Metode u citogenetici

dr. sc. Vesna Boraska

 Ljudski genom
 Genom: skup svih molekula DNA
koje čine nasljedni materijal
određene vrste organizma

 Gen: temeljna jedinica nasljeđivanja

koja određuju neko svojstvo

 Kromosom: struktura u stanici koja

nosi DNA, sastoji se od proteina i
DNA molekule
 Kromosom
 svaki kromosom sadrži jednu linearnu dvolančanu DNA čija
veličina varira 50-250 milijuna baza
 kromosom se sastoji od > 1000 gena, koji su u rangu
veličine od nekoliko tisuća pa do 2 milijuna baza
 za vrijeme staničnog ciklusa, interfaze, kromosomi su
slabije kondenzirani i ne mogu se prepoznati kao zasebna
tjelešca
 za vrijeme stanične diobe, mitoze, kromosomi podliježu
visokom stupnju kondenzacije i tek se tada raspoznaju kao
zgusnuta tjelešca unutar st. jezgre
 Kromosomsko bojenje
 kromosomi su maksimalno vidljivi i prepoznatljivi u metafazi st.
ciklusa
 veliki korak u humanoj citogenetici: tehnike bojenja
 karakteristične horizontalne linije na kromosomima
1) identifikaciju svih kromosoma
2) prepoznavanje strukturnih promjena
3) prepoznavanje lomova kromosoma

Kromosomska bojanja su omogućila prepoznavanje ogromnog

broja kariotipskih aberacija (abnormalnosti) te stvaranje fizičke
i genetičke mape kromosoma.
 Ljudski kariotip
 skup svih kromosoma porijeklom iz jedne stanice naziva se
kariotip
 kariotip humane diploidne (2n) normalne stanice ima 46
kromosoma, a čine ga 22 para autosoma i 2 spolna
kromosoma (2X kromosoma za žene ili X i Y kromosomi za
muškarce)
 poremećaj broja i strukture kromosoma nazivamo
kromosomskom aberacijom
 svaki poremećaj broja ili ustroja kromosoma uzrokuje teške
poremećaje funkcije, koji izazivaju višestruka oštećenja
fenotipa
Kariotip muškarca i žene

X X

X
 Kariogram

 grafički prikaz
kariotipa pri
čemu su
kromosomi
poredani po
veličini
 Standardna citogenetika

