Ri SPOSTE

Domande corrette da 5 punti
- Risposte a crocetta giuste

- Dalla dimensione, forma e carica del sito attivo o della tasca di specificità
- Risposte a crocetta sbagliate

- Km e vmax diminuiscono entrambe
- L’adp fa aumentare la vmax dell’enzima
- Richiede l’utilizzo di ceppi di lievito contenenti due marcatori auxotrofici
- Laccasi nel trattamento di pece lipasi nella disinchiostrazione e cellulasi nel biopulping +++++
Laccasi nella disinchiostrazione, lipasi nel biopulping e cellulasi nel trattamento di pece
- Stato conformazionale
- Niente: la glicogeno fosforilasi non è in grado di idrolizzare il glicogeno
- X Dai ribosomi liberi nel citoplasma ricco di aa idrofobici nella sua regione centrale ed è posizionato
all’estremità c-term della proteina
- Brevi sequenze peptidiche che servono per trasportare delle proteine nel nucleo
- Mediamente maggiore rispetto a quella di proteine globulari di pari peso molecolare ++++++
Uguale a quello di proteine globulari di pari peso molecolare
- Tra 500 e 1000
- Dipende dalle cells
- La specificità del sito di legame di una proteina si basa:

a) Sull’assenza di ligandi competitori
b) Sui residui amminoacidici che rivestono il sito di legame
c) Sulla presenza di molecole d’acqua idratanti
d) Sulla chiralità opposta del ligando
- Il tratto distintivo comune a tutte le serin-proteasi è:

a) La presenza di una tasca di specificità idrofobica
b) La presenza di una tasca di specificità idrofila
c) La presenza di un cluster di residui serinici reattivi
d) La presenza di un singolo residuo di serina reattivo
- Un pathway di trasduzione del segnale si attiva quando _____ si lega a un recettore:

a) Una proteina G
b) Una tirosin-chinasi
c) La calmodulina
d) Una molecola segnale
e) Una molecola di Camp
1
- Quali delle seguenti affermazioni riferite ad un esperimento di trascrittomica con
tecnologia affymatrix sono VERE:
1. Le sonde sono marcate con specifici reagenti fluorescenti
2. I chip contengono sonde a cDNA a singolo filamento
3. È possibile comparare solo due campioni alla volta
4. I chip NON sono riutilizzabili
RISPOSTE
a) Sono vere 1 e 3
b) Sono vere 2 e 4
c) Sono vere 1,2 e 3
d) Sono vere 1,2,3 e 4
e) È vera solo la 4
- Quali delle seguenti affermazioni riferite al trascrittoma sono FALSE?

1. Nel trascrittoma si includono tutti i tipi di RNA cellulare
2. In un organismo pluricellulare esistono tanti trascrittomi diversi quanti sono i tipi cellulari
3. In studi di trascrittomica, che esaminano l’espressione dei livelli di RNA in una popolazione
cellulare, si utilizzano spesso tecniche high-throughput basate sulla tecnologia GeneChip.
4. Nell’ambito dell’errore sperimentale i livelli relativi di mRNA e delle proteine da questi codificate
sono sempre correlati. Eventuali deviazioni dalla linearità sono imputabili ad errore sperimentale
Risposte:
A) Sono FALSE 1 e 3
B) Sono FALSE 2 e 4
C) Sono FALSE 1, 2 e 3
D) Sono FALSE 1, 2, 3 e 4
E) È FALSA solo la 4
- Dire quali affermazioni relative alla mutagenesi a saturazione sono VERE:

1. Si effettua su uno o più codoni di un gene codificante proteine
2. Genera 64 varianti amminoacidiche diverse
3. Richiede la sintesi di oligonucleotidi degeneranti
4. Richiede l’utilizzo di ceppi di E.Coli con alterato utilizzo del codice
RISPOSTE
a) Sono corrette 1 e 3
b) Sono corrette 1,2 e 3
c) Sono corrette 1,2,3 e 4
d) È corretta solo la 4
- Una molecola segnale è altrimenti nota come:

a) Ligando
b) Proteina
c) Iniziatore
d) Chiave
e) Recettore
2
- Quale tra le seguenti molecole segnale extracellulari può diffondere liberamente
attraverso la membrana plasmatica e legarsi a un recettore intracellulare?
a) Estrogeno
b) Glicerolo
c) Cellulosa
d) Glucosio
e) Amido
- Un(o/a)________ è un esempio di molecola segnale che può legarsi ad un recettore

intracellulare regolando così la trascrizione genica
a) Ione
b) Proteina
c) Carboidrato
d) Acido nucleico
e) Steroide
- Dire quali delle seguenti affermazioni relative ai corpi di inclusione sono FALSE:
1. È possibile limitare la formazione mediante crescita dell’ospite a temperature ridotte
2. È possibile ottenere corpi di inclusione pressoché puri mediante centrifugazione a bassa
velocità
3. È possibile disaggregare i corpi di inclusione mediante detergenti o solventi organici
4. È possibile disaggregare i corpi di inclusione mediante trattamento a basse temperature
RISPOSTE
a) Sono false 1 e 3
b) Sono false 1,2 e 3
c) Sono false 2 e 4
d) Sono false 1,2,3 e 4
e) È falsa solo la 4
- L’espressione di un gene eucariotico in procarioti richiede:

1. Una sequenza SD nel mRNA
2. Assenza di introni
3. Elementi di regolazione a monte del gene
4. Una proteina di fusione
RISPOSTE
a) Sono corrette 1,2 e 3
b) Sono corrette 2 e 4
c) Sono corrette 1 e 3
d) Sono corrette 1,2,3 e 4
e) È corretta solo la 4
- Il segnale di localizzazione nucleare che consente il trasporto di una proteina nel nucleo è
ricco in:
a) Lisina e arginina
b) Glutammina e asparagina
c) Serina e treonina
d) Triptofano e istidina
e) Nessuno degli aa sopra elencati
3
- Quali dei seguenti enzimi sono coinvolti nella conversione dell’amido (di mais) in
sciroppo ad alto tenore di fruttosio (HFCS)?
1. Alpha-amilasi
2. Glucosio isomerasi
3. Glucoamilasi
4. Esochinasi
RISPOSTE
- Mettere in ordine corretto i seguenti passaggi utilizzati nella procedura di DNA shuffing:
a) PCR senza primers → PCR con primers → frammentazione con DNAse → selezione in un ospite
opportuno
b) PCR con primers → frammentazione con DNAse → PCR senza primers → selezione in un ospite
opportuno
c) Frammentazione con DNAse → PCR senza primers → PCR con primers → selezione in un ospite
opportuno
d) PCR con primers → selezione in un ospite opportuno → frammentazione con DNAse → PCR
senza primers
e) Frammentazione con DNAse → PCR con primers → PCR senza primers → selezione in un ospite
opportuno
- Il set minimo di geni richiesti per la vita è approssimativamente:

a) 50-100
b) tra 250-400
c) tra 500 e 1000
d) oltre 1000
e) dipende dalle cellule
- Nell’elenco seguente individuare quale molecola funziona da recettore per ioni calcio:
a) calmodulina
b) PIP2
c) G protein
d) IP3
e) Adenilato ciclasi
- ________ catalizza la produzione di________ che determina l’apertura dei canali ionici
che rilasciano________ nel citoplasma:
a) L’adenilato ciclasi…. cAMP….. ioni calcio
b) L’adenilato ciclasi…. IP3….. ioni calcio
c) L’adenilato ciclasi…. PIP2…. Ioni calcio
d) La fosfolipasi C…. cAMP…. Ioni calcio
e) La fosfolipasi C…. IP3…. Ioni calcio
4
- Il raggio idrodinamico di proteine intrinsecamente disordinate è:
a) Mediamente maggiore rispetto a quello di proteine globulari di pari peso molecolare
b) Mediamente minore rispetto a quelle di proteine globulari di pari peso molecolare
c) Uguale a quello di proteine globulari di pari peso molecolare e pertanto prevedibile in base
a formule empiriche
d) Non è in relazione con il loro peso molecolare
- In esperimenti SDS-PAGE la mobilità elettroforetica di proteine intrinsecamente

disordinate è:
a) Mediamente maggiore rispetto a quella di proteine globulari di pari peso molecolare
b) Mediamente inferiore rispetto a quella di proteine globulari di pari peso molecolare
c) Uguale a quello di proteine globulari di pari peso molecolare
d) Indipendente dal loro peso molecolare
- Le proteine citoplasmatiche come gli enzimi della glicolisi vengono sintetizzate:

a) Dai ribosomi sul reticolo endoplasmatico (RER)
b) Nel reticolo endoplasmatico liscio (SER)
c) Dai ribosomi liberi nel citoplasma
d) Dai ribosomi sulla membrana nucleare
- Quale tra le seguenti affermazioni NON è corretta:

a) La fosfolipasi C catalizza la formazione di IP3
b) I recettori tirosin-chinasici sono composti da due polipeptidi che si associano quando attivati da
una molecola segnale
c) I canali ionici sono localizzati sia sulla membrana plasmatica che sul reticolo endoplasmatico
d) I cAMP si lega alla calmodulina
e) La chinasi sono enzimi che fosforilano altre molecole
- Si hanno a disposizione tre gel 2D:

X) IPG ph 4-7 + 6%T SDS-PAGE
Y) IPG ph 7-11 + 10%T SDS-PAGE
Z) IPG ph 3-10 + 12%T SDS-PAGE
Si vogliano esaminare tre proteine:
1. L’antigene tumorale p53 (pl 6.48, Mw 43.712 Da)
2. G3P deidrogenasi (pl 8.4, Mw 35.622 Da)
3. Desmoplachina (pl 6.2, Mw 373.400 Da)
Quali gel (X,Y,Z) daranno i risultati migliori rispettivamente per le proteine 1,2 e 3?
a) X,Y,Z
b) Z,Y,X
c) Z,X,Y
d) Y,Z,X
e) X,Z,Y
5
- Le sequenze segnale sono:
a) Brevi sequenze peptidiche che servono per indirizzare il trasporto delle proteine di nuova sintesi
verso la corretta direzione
b) Glicoproteine che servono per indirizzare il trasporto delle proteine si nuova sintesi verso la
corretta destinazione
c) Brevi sequenze peptidiche che servono per il trasporto delle proteine nel nucleo
d) Brevi sequenze peptidiche attaccate ad una proteina che danno inizio alla sua degradazione ad
opera degli enzimi digestivi
- Quale tra le seguenti successioni di eventi descrive correttamente un tipico meccanismo

di trasduzione del segnale?
a) Un recettore tirosin-chinasico attiva l’adenilato ciclasi, che a sua volta attiva la fosfolipasi C.
la fosfolipasi C converte ATP in cAMP, che si lega ad enzimi intracellulari che determinano una
risposta
b) Un recettore-canale ionico si apre, permettendo ad un ormone stereoideo di entrare nella
cellula; l’ormone stereoideo attiva alcune pretein-chinasi che convertono GTP in GDP, il quale si
lega ad un enzima intracellulare che effettua una risposta
c) Un recettore intracellulare attiva la fosfolipasi C, che taglia una proteina di membrana per
produrre IP3. In seguito l’IP3 determina l’apertura di una proteina canale seul reticolo
endoplasmatico, consentendo così il rilascio nel citoplasma di cAMP, il quale si lega ad un enzima
intracellulare che elabora una risposta.
d) Un recettore attiva la proteina G a cui è associato, che a sua volta attiva la fosfolipasi C. la
fosfolipasi C taglia un lipide di membrana generando IP3, che va a legarsi ad un canale ionico per il
calcio sul reticolo endoplasmatico, determinando il rilascio di ioni calcio nel citoplasma. Gli ioni
calcio si legano infine ad un enzima intracellulare che determina la risposta.
e) Nessuna delle descrizione sopra elencate è corretta
- Quale tra le molecole si seguito agisce da secondo messaggero:

a) Proteina G
b) Recettore accoppiato a proteina G
c) Proteina chinasi
d) Adenilato ciclasi
e) cAMP
- Le proteine di secrezione vengono sintetizzate:

a) Dai ribosomi nel citoplasma
b) Dai ribosomi sul reticolo endoplasmatico (RER)
c) Dai ribosomi sulla membrana nucleare
d) Da tutti i ribosomi sopra elencati
- La specificità di taglio di tripsina e chimotripsina dipende in parte

a) Dalla prossimità al sito attivo o alla tasca di specificità della Ser in posizione 195
b) Dalla dimensione, forma e carica del sito attivo o della tasca di specificità
c) Dalla presenza di una barriera di legami idrogeno nel sito attivo o nella tasca di specificità
d) Dall’assenza di acqua nel sito attivo
6
- Scegliere la corretta successione di eventi per il trasporto di una proteina attraverso il
pathway di secrezione:
a) sintesi della proteina nel citoplasma → lume del reticolo endoplasmatico liscio (SER) →
lume del reticolo endoplasmatico rugoso (RER) → cis Golgi → trans Golgi → vescicole →
fusione delle vescicole con la membrana plasmatica → esocitosi
b) sintesi della proteina nel citoplasma→lume del reticolo endoplasmatico rugoso (RER) →cis
Golgi→median Golgi→trans Golgi→vescicole→fusione delle vescicole con la membrana
plasmatica→esocitosi
c) sintesi della proteina nel citoplasma→ vescicole→ lume del reticolo endoplasmatico liscio
(SER)→luma del reticolo endoplasmatico rugoso (RER)→cis Golgi→median Golgi → trans Golgi→
vescicole→ fusione delle vescicole con la membrana plasmatica→ esocitosi
d) sintesi della proteina nel citoplasma → lume del reticolo endoplasmatico rugoso (RER) →trans
Golgi → median Golgi → cis Golgi → vescicole → fusione delle vescicole con la membrana
plasmatica → esocitosi
- La cromatografia di affinità ha a che fare con:

a) Il legame specifico di una porzione di una proteina con un’altra molecola
b) Interazioni proteina-proteina
c) Interazioni proteina-carboidrati
d) Nessuna delle interazioni sopra elencate
- La specifica risposta di una cellula o tessuto bersaglio ad uno specifico stimolo esterno:
1. dipende dalla presenza o meno di uno specifico recettore
2. produce necessariamente una ed una sola risposta cellulare
3. dipende dalla presenza di uno specifico, correlato apparato di trasduzione del segnale
4. non è influenzata dal funzionamento di altri sistemi di trasduzione del segnale
eventualmente presenti nella cellula bersaglio
RISPOSTE
a) sono corrette 1 e 3
b) sono corrette 1,2 e 3
c) sono corrette 2 e 4
d) sono corrette 1,2,3 e 4
e) è corretta solo la 4
- Abbinare ad ogni enzima il processo dell’industria tessile in cui viene utilizzato:

a) Proteasi per la purga enzimatica, amilasi per la sbozzima, laccasi per l’ossidazione di carboidrati
b) Pectinasi per il trattamento di fibre proteiche, amilasi per la sbozzima e cellulasi per stone wash
c) Amilasi nella sbozzima, catalisi nella dismutazione dell’acqua ossigenata dopo candeggio e
prima di tintura, cellulasi nel biopolishing
- Un attivatore allosterico:
a) Aumenta l’affinità di legame
b) Diminuisce l’affinità di legame
c) Stabilizza lo stato conformazionale rilassato R della proteina
d) Aumenta l’affinità di legame e stabilizza lo stato conformazionale rilassato R della proteina
7
- In termini quantitativi il legame 1:1 tra un ligando (L) e il proprio recettore (R) viene
descritto dalla Kd
1. Kd=Kon/Koff
2. Tanto è maggiore è la Kd, tanto maggiore è l’affinità tra R e L
3. La Kd della interazione LR e la concentrazione di L necessaria per l’ottenimento del 50%
della risposta fisiologica sono necessariamente uguali
4. La Kd misura l’affinità del recettore per il suo ligando
RISPOSTE
b) Sono corrette 1,2, e 3
- Dire quali delle seguenti affermazioni relative al sistema pET sono vere:
1. È un sistema di espressione utilizzabile in E.coli
2. Richiede la cooperazione di elementi genetici batterici e fagici
3. Consente elevati livelli di espressione
4. È un sistema di espressione indicibile, ma “leaky”
RISPOSTE
- Dire quali delle seguenti affermazioni relative alla mutagenesi a saturazioni sono VERE:
1. Si effettua su uno più codoni di un gene codificante proteine
2. Genera 64 varianti amminoacidiche diverse
3. Richiede la sintesi di oligonucleotidi degenerati
4. Richiede l’utilizzo di ceppi ei E.coli con un alterato utilizzo del codice
RISPOSTE
- In esperimento di SDS-PAGE, l’anomala mobilità elettroforetica di proteine

intrinsecamente disordinate rispetto a proteine globulari di pari MW si deve a:
a) Composizione amminoacidica
b) Stato conformazionale
c) Punto isoelettrico
d) Peso molecolare
8
- Un proto-oncogene può diventare un oncogene a seguito di
1. Traslocazione
2. Mutazione puntiforme nella sequenza codificante
3. Mutazione puntiforme nella sequenza di controllo della trascrizione
4. Amplificazione genica
RISPOSTE
- Quali delle seguenti affermazioni riferite al trascrittoma sono VERE

