Sei sulla pagina 1di 77

SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE

BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
E. coli: 4.6 X 106 bp genome size, in terreni ricchi.
G= 22’, aerobiosi, per produzione di proteine
ricombinanti.

Tempo di ALCUNI MICRORGANISMI UTILIZZATI PER


riproduzione I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
• Aeremonium chrysogenum
• Bacillus brevis
• Bacillus subtilis
• Bacillus thurigiensis
• Corynebacterium glutamicum
• Pseudomonas
•Rhizobium
•Streptomyces
•Zymonas mobilis
SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE

• S. cerevisiae: 14 x 106 bp genome size, ben nota la


biologia molecolare e il metabolismo, genoma
totalmente sequenziato nel 1996, impiegato per la
produzione di proteine ricombinanti da eucarioti.

VETTORI VIRALI: PRODUZIONE IN SISTEMI CELLULARI


DI PROTEINE RICOMBINANTI E
VACCINI.
PROCEDIMENTO DI CLONAZIONE DEL DNA
RICOMBINANTE
DNA Vettore di

1 di partenza clonazione

Frammentazione
enzimatica

DNA Linearizzazione
bersaglio enzimatica

Unione DNA bersaglio-vettore


2 Di clonazione

Introduzione delDNA Costrutto di DNA


nella cellula ospite
Proteina codificata
Isolamento delle cellule con dal gene clonato
il gene clonato
4
Produzione di proteina
da gene clonato
3 Cellula ospite
Enzimi di restrizione 
Le biotecnologie ricombinanti sono in grado di analizzare e manipolare il 
materiale genetico essenzialmente utilizzando una serie  di specifiche attività 
enzimatiche con le quali possono “tagliare” e “cucire” il DNA 

Tra gli strumenti più utili a nostra disposizione si annoverano gli enzimi di 
restrizione, enzimi capaci di riconoscere sul DNA brevi sequenze bersaglio, di 
solito palindromiche tagliandole in posizioni specifiche. 
Una palindrome è una parola che si legge allo stesso modo sia da destra che da 
sinistra, per es. la parola radar oppure  ala.  Un sito di riconoscimento 
palindromico è una sequenza in cui il filamento superiore e inferiore, letti in 
direzione 5’­3’, sono uguali. Per es. la sequenza: 

5 −ΓΑΑΤΤΧ−3
3 −ΧΤΤΑΑΓ−5
Gli enzimi di restrizione furono scoperti intorno agli anni ‘50 e devono il loro nome al 
fenomeno della restrizione­modificazione controllata dalla cellula ospite.  Si notò che 
talvolta  l’introduzione in E.coli di DNA esogeno, proveniente da un diverso ceppo di 
E.coli, risultava nella sua rapida frammentazione in piccoli frammenti (restrizione). 
L’analisi di un DNA virale rivelatosi capace di resistere alla degradazione, rivelò, una 
decina di anni più tardi, la presenza di alcune basi metilate. Si scoprì, quindi, 
l’esistenza in E.coli di sistemi di restrizione/modificazione capaci di metilare 
specifiche basi e, contemporaneamente, di tagliare le stesse basi quando non metilate.  
Con questo sistema E.coli è capace di degradare DNA esogeno tagliandolo in specifici 
siti di riconoscimento. Gli stessi siti presenti sul DNA endogeno, tuttavia, non sono 
tagliati perché preventivamente metilati dal sistema di restrizione­metilazione 
ENZIMI DI RESTRIZIONE
ISOLATI DAI BATTERI RICONOSCONO BREVI SEQUENZE DI DNA
E TAGLIANO MOLECOLE DI DNA IN SITI SPECIFICI
(SITI DI RICONOSCMENTO)

RICONOSCONO COME SITI “TARGET” ESANUCLEOTIDI MA


ANCHE SEQUENZE DI DNA DI 4,5,8 NUCLEOTIDI

-N-N-GAATTC-N-N
EcoRI -N-N-CTTAAG-N-N

Specifica sequenza palindromica

TAGLIA TRA I RESIDUI DI GUANINA E DI ADENINA


DI CIASCUN FILAMENTO
EcoRI:
TAGLIO SIMMETRICO E SFALSATO

Scanner pag 43 fig 4.2

SI PRODUCONO DUE ESTREMITA’ COMPLEMENTARI AD UN SOLO


FILAMENTO (ESTREMITA’ COESIVE).
EcoRI:
TAGLIO SIMMETRICO E SFALSATO
Legame internucleotidico

3’ 5’

SI PRODUCONO 2 ESTREMITA’ COMPLEMENTARI AD UN SOLO LATO


(ESTREMITA’ COESIVE)
HindIII:
TAGLIO CON ESTREMITA’ NETTE

SI PRODUCONO MOLECOLE DI DNA TERMINANTI PARI


(ESTREMITA’ NETTE)
SEQUENZE DI RICONOSCIMENTO DI ALCUNE
ENDONULEASI DI RESTRIZIONE
ENZIMI DI RESTRIZIONE

3 CLASSI:
• TIPO I E III:
ATTIVITA’ DI RESTRIZIONE E DI METILAZIONE NELLA STESSA
MOLECOLA. ASPECIFICITA’ DI TAGLIO: NON USATI IN BIOLOGIA
MOLECOLARE.
• TIPO II:
2 ATTIVITA’ SU MOLECOLE DISTINTE. ELEVATA SPECIFICITA’ DI
TAGLIO.