 za rutinsku analizu kromosoma

 metode pruganja omogućuju identifikaciju pojedinih
kromosoma na temelju rasporeda svjetlije i tamnije
obojenih regija uzduž krakova kromosoma
 aberacije koje zahvaćaju manje segmente DNA nije
moguće sa sigurnošću otkriti metodama klasične
citogenetike pa se koriste molekularne metode
 Primjena citogenetičkih metoda
1. prenatalno
 zbog sumnje na postojanje kromosomskih aberacija zbog
obiteljske anamneze ili zbog starosti majke (> 35 godina)
→ analiza stanica iz plodove vode
→ analiza pobačenog ploda
2. postnatalno
→ tumorska citogenetika
→ citogenetika kod djece s multiplim malformacijama
→ citogenetika bračnih parova sa sterilitetom
 G-pruge
 najučestalije se koriste u standardnoj citogenetici
 ime po Giemsa boji (akridine orange i metilene blu)
 kromosomi se tretiraju sa slanom otopinom na 60 °C ili s
proteolitičkim enzimom (tripsin) koji uništava proteine, a
potom boje Giemsa bojom
 tamne pruge nas usmjeravaju na postojanje heterokromatina
i AT bogati dio kromosoma
 svjetlije pruge nas usmjeravaju da bi to mogao biti
eukromatin i GC bogati dio kromosoma
 pomoću pruganja G-metodom moguće je otkriti poremećaje
segmenata kromosoma veličine 5Mb
Kariotip nakon G-bojenja
 Q-pruge
 1970. otkrivena DNA-vezujuća fluorokromatska boja
quinacrine mustard
 quinacrine je planarna molekula koja se interkalira između
nukleotidnih baza u DNA
 Q-pruge daju istu informaciju kao G-pruge samo što se
svjetle Q-pruge prikazuju kao tamne G-pruge i obrnuto
 kromosomi pokazuju fluorescentne linije različitog
intenziteta, pregled fluorescentnim mikroskopom
 Q-pruge
 obe tehnike (G i Q pruganje) stvaraju otprilike 300 pruga u
haploidnom metafaznom genomu te 850-1250 pruga u
prometafaznom i profaznom (jer su duži)
 najintezivnije se vide satelitne DNA regije izrazito bogate
AT pb te duža ruka Y-kromosoma
 nema predtretmana – morfologija ostaje očuvana
 intezitet boje se može mjeriti
Kariotip nakon Q-bojenja
 C-pruge
 kromosomi se najčešće kratko tretiraju s kiselinom, potom
s lužinom (barij hidroksid), a na kraju se boje Giemsa
bojom
 C-pruge boje mjesta oko centromere
 jake C-pruge se vide na krom 1, 9, 16 i distalno na Y-
kromosomu
 različite boje uzrokuju različita, ali i slična obojenja
pojedinih kromosoma: Q-bojenjem Y-krom izgleda jednako
C-bojenju, ali npr. dijelovi 1, 9, 16 krom nisu svjetli nego
tamni
Kariotip nakon C-bojenja
 R-pruge
 R-pruge (“reverse”) su otprilike pruge obrnute od G-pruga
 tamnije regije su eukromatin, a svijetla područja
heterokromatin
 kromosomi se tretiraju s vrućom lužinom i potom boje
Giemsa ili acridine orange bojom
 acridine orange može interkalirati među nukleotidne baze i
tada svjetli žuto
 dobro za uočavanje strukturalnih promjena na krajevima
kromosoma
Kariotip nakon
R-bojenja
 Heteromorfizmi
 veličina Q i C-pruga varira između ljudi: heteromorfizmi
 heteromorfizmi najčešće nastaju prilikom inverzija velikih
heterokromatinskih dijelova DNA
 konstitutivni heterokromatin ne sadrži gene i ne transkribira se,
stoga heteromorfizmi, odnosno varijacije C-pruga, ne utječu na
fenotip
 heteromorfizmi se koriste kod testiranja očinstva, razlikovanja
jednojajčanih od dvojajčanih blizanaca, kod otkrivanja trisomija ili
triploidija prilikom određivanja roditelja koji je prenio višak
kromosoma
 nove preciznije tehnike su više u upotrebi
 Bojenje u visokoj rezoluciji

 profazni i prometafazni kromosomi su puno duži od

metafaznih kromosoma
 na njima se vidi puno više pruga i zbog toga se najčešće
koriste za prepoznavanje malenih strukturalnih promjena
 za visoku rezoluciju se stanice dovode u istu fazu:
zaustavljanje u S-fazi staničnog ciklusa ametopterinom
(metrotreksatom), otpuštanje velikog broja stanica iz S-
faze u mediju bogatom timidinom = sinhroniziranje stanica
i bojenjem kromosoma u željenoj fazi (npr. prometafazi)
 Ostale vrste bojenja
 postoji još puno fluorokromatskih boja koje se koriste u
citološkim bojenjima
→ neke se vežu specifično za AT pb (DAPI)
→ neke se vežu specifično GC pb (kromomicin)
 postoje i nefluorescentne boje koje se specifično vežu
za pojedine baze
→ metil-zeleno se veže za AT pb
→ aktinomicin se veže za GC pb
 kariotip psa
 lijevo su DAPI
obojeni
metafazni
kromosomi
 desno su
inverzni DAPI
kromosomi
 Priprema kariotipa
 direktne ili indirektne metode obrade koštane srži, periferne krvi,
limfnog čvora i tjelesnih izljeva
 potrebno je uzgojiti stanice u kratkotrajnoj kulturi 24-satnoj ili
nešto dužoj 48-72 satnoj staničnoj kulturi s primjenom faktora
rasta ili mitogena ili bez njih
 standardna tehnika pruganja uključuje slijedeće postupke:

1. zaustavljanje dijeljenja stanica u metafazi primjenom kolhicina

ili kolcemida
2. razbijanje stanica u hipotoničnoj otopini
3. fiksaciju stanica u metanolu i octenoj kiselini
 Priprema preparata za vizualizaciju