1. Nel trascrittoma si includono tutti i tipi di RNA cellulare
2. In un organismo pluricellulare esistono tanti trascrittomi diversi quanti sono i tipi cellulari
3. In studi di trascrittomica, che esamina l’espressione dei livelli di RNA in una popolazione
cellulare, si utilizzano spesso tecniche high-throughput basate sulla tecnologia GeneChip
4. Nell’ambito dell’errore sperimentale i livelli relativi di mRNA e delle proteine da questi
codificate sono sempre correlati. Eventuali deviazioni della linearità sono imputabili ad errore
sperimentale
RISPOSTE
b) Sono corrette 2 e 4
c) Sono corrette 1,2 e 3
- Una situazione in cui una proteina-chinasi attiva numerose altre proteine-chinasi è un

esempio di:
a) Amplificazione
b) Sensitizzazione
c) Mutualismo
d) Risposta cellulare
e) Deattivazione
- L’adrenalina o epinefrina agisce come molecola segnale legandosi a recettori:

a) Intracellulari
b) Accoppiati a proteine G
c) Nucleari
d) Tirosin-chinasici
e) Canali-ionici
- In quali fasi del processo di lavorazione della carta vengono impiegate laccasi, lipasi e
cellulasi?
a) Laccasi nella disinchiostrazione, lipasi nel biopulping e cellulasi nel trattamento di pece
b) Laccasi nel biopuping, lipasi nel trattamento di pece e cellulasi nella disinchiostrazione
c) Laccasi nel trattamento della pece, lipasi nella disinchiostrazione e cellulasi nel biopulping
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- Il taglio del glicogeno ad opera della glicogeno fosforilasi determina il rilascio di:
a) glucosio-1-fosfato
b) cellulosa
c) galattosio-1-fosfato
d) fruttosio-1-fosfato
e) niente: la glicogeno fosforilasi non è in grado si idrolizzare il glicogeno
- L’enzima isocitrato deidrogenasi catalizza la reazione

Isocitrato + NAD+ à alpha-chetoglutarato + CO2 + NADH + H+
Le curve illustrate si ottengono mettendo in grafico la velocità (V) iniziale della reazione in
funzione della concentrazione di isocitrato in presenza di vari livelli di ADP e di un eccesso di
NAD+
Quali delle seguenti affermazioni è corretta:
a) In assenza di ADP l’isocitrato deidrogenasi esibisce una semplice cinetica di MichaelisMenten

b) L’ADP fa aumentare la Km dell’enzima per l’isocitrato
c) L’ADP fa aumentare la Vmax dell’enzima
d) L’ADP attiva l’enzima
- Dire quale delle seguenti condizioni portano ad un numero di errori nel processo di PCR e
possono quindi essere utilizzate nel processo si error-prone mutagenesis
1. Alta concentrazione di ione magnesio
2. Uso di ione manganese insieme allo ione magnesio
3. Presenza di alcool
4. Concentrazioni sbilanciate di nucleotidi
RISPOSTE
- Solitamente un inibitore allosterico di un enzima:

a) partecipa alla regolazione feedback
b) denatura l’enzima
c) è un composto idrofobico
d) fa si che l’enzima lavori più velocemente
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- Il grafico in figura rappresenta la relazione tra concentrazione del substrato e la velocità
di reazione per un singolo enzima in assenza (curva x) e in presenza (curva y) di un
composto che si lega in modo allosterico all’enzima. Il composto allosterico è:
a) Un inibitore competitivo
b) Un inibitore non competitivo
c) Un inibitore irreversibile
d) Un attivatore
OPPURE (stessa immagine):
In presenza del composto allosterico:
a) Km e Vmax aumentano entrambe
b) Km e Vmax diminuiscono entrambe
c) Km aumenta e Vmax diminuisce
d) Km diminuisce e Vmax aumente
e) Km diminuisce e Vmax non varia
- La dimerizzazione dei recettori tirosin chinasici (RTK) indice direttamente i seguenti

effetti:
1 Il reclutamento di proteine adattrici
2 La rimozione del T loop del sito attivo
3 La dissociazione delle subunità betagamma dalla subunità alfa delle G proteins
4 La fosforilazione in trans del T loop di RTK
RISPOSTE:
- Il peptide-segnale per una proteina di secrezione è:

a) ricco in amminoacidi idrofobici nella sua regione centrale ed è posizionato all’estremità
N-terminale della proteina
b) ricco di amminoacidi idrofili nella sua regione centrale ed è posizionato all’estremità
N-terminale della proteina
c) ricco in amminoacidi idrofobici nella sua regione centrale ed è posizionato all’estremità
C-terminale della proteina
d) ricco di amminoacidi contenenti zolfo nella sua regione centrale ed è posizionato
all’estremità N-terminale della proteina
11
- Dire quale delle seguenti affermazioni riferite al traslocone Sec61 sono VERE:
1. è un eterotrimero
2. forma una struttura ad anello
3. ogni unità è una proteina integrale di membrana
4. contiene un piccolo RNA 7S
RISPOSTE
- Abbinare la struttura chimica al polisaccaride corrispondente:
1) A=galattomannaro; B=amilopectina; C=xantano

2) A=xantano; B=galattomannaro; C=amilopectina
3) A=amilopectina; B=xantano; C=galattomannaro
- Individuare quali delle seguenti affermazioni riferite al metodo dei due ibridi sono VERE:
1. È una tecnica che si effettua nel lievito S.Cerevisiae
2. Richiede l’utilizzo di ceppi di lievito ontenenti un opportuno gene reporter
3. Serve per studiare interazioni proteina-proteina
4. È particolarmente adatta per lo studio di proteina di membrana
RISPOSTE
- La specificità del sito di legame di una proteina si basa

A) Sull’assenza di ligandi competitori
B) Sui residui di amminoacidi che rivestono il sito di legame
C) Sulla presenza di molecole d’acqua idratanti
D) Sulla chiralità opposta del ligando
12
- In un esperimento di 2D-DIGE:
1. la proteine sono separate in funzione della massa molecolare e del punto isoelettrico
2. è necessario pre-frazionare gli estratti in funzione della localizzazione cellulare
3. la quantificazione dell’esperimento differenziale richiede la marcatura delle proteine con
specifici reagenti fluorescenti prima della isoelettrofocalizzazione
4. è teoricamente possibile separare 100000 diverse specie proteiche
RISPOSTE
b) sono corrette 2 e 4
c) sono corrette 1,2 e 3
- Dire quali delle seguenti affermazioni relative alla mutagenesi a saturazione sono VERE:
1.Si effettua su uno o più codoni di un gene codificante proteine

2.Genera 64 varianti amminoacidiche diverse
3.Richiede la sintesi di oligonucleotidi degenerati
4.Richiede l’utilizzo di ceppi di Escherichia coli con un alterato utilizzo del codice
A) Sono corrette 1 e 3
B) Sono corrette 1, 2 e 3
C) Sono corrette 2 e 4
D) Sono corrette 1, 2, 3 e 4
E) È corretta solo 4
- L’analisi della composizioni amminoacidica delle proteine intrinsecamente disordinate

(compositional bias) rispetto a quelle delle proteine globulari indica che:
1. gli amminoacidi idrofobifi sono più frequenti e la carica netta minore
2. gli amminoacidi idrofobifi sono più frequenti e la carica netta maggiore
3. gli amminoacidi idrofobifi e la carica netta sono distribuiti come nelle proteine globulari
4. gli amminoacidi idrofobifi sono meno frequenti e la carica netta maggiore
RISPOSTE
a) sono corrette 1,2 e 3
b) sono corrette 2 e 4
Nella seguente serie di eventi associati alla trasduzione del segnale qual è fuori posto?
Il recettore lega l’ormone.
A) Il recettore subisce una modificazione conformazionale
B) Il recettore interagisce con la proteina G
C) La subunità alpha della proteina G idrolizza GTP
D) La subunità alpha della proteina G si dissocia dalle subunità beta e gamma
E) Le subunità alpha della proteina G si lega all’adenilato ciclasi
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- Dire quale delle seguenti condizioni portano ad un aumento di errori nel processo di PCR e
possono quindi essere utilizzate nel processo di error-prone mutagenesis. Pag 62 dispensa.
1. Alte concentrazioni di ione magnesio
2. Uso di ione manganese insieme allo ione magnesio
3. Presenza di alcool
4. Concentrazioni sbilanciate di nucleotidi
Risposte:
A) Sono corrette 1 e 3
B) Sono corrette 1, 2 e 3
C) Sono corrette 2 e 4
D) Sono corrette 1, 2, 3 e 4
E) È corretta solo 4
- Dire quali delle seguenti affermazioni relative alle lipasi sono VERE:
1.Possiedono una triade catalitica

2.Sono attive solo ad alta temperatura
3.Presentano una diversa conformazione nello stato attivo ed inattivo
4.Seguono una cinetica di Michaelis - Menten
a)Sono corrette 1 e 3
b)Sono corrette 1, 2 e 3
c)Sono corrette 2 e 4
d)Sono corrette 1, 2, 3 e 4
e)È corretta solo 4
- Dire quali delle seguenti affermazioni riferite al trasporto di proteine nel nucleo sono
VERE:
1. Viene consumata una molecola di GTP a livello del citosol

2. Ran - GTP traversa i pori nucleari in direzione nucleo - citosol
3. Ran – GTP è richiesto per il rilascio della proteina cargo
4. Il legame del cargo al recettore è sempre diretto
b) sono corrette 1, 2 e 3
14
- Gli enzimi allosterici sono
1) Necessariamente dotati di struttura quaternaria
2) Stabilizzati da un effettore allosterico
3) Attivati da ADP
4) Non necessariamente dotati di struttura quaternaria
- Un dispositivo di tipo “stopped-flow” può essere utilizzato

1) per studiare la cinetica di enzimi allosterici
2) per studiare reazioni enzimatiche molto veloci
3) per studiare reazioni enzimatiche molto lente
4) per studiare lo stadio pre-stazionario di una cinetica enzimatica
1- Sui residui amminoacidici che rivestono il sito di legame. B

2- La presenza di un singolo residuo di serina. D
3- Più flessibili. B
4- Accoppiati a proteine G. A&B
5- Un recettore attiva la proteina G a cui si è associato, che a sua volta attiva la fosfolipasi C. La
fosfolipasi C taglia un lipide di membrana generando IP3, che va a legarsi ad un canale ionico per il
calcio sul reticolo endoplasmatico, determinando il rilascio di ioni calcio nel citoplasma. Gli ioni
calcio si legano infine ad un enzima intracellulare che determina la risposta. D
6- Sui residui amminoacidici che rivestono il sito di legame. B
7- Brevi sequenze peptidiche che servono per indirizzare il trasporto delle proteine di nuova sintesi
verso la corretta destinazione. A
8- Ricco di amminoacidi idrofobici nella sua regione centrale ed è posizionato all’estremità N-
terminale della proteina. A
9- Aumenta l’affinità di legame e stabilizza lo stato conformazionale rilassato R della proteina. D
15
Domande da 10 punti
1- IDP (punti: 10)
Le proteine intrinsecamente disordinate non possiedono una struttura 3D ben definita mentre le proteine
globulari si. Questa particolare caratteristica delle idp ha permesso di mettere in dubbio un dogma della
biochimica che metteva in relazione struttura e funzione. Le idp infatti assumono una struttura ben definita
in seguito al legame con il partner con il quale interagiscono (folding upon binding). Per questo motivo
possono legare diversi partner. Le idp contengono amminoacidi idrofilici flessibili delle proteine globulari.
Infine le idp a differenza delle proteine globulari migrano più lentamente sia in gel elettroforetici sia in gel
filtrazione.
2- IDP – caratteristiche che permettono di classificare una proteina come

IDP Punti 10/10
1- Nel rapporto con i ligandi non hanno un rapporto chiave e serratura ma di folding indotto ( folding
upon binding)
2- Le IDP hanno una percentuale maggiore di residui idrofilici rispetto agli idrofobici perché questi
ultimi promuovono la rigidità, ciò non è riscontrabile nelle globulari
3- Le IDP grazie al folding indotto possono prendere contatto con più ligandi e svolgere un maggior
numero di funzioni rispetto alle globulari
4- Le IDP in elettroforesi migrano dando l’impressione di avere un MW superiore rispetto alle
globulari di pari MW
3- Epitopo strutturale e epitopo funzionale (punti: 10)

L’epitopo strutturale è l’insieme degli amminoacidi che fanno parte della zona di interazione fra le due
proteine e che determinano la specificità di legame e l’efficienza di legame. L’epitopo funzionale è un
sottoinsieme dell’epitopo strutturale e riguarda gli specifici residui che fanno parte dell’interfaccia di
legame tra due partner proteici. Le tecniche che permettono di studiarli possono essere i saggi di
interazione con fluorescenza oppure il saggio di interazione label free, che si basa sulla risonanza di
superficie.
4- Grafico: corsa elettroforetica bidimensionale con regucalcina

A→ è probabilmente andata incontro a modifiche post-traduzionali come per esempio fosforilazione,
glicosilazione o lipidazione perché il peso molecolare è più alto. È variato il punto isoelettrico perché il
gruppo fosfato da carica negativa alla molecola.
B → probabilmente è appena stata trasferita in un organello e ha perso la sequenza segnale. Ha subito un

taglio della sequenza segnale grazie a una peptidasi durante il passaggio in un organello.
5- Stop-transfer sequence Punti: 8

Una stop-transfer sequence è una sequenza amminoacidica di aa idrofobici presente all’interno di una
proteina. La sequenza è riconosciuta dal traslocatore posto sulla membrana attraverso cui la proteina deve
essere trasferita ed è in grado di bloccarne il suo trasferimento. Come risultato si può avere una proteina
16
transmembrana ad esempio con due domini extra e uno intramembrana ( che corrisponde alla sequenza
stop).
6- Mutagenesi a saturazione Punti: ?/10

E’ una tecnica di mutagenesi semi-casuale, in cui un singolo codone o set di codoni viene randomizzato per
produrre tutti gli amminoacidi possibili in quella posizione.
Utilizzo codoni degenerati per codificare gruppi di amminoacidi.
( N.B. alcuni aa sono codificati da più codoni rispetto ad altri. Utilizzo codoni degenerati al fine di ridurre al
minimo codoni di arresto che in questa metodica non sono graditi. )
Quindi nel mio codone avrò il 25% di trovare T, A, C, e G.
La mutazione di un singolo aa porta una modifica sia strutturale che funzionale della proteina.
7- SRP Punti ?/10

Le SRP ( signal recognition particle) è un tipo di molecola caratterizzata da elementi proteici e nucleotidi di
RNA, essa è un adattatore che accoppia il sistema di traslocazione con quello di traduzione all’interno del
trasporto citosol-reticolo endoplasmatico; questo tipo di trasporto è definito co-traduzionale, perché la
proteina viene trasportata prima che completi la sua sintesi. L’SRP più comune è l’SRP54, che contiene un
piccolo RNA 7S, ed è formato da tre domini principali: dominio M, ricco di metionine, dominio N, che è l’N-
terminale ed il dominio G che lega ed idrolizza il GTP. L’SRP si lega alla sequenza segnale della proteina da
trasporto e la sequenza è così composta : dominio N-terminale basico e positivo, dominio centrale ricco di
aa idrofobici e dominio C-terminale, ricco di aa neutri e polari. Inoltre l’SRP lega il suo recettore SR,
eterodimero, costituito da due domini alfa e beta con attività GTPasica, quindi l’SRP può esistere in tre stati
differenti: legato alla sequenza segnale, legato a SR oppure libero. Le tappe del ciclo dell’SRP sono le
seguenti: SRP lega la sequenza segnale posta all’N-term della proteina ed in questo modo si ha un
momentaneo arresto della traduzione; SRP lega il GTP e ciò ne consegue un cambiamento
conformazionale; il complesso SRP-GTP-proteina si lega al recettore SR; SRP ed SR si staccano dal ribosoma
per permettere l’entrata della proteina all’interno del traslocatore, ancorato nei pressi della membrana del
reticolo endoplasmatico; una volta che la sequenza segnale della proteina incontra il traslocone viene
ripresa la traduzione e la proteina viene fatta passare all’interno di esso e può completare così la sua
sintesi. Il traslocone più comune è il SEC61 ed è un eterotrimero, composto quindi da tre subunità alfa, beta
e gamma che sono proteine integrali di membrana; esso forma una struttura ad anello e rimane chiuso per
impedire l’entrata di proteine libere che non sono ancorate al ribosoma, e si apre nel momento in cui la
proteina si avvicina ed incontra la sua sequenza segnale.
8- Cos’è una stop transfer sequence.