NOMENCLATURA
GENERE E SPECIE DEL BATTERIO DA CUI E’ STATO ISOLATO.

ISOSCHIZOMERI
RICONOSCONO LA STESSA SEQUENZA DI TAGLIO.

SPECIFICITA’ SITO SPECIFICA E FREQUENZA DI TAGLIO


Specificità sito­specifica e frequenza di taglio
 
La straordinaria importanza degli enzimi restrizione risiede nella loro 
specificità. Ogni particolare enzima di restrizione, infatti, riconosce una 
sequenza specifica di basi all’interno di una catena polinucleotidica.  La 
maggior parte degli enzimi più comuni riconoscono da 4 a 6 basi.

 Il numero di basi riconosciute è di importanza pratica perché determina la 
frequenza media di taglio e la dimensione media dei frammenti generati. 

E’ ovvio che un enzima che riconosce una sequenza di 4 basi taglierà più 
frequentemente di uno che ne riconosce 6.
  
ENZIMI DI RESTRIZIONE

• LA MAGGIOR PARTE FUNZIONA IN SEMPLICI


TAMPONI TRA pH 7 E 8, DI SOLITO A 37°C.
(SPECIFICHE DEL FORNITORE)

• UNITA’ DI ENZIMA

• “EFFETTO STAR”
ENZIMI DI RESTRIZIONE: MODALITA’ DI TAGLIO

•Generano estremità piatte (blunt)

Es. SmaI
5'-CCC GGG-3'
3'GGG CCC-5’

•Generano estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protuding)

Es. EcoRI
5'-G AATTC-3'
3'-CTTAA G-5’

•Generano estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' (3' protuding)

Es. PstI
5'-CTGCA G-3'
3'-G ACGTC-5'
ELETTROFORESI SU GEL
ESTRAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA DA GEL DI AGAROSIO 
(POLISACCARIDE RICAVATO DA ALGHE MARINE)

ESEMPI DI SISTEMI DI PURIFICAZIONE:

•       elettroeluizione
•       colonne a scambio ionico
•       gel­filtration
•       ultrafiltrazioni
•       agarosio a basso punto di fusione
•       ecc. ecc.
VETTORI PLASMIDICI
MOLECOLE DI DNA CIRCOLARI, A DOPPIO FILAMENTO CAPACI
DI AUTOREPLICAZIONE CHE SI MANTENGONO NEI BATTERI
COME ENTITA’ EXTRACROMOSOMALI INDIPENDENTI

CARATTERISTICHE ESSENZIALI:

PLASMIDE • ORIGINE DI REPLICAZIONE


• MARCATORE SELEZIONABILE
• SITI DI RESTRZIONE UNICI
• GRANDEZZA 1-500 Kb
• GRANDEZZA INSERTO 0.1-10-15 Kb
• ELEVATO N° DI COPIE: 10-100 COPIE
• BASSO N° DI COPIE: 1-4 COPIE
Replicazione plasmidica
• “repliconi”
molecole capaci di replicazione autonoma. Presenza di una 
origine di replicazione, chiamata ori (Nel caso dei plasmidi oriV, per “ori vector”))

replicazione   (uni o bi­direzionale) 
circolo rotante

Richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico

Funzioni dell’origine di replicazione

•Il numero di copie

•La specificità d’ospite

•I gruppi di incompatibilità
 
                    NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE 
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE

Modalità di replicazione:
• quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la 
replicazione del cromosoma batterico e si di dicono sottoposti a controllo 
stringente. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.

• Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla 
replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassato. 
Sono presenti in molte copie ­ fino a 1000 ­ per batterio. 

 Plasmidi    ori numero di copie

PBR322 e derivati   PMB1  15­20 

PUC e derivati ColE1  500­700 

pACYC e derivati  p15A  10­12 

pSC101 e derivati  pSC10     1 ­5


Controllo del numero di copie

I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione
 plasmidica

L’inizio della replicazione può essere controllata regolando:

•  La disponibilità del primer necessario a innescare la replicazione del DNA plasmidico
•  La disponibilità di proteine essenziali alla replicazione
•  La funzionalità  di proteine essenziali alla replicazione
  SPECIFICITA' D'OSPITE

• Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie 
batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata ( narrow host range).   Per 
esempio PBR322 o PUC18 che si replicano solo in E.coli.   

• Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si 
dicono a largo spettro d'ospite (Broad host range). Per es. RK2 , è capace di 
replicarsi in molti batteri gram­negativi.

I plasmidi a largo spettro d'ospite derivano questa loro proprietà dal possesso 
di alcuni geni necessari per il riconoscimento dell' origine di replicazione. 
Dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico.
     GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’

Plasmidi con la stessa origine di replicazione (Inc) sono incompatibili tra loro.  

I batteri dipendono per la loro replicazione da componenti genetiche 
dell'ospite batterico in grado di riconoscere l'origine di replicazione e iniziare 
la replicazione. Per esempio i geni che codificano la DNA polimerasi, RNA 
polimerasi­ DNA dipendente, RNasi H ecc. Se in uno stesso batterio entrano 
due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per 
componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno 
dei due plasmidi verrà perso.   Possono invecere coesistere plasmidi con origine 
di replicazione diverse che appartangono a diversi gruppi di incompatibilità
MARCATORI SELEZIONABILI

I plasmidi naturali a volte codificano per uno o pochi geni non essenziali 
capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni. Per 
esempio possono codificare per la tossine batteriche o per geni di resistenza 
agli antibiotici. In alcuni casi, tuttavia, nessun vantaggio competitivo sembra 
essere associato alla presenza di geni di resistenza.