4. smještanje kromosoma u
jednu ravninu “squash”
tehnikom (gnječenjem)
5. bojenje kromosoma
6. pregled kromosoma pod
svjetlosnim ili fluorescentnim
mikroskopom
7. slikanje, izrezivanje
kromosoma i izrada
kariograma
 Bojenje antitijelima
 imunocitokemijske studije su korištenjem antitijela na
adenin i citozin prve pokazale da kromosomske pruge
odražavaju razlike u sastavu baza (anti-A i anti-C antitijela)
 antitijela se vezuju za baze u jednolančanoj (denaturiranoj)
DNA, ali ne u dvolančanoj DNA
 razvijen je veliki broj antitijela koji se vezuju za specifična
mjesta na DNA molekuli: antitijela na acetilirane histone ili
na metilirane baze npr. antitijela na 5-metilcitozin proizvode
C-pruge
 Korištenje restrikcijskih endonukleaza

 restrikcijske endonukleaze (RE) cijepaju DNA na točno

određenim slijedovima
 ako je slijed DNA promijenjen RE ne cijepaju DNA
 RE se koriste za cijepanje C-pruga na svojim slijedovima i za
analizu heteromorfizama
 Nazivlje (nomenklatura) strukturnih
dijelova na obojenim kromosomima

 predložena na konferenciji u Parizu 1971. godine

 telomere, centromere i brojne jake pruge se koriste kao
mjesta prepoznavanja (oznake)
 dijelovi kromosoma između dviju oznaka se nazivaju
područjima (regijama) i numerirana su brojevima 1, 2, 3 i 4
na p ("p" za "petit") i q ("q" za "queue") kraku počevši od
centromere
 pruge su numerirane na isti način
 ideogram
 Nazivlje

 bojenje u visokoj rezoluciji je dovelo do dodatnih podjela u

ideogramskom prikazu tj. do pojave subpruga
 subpruge se označavaju točkom i brojem iza nje
 kada su subpruge dodatno podijeljene u još pruga tada se
pri imenovanju dodaje još jedan broj
 najnovije nazivlje je standardizirano ISCN (International
System for Human Cytogenetic Nomenclature)
dogovorom 2005. godine
Ideogram kromosoma
 ISCN nomenklatura
 t – translokacija: prijenos genetskog materijala s jednog
kromosoma na drugi
 ins – insercija: jedan dio kromosoma premjestio se na novu
poziciju u istom ili nekom drugom kromosomu
 inv – inverzija: označava rotaciju dijela kromosoma za 180°
 del – delecija: označava gubitak dijela kromosoma
 dup – duplikacija: prisutnost dodatne kopije dijela
kromosoma
 ISCN nomenklatura
 i – izokromosom: sastoji se od dvaju krakova od kojih je jedan
krak zrcalna slika drugog kraka
 r – ring kromosom: označava kromosom koji ima izgled
prstena
 mar – marker kromosom označava bilo koju strukturnu
promjenu kromosoma koja se ne može objasniti standardnim
terminima
 der – derivirani kromosom: strukturna promjena koja uključuje
dva ili više kromosoma
 (+) plus ili (-) minus označava višak ili manjak pojedinog
kromosoma
 In situ hibridizacija
 metoda koja se koristi za identifikaciju specifičnih manjih
dijelova kromosoma
 npr. ako nam je poznata sekvenca nekog gena (najčešće preko
Human Genome projekta), ali ne znamo na kojem je
kromosomu lokalizirana, upotrijebit ćemo ovu metodu radi
pronalaženja točne lokacije gena
 sjedinjuje citogenetičke i molekularne metoda ispitivanja, a
temelji se na hibridizaciji komplementarnih sekvenci nukleinskih
kiselina
 procesom denaturacije ili disocijacije razbijaju se nekovalentne
vodikove veze između komplementarnih baza i dolazi do
razdvajanja lanaca DNA
 In situ hibridizacija
 denaturacija se može postići povišenjem temperature, dok se
njenim snižavanjem obnavljaju vodikove veze, a lanci DNA se
ponovo sparuju – renaturacija
 korištenjem fluorescentnih DNA ili RNA probi mogu se
detektirati određeni DNA slijedovi (npr. geni) na
nitroceluloznom filteru (molekularna hibridizacija) ili na
citološkim preparatima (in situ hibridizacija)
 prisutnost ili odsutnost fluorescentnog signala upotrijebljene
DNA probe ukazuje na prisutnost ili odsutnost specifičnih DNA
sekvenci u genomu pojedinih stanica
 In situ hibridizacija ponavljajućih i
jedinstvenih DNA slijedova
 DNA ili RNA probe mogu biti obilježene radioaktivnim
izotopima ili fluorescentnim bojama (FISH)
 probe hibridiziraju na denaturirane metafazne kromosome
koji su fiksirani na podlogu
 pod strogo određenim uvjetima temperature i koncentracije
soli događa se sparivanje probe i isključivo njenih
komplementarnih slijedova
 samo vodikove veze formirane između komplementarnih
baza ostaju stabilne
 mjesta hibridizacije se određuju autoradiografski (kod
radioaktivnih probi) ili prema fluorescenciji
Hibridizacija probe
 Postupak izrade
 uzorak suspenzije metafaznih
kromosoma se suši na
mikroskopskom staklu i tretira
s formamidom da kromosomi
postanu denaturirani, ali se
čuva karakteristična
metafazna morfologija
 dodavanje i lokalizacija probe
koja je hibridizirala sa
kromosomalnom DNA
 Fluorescentna in situ hibridizacija -
FISH