É una sequenze transmembrana idrofobica di una proteina. Stop transfer sequence costituita da  residui
amminoacidici idrofobici posta dopo la sequenza segnale all’N-terminale la proteina scorre attraverso il
poro finchè non si inserisce nel traslocone la stop transfer sequence. Il traslocatore cambia conformazione
si apre lateralmente, viene arrestato il processo di traslocazione e quindi la proteina si dissocia e diffonde
nello strato fosfolipidico. La peptidasi rimuove la sequenza segnale di importazione, l’N terminale libero
rimane all’interno del reticolo mentre il C-terminale all’esterno.
17
9- Trascrittomica Punti: 8/10
La trascrittomica è lo studio e l’analisi di tutti i trascritti dei geni presenti in un tipo cellula in determinate
condizioni sperimenti, e comprende sia proteine, miRNA e siRNA. Il livello e la varietà dei trascritti varia
secondo tipo cellulare e secondo fattori come stress, fumo, malattie e droghe.
10- Trascrittoma
È l’insieme dei geni che sono trascritti in un organismo, comprende sia proteine, miRNA e siRNA. È il
completo dei trascritti di un determinato stirpe cellulare in una certa condizione fisiopatologica ( esempio: i
neuroni nella diversa età avranno un contenuto di RNA differente, l RNA sarà differente anche dopo un
ischemia o dopo una cura con un determinato farmaco). Le cellule usate per gli studi di trascrittomica sono
le Cerevisiae. L’analisi di trascrittomica si fa su colonne che rappresentano i singoli campioni. Permetto alle
cerevisiae di sporulare in terreno e a diversi tempi dei cambiamenti di terreno sono stati preparati degli
RNA. Ogni riga rappresenta il livello di espressione di un gene, che viene espresso con un codice a colori,
rosso quando il livello di espressione aumenta e verde quando diminuisce.
11- Fenomeno folding upon binding Punti 8/10

Il fenomeno di folding upon binding si riferisce al meccanismo di folding tipico delle proteine
intrinsecamente disordinate. Esse infatti si ripiegano in una conformazione funzionalmente attiva solo dopo
l’interazione e il legame con il substrato; dunque prima incontrano il substrato e poi si foldano.
12- Molte vie di trasduzione del segnale si avvalgono di secondi

messaggeri: esponete quali proprietà sono richieste ad un secondo
messaggero e chiarire con un esempio.
I secondi messaggeri sono una famiglia eterogenea di molecole, nucleotidi o ioni no proteici di origine
organica ( in misura minore inorganici ). Sono solubili in acqua. Devono essere velocemente generati e
altrettanto inattivati. Questi permettono all’interno della cellula il trasferimento o la trasmissione o la
regolazione di meccanismi biochimici che hanno funzione di regolare l’attività biologica della cellula.
Il secondo messaggero è quella molecola che viene rilasciata o attivata a seguito del legame del ligando con
in proprio recettore di solito, il legame del secondo recettore ne causa una variazione conformazionale che
innesca una reazione a catena che attiva il secondo messaggero. Il rilascio di questo permette l’attivazione
di molecole intracellulari che regolano l’attività della cellula.
Il cAMP viene inattivato dalla fosfodiesterasi e lo scopo è di abbassare immediatamente il livello di cAMP.
I secondi messaggeri si diffondono velocemente partecipando in vie iniziate da recettori legati a proteine G
e recettori Tirosin chinasici. Hanno ruolo di amplificare il segnale. Sono uno dei principali passaggi di
amplificazione nella cascata di traduzione del segnale.
Al esempi di secondi messaggeri: Ca ++, cAMP, cGMP, diacilglicerolo, inositolo trifosfato.
Esempio2: la fosfolipasi Cè un enzima in grado di idrolizzare PIP2 portando alla formazione di diacilglicerolo
DAG e inositolo trifosfato IP3, secondi messaggeri. IP3 si lega ed attiva i canali per il calcio presenti sul
reticolo endoplasmatico, con conseguente rilascio di ioni Ca nel citosol. L’aumento delle concertazioni di Ca
nel citosol modula l’attività della PKC ( protein chinasi dipendente daal calcio). PKC lega il calcio, cambia
conformazione e diventa attiva solo quando lega a livello della membrana diacilglicerolo. Presenza di
pompe che vengono attivate dalle alte concentrazioni di calcio nel citosol e tendono all’espellere
18
velocemente il calcio. Riserve di calcio presenti nel reticolo e nel mitocondrio, a livello del citosol esistono
delle proteine in grado di legare il calcio per evitare che esso interagisca con altre molecole.
Calmodulina è una proteina in grado di legare il calcio, il calcio ne modifica la conformazione rendendola in
grado di legare e modulare l’attività di altre chinasi o enzimi. La fosfolipasi C può anche legare fattori di
trascrizione ( Tubby) e attivare la trascrizione di gruppi specifici di geni.
13- Inteina Punti ?/10

Nella maggior parte dei casi i geni codificano per una proteina, in alcuni casi codificano per più proteine. Ad
esempio i virus hanno un genoma piccolissimo. Spesso hanno geni che codificano per lunghe poliproteine
che, dopo la sintesi, devono essere tagliate da un enzima specifico per formare un pool di proteine più
piccolo perfettamente funzionanti.
Le inteine sono un esempio di sintesi di 2 proteine dello stesso gene. La prima inteina è stata scoperta
nell’enzima ATPasi. Il gene per l’ATPasi contiene al suo interno un'altra proteina, l’inteina ( internal
protein).
L’inteina si trova all’interno di due frammenti di ATPasi che unirà quando si exciderà.
Applicazioni biotecnologiche:
- Protein ligation
- Incorporazione di aa non canonici
- Purificazione delle prot di fusione ( sistema derivato dalle inteine)
14- Aggregati fibrillari Punti 10/10

Le proteine misfolded sono proteine non ripiegate correttamente. Quando una proteina non è ripiegata in
modo corretto, spesso espone dei residui idrofobici che generalmente sono rinchiusi nel core idrofobico.
Questi residui possono interagire con gli altri residui idrofobici di altre proteine uguali, perciò si possono
formare degli aggregati. Un esempio è rappresentato dalla beta-amiloide nel morbo di alzheimer, che foma
appunto degli aggregati fibrillari.
15- Fosforilazione con esempio a piacere Punti 10 / 10

La fosforilazione è una modificazione post-traduzionale che consiste nell’aggiunta di un gruppo fosfato su
particolari residui di una proteina: i residui che possono subire fosforilazione sono serina, treonina e
tirosina. Le chinasi (trasferasi) sono degli enzimi che catalizzano la defosforilazione, mentre le fosfatasi
(idrolasi) sono quelli che catalizzano la defosforilazione, ossia la rimozione dei gruppi fosfato. Le chinasi
hanno due tipi di specificità: o verso serina e treonina, o verso tirosina; alcune hanno doppia specificità,
quindi possono fosforilare tutti e tre i residui. La fosforilazione / defosforilazione delle proteine modifica la
loro attività: può modificare l’affinità di un enzima per il suo substrato (esempio isocitrato deidrogenasi),
cambiare la conformazione della proteina ( attivazione / inattivazione, esempio glicogeno fosforilasi,
attivata dalla fosforilazione), oppure modificare la locazione cellulare (esempio NF-AT, quando defosforilato
espone la NLS e va al nucleo, fosforilato al contrario).
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16- Saggio di dissociazione
SAGGIO DI DISSOCIAZIONE Inizialmente il nucleotide fluorescente è legato a Ras quindi si ha fluorescenza
massima. Se si aggiunge GEF viene fatto uscire il nucleotide fluorescente, dissociato da Ras ha un livello di
fluorescenza intrinseca più bassa. Il saggio di dissociazione permette di valutare l’uscita del nucleotide ma
non l’ingresso del nuovo nucleotide.
GEF non ha specificità per GTP o GDP ma statisticamente si ha l’ingresso del nucleotide presente in
concentrazione più elevata (nella cellula GTP maggiore concentrazione intracellulare, 10 volte superiore, in
provetta entrerà il nucleotide più concentrato). Possibilità di studiare in vitro l’azione di una molecola in
grado di interferire con il processo di scambio GDP-GTP.
17- Descrivere come si allestisce un saggio di scambio del nucleotide

guanilico legato a Ras. (Rispondere con max due – tre frasi)
Saggio Inizialmente si ha una proteina Ras legata a GDP. Viene aggiunto (in un campione opportuno
contenente magnesio) il nucleotide fluorescente che avrà una fluorescenza di base (valore zero) e GEF
proteina che catalizza la reazione. Avviene lo scambio GDP non fluorescente/GTP fluorescente. Viene
monitorata contemporaneamente l’uscita del nucleotide non fluorescente (non direttamente mediante
fluorescenza ma perché è una condizione indispensabile affinché entri il nucleotide fluorescente) e
l’ingresso della molecola fluorescente.
18- Cicline
Sono una famiglia di proteine che regolano la progressione del ciclo cellulare. Una ciclina forma un
complesso con l'enzima CDK. Così chiamate perché in un ciclo cellulare vengono sintetizzate e degradate in
modo ciclico ed hanno vita breve.
Cambiamenti ciclici nei livelli di cicline, portano al legame e all’attivazione nelle varie fasi del ciclo di
complessi ciclina-Cdk che catalizzano differenti eventi cellulari, fosforilano diversi set di proteine.
Le chinasi cicline dipendenti CDK, controllano il ciclo cellulare, e possono variare di numero nei vari
organismi. Il cambiamento ciclico di attività delle Cdk è controllato dal legame con enzimi e altre proteine
che regolano l’attività delle chinasi.
Il ciclo cellulare è diviso in 4 fasi:
G1 : accrescimento
S : fase di duplicazione
G2 : accrescimento cellulare
M : mitosi
Durante la fase start c’è un aumento delle G1/S cicline, che si legano alla chinasi, che si attiva e fosforila
proteine bersaglio, permettendo la progressione del ciclo cellulare.
Nella fase S c’è un aumento delle S cicline, che promuovono la sintesi di DNA (le proteine effettrici sono
fosforilate dalle chinasi a cui si sono legate). Nella fase M sono presenti elevati livelli di M cicline.
Meccanismo di regolazione delle cdk: durante la mitosi il complesso APC si lega a una subunità (cdc20) e il
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complesso APC ora attivo acquisisce attività ubiquitina ligasi, cioè lega l’ubiquitina ai bersagli. L’aggiunta
dell’ubiquitina alle cdk permette il riconoscimento da parte del proteosoma, che degrada la ciclina legata.
19- Interazioni HUB ???

Dai dati ottenuti si costruiscono network di interazione proteina-proteina, molto vasti e complessi. Tali
network sono rappresentati come dei cerchi che rappresentano le proteine, uniti da archi ogni volta che c’è
un’interazione. Possono essere generati network con struttura differente, si possono pensare tre diversi
livelli di complessità per l’unione dei nodi:
Nella scale-free dove ho un network con nodi che hanno molte interazioni, questi vengono chiamati HUB
molti nodi hanno poche interazioni, ma alcuni nodi detti hubs hanno un numero molto elevato di
collegamenti. Modello più diffuso per descrivere l’organizzazione delle interazioni fra proteine e reti
metaboliche. Reti di tipo SMALL WORLD.
Se si prende lo stesso network e si organizzano in un modo differente ci saranno dei nodi che hanno molte
interazioni e nodi che ne hanno una. I nodi che hanno moltissime interazioni sono indicati con il termine
hub. La struttura delle reti proteiche all’interno di una cellula sono fatte in questo modo: sull’asse Y si ha
P(k), cioè quanti nodi hanno il numero k di interazioni; sull’asse X il numero di interazioni k. Se si mettono in
scala logaritmica si ottiene una retta, da cui si può capire di che tipo di rete si tratta. Questo tipo di
organizzazione viene detta a “piccolo mondo” ed è tipica delle organizzazioni biologiche.
20- Definire quali caratteristiche conformazionali sono attribuite a

“molten globule”, “pre-molten globule” e “random coil”. (Rispondere
con max due – tre frasi)
Pre-molten globule → proteina che inizia a presentare pochi elementi di struttura secondaria. Si iniziano a
intravedere alpha eliche e beta foglietti ma comunque molto presente random coil.
Molten-globule → inizia ad assumere una conformazione tridimensionale, più compatta (diminuzione del
raggio idrodinamico della proteina). Struttura secondaria che inizia a diventare terziaria (quasi foldata)
Random coil → Stato disordinato della struttura di una proteina, in cui le conformazioni possibili sono
moltissime. Il random coil è l’effetto dell’azione di agenti denaturanti sull’organizzazione strutturale delle
proteine native che, distruggendo le interazioni non covalenti, generano una struttura disorganizzata ed
estremamente flessibile. Per niente foldata.
21- Cinetica di inattivazione interfacciale

Cinetica di attivazione interfacciale non segue M&M.
È caratteristica delle lipasi, enzimi in grado di idrolizzare acidi grassi, e scindere i trigliceridi in glicerolo e
acidi grassi. Gli enzimi lipolitici hanno una struttura globulare, sulla quale è presente un lid, un coperchio
che può assumere posizioni differenti aperto (il substrato ha accesso all’enzima e si espone un sito
idrofobico di legame) o chiuso. Il meccanismo di azione delle lipasi è simile a quello delle serine proteasi,
presenza di una triade catalitica His, Ser, Asp/Glu. Si forma un intermedio covalente che viene scisso
mediante l’intervento di una molecola di H2O.
È una cinetica che funziona con l’aumentare della concentrazione del substrato, i grassi tendono a formare
delle strutture micellari per limitare le interazioni delle catene idrofobiche con il solvente acquoso. Le lipasi
sono praticamente inattive quando i grassi sono dispersi, l’attività aumenta quando si vengono a formare
strutture micellari o lamellari (il substrato si trova concentrato in una zona, non disperso).
21
Problemi valgono 20 punti
1- Tripsina e chimotripsina sono membri della famiglia delle serine proteasi.
Esse tagliano legami peptidici all’estremità C-terminale di residui specifici.
La chimotripsina riconosce residui aromatici, mentre la tripsina riconosce
lisina ed arginina. Il riconoscimento di una particolare catena laterale (lato
specificità catena) è completamente determinata dalla struttura e dalle
proprietà della tasca di legame. Nel caso della chimotripsina, la tasca di
legame è idrofobica ed è sufficientemente ampia per accogliere un anello
aromatico. Cosa si può dire circa la dimensione/forma e le possibili
interazioni che danno luogo alla specificità di substrato, nel caso della
tripsina? Che residui amminoacidici vi aspettate di trovare nel sito di
legame della tripsina? In quale posizione della tasca dispecificità? Perché?
Nella tasca di legame della tripsina è presente la triade catalitica formata da Ser 95, His 57 e Asp 102.
Questi residui sono lontani tra loro nella sequenza primitiva ma nella terziaria il folding li pone in modo da
creare un ambiente adeguato per l’interazione con Lys e Arg, l’idrolisi del legame peptidico tra aa basici
(carichi +). La tasca inoltre è idrofilica e l’H20 servirà a ripristinare la triade catalitica dopo il taglio
proteolitico.
La tasca della chimotripsina presenta ai lati dei residui di Gly. L’ambiente è idrofobico quindi ospita residui
di tipo idrofobico, apolari e aa aromatici ( con ingombro sterico elevato)
2- Come ottenere un proteasi con ridotta Km?

