monoclonali di origine umana, cosa possibile ma difficile. I linfociti umani produttori di anticorpi possono potenzialmente essere resi immortali per mezzo di : Trasformazione da infezione da virus di Epstein-Barr (EBV) Fusione con anticorpi monoclonali murini Fusione con linee cellulari linfoblastoidi umane Tuttavia restano alcuni ostacoli tecnici che impediscono la produzione di routine di preparati di anticorpi monoclonali umani. Questi includono: Fonte di cellule produttrici di anticorpi Metodi affidabili per limmortalizzazione dei linfociti Stabilit e capacit di produrre anticorpi delle risultanti cellule immortali Il primo stadio della produzione di anticorpi monoclonali murini prevede la somministrazione dellantigene al topo, cosa che chiaramente non pu essere fatta sull'uomo, mentre, per quanto riguarda i linfociti B, potrebbero essere prelevati dalla circolazione periferica, ma la maggior parte di questi non stimolata e il loro recupero dalla milza ovviamente impraticabile. Nonostante l'EBV sia capace di indurre trasformazione cellulare, pochi linfociti B presentano il recettore di superficie per questo virus, e quindi la maggior parte di essi risulta immune all'infezione. Anche dopo un'eventuale trasformazione, molti producono anticorpi IgM a bassa affinit, e le cellule sono spesso instabili. La fusione di linfociti umani con linee cellulari linfoblastoidi umane un processo molto poco efficiente, e la fusione di linfociti umani con cellule di mieloma murino porta a ibridi molto instabili. Questi ed altri fattori rendono la produzione di anticorpi monoclonali umani estremamente difficile e costosa.

ANTICORPI CHIMERICI E UMANIZZATI


La tecnologia del DNA ricombinante ha fornito un alternativo e riuscito metodo per ridurre l'immunogenicit innata degli anticorpi monoclonali murini. Sono stati clonati i geni di tutti i sottotipi di immunoglobuline umane, e questo ha permesso la produzione di vari anticorpi ibridi ad immunogenicit ridotta. Il primo metodo impiegato per ridurre l'antigenicit di un anticorpo monoclonale murino consistito nel costruire semplicemente dei geni "chimerici" che codificavano proteine in cui le regioni variabili degli anticorpi murini erano fuse con le regioni costanti di un anticorpo umano: l'anticorpo chimerico conservava la specificit di legame ma assomigliava maggiormente a un anticorpo umano naturale.

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Si dunque osservato che gli anticorpi chimerici: sono significamente meno immunogenici Hanno una prolungata emivita sierica Permettono l'attivazione di varie funzioni mediate dalla regione Fc Il grado di risposta immunitaria osservata dopo la somministrazione di una singola dose calato dall'80%, nel caso degli anticorpi murini, al 5% per gli anticorpi chimerici. Resta comunque la possibilit che ripetute somministrazioni di anticorpi chimerici portino a risposta immunitaria nel ricevente. L'"ibridazione" degli anticorpi monoclonali di topo e di ratto stata ulteriormente sviluppata, rispetto alla formazione delle molecole chimeriche appena viste, sostituendo negli anticorpi umani solo le CDR degli anticorpi monoclonali di roditore. Dato che possiedono affinit di legame per l'antigene simile a quella degli anticorpi monoclonali di roditore originali, questi anticorpi "umanizzati" potrebbero dimostrarsi utili come agenti terapeutici. L'umanizzazione degli anticorpi monoclonali umani si pu realizzare cos. Partendo da una linea di ibridomi di roditore, si possono isolare i cDNA per le catene L e H. La PCR servir ad amplificare le regioni variabili di tali cDNA. Gli inneschi oligonucleotidici adoperati per la suddetta amplificazione sono complementari alle sequenze delle estremit 5' e 3' del DNA che codifica le regioni variabili, dove le sequenze nucleotidiche si conservano in grado elevato da un gene anticorpale all'altro. In base alla sequenza nucleotidica dei cDNA delle regioni leggere e pesanti (VL e VH) si possono delimitare i confini delle CDR. Di solito si stabilisce immediatamente dove incominciano e terminano le CDR, giacch queste regioni presentano sequenza altamente variabile, laddove la sequenza delle regioni dell'intelaiatura tende relativamente a conservarsi. Sulla base della sequenza dei DNA che codificano le CDR di roditore si sintetizzano sei coppie di inneschi PCR oligonucleotidici. Ciascuna coppia di inneschi concepita per iniziare la sintesi del DNA di una delle CDR di roditore: tre provenienti dalla catena L, tre dalla catena H. Inoltre ogni innesco comprende alla estremit 5' 12 nucleotidi in pi, complementari alle regioni fiancheggiatrici interne al DNA dell'intelaiatura umana al quale indirizzato il DNA delle CDR di roditore. 15