 DNA probe se u FISH tehnici mogu detektirati na 2 načina:

1. DNA probe se mogu označiti s nekoliko kemijskih skupina

(bromodeoksiuracil, digoksigenin, dinitrofenol) koje se potom
detektiraju sa specifičnim fluorescirajućim antitijelima
2. fluorescentne skupine mogu biti kovalentno vezane za DNA
probu pa nema potrebe za dodavanjem neke druge
fluorescentne molekule koja se vezuje za probu

 postoje kromosomski specifične fluorescentne boje koje

različite kromosome “boje” različitim bojama
 FISH – rezolucija i primjena
 FISH je moguće izvoditi u interfaznim stanicama stoga je
moguće obuhvatiti veći broj stanica te se metoda koristi za
ispitivanje i procjenu mozaicizma
 fluorescentno obilježene probe pokazuju jaku rezoluciju i
dobre su za mapiranje gena
 vrlo osjetljivim digitalnim kamerama i računalnom obradom
može se detektirati gotovo svaki signal
 FISH detektira hibridizaciju na slijedove kratke čak 1 kb
 može se detektirati jedinstven RNA transkript te odrediti broj
RNA transkripata pojedinog gena u stanici
 u ispitivanju i otkrivanju submikroskopskih poremećaja
genoma
Interfazne stanice s translokacijom t(9;22)
 Kromosomske i lokus specifične probe
 mogu se stvarati biblioteke probi – kolekcija probi dobivena
kloniranjem fragmenata DNA, ubačena u odgovarajući vektor
(plazmid, lambda fag, kozmid) i umnožena u odgovarajućem
domaćinu (npr. bakterijama)
 1988. godine su prvi put upotrijebljene biblioteke probi specifičnih
za pojedine kromosome
 koriste se za otkrivanje strukturalnih i brojčanih kromosomskih
promjena
 PCR-om (engl. polymerase chain reaction – lančana reakcija
polimerazom) se mogu napraviti lokus-specifične probe tj. probe
specifične za neki gen, odnosno dio genoma
FISH – detekcija kromosoma 18
 Raznobojni FISH i spektralni kariotip
 raznobojni FISH (engl. multicolor FISH) ili M-FISH i spektralni
kariotip ili SKY omogućavaju rutinske detekcije svakog
kromosoma u metafaznoj ploči
 ove dvije metode koriste 24 kromosomske probe i 5
florokromatskih boja
 zbog specifičnih kombinacija hibridiziranja probi i njihovog
obilježavanja dolazi do različitog obojenja svakog kromosoma
 ove metode ne mogu detektirati intrakromosomske promjene
(npr. delecije, duplikacije, inverzije), ali su jako dobre za
uočavanje promjena u broju kromosoma te za detekciju
strukturalnih promjena kao što su translokacije
M-FISH
 Interfazni FISH

 razvijene su tehnike kojima se može obojati kromatin u

interfaznoj, hipotonično-nabubrenoj jezgri
 razdaljine između probi na kromatinskim nitima direktno
odgovaraju stvarnim molekularnim razdaljinama – mogu se
mjeriti veličine raznih struktura
 mnogobrojne probe i raznobojne fluorofore za obilježavanje
omogućavaju točniju analizu i precizniju detekciju finih
promjena u strukturi kromosoma
a i b) histološki prikaz
koštane srži – velike
atipične limfoidne stanice

c i d) kariotipovi dobiveni
G-bojenjem

e i f) M-FISH kariotipovi

g i h) FISH sa specifičnim
probama za gene IGH
(14q32) i BCL2 (18q23)
Hvala na pozornosti!