Per ridurre una proteasi con ridotta Km, ovvero con minore affinità da parte dell’enzima per il substrato, è
utile rendere l’enzima meno specifico per il sito di legame del suo substrato. Per fare ciò è possibile inserire
mutazioni in tale sito. L’enzima risulterà quindi più aspecifico per il suo substrato ( di conseguenza meno
affine) e avrà maggiore efficienza catalitica.
3- Perché negli eucarioti c’è una grande varietà di proteine rispetto ai geni ?
Dovuta a: Modificazioni post traduzinali e meccanismi di splicing che possono subire le proteine tra cui :
1- Glicosilazione che può essere di due tipi: N –glicosilazione che avviene sui residui di Asn ( con
sequenza con senso ); O- glicosilazione che avviene su residui Ser – Thr
2- Lipidazione che può essere di tre tipi: aggiunta di GPI, glicosil inositolo fosfato, aggiunta di gruppi
farnesilici e gerangilgeramilici, aggiunta di acidi grassi come l’acido palmitico e acido miristico.
Inoltre non tutti gli mRNA vengono tradotti.
4- Metodi per trovare l’antagonista
5- Sintetizzare antagonisti per bloccare l’interazione Prot1-Prot2

Si può iniziare a facendo studi di molecular modelling per studiare l’interfaccia di legame delle due
proteine. Si procede sintetizzando chimicamente dei potenziali inibitori dell’interazione, capaci di legarsi
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all’interfaccia di legame di una delle due proteine, impedendone l’interazione con l’altra. A questo punto si
testa l’affinità dei potenziali inibitori per la prot1 ad esempio mediante la tecnica del phage display. Si
creano delle proteine di fusione, unendo in frame le sequenze che codificano per i potenziali inibitori e la
sequenza che codifica per una proteina del capside del fago. Si inserisce il costrutto di interesse in un
fagemide contenente sia l’origine di replicazione per coli che quella per il fago helper. Con i plasmidi
ottenuti si trasforma un ceppo di Coli soppressore, che non riconosce il codone di stop tra l’inibitore e la
proteina del capside e permette l’espressione della proteina di fusione. Si co-infetta con un fago helper ( es:
f1 o M13) che determina la produzione di particelle fagiche che esprimono la proteina di fusione. Si
effettua un panning su piastra in cui si immobilizza sulla piastra prot2 e si fa competere la prot1 wt con le
diverse varianti di inibitori espresse dai fagi. Dopo diversi cicli (6/8) verranno identificatigli inibitori migliori,
ovvero quelli più affini alla prot2 quindi più abili nello spiazzare la prot1. A questo puntosi può fare
mutagenesi random sugli inibitori trovati e fare nuovamente phage display per trovare varianti ancora
migliori. In alternativa a tutto ciò si può frammentare il DNA che codifica per la prot1. Lo scopo è quello di
ottenere dei frammenti in grado di legarsi alla prot2 ma incapaci di attivarla. Si unisce ciascun frammento a
un promotore e si inserisce la cassetta di espressione all’interno di un plasmide con il quale si trasforma
coli. A questo punto si può valutare l’affinità dei frammenti per la prot2 e la loro capacità di inibire il legame
con la prot1 mediante phage display.
6- Elettroforesi 2D Punti 20/20

Probabilmente dalla situazione 0 alla situazione B, dato che la MW si abbassa e il pI rimane invariato, è
possibile che si sia verificato un taglio proteolitico con conseguente perdita di una parte della catena
proteica che ha quindi causato una diminuzione della massa della proteina.
Dalla situazione 0 alla situazione A invece si verifica un leggero aumento della MW della proteina ma un
notevole cambio nel pI. Una possibile modificazione che può essere avvenuta è quindi l’aggiunta di un
gruppo carico (es gruppo P), che va a cambiare il pI della proteina e influisce minimamente sulla MW
(infatti il peso di un gruppo fosfato è di 80 Da). Ipotizzo quindi che possa essere avvenuta una
fosforilazione.
7- Proporre almeno una strategia per identificare varianti di una proteasi con
ridotta Km dettagliare: presupposti, metodologie impiegate ed esperimenti
per la validazione
per identificare le varianti di questa categoria di proteasi è necessario conoscere la proteasi di partenza. È
fondamentale usare tecniche di mutazione standard e in seguito eseguire screening per variare il profilo
genico e controllare se le modifiche hanno portato dei risultati. Questo procedimento è necessario perché
è impossibile conoscere il profilo genetico delle proteasi. L’alanina funziona come limitante nel senso che
diminuisce la funzionalità delle proteasi. Per questo motivo usiamo tecniche come alanin scanning che ci
permette di rimuovere quei residui responsabili del legame con l’alanina.
8- Proteoma + tecnica 2D-DIGE Punti: 15 / 20

Il proteoma è l’insieme delle proteine di un dato organismo in un determinato momento fisio-patologico.
La tecnica 2D-DIGE è un tipo di elettroforesi bidimensionale, che accoppia cioè la separazione in base al
punto isoelettrico con la separazione in base al peso molecolare. Prima di fare tutto ciò il campione viene
marcato con un reagente fluorescente, per esempio la proteina A con un fluorescente verde e la proteina B
con un fluorescente rosso; quantità identiche di proteine vengono mescolate e separate sul gel.
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Inizialmente si allestisce una isoelettrofocalizzazione e quindi il campione viene separato in base al punto
isoelettrico (pI), successivamente il gel viene ruotato di 90 gradi ed il campione viene fatto correre in
presenza di SDS per poterne calcolare il peso molecolare. Una volta ottenute le proteine di interesse il
macchinario arriva in corrispondenza della macchia, incide il gel, preleva il frammento, lo mette in provetta
con tripsina così da frammentarlo in peptidi ed infine lo analizza con spettrometria di massa.
9- Analisi proteoma Punti 15/20

Il proteoma è l’insieme delle proteine (eso ed endoproteoma) di una cellula in determinate condizioni fisio-
patologiche.
Dato che l’analisi di tutto il proteoma in contemporanea è difficile e porta dati confusi, è utile fare una pre-
frazionamento tramite elettroforesi 2D in cui separo le proteine d’interesse in base al pI e MW. Si
estraggono le proteine dal gel e si esegue una frammentazione enzimatica con tripsina. Per identificare le
proteine si esegue spettrometria di massa.
Analisi comparativa:
1- A e B in due gel 2D. scansione con scanner ottenendo immagine in toni di grigio. Il tono è
proporzionale alle concentrazione della proteina.
2- Analisi a colori: A→ prot marcate con colorante fluorescente verde e B→ con fluorocromo rosso
carico su gel 2D
Una volta finita la corsa ricaverò, con opportuni sistemi, la differenza di fluorescenza dei diversi spot ( uno
spot è un tipo di proteina) e studio i dati ottenuti valutando l’eventuale differenza di exp in quantità di una
proteina. In protomica clinica si può usare questa tecnica per comparare due campioni sano/da
diagnosticare e determinare l’insorgenza di una malattia.
10- Inibire la via di trasduzione del segnale del glucagone per ripristinare il
metabolismo glucidico (idea – metodo – risultati)
CESSAZIONE DELLA TRADUZIONE DEL SEGNALE  I recettori devono essere attivati ma anche inattivati in
modo da permettere alla cellula di rispondere ad altri segnali. I  recettori vengono rimossi mediante
endocitosi. Desensitizzazione di un recettore accoppiato a proteine eterotrimeriche fosforilazione-
dipendente: il recettore viene fosforilato in semplici siti, viene riconosciuto da proteine dette arrestine che
agiscono in due modi: determinano ingombro sterico impedendo l’interazione con il trasduttore
intracellulare (protein G) permettono il riconoscimento del recettore I recettori possono essere attivati non
solo dal legame con un ligando ma anche da variazioni nella concentrazione di un metabolita come
l’ossigeno o i nutrienti, oppure da stimoli i tipo fisico come luce, contatto, calore.
Il legame ligando-recettore è altamente specifico e dipende dalla formazione di forze non covalenti, ma
ioniche, Van der Waals, interazioni idrofobiche. Il legame deve essere sufficientemente forte da poter
avvenire anche a basse concentrazioni del ligando ma deve essere contemporaneamente labile da poter
essere inattivato e non deve essere irreversibile.
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11- Gene Ontology
Progetto bioinformatico atto ad unificare la descrizione delle caratteristiche dei prodotti dei geni in tutte le
specie.
Il progetto si propone di:
1- Mantenere e sviluppare un vocabolario per descrivere i geni e i prodotti genici per ogni organismo
vivente
2- Annotare i geni e i prodotti genici
3- Fornisco strumenti per un facile accesso ai dati forniti dal progetto
Il progetto GO fornisce un ontologia di termini definiti che presentano le proprietà dei geni. L’ontologia
è divisa in 3 ambiti:
a- Cellular component: parti della cellula o del suo ambiente extracellulare

b- Molecolar function: attività elementari di un prodotto genico a livello molecolare
c- Biological process: operazioni/ complessi di eventi molecolari con inizio e fine definiti, pertinenti al
funzionamento di unità viventi integrate: cell, tessuti e organi
Ogni termine GO all’interno dell’ontologia ha un termine specifico.
I termine possono avere sinonimi che sono equivalenti al nome del termine. L’ontologia GO è
strutturato come un grafo orientato a ciclico
L’ontologia GO è dinamica, le aggiunte , le correzioni, le correzioni e le modifiche sono aggiunte e

sollecitate da membri della comunità di ricerca.
12- Gene Ontology

Database gerarchico in cui le specie sono classificate in base alla loro funzionalità.
I primi 3 rami sono detti: geolocalization, biological function e biological process.
Ogni enzima è associato a tanti termini GO diversi.
Si associano le proteine differenzialmente espresse a database come GO o come CAG. Ogni database
associa a ogni pathway uno specifico insieme di geni.
Esempio: nel lievito ci sono 5500 geni che codificano per proteine , genero una lista di 1650 geni (30% del
tot) differenzialmente espressi. In krebs sono coinvolte 8 proteine, ovvero 8 geni.
Il 30% di 8 è 2,4 ( 2< geni<4 ). Troverò 2 o 3 geni se krebs non è influenzato dalla condizione che sto
studiando. Faccio un analisi di arricchimento.
13- Gene ontology Punti 10/ ???

A ciascuna proteina è possibile associare dei termini di gene ontology. All’interno di una lista di geni
preferenzialmente espressi è possibile associare ciascun geni i suoi termini di Gene ontology. Un analisi di
arricchimento consiste nel vedere se qualche termine di GO è presente con una frequenza maggiore nella
lista dei geni preferenzialmente espressi, per esempio se tra tutti i geni che compongono il genoma ( 6000)
il termine di GO “PIPPO” è presente 100 volte, mi aspetto che prendendo in considerazione 600 geni a caso
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il termine PIPPO sia presente 10 volte. Se trovo che il termine PIPPO è presente 50 volte nella mia lista di
100 geni differenziamento espressi, allora significa che in questa lista di geni il termine PIPPO è presente
con una frequenza maggiore. Quindi i miei 100 geni differenziamento espressi sono associati al termine
PIPPO in modo maggioritario che può per esempio indicare la localizzazione del gene codificato della
proteina, la sua funzione biologica o il processo biologico in cui la proteina è coinvolta
14- Malattie da misfolding

Le proteine misfolded sono proteine non ripiegate correttamente. Queste proteine , non essendo nella loro
conformazione ottimale, perdono totalmente o parzialmente la loro attività fisiologica. Questo può
influenzare i pathway in cui la proteina è coinvolta , e causa danni a livello cellulare che si possono
ripercuotere a livello dell’organismo. Queste proteine possono anche guadagnare attività dannose,
intervenendo in altri pathway in cui fisiologicamente non sono coinvolte.
15- Passaggi chiave nella formazione degli aggregati fibrillari

Il misfolding consiste in un alterazione del normale processo di ripiegamento della proteina nella sua
conformazione nativa. Le malattie correlabili al misfolding sono state raggruppate insieme sotto il nome di
“ disordini conformazionali proteici” e comprendono il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson che
hanno tutte un deposito nei tessuti di aggregati fibrillari proteici insolubili rispetto alle normali proteine,
essi possono formare depositi intrattabili e generalmente tossici nei vari tessuti dell’organismo e prendono
il nome di placche di amiloide.
Ogni tipo di amiloide deriva da una proteina sierica precursore, con un’alta inclinazione al misfolding e che
quindi sfugge a tutti i meccanismi protettivi che i sistemi biologici hanno messo a punto sia per assicurare
che le proteine si foldano correttamente, sia per degradarle, prima che possano arrecare seri danni
all’organismo ospite.
Nonostante la loro diversità biochimica, queste proteine formano fibrille con morfologia, proprietà
coloranti e struttura a foglietti beta simili e strettamente influenzate dalle condizioni nelle quali è avvenuto
il processo di formazione e ciò avviene per il legame idrofobico dei residui che sono esposti al di fuori
dell’aggregato.
Fattori ambientali pH, ioni metallici, stress ossidativo possono contribuire alla destabilizzazione di una
molecola nativa e presumibilmente, incrementare la popolazione degli stati “misfolded”, caratterizzati da
un aumento delle strutture in conformazione beta
è frequente, durante la formazione di fibrille, cambiamento conformazionale, coinvolge una transizione da

α elica a fogliettoβ.
L’aggregazione di depositi di amiloide è generalmente lenta e prevede la formazione di specie oligomeriche

come risultato di interazioni non specifiche. Questi aggregati amorfi o micelle si trasformano in specie con
morfologie più caratteristiche, definite “proto fibrille o protofilamenti”. Queste strutture, comunemente
corti, sottili, a volte ricciolute, si associano a formare fibrille mature che si formano attraverso tre passaggi:
- formazione di dimeri di proteina denaturata > vengono cambiamenti nella struttura secondaria
della proteina, dovuti ad un aumento di fogliettiβ rispetto alle α eliche, questa conversione
strutturale rappresenta un evento chiave nella formazione di fibrille in quanto i dimeri fungono da
nuclei per la formazione di protofilamenti.
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- Formazione di protofilamenti >avviene attraverso una polimerizzazione nucleazione – dipendente,
perché i dimeri, formati contemporaneamente ai cambiamenti della struttura secondaria , fungono
da nuclei oligomerici dalla cui addizione deriva la fibrilla.
- Formazione di fibrille di amiloide attraverso l’associazione di protofilamenti > sebbene la struttura
dei nuclei e dei protofilamenti è diversa da proteina a proteina, il meccanismo di formazione
sembra essere comune, basato cioè sull’associazione di dimeri a partire dall’estremità della fibrilla.
In fine l’associazione laterale di protofilamenti dà origine alle placche di amiloide.
16- Sistema dei due ibridi

È una tecnica utile per rilevare l’interazione tra 2 proteine ( partner proteici ). Il saggio viene effettuato in
cerevisiae . Utilizzo una proteina costituita da 2 domini, la cui funzione dipende dall’interazione spaziale dei
due domini ( i due domini devono essere posti vicini affinché la proteina funzioni e possono appartenere a
due catene polipeptidiche diverse ) → se i due domini sono separati la proteina non è in grado di svolgere la
sua funzione.
Gli attivatori trascrizionali hanno:
- Dominio di legame al DNA

- Dominio di attivazione della trascrizione ( RNApol)
17- Test d’arricchimento

Se in una lista di geni differenzialmente espressi in numero di geni appartenenti ad uno stesso pathway è
maggiore rispetto alle aspettative significa che quel pathway di GO è arricchito .
Esempio: all’interno di S. Cerevisiae in cui ho 6000 geni trovo 600 geni di interesse il pathway della glicolisi
in 60 ha ad esempio 20 geni, 10 mi aspetto che secondo i parametri statistici di questi 20 ce ne siano 2 ( 1
/10 ). Se ne trovo 6 significa che quel pathway GO è arricchito in quel particolare studio.
Per vedere se è un dato casuale o meno calcolo il P- VALUES : <5*10^-2 NO; >5*10^-2 Sì.
18- Chimotripsina
È un enzima appartenente alla classe delle proteasi, che catalizza la rottura del legame peptidico che
preferenza per la Tyr, Trp, Phe e Leu. Fa parte della famiglia delle serina proteasi, avente tutte un sito attivo
molto simile. Viene ad essere sintetizzata in forma inattiva dal pancreas, e una volta attiva completa la
digestione di alcune proteine. È una proteina globulare, come la tripsina possiede una tasca idrofobica
ricoperta da residui aa apolari. La cavità idrofoba contiene una triade catalitica ( Ser, His, Asp ) orientata
sempre nello stesso modo.
Idrolizza il legame sono in corrispondenza di aa idrofobici, e scorre lungola catena per trovarli.
19- Tripsina
È un enzima che appartiene alla classe delle idrolasi che catalizza il taglio proteolitico con specificità della
Arg e Lys.
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Nel sito attivo presente una sequenza specifica che prende il nome di triade catalitica ( His, Ser, Asp). Il suo
substrato è rappresentato da una proteina basica.
Pancreas →tripsinogeno (inattivo)→ va nell’intestino tenue→ si attivo e viene trasformato dai

enteropeptidani) tripsina
Inibitori: peptina.
20- Tripsina
Essa riconosce aa come la Lys e Arg che sono carichi positivamente (basici). La specificità dell’interazione
con il substrato è data dalle interazioni che avvengono tra gli aa e le loro dimensioni. Essendo carichi
positivamente nel sito di legame della tripsina mi aspetto un aa acido (negativo) come l’aspartato in grado
di avere una buona interazione con le cariche positive degli aa basici.
L’Asp è preferibile al glutammato in quanto la sua catena è più corta e quindi compensa la lunghezza del
Arg e della Lys.
Ai lati della tasca di specificità cui aspetto aa di piccole dimensioni come la Gly (apolare che sostituente solo
H) che favoriscono solo l’entrata nella tasca di Lys e Arg e ne stabilizzano la carica.
21- Sic 1
Sic1 è una proteina intrensicamente disordinata che lega cdc28, inibendo il passaggio alla fase successiva
nel ciclo cellulare. Sic1 è caratterizzata dalla possibilità di avere 9 siti fosforilabili e se viene fosforilata in
almeno 7 può essere riconosciuta da wd40 di cdc4.
Grazie al fatto che Sic1 è una IDP può essere fosforilata in più siti vicini senza essere successivamente
soggetta alla repulsione dei gruppi P. questa è una delle caratteristiche delle IDP, cioè di avere numerosi siti
accessibili alle modifiche post
L’elevata densità di carica permette il riconoscimento e il legame con cdc4. Il legame allovalente in quanto il
dominio cdc4 ha capacità di legarsi a più siti fosforilati di Sic1grazie all’elevato numero di fosforilazioni. A
questo punto Sic1 può essere ubiquinato ed essere degradato da SCF.
Cdc28 viene quindi ad essere liberata dal legame con Sic1 e il processo di avanzamento dl ciclo cellulare
può avvenire.
22- Sintetizzare una subtilisina più resistente ai solventi organici