Tutti i vettori di clonaggio includono almeno un marcatore selezionabile. 

Hanno lo scopo essenziale di distinguere e selezionare le molecole 
ricombinanti. Inoltre, sotto un'appropriata pressione selettiva, stabilizzano il 
plasmide 

I marcatori selezionabili più utilizzati nei batteri sono i geni di resistenza agli 
antibiotici. Per esempio il gene per la Beta­lattamasi codifica per un enzima 
capace di idrolizzare l'anello lattamico degli antibiotici di tipo penicillinico (es. 
l'ampicillina). I batteri che contengono un plasmide con questo gene quindi 
( simboleggiato con Amp o Ap) possono crescere in terreni di coltura che 
contengono l'ampicillina.
SITI DI RESTRIZIONE UNICI
Per effettuare un clonaggio molecolare é necessario avere sempre 
almeno un sito di riconoscimento per una endonucleasi di 
restrizione. 

Il sito di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione deve 
essere presente nel vettore una volta sola per non distruggere 
l'integrità fisica del plasmide e non deve essere presente in 
regioni cis essenziali (es. ori o promotori) o in geni che codificano 
per funzioni essenziali (es. geni di resistenza).
TIPI DI PLASMIDI
• PLASMIDI F
• PLASMIDI R
• PLASMIDI DEGRADATIVI
• PLASMIDI CRIPTICI
• PLASMIDI DI GRUPPO DI INCOMPATIBILITA’
• PLASMIDI A CAMPO DI OSPITI RISTRETTO E
LARGO
• PLASMIDI INGEGNERIZZATI
GENETICAMENTE
COME SI PRESENTANO I PLASMIDI?
I plasmidi possono essere lineari o integrati nel
cromosoma batterico (episomi) ma, nella maggior parte
dei casi , sono molecole di DNA circolari

Nell'ospite batterico i plasmidi si presentano come molecole circolari


superavvolte, che, durante le manipolazioni sperimentali, possono
rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio
filamento.

nick

Plasmide circolare  Plasmide linearizzato
Plasmide superavvolto
       (supercoiled)
       rilassato        
GEL DI AGAROSIO E BROMURO DI ETIDIO:
Le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte.

forma linerizzata ( tagliata con un 
Plasmide: enzima di restrizione in un sito unico)
forma rilassata
forma lineare
forma superavvolata
PLASMIDE pBR322
CONTIENE SEGMENTI DI DNA CHE DERIVANO DA TRE PLASMIDI PRESENTI IN
NATURA IN CEPPI DI E. coli

• Amp R -------------------- PLASMIDE R1


• Tet R ----------------------- PLASMIDE R1
• ORI ------------------------- pMB1 (Col E1)

• SITI UNICI DI RESTRIZIONE

• ELEVATO NUMERO DI COPIE


CLONAZIONE DI DNA ESTRANEO IN UN VETTORE PLASMIDICO
FOSFATASI ALCALINA
• ENZIMA CHE RIMUOVE I GRUPPI FOSFATO
5’ DAL DNA PLASMIDICO RESO LINEARE
(DEFOSFORILAZIONE)

DNA LIAGASI T4
• DNA-LIGASI DERIVATA DAL
BATTERIOFAGO T4. FORMA LEGAMI
FOSFODIESTERI CONGIUNGENDO I GRUPPI
FOSFATO 5’ E OSSIDRILE 3’ DI MOLECOLE
DI DNA ADIACENTI.
• RICHIEDE ATP
TRASFORMAZIONE
PROCESSO CON IL QUALE SI INTRODUCE DNA
PURIFICATO IN UNA CELLULA BATTERICA

• TRATTAMENTO PRELIMINARE DI E. coli CON


CLORURO DI CALCIO (CaCL2)

• CARATTERISTICHE DELLA CELLULA OSPITE:


F) PRIVE DI GENI PER GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (Per
evitare la degradazione del clone)
G) NEGATIVE ALLA RICOMBINAZIONE (RecA-) (Per
evitare che il DNA inserto venga alterato)
SELEZIONE E SCREENING DI
MOLECOLE RICOMBINANTI
ES. SISTEMA pBR322 RECANTE UN DNA BERSAGLIO INSERITO
IN UN SITO BamHI
(SISTEMA SENSIBILE ALLA TETRACICLINA)

I TAPPA
PIASTRATURA DELLE CELLULE CONTENENTI LA MISCELA DI
TRASFORMAZIONE SU MEZZO CON AMPICILLINA

CRESCITA
LB/AMP
• CELLULE + pBR322 INTATTO SI

• CELLULE + pBR322-DNA CLONATO SI

• CELLULE NON TRASFORMATE NO


SELEZIONE E SCREENING DI
MOLECOLE RICOMBINANTI

II TAPPA
CELLULE CHE CRESCONO NEL MEZZO CON AMPICILLINA
VENGONO TRASFERITE IN UN MEZZO CON TETRACICLINA

CRESCITA
LB/TET
• CELLULE + pBR322 INTATTO SI

• CELLULE + pBR322-DNA CLONATO NO


Make a replica plate of original Amp plate and transfer to Tet.
• plasmids with insert will not grow on Tet (will be TetS)