Peptide segnale

FR 1

CDR 1 FR 2

CDR 2 FR 3 CDR 3 FR 4

P1 CDR 1

P2

A questo punto si utilizza la mutagenesi mirata agli oligonucleotidi per sostituire, una alla volta, le sequenze DNA complete di ognuna delle CDR umane con il DNA amplificato originante dai roditori. Cos facendo, per sostituire tutte le CDR occorrono sei cicli di mutagenesi mirata agli oligonucleotidi. Il procedimento "trapianta", di fatto, le CDR di roditore dentro l'intelaiatura dell'anticorpo umano. Successivamente si clonano i cDNA delle regioni variabili umanizzati in vettori di espressione che vengono poi introdotti in cellule ospiti idonee, di solito cellule di E. Coli o di mammifero, in modo da produrre gli anticorpi. Con questa tecnica sono gi stati umanizzati oltre 50 anticorpi monoclonali diversi; la tecnologia senza dubbio efficace e diffusamente applicabile, tuttavia costosa e lunga. Una strategia promettente comunque costituita da genoteche combinatorie a espressione fagica, costruite con mRNA provenienti da cellule B umane di donatori non immunizzati.

FRAMMENTI DI ANTICORPI
Una limitazione al trattamento dei tumori solidi per mezzo di anticorpi sta nella loro scarsa capacit di penetrazione nella massa tumorale, a causa delle loro dimensioni fisiche. Di conseguenza, stato di recente posto l'interesse sull'uso di frammenti di anticorpi, che mantengano la capacit di legare l'antigene. Frammenti come Fab, F(ab)2 e Fv possono essere prodotti facilmente per mezzo della tecnologia del DNA ricombinante, e sono stati legati, per esempio, a traccianti radioattivi per la diagnostica. Mentre la loro diminuita massa molecolare facilita la penetrazione del tumore, gli anticorpi chimerici o umanizzati interi si sono comunque dimostrati pi efficaci, soprattutto se usati per scopi terapeutici.

APPLICAZIONI DELL'INGEGNERIA DELLE PROTEINE AGLI ANTICORPI


Un altro modo in cui gli anticorpi vengono attualmente manipolati mediante modificazione dei loro domini effettori, ossia le regioni delle catene pesanti che definiscono la funzione anticorpale, quale, ad esempio, l'uccisione delle cellule segnalata dall'anticorpo stesso: secondo tale via possibile riprogrammare la modalit di azione di un anticorpo monoclonale. Una strategia promettente quella di sostituire interamente il dominio effettore con una sequenza che codifica una tossina: una proteina di fusione anticorpo-tossina convoglierebbe la tossina 16

specificamente alle cellule che hanno l'antigene bersaglio, e questo tipo di prodotto potrebbe essere un trattamento eccezionalmente potente nei confronti del cancro e di malattie virali come l'AIDS. L'ingegneria degli anticorpi viene impiegata anche per costruire anticorpi bispecifici, nei quali ognuno dei due bracci riconosce un antigene differente, consentendo cos all'anticorpo di fare da ponte fra due antigeni; per esempio un anticorpo bispecifico potrebbe riconoscere una proteina di una cellula tumorale con un braccio e una proteina di superficie di un linfocita T con l'altro, mettendo cos il linfocita killer a diretto contatto con la cellula tumorale. (v. figura seguente)

ALTRE APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI


Oltre alla cura del cancro, gli anticorpi monoclonali hanno vaste potenzialit terapeutiche, tra cui la rivelazione e il trattamento di patologie cardiovascolari, malattie infettive e varie altre patologie.