Per sintetizzare una subtilisina (S) più resistente ai solventi organici si può fare mutagenesi random; dal
momento che non è coinvolta una particolare superficie di interazione non è possibile fare mutagenesi sito
diretta a livello dei residui più importanti per l’interazione. Si può utilizzare la tecnica della PCR mutagenica
random “error prone” ( polimerasi senza attività di proofreading, alte [Mg], presenza [Mn] e alcoli)oppure
con analoghi delle basi ( 5bromouracile e aminopurina). Successivamente si inseriscono le varianti della
subtilisina in diversi plasmidi con i quali si trasforma un organismo ospite, come E. coli. Si procede
prelevandole varianti di S prodotte da coli e sottoponendole a un saggio enzimatico per valutare l’effetto
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delle mutazioni sull’efficienza catalitica (Kcat/Km) dell’enzima. Si allestiscono diverse provette: in ciascuna
si inserisce una variante di S, solventi organici e un substrato cromogenico. Più la variante è resistente ai
solventi , maggiore sarà l’efficienza catalitica dell’enzima e quindi maggiore sarà la colorazione rilevata.
23- Subtilisina
Gli enzimi applicabili in detergenza devono essere enzimi capaci di tollerare e restare attivi in condizioni di
forte stress. Devono avere resistenza in presenza di sulfattanti, builders (chelanti), pH alcalini (7-11)
temperature generalmente elevate (40-60°C), potenziale presenza di ipoclorito di Na (candeggina) e
sbiancanti vari. Ciò ha portato alla ricerca e selezione di enzimi di natura microbica cercati spesso tra moo
estremofili per quanto riguarda temperature di attività e pH. Gran parte delle proteasi in uso sono
subtilisine di origine batterica , isolate originariamente da Bacillus subtilis. Hanno sito catalitico simile a
quello delle chimotripsine. Tramite mutazioni sito dirette (SDM) è stata mutata una metionina posta
accanto alla serina del sito catalitico, aumentando la stabilità ad H2O2. Introducendo un nuovo ponte
disolfuro SDM che introduce una o più cisteine, è stata aumentata la stabilità termica. I principali interventi
in ingegneria proteica sono stati basati però sulla tecnica DNA shuffling, una tecnica che permette
mutazioni di disegno semirazionale, cioè mutazioni casuali sviluppate scambiando frammenti genici di
subtilisine di 4 famiglie differenti, agendo su un’ area perfettamente nota, ottenendo smart libraries. In
seguito con error-prone PCR si è incrementata la stabilità ai chelanti del Ca2+.
24- Secondo messaggero

In biologia molecolare si definisce secondo messaggero quella famiglia eterogenea di molecole, soprattutto
di origine organica ma in misura minore anche inorganica, che permettono all’interno della cellula il
trasferimento, o la trasmissione o la regolazione di meccanismi biochimici che hanno la funzione di regolare
l’attività biologica della cellula.
Il secondo messaggero è una molecola che viene rilasciata o attivata a seguito del legame con il proprio
recettore. Di solito, il legame del ligando con il recettore ne causa una variazione conformazionale che ne
innesca una reazione a catena che attiva il secondo messaggero. Il rilascio di questo permette l’attivazione
di molecole intracellulari che regolano l’attività della cellula.
Esempio: FOSFOLIPASI C è un enzima in grado di idrolizzare PIP2 portando alla formazione di diacilglicerolo
DAG e inositolo trifosfato IP3, secondi messaggeri. IP3 si lega ed attiva i canali per il calcio presenti sul
reticolo endoplasmatico, con conseguente rilascio di calcio nel citosol. L’aumento delle concentrazioni di
calcio nel citosol modula l’attività del PKC (proteina chinasi dipendente dal calcio). PKC lega il calcio, cambia
conformazione e diventa attiva solo quando lega a livello della membrana diacilglicerolo. Presenza di
pompe che vengono attivate dalle alte concentrazioni di calcio nel citosol e tendono all’espellere
velocemente il calcio. Riserve di calcio presenti nel reticolo e nel mitocondrio, a livello del citosol esistono
delle proteine in grado di legare il calcio per evitare che esso interagisca con altre molecole.
CALMODULINA proteina in grado di legare il calcio e modulare l’attività di altre chinasi o enzimi. La
fosfolipasi C può anche legare fattori di trascrizione ( tubby) e attivare la trascrizione di gruppi specifici di
geni.
25- Km Kcat e perfezione catalitica

l’affinità di un enzima per il substrato si determina valutando la sua Km, cioè la sua concentrazione di
substrato necessaria affinché l’enzima raggiunga il 50% della sua velocità massima. Perciò Km bassa è
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indice di alta affinità per il substrato. Valutando quindi i dati tabulati, risulta essere l’enzima FUMARASI
quello con maggiore affinità al substrato.
La maggiore efficienza catalitica è determinata da Kcat, cioè il numero di turnover, il numero di molecole di
substrato convertite in prodotto nell’unità di tempo. In questo caso più il valore è elevato, più un enzima
sarà efficiente. Perciò nei dati tabulati il più efficiente è la CATALASI.
Per confrontare però quale tra le due o più enzimi si avvicina alla perfezione catalitica, è utile introdurre
Keff, costante di specificità o efficienza catalitica, data da Kcat/Km. Il rapporto per indicare alta efficienza
catalitica deve essere maggiore possibile, ciò Kcat elevato e Km piccolo. Indicativamente è la CATALASI
l’enzima con maggiore efficienza catalitica.
Domande da 40 punti
1- Studio della via metabolica del galattosio con approcci di system
biology Punti : 30/40
La biologia di sistemi si basa su uno studio di cellule, organi e tessuto che interagiscono tra di loro a livello
di un sistema organizzato. Per studiare la via metabolica del galattosio bisogna prendere in considerazione i
geni coinvolti: gal4 la cui trascrizione produce una proteina GAL4 che è l’attivatore trascrizionale del
metabolismo del galattosio, si lega alle sequenze UAS-GAL prima dei geni; il gene gal2 che codifica per la
proteina GAL2 che è responsabile del trasporto di galattosio all’interno della cellula (il sistema per
funzionare ha bisogno di galattosio); gal1 che codifica per la proteina GAL1 che è una galattochinasi che
fosforila il galattosio trasferendo gruppo fosfato da una molecola di ATP producendo galattosio-1-P; i geni
gal7 e gal10 che codifica per le rispettive proteine GAL7 e GAL10 nei quali convertono il galattosio-1-P in
glucosio 1-P utilizzando come cofattore UDP-galattosio; il gene gal5 che codifica la proteinaGAL5 trasforma
il glucosio1-P in glucosio 6-P in modo che possa entrare nella glicolisi con lo scopo di produrre energia sotto
forma di ATP; infine il gene gal80 che codifica per la proteina GAL80 che è il repressore e in assenza di
galattosio li lega alla attivatore GAL4 per reprimere il sistema. Sono stati fatti degli studi questo sistema
tramite tecniche omiche su S. Cerevisiae; è stato costruito un modello per studiare l’interazione dei geni
coinvolti. I geni coinvolti sono nove e vengono considerate due condizioni di crescita differenti; su
galattosio e il su raffinosio che hanno zucchero che non induce ne reprime il sistema. I geni che considero
sono 10 poiché uno è quello wt e provoco una delezione negli altri a turno. Lo scopo è quello di studiare il
livello di espressione dei geni e la loro interazione tramite un incrocio il risultato di una perturbazione
ambientale (dovuta allo zucchero) e una perturbazione genica (dovuta alla delezione genica ). Una volta
recuperati gli RNA con le apposite tecniche si esegue un’analisi di trascrittomica per valutare i risultati.
Altro studio è stato fatto sempre per valutare l’espressione di geni in seguito a mutazioni: sono stati deleti i
geni gal7 e gal10 e si è notata un’anomalia nella crescita delle cellule che crescevano poco. Questo perché
non erano presenti i geni che codificano per la conversione da galattosio 1-P a glucosio 1-P quindi nella
cellula accumula galattosio che in elevate concentrazioni risulta tossico e provoca un malfunzionamento
della crescita cellulare. Se invece viene deleto in un ceppo gal80 non è presente la proteina che reprime il
sistema quindi ci si aspetterebbe che ci sia una buona crescita cellulare, in realtà questo non accade perché
l’attivatore GAL40 è sempre attivo (non essendo spento dalla repressore) ma anche in condizioni in cui non
dovrebbe esserlo (ad esempio quando non è presente galattosio), di conseguenza non si ha una crescita
corretta.
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2- Gal Punti: 35 /40
Il sistema GAL permette agli eviti di sfruttare il galattosio come fonte di carbonio; esso è caratterizzato da
nove geni che provvedono alla regolazione del galattosio e alla sua sintesi e formazione. Ci sono i geni GAL2
e HXT che codificano per i trasportatori del galattosio, di cui il primo è specifico e quindi ad alta attività per
il galattosio mentre il secondo è aspecifico e quindi ad alta attività per il glucosio e a bassa affinità per il
galattosio; ci sono i geni regolatori GAL3, GAL6, GAL4, GAL80, di cui il GAL4 è l’attivatore trascrizionale
mentre GAL80 è l’inibitore che in assenza di galattosio va ad inattivare il gene GAL4; i geni strutturali sono
GAL1, che codifica per la galattochinasi e che permette la trasformazione del galattosio in galattosio 1P; poi
ci sono GAL7 e GAL10 che permettono la trasformazione del galattosio 1P in glucosio 1P ed utilizzano come
substrato l’UDP, ed infine il gene GAL5 che permette di trasformare il glucosio 1P in glucosio 6P che può
così entrare in glicolisi. Lo scopo di questo studio è quello di perturbare in maniera sistematica il
metabolismo del galattosio mediante approcci sia genetici che ambientali. Chi si avvale innanzitutto di
esperimenti di trascrittomica e si va ad analizzare il profilo di espressione genica sia della cellula wt che
delle cellule mutate in maniera specifica per ognuno dei nove geni coinvolti (GAL1, GAL2, GAL3, GAL4,
GAL5, GAL6, GAL7, GAL80, GAL10) e comparare il profilo di espressione genica dei mutanti con quello delle
cellule WT. Si allestiscono due condizioni nutrizionali diverse, una con galattosio e raffinosio ed una con il
raffinosio soltanto e quindi alla fine avremo 20 condizioni totali da porre in esame. Vado così ad allestire
l’analisi trascrizionale mediante tecnologia Affymetrix; ogni esperimento è condotto in quadruplicato; il
filtro viene preparato l’RNA, viene retrotrascritto a cDNA e poi trascritto in presenza di nucleotidi
fluorescenti in cRNA; i dati vengono interpretati per valutare quali geni hanno differenze di espressione
rispetto alla condizione wt e calcolare tali livelli di espressione. Si trova che su 6000 geni, il numero di geni
in cui livello di espressione cambia in modo significativo in almeno una di queste condizioni è pari a 1000,
ovvero 1/6. Fatto ciò si va a raggruppare tali geni in base alla funzione ed avrò quindi vicini quelli con la
funzione simile. Si va inoltre a raggrupparli mediante il sistema Gene Ontology (GO), dove ogni genere può
essere associato ad una serie di termini che rientrano in un ontologia specifica. Ora io voglio vedere se c’è
una correlazione tra il livello di espressione di geni e quello delle proteine; allestisco così una marcatura
post traduzionale solo per due condizioni, il wild type in raffinosio ed il wt in raffinosio più galattosio; si
estraggono le proteine dalle cellule cresciute in presenza di raffinosio e raffinosio più galattosio, le vado a
marcare con isotopo pesante il wt con solo raffinosio e con isotopo leggero quello con raffinosio e
galattosio, le si fanno correre, dopo averli digerite con tripsina in uno spettrometro di massa ed il rapporto
tra il picco leggero ed il picco pesante sarà proprio rapporto tra il livello di espressione delle proteine. A
questo punto si fa un database cross correlation e cioè si confrontano i propri dati con quelli ottenuti in
letteratura. Queste analisi creano nuove ipotesi riguardo il modello di base; la prima ha a che fare col fatto
che se si deletano i geni GAL7 e GAL10, il livello di espressione degli altri geni del sistema GAL viene esso
stesso influenzato, cosa che non ci si aspetta perché sono geni strutturali e non regolatori; questo però può
essere spiegato dall’incapacità di convertire il galattosio 1P che può essere tossico se si accumula quando la
sua via di smaltimento è inattivata; per valutare se l’accumulo è tossico vado ad allestire una doppia
mutazione GAL1-GAL7 o GAL1-GAL10 così che gal1P non può accumularsi; il doppio montante dovrebbe
assomigliare di più al singolo mutante gal1 che al singolo mutante gal7 o gal10 ed è quello che
effettivamente si osserva. La seconda ipotesi riguarda le caratteristiche del mutante GAL80 e che crescono
in assenza di galattosio, in solo raffinosio, crescono molto lentamente e danno un profilo di espressione che
si differenzia da tutti gli altri geni. Anche qui per dimostrare ciò viene fatto una doppia mutazione GAL80-
GAL4 e si è visto che il fenotipo derivante assomiglia più al singolo mutante GAL4 che al singolo mutante
GAL80 e ciò ne deriva che il profilo di espressione di GAL80 sta in un angolo e che quindi diverso da tutti gli
altri profili, quindi i fenotipo sono dovuti non alla perdita di GAL80 ma alla attivazione costitutiva di GAL4.
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3- Fosforilazione Punti: 30 / 40
La fosforilazione delle proteine e un procedimento in cui una proteina (generalmente una chinasi) fosforila
dei particolari residui sulla molecola bersaglio. Lo scopo è quello di attivare, inattivare la proteina per
indurre una funzione che influenzano il metabolismo cellulare o le diverse fasi di crescita o modificazioni
conformazionali e genetiche (in questo caso tramite attivazione/inibizione dei fattori di trascrizione). La
fosforilazione avviene tramite l’aggiunta di un gruppo fosfato (carico negativamente) da parte di una
molecola donatrice come ATP o GTP liberando poi ADP o GDP. Il gruppo fosfato si sostituisce ad un gruppo
OH- della molecola da fosforilare. I residui che possono essere fosforilare sono Tyr, Thr e Ser poiché
possiedono un gruppo ossidrile. Nella reazione si avrà la liberazione di una molecola di idrogeno ( che
apparteneva a OH-). Le chinasi possono essere di diversi tipi a seconda dei residui che fosforilano. Un
esempio di fosforilazione si può anche chiarire con il recettore Tirosin chinasico, il quale ha attività
enzimatica intrinseca in grado di fosforilare residui di tirosina propri. La fosforilazione avviene in seguito a
un segnale esterno (il ligando) che lega il recettore provocando inoltre la sua dimerizzazione. In questo caso
la fosforilazione del recettore ha utilità di attivazione poiché una volta fosforilato è in grado di reclutare
Grb2 e SOS (una proteina Gef) che attivano Ras. In particolare Grb2 catalizza l’attivazione del fattore G e
SOS si occupa del legame con Ras e GTP attivandolo. Successivamente si ha il processo della cascata delle
MAP chinasi che sono proteine con capacità chinasica e allo stesso tempo sono fosforilate. In particolare
Ras attiva Raf1 e poi si ha la fosforilazione della cascata delle MAP chinasi, che vengono attivate una volta
fosforilate e attivano le proteine successive fosforilandole. Altro esempio è la glicogeno fosforilasi che un
enzima che favorisce la formazione di monomeri di glucosio a partire da una molecola di glicogeno quando
è attivo. L’enzima è attivato se fosforilato da una chinasi poiché viene esposto il sito attivo grazie alla
presenza della carica negativa data dalla presenza del gruppo fosfato. Al contrario quando è inattivo
l’enzima non è fosforilato e presenta il sito attivo occluso.
4- Fosforilazione Punti: 30/40

La fosforilazione è un tipo di trasformazione covalente e reversibile, promossa dalle proteine kinasi, che
permette il trasferimento di un gruppo fosfato P, in genere donato dal ATP, verso una molecola che la
accetta ed in genere va sostituire il residuo ossidrile di serina, treonina o tirosina. La reazione inversa è
seguita dalle fosfatasi e che quindi vanno a togliere alla molecola un gruppo fosfato. Il gruppo fosfato è
ingombrante e causa quindi un cambiamento conformazionale ed altera la funzionalità delle proteine che
va a fosforilare. Quando la proteina viene fosforilata assume un diverso peso molecolare provocando un
cambiamento nella velocità di migrazione su gel elettroforetico. La fosforilazione causa tre principali
cambiamenti: va a creare cambiamenti conformazionali in prossimità del sito attivo dovuti a fenomeni di
attrazione e repulsione dati dalla carica negativa del fosfato (un esempio lo è la reazione catalizzata
dall’isocitrato deidrogenasi, che catalizza la trasformazione dell’isocitrato in Alfa-chetoglutarato; essendo
l’isocitrato carico negativamente andrà a creare fenomeni di repulsione poiché anche il gruppo fosfato è
carico negativamente e quindi ciò andrà a peggiorare l’efficacia dell’enzima); va a formare legami idrogeno
e fenomeni di attrazione e repulsione tra regioni intramolecolari cariche con conseguente cambiamento
conformazionale che modula l’attività dell’enzima( ne sono esempi le MAP chinasi); va a formare i siti di
consenso per il binding con altre proteine con conseguente variazione della localizzazione sul cellulare (ne
sono esempi proteine condomini SH2 che possono andare a legare delle proteine se queste ultime
presentano delle fosfotirosine). Inoltre la fosforilazione può essere di tipo sequenziale, nel caso in cui
agiscano due kinasi, dove entra prima una kinasi che agisce su un sito e successivamente ne entra un’altra
che agisce sul secondo sito, oppure può essere un tipo casuale dove non importa quale delle due kinasi
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entra per prima; può anche essere di tipo gerarchico, dove c’è un ordine preciso in cui le kinasi si
susseguono e vanno a fosforilare la proteina.
5- SPR e traslocazione nel RE Punti: 35/40