Colonies of AmpR E.coli


Colonies missing on Tet plate

Master Plate Replica Plate


Ampicillin in Tetracycline in
media media

Go back to master plate and pick colonies


that were missing on Tet plate. These will
be transformed E. coli with insert of interest.
ALTRO VETTORE DI CLONAZIONE PLASMIDICO: pUC19

INCORPORATA NEL
GENE lacZ’

• GENE lacZ’: GENE PER LA b-GALATTOSIDASI


DELL’OPERONE PER IL LATTOSIO DI E. coli

• GENE lacI: PRODUCE UN REPRESSORE CHE REGOLA


L’ESPRESSIONE DEL GENE lacZ’.
PROCEDIMENTO DI SELEZIONE DI pUC19

PIASTRATURA DELLE CELLULE OSPITI SU UN MEZZO


(LB) CONTENENTE AMPICILLINA, IPTG E X-Gal

4. CRESCITA IN PRESENZA DI IPTG (ISOPROPIL-BETA-D-


TIOGALATTOPIRANOSIDE)
INDUTTORE DELL’OPERONE lac------- IL REPRESSORE
PRODOTTO DA lacI NON SI LEGA ALL’OPERATORE DI lacZ’------
TRASCRIZIONE DI lacZ’------BETA-GALATTOSIDASI ATTIVA

8. PRESENZA DI X-Gal SUBSTRATO (5-BROMO-4-CLORO-3-


INDOLIL-BETA.D-GALATTOPIRANOSIDE)
L’X-Gal VIENE IDROLIZZATO DALLA BETA-GALATTOSIDASI IN
UN PRODOTTO DI COLORE BLU.
SELEZIONE

1. CELLULE + pUC19 INTATTO:


CRESCONO IN AMP -------- COLONIE BLU

2. CELLULE + pUC19-DNA CLONATO:


CRESCONO IN AMP -------- COLONIE BIANCHE

3. CELLULE NON TRASFORMATE:


NON CRESCONO IN PRESENZA DI AMP.
Identifying Transformants

pUC Vector

Blue white

Ampicillin +IPTG+ X-Gal


media
Allows for selection and screening
Ampicillin media on one plate. No need for replica plating
Pick white colonies on Amp, IPTG and X-gal
Select for White colonies on Ampicillin (AmpR)
and X-gal plates (LacZ-)
EVOLUZIONE DEI VETTORI DI CLONAGGIO
Da questi due vettori di clonaggio sono derivati decine di nuovi altri
vettori. La tendenza é quella di creare vettori più piccoli e
funzionali.

VANTAGGI

1) E' più maneggevole. Per esempio é più difficile danneggiarlo o


introdurvi interruzioni a singola elica durante le manipolazioni
sperimentali.

2) E' più facile estrarlo. I principali metodi di separazione dei


plasmidi dal cromosoma batterico si basano sulla denaturazione degli
acidi nucleici ( per es. mediante calore o basi diluite) e sulla loro
successiva rinaturazione. Mentre i plasmidi, di piccole dimensioni,
rinaturano rapidamente il grosso cromosoma batterico non riesce a
rinaturare velocemente e viene selettivamente eliminato.
La velocità di rinaturazione plasmidica é inversamente proporzionale
alla dimensione. Quanto più piccoli sono, quindi, tanto più facile é il
loro isolamento.
EVOLUZIONE DEI VETTORI DI CLONAGGIO

VANTAGGI

3) E' più facile introdurlo dentro un batterio. I metodi di "trasformazione" sono


essenziali nella tecnologia del DNA ricombinante. esistono varie tecniche, come la
trasformazione con CaCl2 o l'elettroporazione, ma in tutti i casi l'efficenza di
trasformazione é inversamente proporzonale alla dimensione plasmidica.
Un'ulteriore tendenza é quella di sostituire i siti di restrizione unici con Multi cloning
sites sempre più completi. Questa caratteristica (in genere) facilita il lavoro di
clonaggio permettendo di utilizzare l'enzima di restrizione più conveniente. Questo
problema é particolarmente sentito quando si devono clonare inserti di grosse
dimensioni in cui possono essere presenti numerosi siti di restrizione. Numerosi altri
vettori più o meno "specializzati" sono reperibili per gli utilizzi più disparati:
trascrizione in vitro, inserzioni di trasposoni, selezione di mutazioni, clonaggio di
frammenti amplificati con PCR, vettori "shuttle" che contengono più origini di
replicazione ecc.
Vettori per la clonazione di frammenti di
DNA di grandi dimensioni

• VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO λ


Formazione di genoteche (DNA > 10kb)

• COSMIDI
DNA clonato di 40 kb

• SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A INSERTO


MOLTO GRANDE
DNA clonato > 100 kb
VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO λ

• CICLO LITICO E LISOGENO

• LUNGHEZZA DNA DEL BATTERIOFAGO λ:


50 kb. 20 kb INDISPENSABILI PER EVENTI DI
INTEGRAZIONE-ESCISSIONE (I/E)