Malattie cardiovascolari
Sono state sviluppate varie preparazioni di anticorpi che facilitano la visualizzazione di patologie cardiovascolari quali infarto del miocardio, trombosi, arteriosclerosi. Ad esempio, frammenti (Fab) di anticorpi monoclonali anti miosina marcati con 111In sono stati usati nella diagnostica per immagini, poich l'anticorpo dimostra specificit per la miosina intracellulare cardiaca, che viene "esposta" solo in caso di infarto del miocardio.

Malattie infettive
Gli anticorpi monoclonali "per immagini" possono essere anche usati per visualizzare i siti o l'estensione di infezioni batteriche localizzate. Questo pu essere fatto utilizzando anticorpi radiomarcati che mostrino affinit di legame per specifici antigeni batterici di superficie. Un approccio indiretto prevede, invece, l'uso di anticorpi capaci di rivelare granulociti e vari altri leucociti che si concentrano al sito di infezione.

Malattie autoimmuni
L'autoimmunit la condizione in cui il sistema immunitario di un organismo designa come bersaglio elementi di se stesso, e questo deriva da errori di vari sistemi di controllo immunologici che sono normalmente responsabili del mantenimento dell'auto-tolleranza. E' stato stimato che circa l'1-2 % della popolazione degli Stati Uniti soffre di malattie autoimmuni, tra cui l'artrite reumatoide, la sclerosi multipla e alcune forme di diabete. In molti casi la risposta autoimmune deriva dall'inappropriata attivazione di uno specifico sottoinsieme di linfociti B e/o T. 17

L'approccio immunoterapeutico pi comune per trattare queste patologie consiste nell'indurre la deplezione delle popolazioni cellulari T e B. Questo pu essere fatto mediante la somministrazione di un anticorpo diretto contro un antigene di superficie di tali cellule. I primi studi, per esempio, hanno dimostrato che l'iniezione di un anticorpo non coniugato anti CD-4 (glicoproteina di superficie presente su molti linfociti T) in sette giorni riduce significativamente i sintomi clinici dell'artrite reumatoide e l'effetto dura per diversi mesi.

Prevenzione del rigetto nel trapianto di organi


Negli anni '70 si ritornati a prendere in considerazione l'immunizzazione passiva come mezzo per prevenire il rigetto immunitario degli organi trapiantati. Il criterio logico era quello di somministrare ai pazienti un anticorpo specifico che si legasse a certi linfociti, diminuendo la risposta immunitaria diretta contro l'organo trapiantato. Il primo ad essere approvato dalla Food and Drug Administration americana come agente immunosoppressore per il trapianto nell'uomo fu l'anticorpo monoclonale del topo OKT-3. I linfociti che si differenziano nel timo si chiamano cellule T e vari membri della popolazione delle cellule T agiscono come cellule aiutanti immunitarie ed effettrici, per cui rispondono del rigetto dell'organo. L'anticorpo monoclonale OKT-3 si fissa su un recettore della superficie cellulare detto CD3, presente sulle cellule T, e tale azione impedisce la piena risposta immunitaria e risparmia il rigetto all'organo trapiantato. L'immunosoppressione effettuata con questi mezzi stata accettabilmente efficace, anche se, come previsto, non sono mancati effetti secondari come febbre ed eruzione cutanea.

Anticorpi catalitici (abzimi)


Gli anticorpi catalitici o abzimi rappresentano un primo esempio della ricerca all'interfaccia tra chimica ed immunologia. Essi sono stati considerati come una nuova classe di enzimi che catalizzano reazioni per cui non esistono enzimi naturali. Jencks per primo, nel 1969, ipotizz il concetto di anticorpo catalitico, suggerendo che immunoglobuline che formavano selettivamente legami stretti con lo stato di transizione potessero avere azione catalitica. Lo sviluppo della tecnologia dell'ibridoma e l'ingegneria delle proteine hanno permesso di produrre anticorpi monoclonali omogenei e anticorpi modificati in quantit necessaria per purificare potenziali abzimi e caratterizzare le loro propriet.

ASPETTI COMMERCIALI
Dal punto di vista commerciale, gli anticorpi monoclonali hanno rappresentato una delle aree pi redditizie della nuova biotecnologia. Attualmente, circa il 30% dell'intero mercato dei prodotti per test diagnostici rappresentato dagli immunoassay, e si prevede che entro il 2000 le vendite arriveranno a toccare i 10 miliardi di dollari.

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