La signal recognition particle (SPR) interviene nel meccanismo di trasporto di una proteina all’interno del
reticolo endoplasmatico. L’SPR è un complesso ribo-proteico infatti è formato da proteine e RNA e presenta
tre domini: il dominio M per il legame con la sequenza segnale della proteina da traslocare all’interno del
reticolo endoplasmatico, il dominio G che lega GTP e il dominio N. L’SPR riconosce una particolare sequenza
sulla proteina da trasportare chiamata sequenza segnale SRL. La proteina da traslocare quando viene
riconosciuta dal SPR può trovarsi legata al ribosoma poiché il processo in questione è co - traduzionale (a
differenza della traslocazione di una proteina all’interno del mitocondrio che è post – traduzionale) dove la
proteina completerà la traduzione solo una volta legata al traslocatore. Il procedimento è il seguente: l’SPR
riconosce la sequenza segnale della proteina da traslocare e la lega al dominio M, la trasporta sulla faccia
citosolica del reticolo endoplasmatico in prossimità del traslocatore Sec61 (un eterodimero con struttura ad
anello ) legandosi al suo recettore SR posto sulla membrana del reticolo. La proteina, ancora legata al
ribosoma, viene traslocato verso l’interno del reticolo tramite un traslocato e che viene liberato dal PLUG
rendendolo accessibile, completando nel frattempo la sua traduzione. Una volta traslocata l’SPR si dissocia
dal suo recettore SR. In questo procedimento viene utilizzato GTP per fornire energia: un’ idrolisi di un GTP
avviene per distaccare il ribosoma dal traslocatore ed è ad opera di SR, un’altra idrolisi viene fatta da SRP,
che presenta il dominio G, per distaccarsi dal suo recettore SR. SPR può trovarsi in diversi modi: free
quando non è legato, targeting quando lega la proteina e infine docking quando è in fase di ancoraggio sulla
faccia citosolica del reticolo mediante il suo recettore.
6- SRP Punti: 30 / 40
La SRP ( signal recognition particle ) è un tipo di molecola caratterizzata da elementi proteici e nucleotidi di
RNA, essa è un adattatore che accoppia il sistema di traslocazione con quello di traduzione all’interno del
trasporto citosol-reticolo endoplasmatico; questo tipo di trasporto è definito co-traduzionale, perché la
proteina viene trasportata prima che completi la sua sintesi. L’SPR più comune è l’SPR54, che contiene un
piccolo RNA 7S, ed è formato da tre domani principali: dominio M, ricco di metionine, dominio N, che è l’N-
terminale e il dominio G che lega ed idrolizza il GTP. L’SPR si lega alla sequenza segnale della proteina da
trasportare e la sequenza è così composta: dominio N-terminale basico e positivo, dominio centrale ricco di
amminoacidi idrofobici e dominio C-terminale, ricco di amminoacidi neutri e polari. Inoltre l’SRP lega il suo
recettore SR, eterodimero, costituito da due domini alfa e beta con attività GTPasica, e quindi l’SRP può
esistere in tre stati differenti: legato alla sequenza segnale , legato a SR oppure libero. Le tappe del ciclo
dell’SRP sono le seguenti: SRP lega la sequenza segnale posta all’N-terminale della proteina ed in questo
modo si ha un momentaneo arresto della traduzione; SRP lega GTP e ciò ne consegue un cambiamento
conformazionale; il complesso SRP-GTP-Proteina si lega al recettore SR; SRP ed SR si staccano dal ribosoma
per permettere l’entrata della proteina all’interno del traslocone, ancorato nei pressi della membrana del
reticolo endoplasmatico; una volta che la sequenza segnale della proteina incontra il traslocone viene
ripresa la traduzione e la proteina viene fatta passare all’interno di esso e può completare così la sua
sintesi. Il traslocone più comune è il SEC61 ed è un eterodimero, composto da tre subunità alfa, beta e
gamma che sono proteine integrali di membrana; esso forma una struttura ad anello e rimane chiuso per
impedire l’entrata di proteine libere che non sono ancorate al ribosoma, e si apre nel momento in cui la
proteina si avvicina ed incontra la sua sequenza segnale.
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7- Recettori tirosin chinasici Punti: 25/40
I recettori tirosin chinasici sono recettori interni membrana che interagiscono con molecole idrofile, che
non sono in grado di attraversare il doppio strato lipidico. Questi trasducono il segnale all’interno della
cellula che si traduce poi in una risposta. Posso avere attività enzimatica intrinseca: quando interagiscono
con il ligando dimerizzato e si attivano e fosforilano residui di tirosina attivando i bersagli e spesso una
cascata con sommazione di segnale. Quelli associati ad enzimi (ad esempio Jack-Stat “just Another
chinase”) si attivano una volta che avviene il legame con il ligando, che deve essere abbastanza forte da far
avvenire l’interazione, ma non troppo per poterne permettere il distacco una volta finita la trasduzione del
segnale. Attivato l’enzima andrà a fosforilare i bersagli che a loro volta possono attivare altre molecole con
fosforilazione e portare alla formazione di secondi messaggeri. In particolare i recettori tirosin chinasici con
attività enzimatica intrinseca controllano il differenziamento e la proliferazione cellulare. Il ligando si lega al
recettore che fosforila dei residui di tirosina, viene reclutato Grb2 che porta legato SOS. Grb2 si trova nel
citosol e presenta due domini: SH2 con cui si lega al recettore e SH3 con cui si lega a SOS. SOS è
responsabile della conversione da GDP a GTP che attiva Ras. A questo punto Ras lega Raf1 attivandolo e
inizia la cascata delle MAP chinasi dove Raf1 fosforila MEK, che fosforila MAPK e trasla nel nucleo. Qui
verranno attivati altri fattori come Jun e Ets che sono coinvolti nella trascrizione. Se vengono attivati le
cicline da CKD tramite fosforilazione, queste controllano il ciclo cellulare tramite diverse fasi: G1 di
accrescimento, S di sintesi del DNA che viene duplicato, G2 in cui la cellula si prepara e decide se dividersi e
M la fase di mitosi quindi in cui la cellula si divide. La trascrizione viene attivata solo tramite cicline
specializzate (con CDK) che risultano dei fattori trascrizionali che attivano la trascrizione del DNA dei geni
specifici. Per controllare la proliferazione cellulare si può agire su Ras tramite down-regolazione andando
ad agire ai diversi livelli del processamento di Ras in modo da limitarne o impedirne l’espressione, agendo
quindi a livello trascrizionale su mRNA o sul processamento della proteina una volta prodotta. Altro modo è
quello di agire su Gef e Gap che rispettivamente attivano e inibiscono Ras.
8- Studio del pathway del galattosio Punti: 30 / 40

Come primo passo per studiare la via del galattosio è importante definire i geni implicati, questo viene
fatto sfruttando i dati contenuti in letteratura. La via del galattosio comprende 9 geni. La proteina Gal2 è
una permeasi che consente di portare dentro la cellula il galattosio come del resto anche HXT. La proteina
Gal1 è una chinasi che consente di fosforilare il galattosio e ottenere galattosio 1P. Poi intervengono Gal7 e
Gal10 che grazie ad un azione combinata sono in grado di convertire galattosio 1P in glucosio 1P il quale poi
viene convertito in Glucosio 6P per azione della proteina Gal5. Il glucosio 6P è in grado quindi di entrare
nella via glicolitica. Oltre a questi geni ce ne sono altri quattro coinvolti nella regolazione del metabolismo.
Gal4 è un attivatore della trascrizione dei geni che codificano per la via del galattosio, Gal80 è un repressore
che si lega a Gal4, Gal3 è un inibitore della funzione di Gal80 mentre Gal6 è un inibitore della funzione di
Gal4. Il sistema del galattosio è un sistema represso in presenza di glucosio, indotto in presenza di
galattosio e ne represso ne indotto in presenza di nessuno di questi due zuccheri. Per studiare il sistema
Gal con approcci di system biology gli studiosi hanno preso in considerazione due condizioni ambientali
diverse, crescita in presenza di raffinosio ( sistema ne prepreso ne indotto), crescita in presenza di
raffinosio + galattosio (sistema indotto). Nella condizione di sistema indotto viene inserito anche raffinosio
perché analizzeremo mutanti che in sola presenza di galattosio non saranno in grado di crescere. Oltre alle
alterazioni ambientali infatti sono stati costruiti nove ceppi mutanti, mutati ciascuno per uno dei geni
indicati prima implicate nel metabolismo. La prima analisi viene fatta è un’analisi sui trascritti. Vengono
comparate situazioni diverse. Abbiamo infatti due diverse condizioni per 10 ceppi (nove mutati +1wt). Per
analisi di trascrittomica si procede con la tecnica dei microarray che consente di analizzare il profilo di
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espressione genica di una cellula in una determinata condizione. Una volta che ho ottenuto questi dati
faccio una scrematura differenzia realmente espressi nelle varie condizioni rispetto al wt. Quando sono
arrivato ad ottenere questa lista sfrutto poi mi dati contenuti in letteratura. Integro con i miei risultati e
cerco di raggruppare i geni GED sfruttando ad esempio un database come GO. Procedo poi con analisi di
Proteomica. Analizzo in questo caso solo due condizioni, crescita in galattosio e crescita in assenza di
galattosio. Per analisi di Proteomica posso procedere in diversi modi ma in ogni caso sfrutto la
spettrometria di massa per cercare di arrivare a capire quali delle proteine che quel genoma può codificare
sono espresse in modo differenziale nelle due condizioni. Anche in questo caso alla fine degli esperimenti
ottengo liste di proteine espresse in modo differenziale che cercherò di integrare con database di
letteratura per raggruppare le proteine con funzioni simili. Arrivo alla fine a trarre numerose conclusioni
che non mi sarei aspettato all’inizio dell’esperimento.. Infatti vedo, sia in caso che in uno e nell’altro che
sistemi biologici coinvolti in questa via metabolica sono numerosi inaspettati. Sono infatti implicati in
questo sistema ad esempio le vie del metabolismo N e della fosfato. Facendo un’analisi del fenotipo dei vari
mutanti che ho analizzato noto che ad esempio che il mutante Gal80∆gal cresce in modo molto simile ai
ceppi che crescono in presenza di galattosio. Ciò è stata avanzata una ipotesi, il gene gall80 codificherà per
un repressore di Gal4. Se manca Gal80, Gal4 è sempre attivo, simulando quindi una situazione in presenza
di galattosio. Per provare questa ipotesi è stato impostato un esperimento. Hanno costruito un ceppo
doppio deleto in Gal4 e Gal80 ed è stato fatto crescere in assenza di galattosio. Se l’ipotesi fosse stata
corretta con l’assenza contemporanea di Gal80 e Gal4. L’espressione dei geni per il galattosio sarebbe stata
repressa e quindi il ceppo sarebbe dovuto tornare ad avere un fenotipo diverso simile ai ceppi che
cresceranno in assenza di galattosio. E così è stato verificato quindi l’ipotesi era corretta. Questo approccio
di studi ci ha permesso di fare nuove ipotesi sulla base dei dati ottenuti che ci permettono quindi di
esplicare anche nuove funzionalità di proteine che ad esempio si conoscono poco. Ceppi deleti in Gal7 e
Gal10 hanno problemi in tutti i geni coinvolti nel metabolismo del galattosio, inoltre si accumula galattosio
1P che è tossico. Per impedire che venga accumulato si creano ceppi mutanti Gal1 e Gal10. Si è visto che i
ceppi doppi deleti hanno un profilo di espressione simile a quello del ceppo deleto Gal1. Ceppi deleti di
Gal80 crescono più lentamente dei wt in terreni privi di galattosio. Inoltre essendo Gal80 deleto un inibitore
di Gal4 questo ceppo attiva la trascrizione di tutti i geni Gal consumando energia inutilmente.
9- Traslocazione di proteine nel mitocondrio Punti: 30 /40

Il mitocondrio è formato da due membrane (interna ed esterna) che identificano lo spazio intermembrana
e matrice. Il trasporto della proteina nel mitocondrio è un trasporto di tipo post- traduzionale. Per poter
essere traslocate al mitocondrio, processo post-traduzionale, le proteine devono contenere una sequenza
segnale idonea alla loro traslocazione verso il mitocondrio stesso. Questa sequenza è formata da circa otto
residui polari e idrofobici all’ N-terminale della proteina che formano un alfa elica( sono molto presenti Lys
e Arg). Sul mitocondrio sono presenti proteine di membrana: TOM e SAM si trovano sulla membrana
esterna, MIA è una proteina che si trova nella zona transmembrana che aiuta il folding delle proteine. Infine
abbiamo TIM22 e TIM23 collocate sulla membrana interna del mitocondrio; le proteine che devono essere
traslocate al mitocondrio vengono sintetizzate dai ribosomi liberi del citosol e prima di arrivare al
mitocondrio sono tenute unfolded grazie al legame con Hps70 (chaperon molecolare). Le proteine
destinate alla membrana mitocondriale esterna passeranno dalla proteina TOM ( producono ATP) che
riconosce la sequenza segnale; passeranno nella zona transmembrana, dove vengono aiutate nel processo
nel processo d folding da MIA e successivamente verranno introdotte nella membrana esterna tramite SAM
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(porine) con il distacco della sequenza segnale. Proteine destinate a essere solubili nella zona
transmembrana contengono oltre ad una sequenza segnale anche una sequenza di stop: la proteina passa
da TOM e continua a scorrere fino a che TOM non incontra la sequenza di stop (sequenza di circa 20aa
idrofobici). A questo punto la sequenza segnale che è passata anche per TIM23, viene tagliata in questo
modo otterremo la proteina matura ( che viene aiutata nel folding sempre da MIA). Proteine destinate alla
membrana mitocondriale interna passano anche queste per TOM e successivamente per TIM23 fino ad
arrivare alla matrice. Qui viene riconosciuta una seconda sequenza segnale secondaria dalla proteina OXA,
la quale indirizzo la proteina verso la sua collocazione sulla membrana interna. La proteina responsabile del
folding all’interno della matrice è la proteina PAM (complesso di chaperoni molecolari). Proteine destinate
alla matrice mitocondriale seguono lo stesso percorso di quelle della membrana interna, solo che
rimarranno nella matrice e diventeranno mature dopo il folding aiutando dalla proteina, PAM. Proteine
transmembrana, invece, dopo aver seguito lo stesso percorso descritto sopra, passeranno dalla proteina
TIM22 che le indirizza alla loro collocazione transmembrana.
10- Trasporto nei mitocondri