• SOSTITUZIONE DI QUESTE 20 kb CON


ALTRETTANTE DI DNA CLONATO

• BATTERIOFAGO LAMDA “RICOMBINANTE”


(Cicli litici obbligatori)
I Batteriofagi
A partire dalla scoperta iniziale (intorno alla secoda decade del 900’) sono stati isolati e
caratterizzati numerosi batteriofagi, ciascuno con differenze genetiche e strutturali.
fago capace di integrarsi nel genoma batterico sfruttando delle integrasi virali
batteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima
transposasi.
batteriofago , il fago di maggior interesse in Biologia molecolare, può utilizzare due
stili di vita all'interno del batterio: il ciclo litico e il ciclo lisogeno

• Ciclo litico:
litico il
batteriofago replica il
proprio corredo genetico,
si assembla in virione
maturo e lisa la cellula
uccidendola.
• Ciclo lisogeno: il fago é
capace di integrare il
proprio DNA nel
cromosoma batterico,
mantenendolo in uno stato
profagico inattivo e non
dannoso per l'ospite
batterico .
A livello molecolare il controllo della scelta del ciclo litico o di quello lisogeno dipende dall’espressione 
di una serie di repressori proteici. Il repressore essenziale nel mantenimento del ciclo lisogeno è cI. La sua
presenza reprime efficacentemente l’espressione dei geni del ciclo litico. La proteina più importante per
lo stabilirsi del ciclo litico è il prodotto del gene S.

geni tardivi

ricombinazione lisogenia replicazione DNA lisi


geni della geni della
testa coda att intXis α  β  γ cIII N cI cro cII O P Q  S R
cos cos

cI cro cII O
N P
cIII
Q
γ
β S
α
xis R
int
att cos

i   d ella
n
Gen
i de Ge esta
t
coda lla
Lisi o Lisogenia?

Lamda è un fago temperato, che può infettare una cellula di E.coli e lisarla, producendo molte particelle
fagiche, oppure integrarsi nel cromosoma batterico replicandosi come parte integrante di coli senza produrre
danno alcuno. La scelta tra ciclo litico e ciclo lisogeno è influenzato da diversi fattori. Una volta che la scelta
è stata effettuata è, essenzialmente irreversibile, anche se una piccola percentuale di fagi possono revertire da
un ciclo all’altro.

L’espressione dei geni di λ si divide in fasi che portano all’espressione dei geni molto precoci, precoci,
intermedi e tardivi.L’espressione dei geni precoci utilizza essenzialmente le proteine di coli e porta alla
trascrizione dei geni N e cIII, a partire da PL e d cro e cII, a partire da PR.

I prodotti di cIII e cII e sono necessari all’espressione di cI, che, a sua volta reprime l’espressione della
maggior parte dei geni, incluso se stesso.

N e cro, d’altra parte codificano, rispettivamente per un fattore di antiterminazione e per un repressore di cI

Il prevalere dell’azione di N e cro porta alla repressione di cI, alla trascrizione dei geni intermedi e allo
stabilirsi del ciclo litico, mentre il prevalere dell’azione di cIII, cII e, quindi, cI, porta al ciclo lisogeno.

PR TL
cIII N cI cro cII

TL PL
Aspetti applicativi
Dal punto di vista pratico inizialmente i batteriofagici hanno suscitato molto interesse per un loro possibile
utilizzo contro agenti patogeni batterici. Completamente superato dall'introduzione degli antibiotici, questo
possibile utilizzo dei batteriofagi come "antibiotici naturali" sta nuovamente risquotendo qualche interesse, a
causa della comparsa di ceppi batterici resistenti agli antibiotici. Il principale campo di applicazione dei
batteriofagi, tuttavia, consiste nello sviluppo di diversi tipi di vettori per biologia molecolare.
molecolare Fra i più
comuni citiamo, ovviamente, il fago λ , ma anche M13, T3, T7 e f1.

Packaging in vitro

Sebbene il DNA possa essere inserito in un batterio per trasformazione, la dimensione del genoma di λ rende
questa metodica poco efficiente. Si preferisce sfruttare, in alternativa, il sistema di packaging in vitro di λ .
In una normale infezione litica, λ comincia a replicarsi con la modalità del circolo rotante, producendo lunghi
concatenameri. Questi vengono successivamente ridotti in frammenti lineari, delimitati dalle estremità cos,cos e
impacchettati all’interno di un capside vuoto. In seguito all’assemblaggio con una coda, si ricostituisce un
virione maturo e infettivo. Il risultato di un’ infezione fagica consiste nella formazione di placche di lisi
traslucide su uno strato di batteri a confluenza.

Mescolando il DNA da inserire, con due colture di fagi difettivi, uno incapace di introdurre il DNA nei
capsidi vuoti e l’altro incapace di produrre capsidi vuoti, si riesce a produrre un packaging efficiente

A causa delle caratteristiche biologiche di λ, la produzione di lunghi stampi concatenati, risulta in packaging
più efficienti.
I vettori derivati dal fago l

I più importanti vettori fagici sono quelli derivati dal fago l. Il DNA di l è una molecola
lineare a doppio filamento di 48,5 Kb, caratterizzata dalla presenza alle estremità 5’ di due
terminali coesivi a singola elica di 12 bp. Queste code a singolo filamento sono chiamte siti
cos ( per cohesive ends ) e permettono la circolarizzazione del DNA di l dopo l’infezione della
cellula ospite.

