Isolamento genico

Come si fa per trovare un gene? (per poi clonarlo)

Per trovare qualcosa bisogna sapere cosa si sta cercando.

Devo sapere qualcosa del gene che voglio trovare.

La proteina
Il fenotipo determinato da esso

L’organo o il tessuto di espressione

 Conoscendo la proteina

Screening con anticorpo Dalla squenza degli a.a.

su cloni batterici contenenti banca Ricostruisco il DNA
di cDNA. (attenzione al codon usage)

Sonda su libreria di cDNA

Estrazione del gene dal clone batterico

risultato positivo e sequenziamento. Ibridazione in situ
su piastra metafasica
Produzioni di anticorpi monoclonali
 Organo o tessuto dell’espressione

Fiore rosso flavonoidi antociani

Pianta
Foglia verde
Significa che il gene o i geni per i flavonoidi non sono espressi nelle
foglie ma nei fiori quindi solo in essi troveremo gli mRNA
corrispondenti.
Estrazione mRNA

fiore foglia
 Differentia dispaly RT-PCR

La sequenza clonata la uso come sonda in libreria (banca) o in situ

 Conoscendo solo il fenotipo

Ci troviamo nella situazione di Mendel

 Mi serve un “segugio molecolare” capace di cogliere la variazione
Fenotipica a livello genotipico.

Marcatore molecolare= è una differenza nella sequenza di basi del DNA

tra 2 individui in determinati loci che genera un
polimorfismo.

Caratteristiche
•Illimitati perché basati sulla variabilità
•Ubiquitari perché il DNA è in tutte le cellule
•Non influenzati dall’ambiente
•Non interferiscono con altri geni
•Non hanno effetti sul fenotipo
 Come funzionano

Per esempio :RFLP=polimorfismi di lunghezza di frammenti di

restrizione.
Esempio di enzimi polimorfici e
Non per un lucus con l’uso di una
Determinata sonda usando diversi enzimi di restrizione
Bisogna avere la sicurezza che la banda differenzialmente espressa
contenga il mio gene, specialmente se non ho una sonda specifica per
esso, per far ciò va da se che le piante (individui) da cui ho estratto il
DNA debbano differire solo per il carattere in esame(forma del seme)

Due linee che differiscono per un solo carattere fenotipico si dicono

Linee quasi isogeniche (N.I.L.)
D(SS) (Bb Cc Dd) X R(ss bb CC DD)

F1 (Ss) X R

BC1 o F2 50%Ss 50%ss

Seleziono quelli con il fenotipo X R

desiderato S------Ss

Dopo 7 o 8 generazioni di reincrocio avrò una pianta con quasi tutti i geni
di R e solo il gene S della pianta D. Cioè saranno eterozigoti al locus S.

Ss bb CC DD
Pea plants isogenic for Le/le alleles.
Tall is Le. Dwarf is le
The GA 3beta-hydroxylase which converts GA20 to GA1
gene is encoded by the Le locus which controls the tall/dwarf character
studied by Gregor Mendel
 Per ovviare alla costruzione di linee isogeniche

D(SS) (Bb cc Dd) X R(ss bb CC DD)

F1 (Ss) X F1

Ampia circa 1000 F2 25%ss 50%Ss 25%SS

Divido la F2 in 2 bulk (raggruppamenti) fenotipici

Bulk 1: ss Bulk 2: S-
Estraggo il DNA da i due bulk e faccio
RFLP. I due pattern avranno
Quasi tutte le bande in comune tranne 1
quella è il mio gene
RAPD= polimorfismi di DNA per amplificazioni a random

•Estrazione DNA
•Denaturo a ssDNA
•Primer 8-10b
•PCR
•Eletroforesi sul gel
•Eluizione delle bande differenzialmente espresse e loro sequenza
•Clonaggio del gene
•Esperimenti di complementazione genica per avere la certezza della
relazione gene-fenotipo.