I mitocondri sono composti da due membrane (interna ed esterna), che identificano altri due spazi: spazio
intermembrana e matrice. L’import nei mitocondri è un processo post traduzionale, mentre nel reticolo è
co-traduzionale. La sequenza segnale che determina dove deve andre la proteina è composta da
un’alternanza di residui polari e idrofobici; ciò determina che la proteina possa assumere una
conformazione ad elica anfipatica.
La proteina deve mantenersi il più possibile denaturata per poter entrare nel mitocondrio. Per fare ciò
intervengono delle proteine (HSP70), che sfavoriscono il folding. Le proteine in questo stato sono chiamate
Pre-proteine, cioè non sono proteine mature, ma contengono la sequenza segnale. Possono essere anche
36
Pre-Pro-proteine, in cui la parte Pro aiuta il successivo folding e verrà tagliata da proteasi quando la
proteina diventerà matura.
La Pre-proteina passa la membrana interna attraverso il sistema TOM (traslocate outer membrane).
Successivamente la proteina perde la sequenza segnale e può avere diversi destini. Il sistema TIM trasloca
la proteina attraverso la membrana interna e permette la perdita della sequenza segnale. TIM22 si occupa
delle proteine integrali della membrana interna; TIM23 si occupa delle proteine della matrice.
MIA è il sistema dello spazio intermembrana, che si occupa dell’import e assemblaggio. PAM è un
complesso di chaperoni molecolari.
Per studiare il passaggio della proteina nel mitocondrio marco la proteina con un amminoacido radioattivo,
la faccio interagire col mitocondrio e porto a 5°C. Utilizzo una proteasi per degradare la proteina rimasta
all’esterno del mitocondrio e vedo se la sequenza segnale è dentro o fuori dal mitocondrio.
Nell’entrata della proteina nel mitocondrio ci sono due fasi:  1) Riconoscimento ed ancoraggio —>
avviene anche a 5°C, ma la proteina non è entrata completamente, quindi posso degradare la proteina
esterna on proteasi.  2) Traslocazione —> continua il processamento della proteina che entra nel
mitocondrio (25°C). A tal punto la proteina è protetta dall’azione delle proteasi. Troverò proteine degradate
all’esterno solo se tratto la membrana con detergenti, degradandola. In tal modo le proteine possono
uscire ed essere degradate dalle proteasi.
La traslocazione delle proteine attraverso le membrane nel mitocondrio attraverso il complesso TOM
sintetizza energia sotto forma di ATP. La proteina passa al complesso TIM e interagisce con un’altra
proteina HSP. Successivamente vi è un cambiamento conformazionale che richiede ATP. L a HSP deve
cambiare conformazione per rilasciare la proteina.
Non tutte le proteine devono arrivare alla matrice mitocondriale e il destino della proteina (Pre- proteina) è
determinato sequenze segnale secondarie, perché intervengono dopo che la proteina ha attraversato il
complesso TOM. Una volta che la proteina ha attraversato il complesso TOM, interagisce con delle proteine
chaperone che la mantengono unfolded e ne permettono l’internalizzazione con il complesso SAM,
anch’esso sulla membrana esterna. La proteina entra ed esce più volte formando una struttura a β-barile e
rimane nella membrana esterna.   Per rimanere nella membrana interna, la proteina deve interagire con
un complesso TIM e deve possedere una sequenza detta stop-transfer sequence, che determina che la
proteina non venga ulteriormente trasportata oltre la membrana interna. La proteina non deve
necessariamente restare ancorata alla membrana interna, ma grazie all’azione di una proteasi può lasciare
la sequenza stop nella membrana interna e muoversi nello spazio intermembrana. La proteina potrebbe
anche entrare nella matrice e interagire col complesso OXA, nella membrana interna, che lo riporta nella
membrana interna e nello spazio intermembrana.
Il sistema TIM22 opera nel caso in cui la proteina possegga più sequenze intermembrana. In questo caso la
proteina resta nella membrana interna.
37
11- Interazioni HUB
12- Studio della via metabolica del galattosio con approcci di system
biology Punti 35 / 40
Il sistema GAL permette ai lieviti di sfruttare il galattosio come fonte di carbonio: esso è caratterizzato da 9
geni che provvedono alla regolazione del galattosio ed alla sua sintesi e trasformazione. Ci sono i geni GAL2
e HTX che codificano per i trasportatori del galattosio, di cui il primo è specifico e quindi ad alta affinità per
il galattosio mentre il secondo è aspecifico e quindi ad alta affinità per il glucosio ed a bassa affinità per il
galattosio: ci sono i geni regolatori, GAL3, GAL6, GAL4 e GAL80. GAL4 è l’attivatore trascrizionale mentre
GAL80 è l’inibitore che in assenza di galattosio va ad inattivare il gene GAL4. I geni strutturali sono GAL1,
che codificano per la galattochinasi e che permette la trasformazione del galattosio in galattosio-1-P; poi ci
sono GA7 e GAL10 che permettono la trasformazione del galattosio-1-P in glucosio-1-P ed utilizzano come
substrato l’UDP ed infine il gene GAL5 che permette la trasformazione del glucosio-6-P in glucosio-6-P che
può così entrare in glicolisi. Lo scopo di questo studio è quello di perturbare in maniera sistematica il
metabolismo del galattosiomediante approcci sia genetica che ambientali. Ci si avvale innanzitutto di
espressione genica sia della cellula wild type che delle cellule mutate in maniera specifica per ognuno dei 9
geni coinvolti ( GAL1, GAL2, GAL3, GAL4, GAL5, GAL6, GAL7, GAL80, GAL10) e comparare il profilo di
espressione genica dei mutanti con quello delle cellule wild type. Si allestiscono inoltre due condizioni
nutrizionale diverse, una con galattosio e raffinosio ed una con raffinosio soltanto quindi alla fine avremo
20 condizioni totali da porre in esame. Vado così ad allestire l’analisi trascrizionale mediante tecnologia
Affymetrix; ogni esperimento è condotto in quadruplicato, in vitro viene preparato l’RNA, viene
retrotrascritto a cDNA e poi trascitto in presenza di nucleotidi fluorescenti in cRNA; i dati vengono
interpretati per valutare quali geni hanno differenze di espressione rispetto alla condizione wild type e
calcolare tali livelli di espressione. Si trova che su 6000 geni, il numero di geni il cui livello di espressione
cambia in modo significativo in almeno una di queste condizioni è pari a 1000, ovvero un sesto. Fatto ciò, si
va a raggruppare tali geni in base alla funzione ed avrò quindi vicini quelli con funzione simile. Si va inoltre a
raggrupparli mediante il sistema Gene Ontology (GO), dove ogni gene può essere associato ed una serie di
termini che rientrano in un’ontologia specifica. Ora io voglio vedere se c’è una correlazione tra il livello di
espressione dei geni e quello delle proteine; allestisco così una marcatura post-traduzionale solo per due
condizioni , il wild type in raffinosio ed il wild type in raffinosio più galattosio, le vado a marcare con isotopo
pesante il wild type con solo raffinosio e son isotopo leggero quello con raffinosio e galattosio, le si fanno
correre, dopo averle digerite con tripsina, in uno spettrometro di massa ed il rapporto tra il picco pesante
sarà proprio il rapporto tra il livello di espressione delle proteine. A questo punto si fa un database cross
correlation e cioè si confronta i propri dati con quelli ottenuti in letteratura. Queste analisi creano nuove
ipotesi riguardo il modello di base; la prima ha a che fare col fatto che se si deletano i geni GAL7 e GAL10, il
livello di espressione degli altri geni del sistema GAL viene esso stesso influenzato, cosa che non ci si
aspetta perché sono geni strutturali e non regolatori questo può essere spiegato dall’incapacità di
convertire il galattoiso-1-P che può essere tossico se si accumula quando la sua via di smaltimento è
inattivata; per valutare se l’accumulo è tossico vado ad allestire una doppia mutazione GAL1-GAL7 o GAL1-
GAL10 così che GAL1P non può accumularsi; il doppio mutante GAL1 che al singolo mutante GAL7 o GAL10
ed è quello che effettivamente si osserva. La seconda ipotesi riguarda le caratteristiche del mutante GAL80;
ceppi privi di GAL80 e crescono in assenza di galattosio, in solo raffinosio, crescono molto lentamente ed
hanno un profilo di espressione che si differenzia da tutti gli altri geni. Anche qui per dimostrare ciò viene
fatta una doppia mutazione GAL80-GAL4 e si è visto che il fenotipo derivante assomiglia più al singolo
mutante GAL4 che al singolo mutante GAL80 sta in un angolo e che è quindi diverso da tutti gli altri profili,
38
quindi i fenotipi sono dovuti non alla perdita di GAL80 ma all’attivazione costitutiva di GAL4
13- Ruolo dei recettori tirosin chinasi nel controllo della proliferazione
cellulare in eucarioti superiori. Enunciare le proprietà generali e
chiarire con esempio Punti ?/10
La progressione del ciclo cellulare è regolata dalle chinasi ciclina dipendenti (il sito attivo delle Cdk è occluso
da un T-loop, il legame con la ciclina permette un cambiamento conformazionale che porta all’esposizione
del sito attivo) Cdks, meccanismo molto conservato sia in eucarioti superiori che inferiori (gli inferiori
presentano un’unica chinasi Cdk1, mentre i superiori presentano più Cdk differenti che funzionano in
diverse fasi del ciclo). Il cambiamento ciclico di attività delle Cdk è controllato dal legame con enzimi e altre
proteine che regolano l’attività delle chinasi. I livelli intracellulari delle varie cicline (così chiamate perchè in
un ciclo cellulare vengono sintetizzate e degradate in modo ciclico, hanno vita breve) variano a seconda
della fase del ciclo cellulare, i livelli intracellulari delle chinasi ciclina dipendenti invece rimangono costanti.
Cambiamenti ciclici nei livelli di cicline, portano al legame e all’attivazione nelle varie fasi del ciclo di
complessi ciclina-Cdk che catalizzano differenti eventi cellulari, fosforilano diversi set di proteine. Per
esempio in fase G1 le cicline D sono maggiormente espresse, si ha un aumento dei livelli intracellulari di
cicline D che vanno ad attivare le chinasi G1/S Cdk le quali in forma attiva possono fosforilare specifici siti su
proteine effettrici del ciclo cellulare permettendo la progressione nella fase successiva. Durante la fase S
aumenta il livello delle cicline di fase S che si attivano chinasi Cdk che promuovono l’attivazione di bersagli
molecolari coinvolti nell’inizio o nella replicazione del DNA. "Regolazione dell’attività chinasica delle cdk:"
• attivazione a seguito del legame con la ciclina (presenza di un T-loop che occlude il sito attivo della
chinasi, il legame con la specifica ciclina porta alla modificazione del T-loop e alla esposizione del sito attivo.
Il legame con la ciclina porta ad un’attivazione parziale, la piena attivazione catalitica si ottiene solo in
seguito alla fosforilazione da parte di una chinasi Cdk-attivatrice di un amminoacido vicino all’entrata del
sito attivo. Questa fosforilazione causa una piccola modificazione conformazionale che aumenta l’attività
della Cdk."
• attivazione o inibizione mediante fosforilazione/defosforilazione (Wee1 è una chinasi che fosforila Cdk
inattivandola, mentre Cdc25 è una fosfatasi che rimuove il fosfato e attiva il complesso)"
• legame inibitorio con CKI, distorce la struttura del sito attivo della chinasi e si inserisce nel sito di legame
per ATP impedendone il legame (le Cdk legano ATP in quanto hanno attività chinasica, utilizzano ATP come
donatore di gruppi fosfato)"
• Controllo proteolitico (la ciclina che deve essere rimossa viene legata a delle ubiquitine, proteine target
che permettono il riconoscimento da parte del proteosoma e degradate) controllo trascrizionale(
cambiamenti nei livelli di espressione dei geni che codificano per le cicline permettono di controllare i livelli
cellulari delle cicline in ogni fare del ciclo)" Le proteine Ras sono coinvolte in questa fase del ciclo, nel
passaggio dalla fase G1 alla fase S e nell’entrata/uscita dalla fase G0. Ras attiva la ciclina D1 (subunità
regolatoria) legata a CDK4 facendo staccare la proteina p16 con funzione inibitoria, la ciclina D1 attiva
mediante fosforilazione Rb (retinoblastoma è un’inibitore della trascrizione, lega il fattore E2F rendendolo
inattivo), questa fosforilazione compromette la capacità di Rb di legarsi al fattore di trascrizione E2F. E2F
libero attiva la trascrizione di una serie di geni che permettono la sintesi di altre due cicline, A e E che
permettono la transizione in fase. La ciclina E consente di fosforilare nuovamente Rb rinforzando l’azione
della ciclina D1 (rendono il processo irreversibile finché non intervengono delle proteine fosfatasi. Il livello
di queste cicline deve essere mantenuto alto solo in questa fase del ciclo).
39
14- Ruolo della fosforilazione reversibile delle proteine nel controllo
della funzionalità cellulare: chiarire la logica molecolare, enunciare i
principi alla base della specificità e chiarite con un esempio. Punti ?/?
La fosforilazione è un tipo di trasformazione covalente e reversibile, promossa dalle chinasi, che permette il
trasferimento di un gruppo P, in genere donato dall’ATP, verso una molecola eccettrice ed in genere va a
sostituire il residuo ossidrilico di serina, treonina o tirosina. La reazione inversa è eseguita dalle fosfati che
quindi vanno a togliere alla molecola un gruppo fosfato. Il gruppo P è ingombrante e carico negativamente
e causa quindi un cambiamento conformazionale ed altera la funzionalità della proteina che va a
fosforilare. Quando la proteina viene fosforilata assume un diverso peso molecolare provocando un
cambiamento nella velocità di migrazione sul gel elettroforetico. La fosforilazione causa tre principali
cambiamenti conformazionali: va a creare cambiamenti conformazionali in prossimità del sito attivo dovuti
a fenomeni di attrazione e repulsione dati dalla carica negativa del P ( esempio lo è la reazione catalizzata
dall’isocitrato deidrogenasi, che catalizza la trasformazione dell’isocitrato in alfa-chetoglutarato; essendo
l’isocitrato carico negativamente andrà a creare fenomeni di repulsione poiché anche il gruppo P è carico
negativamente e quindi ciò andrà a peggiorare l’efficacia dell’enzima); va a formare legami H e fenomeni di
attrazione e repulsione tra regioni intramolecolari cariche con conseguente cambiamento conformazionale
che modula l’attività dell’enzima (ne sono esempi le MAP chinasi); va a formare siti di consenso per il
binding con le altre proteine con conseguente variazione della localizzazione subcellulare (ne sono esempi
proteine con domini SH2 che possono andare a legare delle proteine se queste ultime presentano delle
fosfotirosine). Inoltre la fosforilazione può essere di tipo sequenziale, nel caso in cui agiscano due chinasi,
dove entra la prima e poi la seconda che agisce sul secondo sito, oppure può essere di tipo casuale dove
non importa l’ordine delle chinasi; o anche di tipo gerarchico, dove c’è un ordine preciso in cui le chinasi si
susseguono e vanno a fosforilare la proteina
15- Trasduzione del segnale

I processi di trasduzione del segnale permettono alla cellula di entrare in contatto in modo dinamico con
l’ambiente (tutto quello che si trova al di fuori della membrana plasmatica, incluse anche le altre cellule). La
cellula deve ricevere segnali dall’esterno, essere in grado di valutare le modificazioni ambientali e poter
rispondere di conseguenza. La cellula può rispondere ai segnali in modo specifico ed efficace, si può avere
una risposta molto veloce o lenta, transiente (veloce sia ad attivarsi che a spegnersi se il segnale non
persevera) oppure duratura (in modo costante per un periodo di tempo lungo). Ligando o primo
messaggero deve essere ricevuto da specifiche molecole recettore e deve innescare la trasduzione del
segnale, ovvero diverse molecole intracellulari agiscono in sequenza e trasmettono il segnale dal recettore
all’organello bersaglio mediante alterazioni dell’attività, della conformazione, della localizzazione di
proteine intracellulari. Interazione ligando-recettore altamente specifica. La maggior parte dei recettori è
localizzato sulla plasma-membrana. Il segnale in se non entra all’interno della cellula ma attiva il processo di
trasduzione del segnale intracellulare. La presenza di passaggi multipli ha la funzione di amplificazione del
segnale --> vie di trasduzione del segnale o signal trasduction pathway molecola diverse che interagiscono
fra loro in una sequenza specifica di eventi che portano dalla ricezione del segnale alla risposta. L’elemento
terminale della via di traduzione del segnale attiva una o più specifiche risposte cellulari, saranno risposte
veloci.
CARATTERISTICHE dei sistemi di trasduzione"
40
• Specificità data dalla complementarietà fra le superfici di interazione del recettore e la molecola segnale
(come nell’interazione enzima-ligando). Solitamente un recettore è in grado di interagire con un solo tipo di
ligando o famiglia ristretta di ligandi simili fra loro.
• AMPLIFICAZIONE presenza di numerosi enzimi nella via di trasduzione, il passaggio di informazione dal
recettore agli elementi a valle coinvolge un numero di molecole via via maggiore, attivazione a cascata.
• DESENSITIZZAZIONE/ADATTAMENTO presenza di un sistema di regolazione-feedback in grado di spegnere

l’attività del recettore o di uno degli elementi a valle. Impedire che il segnale resti perennemente acceso.
• INTEGRAZIONE segnali diversi possono avere effetto uguale o opposto. L’azione di più segnali in
contemporanea dà luogo ad un effetto finale dato dall’integrazione dei due input.
Il meccanismo di trasduzione del segnale si avvale di proteine in cui ricorrono dei moduli/domini proteici
deputati all’interazione proteina-proteina. Molte proteine contengono due o più domini differenti. Questo
permette la formazione di specifici complessi ligando dipendenti coinvolti nella trasduzione del segnale.
Desensitizzazione di un recettore accoppiato a proteine eterotrimeriche fosforilazione-dipendente: il

recettore viene fosforilato in specifici siti, viene riconosciuto da proteine dette arrestine che agiscono in
due modi: determinano ingombro sterico impedendo l’interazione con il trasduttore intracellulare
(proteine G) e permettono il riconoscimento del recettore per la formazione delle vescicole di endocitosi.
16- Quali caratteristiche permettono di classificare una proteina come

intrinsecamente disordinata?
Attività promiscua: le proteine intrinsecamente disordinate possono assumere funzioni diverse a seconda
del partner  con cui interagiscono, alcune sequenze legano bersagli differenti. Queste proteine possono
assumere molte funzioni, sono molto frequenti nei proteomi dei virus e di organismi dotati di un genoma
molto compatto in quanto la stessa proteina assolve funzioni diverse, può legare molti partner differenti,
funzione che sarebbe altrimenti svolta da un elevato numero di proteine.  
Affinità e specificità di legame sono disaccoppiate. Le interazione a cui danno luogo possono essere a
interazioni contemporaneamente a bassa affinità e alta specificità. Solitamente affinità (complementarietà
delle superfici) e specificità sono direttamente proporzionali. Tanto più due superfici sono complementari,
maggiore è la probabilità che avvengano incontri utili, che si leghi solo la proteina di interesse e non altre.
Le proteine intrinsecamente disordinate quando sono libere non hanno una struttura complementare
definita quindi sono dotate di bassa affinità per il ligando, mentre quando incontrano il partner proteico si
ha folding indotto, tale cambiamento di conformazione aumenta notevolmente la specificità.
17- Via di trasduzione del glucagone