La mappa genetica del fago l comprende circa 40 geni che possono essere suddivisi in tre
gruppi funzionali:

La parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della testa
e della coda.

La parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che porta
all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di questa regione
non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori.

La parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico.
Struttura generale dei vettori λ

La regione tra i geni J e N del genoma di λ, come dicevamo, non è essenziale per la crescita litica. In linea di
principio, un vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa 14500 bp di DNA estraneo, che
ricostituirebbero la lunghezza originale del genoma di λ. Nella testa, del fago, però, può trovare posto fino al
105% della lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di λ altre regioni non essenziali che
possono essere rimosse. Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo di circa 22 Kb di DNA
estraneo inseribile. Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma di λ, pari a circa 37 Kb, al di
sotto il DNA non viene impaccato e il λ non è vitale.

Esistono due tipi di vettori λ


* I vettori d'inserzione
* I vettori di sostituzione

I vettori che contengono un sito di restrizione unico (x) per l'inserzione di DNA estraneo sono chiamati
vettori d'inserzione.
d'inserzione Questi vettori sono più facili da utilizzare e possono accettare inserti di dimensioni da 8
fino a 10-12 Kb. Sono generalmente utilizzati per costruire librerie di cDNA.

I vettori con due siti di taglio, in cui la parte centrale del DNA (frammento stuffer) può essere rimossa e
sostituita con un frammento di DNA estraneo, sono chiamati vettori di sostituzione. Possono accettare inserti
da 10 a 22 Kb e sono in genere utilizzati per costruire librerie genomiche.

In linea generale tutti i λ utilizzati come vettori sono stati estesamente modificati. In particolare sono stati
creati siti di restrizione unici nella regione centrale, eliminando eventuali siti di restizione multipli mediante
mutazioni sito-specifiche. I vettori derivati da λ inoltre sono stati ridotti in dimensione rispetto al wild type,
eliminando la maggior parte delle sequenze non necessarie al ciclo litico. λ gt10 è un esempio di vettore
d'insezione, mentre EMBL3 rappresenta un esempio di vettore di sostituzione.
Clonaggio in vettori di sostituzione
I vettori di sostituzione permettono di clonare frammenti di 15­20 kb.  Si effettua una digestione genomica 
parziale con Sau3A e si purifica una popolazione intorno a i 15 kb.  Si digerisce quindi un vettore di 
sostituzione con BamHI, complementare a Sau3A, e si ligano insieme i  bracci destro, sinistro e la 
popolazione di digesti parziali di circa 15 Kb.

BamHI
digestione parziale 
 con Sau3A
ligazione
Isolamento frammenti sito cos sito cos
da 15 Kb

Packaging in vitro
infezione di E.coli
screening
Infezione di
E.coli

packaging in vitro

I frammenti privi di inserto 
e di “stuffer” sono troppo 
piccoli per essere impacchettati
e dare particelle virali

autoradiografia
gt10 + EcoRI Clonaggio in vettori di insezione

ligasi

Infezione di
E.coli

packaging in vitro
IL PACKAGING DEL DNA DEL BATTERIOFAGO l NELLE TESTE
DURANTE IL CICLO LITICO

50 kb
IL SISTEMA DI CLONAZIONE BASATO SUL BATTERIOFAGO l
La selezione nei vettori fagici
Il problema di selezionare i cloni ricombinanti è più complesso nei fagi a causa delle dimensioni e della
ridondanza delle genoteche da cui si parte

Dal punto di vista pratico la manipolazione e selezione dei batteriofagi ricombinanti è simile a quella
dei plasmidi. In entrambi i casi si utilizzeranno le stesse tecniche, già studiate, per manipolare il DNA.
Le principali differenze risiedono nell’introduzione del DNA nella cellula e nel tipo di colonie.

Ricordiamo che durante un’infezione litica il DNA virale


è introdotto, sotto forma di DNA lineare di circa 48.5 Kb,
all’interno della cellula batterica. Una volta all’interno
della cellula, il DNA fagico ricircolarizza, sfruttando le sue
estremità coesive cos, e si replica come molecola circolare
con una replicazione di tipo Teta, simile a quella batterica.
Da un certo momento in poi, lambda comincia a repilcarsi
con una modalità di tipo “rolling circle, cominciando a
formare lunghi concatenameri di singoli genomi fagici.
Contemporaneamente si esprimono i geni strutturali che
assemblano delle teste “vuote”, dove vengono inseriti
singole
unità di lambda ( un DNA di 48.5 Kb definito da due siti
cos). Infine viene assemblata la coda e i fagi lisano Il
batterio e fuoriescono.
Il packaging in vitro sfrutta l’esistenza di fagi mutanti, che producono teste fagiche vuote, in
quanto mancanti di una proteina necessaria per il packaging, e di fagi capaci di effettuare il
packaging ma incapaci di produrre le teste. Mescolando in provetta queste due popolazioni
fagiche insieme al nostro DNA, avremo un’efficiente packaging in vitro. I fagi ricombinanti
saranno quindi utilizzati per
Infettare una popolazione di batteri sensibili ai fagi in soft agar. Il risultato sarà la produzione di
placche di lisi, apparentemnte simili a colonie batteriche.
La selezione nei vettori fagici
Anche nel caso dei vettori fagici il primo problema è quello di selezionare i fagi ricombinanti che
contengono un inserto clonato da quelli che contengono vettori senza inserto.