Epinefrina e glucagone promuovono la degradazione del glicogeno mentre l’insulina promuove la sintesi del
glicogeno, questo processo di regolazione segue un meccanismo di recettori associati a proteina G.
Adrenalina e glucagone portano ad un aumento dei livelli di cAMP, attivazione della proteina chinasi a che
catalizza la fosforilazione di glicogeno sintasi che viene resa inattiva (inibizione della sintesi di glicogeno).
Contemporaneamente la proteina chinasi a fosforila anche la fosforilasi chinasi, che viene attivata e a sua
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volta va a fosforilare la glicogeno fosforilasi, attivandola (attivazione della degradazione del glicogeno).
L’insulina invece attiva la proteina fosfatasi che ha invece effetto opposto.
18- Il ruolo delle interazioni proteina - proteina nella via di trasduzione

del segnale mediata da Ras in cellule di mammifero
Il ruolo dell’interazione prot-prot fondamentale nella via di trasduzione del segnale mediata da Ras in
quanto l’interazione permette a ras di essere fosforilato e attivato e inseguito alla sua attivazione permette
anche l’attivazione del pathway diversi proprio grazie all’attivazione e interazione di altre proteine.
Possiamo dire che l’interazione tra due proteine è basilare affinchè avvenga una trasduzione corretta del
segnale, una volta che il segnale arriva alla cellula esso viene ricevuto da un recettore in questo caso un
recettore tyr-chinasico che in assenza di ligando si trova in conformazione monomerica. Una volta legato
alla molecola segnalatrice viene indotta dimerizzazione del recettore che porterà ad un fenomeno di
autofosforilazione o fosforilazione incrociata. Sulla coda del recettore sono presenti due catene che in
seguito alla dimerizzazione subiscono anch’esse fosforilazione che permetterà ad altre proteine di
avvicinarsi al recettore essere a loro volta fosforilate e infine attivare Ras. Grb2 è una prot adattatrice che si
posiziona sulla coda de recettore ed ha funzione di portare in posizione un'altra prot chiamata Sos, Sos
viene fosforilata e si stacca in complesso con Grb2 dalla coda del recettore andando verso Ras e
fosforilando lo attiverà. Ras una volta attivo potrà far partire una cascata di segnali e di pathways diversi a
seconda della molecola legata al recettore che permetteranno di amplificare il segnale e attivare nel
nucleo fattori di trascrizione diversi. L’interazione proteina-proteina è dunque importantissima proprio
perché tutta la via di traduzione del segnale mediata da Ras, dalla ricezione del segnale fino all’attivazione
di fattori di trascrizione, si basa su questa interazione, così come in molte altre vie di trasduzione del
segnale.
19- Descrivete le caratteristiche strutturali e funzionali della Signal

Recognition Particle ed il suo ruolo nel processo di secrezione.
Le protein hanno all’N-terminale una sequenza segnale (la prima parte della proteina che viene sintetizzata
ed esposta) che viene riconosciuta non direttamente dal sistema di traslocazione del reticolo ma dalle SRP
(signal recognition particle).
Le SRP ciclano fra il citosol e la membrana dell’ER riconoscendo e legando sia le sequenze segnale dell’ER
sia i recettori per le SRP sul reticolo. 
Tratto N-terminale di 1-5 residui con almeno un residuo carico positivamente (interazioni con membrana)
SRP è un adattatore che accoppia il sistema di traduzione con quello di traslocazione. È un complesso
citoplasmatico riboproteico costituito da proteine e nucleotidi di RNA.  La variante di mammifero è più
grande e complessa di quella di e. coli ma presentano comunque dei domini SRP è un adattatore che
accoppia il sistema di traduzione con quello di traslocazione. è un complesso citoplasmatico riboproteico
costituito da proteine e nucleotidi di RNA. La variante di mammifero è più grande e complessa di quella di
e. coli ma presentano comunque dei domini.
SRP è costituito da un RNA di 300 nuclotidi e 6 proteine, formato da 3 domini:
dominio M: ricco di metionine, solco idrofobico che lega LS
dominio G: lega e idrolizza il GTP
42
dominio N: N-terminale
Ciclo dell’SRP
• srp si lega alla sequenza segnale della catena polipeptidica nascente sul ribosoma.
• Il legame di SRP causa un momentaneo arresto della traduzione.
• La formazione del complesso induce un cambiamento conformazionale che induce il legame del
GTP a SRP54
• SRP-GTP legato al ribosoma interagisce con il recettore SR posto sulla superficie dell’ER (il
recettore a sua volta è legato al GTP) il complesso ribosomiale viene indirizzato verso il traslocone
• SRP e il suo recettore si distaccano lasciando il ribosoma legato al traslocatore (idrolisi di GTP, sia
SRP che il suo recettore possiedono dei domini in grado di legge e idrollizare GTP)
• Mediante il traslocatore la catena polipeptidica viene fatta passare attraverso il doppio strato
fosfolipidico all’interno del reticolo, viene ripresa la traduzione
SRP può quindi essere presente in tre sta di differenti, caratterizzati da una struttura conformazionale
differente:  (1)Libero, (2)Legato alla sequenza segnale della proteina e (3) Legato al recettore RS
20- Ingegneria proteica

L’ingegneria proteica si occupa di produrre e modificare una proteina, questa molto spesso è una proteina
eterologa, cioè che non viene prodotta dall’ospite usato; questo implica degli accorgimenti nella sua
produzione, ad esempio E. Coli non è in grado di produrre proteine glicosilate e quindi non verrà usato per
esse. Proteine che sono spesso modificate sono gli enzimi, ad esempio si cerca di aumentare la sua
specificità o affinità per il substrato cambiando residui nel sito catalitico, ma anche aumentare la sua
stabilità togliendo o formando legami di solfuro, sostituendo l’asparagina con un altro amminoacido,
togliendo sulfedrili liberi, ma anche migliorare la tecnica di purificazione ad esempio inserendo TAG o anche
toglierli la dipendenza da ioni metallici. Per far ciò si sono inventate varie tecniche di mutagenesi a seconda
del grado di conoscenza che si ha su quella proteina. Se si sa molto poco la sua proteine target si usano
tecniche di random mutagenesi, come DNA shuffling, cioè una ricombinazione in vitro di geni omologhi: si
frammentano i geni di partenza derivati da un gene ancestrale comune, si procede con una PCR senza
Primer e poi con una con Primer e infine si seleziona; in un’altra tecnica random è l’ error prone PCR cioè
una PCR con un buffer alterato che provoca un malfunzionamento nella polimerasi (Alta concentrazione di
manganese, aggiunta di alcol e uso di nucleotidi degenerati ). Se si hanno invece molte informazioni (es.
conosco i residui implicati nel legame) su quella proteina si può procedere con tecniche rational design ,
come: mutagenesi sito diretta (con cicli di PCR o a scambio veloce), nella quale si inseriscono mutazioni
specifiche nei primer con cui si farà la PCR, oppure mutagenesi a cassetta, in cui inserisco una “cassetta”
(cioè una sequenza non una mutazione specifica) all’interno del mio gene, ma questo implica la presenza di
siti di restrizione, e infine mutagenesi a saturazione in cui ogni per ogni codone vengono prodotte 64
mutazioni. Si ha a disposizione anche semi radional designs come error prone PCR con Primer degenerati.
L’indirizzamento a una o un’altra strategia sta anche nel fatto che con mutazioni casuali posso formare una
grande libreria di mutanti in poco tempo ( DNA shuffling ), ma è anche un contro perché si hanno moltissimi
campioni da analizzare e magari solo pochissimi di questi possiedono una mutazione efficace. Vari fattori
43
sono importanti da tener conto per la produzione di una proteina e sono: efficienza di trascrizione (uso
plasmidi pET, con elementi fagici e batterici), l’efficienza di traduzione, se traduco un gene di un eucariote
in un procariote devo aggiungere sequenze shine - delgardo e ovviare al problema del codon bias (cioè che
in un genoma ci sono codoni preferiti per la conversione in un amminoacido), stabilità (si usano basse
temperature di crescita, over espressione di chaperoni, ceppi difettosi di proteasi, secrezione della proteina
o formazione di inclusion bodies) e la sua purificazione ( aggiunta nel gene di sequenze per la purificazione
di affinità ); una volta risolti questi problemi si può far esprimere la nostra proteina.
Domande che ha fatto durante orale

- Trasporto di proteine nel nucleo
- Cos’è un recettore allosterico
- Trasporto post traduzionale delle proteine del mitocondrio
- Quali sono i passaggi dove c’è l’amplificazione di segnale (secondi messaggeri)
- Proprietà utile per il secondo messaggero
- Ormoni steroidei - recettori intracellulari
- Differenza tra i peptidi strutturali e funzionali (interazione tra proteine)
- Come selezionare un ormone della crescita più affine per il suo recettore
- Specificità del substrato delle proteine canali
- Homologoscanning e alanin scanning (epitopo funzionale e strutturale)
- Phage display
- Superficie di interazione adattativa
- Database go
- Relazioni sequenziali – ping pong con grafici
- Selezioni di ceppi con glicosilazione difettiva ( tunicamicina )
- Saggi dei due libri (Intertomica – precipitazioni)
- Come funziona la procedura DNA shuffling
- Mutageni a saturazione, come si fanno?
- Elevata temperatura sull’enzima? Rx: elevata velocità di base
- Reazione ping pong – sequenziali –casuali
- Sistema pET? Rx:: elevata efficienza di trascrizione
- Come strutturato la specificità di substrato
- Metodi di purificazione di proteine
- Come agiscono le mutazioni su RAS e come raggirarle
- Omologo scanning
- Metodi sperimentali per riconoscere IDP? Rx: metodi biochimici (cella filtrazione, elettroforesi) e
metodi informatici
- Enzimi industriali
- Sistema affymetrix
- 2D – DIGE
- Inibizione attiva di RAS
- Definizione di transesterificazione
- Perché il numero dei geni di proteine indifferente
- Come rendere un enzima più affine a solventi organici
- Trasduzione del segnale
44
- Interection Sic1 e CDC4: 9 sitifosfox SCF-CDC4 domanain WD40 times and sites diferent for
flexibility 2 hipothesis
- Processo di N-glicosilazione
- Processo di O-glicosilazione
- Elettroforesi dige
- What means a pathway is enriched in go
- Il ruolo della fosforilazione
- A cosa serve il gene onthology
- Quale procedimento sperimentale per ottenere lista dei termini. Cosa significa che un termine
(metabolismo o glicolisi ecc) sia arricchito e rispetto a cosa
- Attraverso quale codificazione possono le cellule oncogene con modificazioni a livello della via di
trasduzione segnale di Ras
- Come si determina l’interattoma di un organismo
- Come isolare mutanti nella via di N glicosilazione in lievito. Perché viene detta ricca di mannani.
Procedura screening quale scopo e logica per cercare il mutante
- Su quale basi è il sistema dei due ibridi. Perché si chiama così, cosa interagiscono tra loro. Che info
di uscita ottengo usando la tecnica per studiare l’interattoma. Come si struttura una lista di
interazione e che tabella si fa.
- Lei ha una proteina di fusione e vuole eliminare il tag dopo purificazione. Cha approcci può
eseguire? Proteasi endo ed eso azione idrolitica significato. La proteasi è ingegnerizzata anche lui
col tag e in che modo agisce in soluzione
- A che livello è controllata trasduzione segnale di proteine ----meriche G stimolatori di target: cross
talking ed effetti controparte relativi. Modi di spegnere le vie segnale in questo caso. Differenze con
monomeriche.
- Costruzione exp trascrittomica con effymerrix. Gene CHIP funzionante struttura. Info di tipo
posizionale.
- Funzionamento a livello molecolare delle chinasi.
- Come rendere una proteina resistente ai solventi organici
- malattie da misfolding
- Stati di aggregazione delle proteine misfoldate
45

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Domande corrette da 5 punti

- Risposte a crocetta giuste

- Risposte a crocetta sbagliate

- La specificità del sito di legame di una proteina si basa:

- Il tratto distintivo comune a tutte le serin-proteasi è:

- Un pathway di trasduzione del segnale si attiva quando _____ si lega a un recettore:

- Quali delle seguenti affermazioni riferite al trascrittoma sono FALSE?

- Dire quali affermazioni relative alla mutagenesi a saturazione sono VERE:

- Una molecola segnale è altrimenti nota come:

- Un(o/a)________ è un esempio di molecola segnale che può legarsi ad un recettore

- L’espressione di un gene eucariotico in procarioti richiede:

- Il set minimo di geni richiesti per la vita è approssimativamente:

- In esperimenti SDS-PAGE la mobilità elettroforetica di proteine intrinsecamente

- Le proteine citoplasmatiche come gli enzimi della glicolisi vengono sintetizzate:

- Quale tra le seguenti affermazioni NON è corretta:

- Si hanno a disposizione tre gel 2D:

- Quale tra le seguenti successioni di eventi descrive correttamente un tipico meccanismo

- Quale tra le molecole si seguito agisce da secondo messaggero:

- Le proteine di secrezione vengono sintetizzate:

- La specificità di taglio di tripsina e chimotripsina dipende in parte

- La cromatografia di affinità ha a che fare con:

- Abbinare ad ogni enzima il processo dell’industria tessile in cui viene utilizzato:

- In esperimento di SDS-PAGE, l’anomala mobilità elettroforetica di proteine

- Quali delle seguenti affermazioni riferite al trascrittoma sono VERE

- Una situazione in cui una proteina-chinasi attiva numerose altre proteine-chinasi è un

- L’adrenalina o epinefrina agisce come molecola segnale legandosi a recettori:

- L’enzima isocitrato deidrogenasi catalizza la reazione

a) In assenza di ADP l’isocitrato deidrogenasi esibisce una semplice cinetica di MichaelisMenten

- Solitamente un inibitore allosterico di un enzima:

- La dimerizzazione dei recettori tirosin chinasici (RTK) indice direttamente i seguenti

- Il peptide-segnale per una proteina di secrezione è:

- Abbinare la struttura chimica al polisaccaride corrispondente:

1) A=galattomannaro; B=amilopectina; C=xantano

- La specificità del sito di legame di una proteina si basa

1.Si effettua su uno o più codoni di un gene codificante proteine

- L’analisi della composizioni amminoacidica delle proteine intrinsecamente disordinate

1.Possiedono una triade catalitica

e)È corretta solo 4

1. Viene consumata una molecola di GTP a livello del citosol

- Un dispositivo di tipo “stopped-flow” può essere utilizzato

1- Sui residui amminoacidici che rivestono il sito di legame. B

2- IDP – caratteristiche che permettono di classificare una proteina come

3- Epitopo strutturale e epitopo funzionale (punti: 10)

4- Grafico: corsa elettroforetica bidimensionale con regucalcina

B → probabilmente è appena stata trasferita in un organello e ha perso la sequenza segnale. Ha subito un

5- Stop-transfer sequence Punti: 8

6- Mutagenesi a saturazione Punti: ?/10

Utilizzo codoni degenerati per codificare gruppi di amminoacidi.

Quindi nel mio codone avrò il 25% di trovare T, A, C, e G.

7- SRP Punti ?/10

8- Cos’è una stop transfer sequence.

11- Fenomeno folding upon binding Punti 8/10

12- Molte vie di trasduzione del segnale si avvalgono di secondi

Al esempi di secondi messaggeri: Ca ++, cAMP, cGMP, diacilglicerolo, inositolo trifosfato.

13- Inteina Punti ?/10

14- Aggregati fibrillari Punti 10/10

15- Fosforilazione con esempio a piacere Punti 10 / 10

17- Descrivere come si allestisce un saggio di scambio del nucleotide

Il ciclo cellulare è diviso in 4 fasi:

19- Interazioni HUB ???

20- Definire quali caratteristiche conformazionali sono attribuite a

21- Cinetica di inattivazione interfacciale

2- Come ottenere un proteasi con ridotta Km?

Inoltre non tutti gli mRNA vengono tradotti.

4- Metodi per trovare l’antagonista