* Nel caso dei vettori di sostituzione, come ad esempio EMBL3, i fagi ricombinanti sono
automaticamente selezionati. La ligazione dei bracci destro e sinistro, infatti, ricostituisce un DNA
fagico le cui dimensioni sono inferiori al fatidico 75% del genoma virale necessario per
l'impacchettamento del DNA in un capside. Solamente i fagi ricombinanti contenenti un inserto di
dimensioni adeguate, potranno quindi ricostituire la dimensione sufficiente per poter essere
inpacchettati nel capside ed essere vitali.

* Nel caso dei vettori di inserzione sono utilizzate diverse strategie.

In molti casi, ad esempio nei Lambda Zap, viene utilizzata la selezione bianco/blu già descritta per i
vettori plasmidici, in cui l'inserto da clonare è posizionato all'interno del gene per la β -galattosidasi
interrompendone l'integrità strutturale. In presenza di un β -galattoside cromogenico, come l'X-gal, le
placche ricombinanti appariranno bianche, quelle prodotte fagi conteneti da vettori senza inserto
appariranno blu.

Lambda gt10 è un altro esempio di inattivazione inserzionale. Il sito EcoRI è posizionato in mezzo al
gene cI. Un inserzione al suo interno, dunque distruggerà l’integrità strutturale del repressore e il fago
non sarà più in grado di entrare nel ciclo lisogeno. Quindi i faghi senza inserzioni avranno colonie
torbide ( miscela di fagi lisogeni e litici) mentre i fagi con l’inserzione daranno placche chiare (placche
litiche). La distinzione può essere resa ancora più evidente usando E.coli recanti la mutazione hfl
( high frequency of lisogeny), in cui tutti fagi conteneti il solo vettorie non produrranno affatto placche.
I COSMIDI
• 40 kb DI DNA CLONATO

• MANTENUTI SOTTO FORMA DI


PLASMIDI IN E. coli

• PROPRIETA’ DEI PLASMIDI E DI


VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO
LAMBDA
I COSMIDI
DUPLICE VANTAGGIO

3. GRUPPI DI GENI E GENI GRANDI


VENGONO CLONATI PIU’
FACILMENTE
4. SCREENING DI UN NUMERO MINORE
DI CLONI AI FINI DELLA CREAZIONE
DI UNA GENOTECA
Cosmidi

Permettono  di  inserire  DNA  fino  a  45  Kb.    Un  cosmide  è  semplicemente  un  plasmide,  di  solito 
intorno alle 5 Kb,  contenente, un sito cos.  Come tutti i  vettori plasmidici contiene una ori, un 
marcatore  di  resistenza  e  siti  unici  di  restrizione  e  si  utilizza  nello  stesso  modo.      Invece  di 
trasformare  la  miscela  di  ligazione  per  trasformazione,  processo  che  sarebbe  piuttosto 
inefficiente, vista la dimensione media di un cosmide, si può utilizzare un packaging in vitro. Il 
cosmide infatti possiede un sito cos è può essere considerato un buon substrato per una reazione 
di  packaging,  purchè  abbia  dimensione  comprese  tra  37  e  51  Kb.  Considerando  la  dimensione 
media di un vettore cosmidico, la dimensione di un inserto che può essere clonato in un cosmide 
varierà tra 32 e 45Kb.
UN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICO

pLFR-5
UN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICO

SELEZIONE IN
PRESENZA DI
TETRACICLINA
SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A
INSERTO MOLTO GRANDE (>100kb)
• FACILITANO L’ANALISI DEI GENOMI
EUCARIOTICI COMPLESSI
• INDISPENSABILI PER:
- MAPPATURA GENOMA UMANO
- SCOPERTA DI GENI UMANI
ESEMPIO:
CROMOSOMI ARTIFICIALI BATTERICI
(BAC): COSTRUTTI VETTORE-INSERTO
BASATI SUL PLASMIDE F
Trasformazione di cellule procariotiche ed eucariotiche

Un aspetto importante di tutte le tecniche di ingegneria genetica è rappresentato 
Dalla introduzione del DNA ricombinante in una cellula ospite capace di 
replicarlo. 

La capacità di trasferire geni da un organismo ad un altro è alla base di tutte le tecni­
che di ingegneria genetica. L’efficienza di questo passaggio è cruciale per garantire il 
successo di qualunque clonaggio

Svariate strategie di trasferimento genico sono state evolute in diversi organismi e 
sono rimaste le tracce di antichi trasferimenti genici.    I batteri, per esempio, sono in 
grado di trasferire materiale genetico da batterio a batterio, mediante coniugazione; i 
virus infettando cellule suscettibili di vari organismi; i batteri del suolo del genere 
Agrobacterium riescono a trasferire e integrare stabilmente in cellule vegetali porzioni 
del loro genoma.
Recenti progressi nelle tecniche di trasferimento genico permettono oggi di trasferire 
ad alta efficenza, e in modo controllato materiale genico in altri organismi.  
L’introduzione di materiale genetico eterologo, cioè proveniente da un altro 
organismo, in una cellula viene generalmente  definita  trasformazione.  Bisogna 
tener conto, tuttavia, che il termine “trasformazione” è piuttosto generico, indicando, 
per esempio anche la trasformazione di cellule normali in cellule tumorali.

Generalmente per “trasformazione” s’intende il trasferimento di DNA in cellule 
batteriche, mentre per “trasfezione” il trasferimento genico mediato da batteriofagi o
virus. 

Per le cellule animali il termine “trasformazione” indica il passaggio da cellula
 normale a cellula tumorale, mentre l’introduzione di DNA eterologo nella cellula si
 definisce  “ trasformazione mediata da DNA” o, più frequentemente “trasfezione”.
Tipi di trasferimento genico
DNA

DNA
plasmidico
virus
Elettroporazione Trasfezione PEG
CaCl2 Elettroporazione 
Coniugazione DEAE­destrano
Trasformazione CaPO4
Cellula animale
Cellula batterica

Elettroporazione
cannoncino balistico
Agrobacterium

Elettroporazione
fusione di protoplasti Cellula vegetale
protoplasto
Principali metodi di trasferimento genico
Batteri Protoplasti
Elettroporazione Elettroporazione
trasformazione chimica con CaCl2 fusione di protoplasti
coniugazione batterica

Piante
elettroporazione
trasferimento mediato da Agrobacterium
cannoncino balistico
fusione di protoplasti

Cellule animali
PEG
Lieviti Elettroporazione 
PEG DEAE­destrano
Elettroporazione  CaPO4
DEAE­destrano
TRASFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI

• TRASFERIMENTO DI DNA IN E. coli (TRASFORMAZIONE)


– CaCl2 ICE-COLD
– HEAT SHOCK 90S, 42 °C
– EFFICIENZA: 107-108/µg DNA

• PERMEABILIZZAZIONE DELLA MEMBRANA MEDIATA DA


CAMPO ELETTRICO
– E. coli: - 25 microfarad
- 2,5 kilovolts
- 200 ohm
- 4,6 millisecondi
Efficienza: 109/µg DNA

• CONIUGAZIONE
Protocollo di trasformazione con cellule calcio­competenti
A.  CaCl2  method (fresh cells)

1. Dilute overnight LB culture 1:1000  into 100 ml of fresh LB broth at 37° C

2.Collect cells at O.D.A600=0.4­0.5 (It  may vary depending on the strains) and
   sediment at  4.000 x g  (=5000 rpm with A4 rotor * ) for 5’ at 4°C

3. Wash cells in  about half the volume ( 50 ml ) of cold  0.1 M CaCl2

4. . Sediment cells at 3.0000 xg for 5’ and resuspend very gently  in  about 1/4 the
volume
    ( 25 ml ) of cold 0.1 M CaCl2

5. Sediment cells at 3.0000 xg for 5’ and resuspend very gently in
    4 ml ) of cold 0.1 M CaCl2. Stand on ice for  at least 30’.

6. Add DNA in  a volume as little as possible (up to 0.1 ml) to a 200 µl  aliquot of
competent
    cells  and incubate on ice from 1 hour to all day

7. Heat shock for 90’’ at 42°C.  (important!)

8. Add 0,8 ml of LB without drugs and incubate without shaking for 1 hour

9. Plate on selective media by spreading.
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
I plasmidi possono essere classificati in due gruppi; plasmidi coniugativi e non coniuga­
tivi in relazione alla loro capacità di trasferire materiale genetico tra batteri mediante la 
coniugazione batterica. In generale, sono i plasmidi di grosse dimensione ad essere
coniugativi, mentre la maggior parte dei piccoli vettori usati in ingegneria genetica, non 
lo sono. 
Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:

• Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)
• I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)
• I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus mob (mobilizzazione)

Plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili; tuttavia se un plasmide
possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando appositi batteri
helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti.
CONIUGAZIONE BATTERICA

La coniugazione batterica è un processo di trasferimento genetico tramite


il contatto tra due cellule.
Il materiale trasferito può essere un plasmide o una porzione di
cromosoma mobilizzato da un plasmide F.
CONIUGAZIONE BATTERICA
La maggior parte dei plasmidi utilizzati nella
ricerca è priva di funzioni coniugative, sicchè
il DNA di questi plasmidi non può essere
trasmesso alle cellule riceventi per
coniugazione.
Introducendo un plasmide con funzioni
coniugative in una cellula batterica già in
possesso di un vettore plasmidico
mobilizzabile, si può trasferire il suddetto
vettore a una cellula ricevente.
MESCOLAMENTO DI 3 CEPPI
• A: plasmide mobilizzabile
coniugativo

• B: vettore di clonazione
mobilizzabile non
A
coniugativo (di interesse)
B C
• C: cellula ricevente
bersaglio
ESEMPIO DI SELEZIONE
• Ceppo A: non può crescere su mezzo
minimo, AMP sensibile

• Ceppo B: non può crescere su mezzo


minimo, AMP resistente

• Ceppo C: cresce su mezzo minimo,


AMP sensibile
Avvenute le coniugazioni….
Crescita delle cellule per breve tempo su mezzo
ricco senza AMP

Trasferimento delle cellule su mezzo minimo con


AMP

Quali cellule potranno crescere in tali

condizioni
…. CELLULE BERSAGLIO CHE HANNO
ACQUISTATO IL VETTORE DI
CLONAZIONE PLASMIDICO!