Tecniche per l’identificazione dell’età della persona in base alla traccia alla stessa riferibile.

Il DNA nucleare umano si suddivide in 22 coppie di cromosomi autosomici e una coppia di cromosomi
sessuali, distinta in XX per le femmine e XY per i maschi. Esso contiene le informazioni genetiche necessarie
alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della
maggior parte degli organismi viventi. Solo circa l’1,5% del DNA codifica per proteine, la restante porzione
può essere trascritta in RNA, oppure è composta da sequenze regolatrici, o, ancora, da sequenze ripetute
non codificanti. Per circa il 99%, la sequenza del DNA risulta essere identica per tutti gli individui. In
quell’1% di differenze possiamo ritrovare diverse tipologie di polimorfismi, che sono delle variazioni della
sequenza del DNA presenti in più dell’1% della popolazione: i polimorfismi di sequenza, come gli SNP (single
nucleotide polymorphism) o gli RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), e i polimorfismi di
lunghezza, come le VNTR (variable number of tandem repeat). Le VNTR si suddividono a loro volta in
minisatelliti, sequenze di DNA ripetuto in tandem non codificante la cui unità ripetitiva può essere lunga tra
le 8 e le 100 paia di basi, e i microsatelliti (STR, ovvero short tandem repeat), sequenze di DNA ripetuto in
tandem non codificante la cui unità ripetitiva può essere lunga tra le 2 e le 6 paia di basi. Il polimorfismo in
questo caso, quindi, non è un nucleotide, ma il differente numero di ripetizioni in tandem dell’unità
ripetitiva.

In genetica forense ogni polimorfismo può essere sfruttato per uno scopo diverso. I più utilizzati ad oggi
sono gli STR nei casi di identificazione, ovvero quei casi in cui si debba confrontare il profilo del DNA
derivante da una traccia con quello derivante da un sospettato. Nei casi di assenza di un sospettato o nei
casi di disastri di massa o, ancora, di ritrovamento di resti cadaverici e di persona scomparsa possono
essere utili gli SNPs. Infatti, sono in corso, ad oggi, diversi studi che dimostrano l’associazione tra uno o più
SNP e una caratteristica fenotipica di un individuo, come la sua origine ancestrale geografica o il suo colore
della pelle, degli occhi o dei capelli, informazioni molto utili nel momento dell’investigazione.

Ci sono, inoltre, le cosiddette isole CpG, ovvero delle sequenze ricche di siti CpG, siti in cui una citosina si
trova vicino a una guanina nella sequenza lineare di basi. Le isole CpG sono associate al 5' dei geni, nelle
regioni promotrici, e sono più lunghe di 500 bp, con un contenuto di GC maggiore del 55%. Queste isole
possono essere o meno metilate a livello delle citosine. Se i geni in questione sono espressi, le isole CpG
non sono metilate, quindi si è ipotizzato che la loro metilazione possa inibire l’espressione dei geni
associati. Inoltre, il grado di metilazione di queste regioni a monte di specifici geni cambia durante la vita di
un individuo, infatti diversi studi hanno dimostrato un aumento del grado di metilazione con l’avanzare
dell’età, definendo questo evento come “orologio epigenetico”. Anche se le cause sono ancora sconosciute,
questa caratteristica può essere sfruttata in genetica forense per avere una stima dell’età dell’individuo a
cui una traccia è riferibile, restringendo il campo delle indagini.

Gli studi del consorzio VISAGE sono volti a sviluppare e migliorare le tecniche e gli strumenti, basati sul
sequenziamento massivo parallelo (MPS), necessari alla predizione delle caratteristiche esterne visibili di un
individuo sconosciuto a cui una traccia è riferibile, come la predizione dell’età.

La conversione con bisolfito è la tecnica di elezione per l’analisi quantitativa della metilazione del DNA. Tale
tecnica si basa sul trattamento del DNA di interesse con sodio bisolfito, seguito da amplificazione con PCR e
sequenziamento.

Quindi, è necessario innanzitutto estrarre il DNA. Esistono diversi metodi di estrazione, come l’estrazione in
fase organica, il metodo Chelex o l’estrazione con le biglie magnetiche, e tutti hanno in comune tre fasi
principali: la lisi cellulare, l’allontanamento delle componenti cellulari diverse dal DNA e infine la sua
purificazione. Solitamente l’estrazione è effettuata in ambienti di laboratorio specifici e con metodi
automatizzati al fine di ridurre errori umani e contaminazioni.
Il DNA estratto viene poi quantizzato con la Real-Time PCR effettuata con le sonde TaqMan, il metodo
elettivo per questo scopo. Questa tecnica permette l’amplificazione di specifiche sequenze di DNA
all’interno di un termociclatore e prevede un ciclo, ripetuto circa 30 volte, composto da tre fasi: la
denaturazione del DNA a 95°C, l’appaiamento dei primers alla loro specifica temperatura di annealing e
l’allungamento del filamento di nuova sintesi effettuato dalla Taq Polimerasi a 72°C. Le sonde TaqMan sono
degli oligonucleotidi al cui 5’ e 3’ sono rispettivamente legati un fluoroforo e un quencher, una molecola
che smorza la fluorescenza del fluoroforo. Queste sonde si legano alle sequenze che devono essere
amplificate e, nella fase di allungamento, il fluoroforo viene allontanato dal quencher dalla stessa
TaqPolimerasi e può così emettere una fluorescenza rilevata dal termociclatore. La tecnica viene chiamata
“Real-Time” in quanto il macchinario è in grado di leggere la fluorescenza emessa dal campione,
proporzionale al quantitativo di DNA, ad ogni ciclo di amplificazione. Il dato finale che viene analizzato è il
Ct, un numero inversamente proporzionale al quantitativo di DNA presente nel campione. Durante l’analisi
vengono quantizzati diversi campioni a concentrazione nota al fine di costruire una curva di taratura basata
sui valori dei Ct e dalla quale ricavare successivamente la concentrazione del campione in analisi. Le
sequenze amplificate sono diverse e specifiche per valutare, oltre alla concentrazione del campione, anche
il suo stato di degradazione, la presenza e concentrazione di DNA prettamente maschile e l’eventuale
presenza di inibitori delle reazioni di amplificazione.

Una volta quantizzato, il DNA può andare in contro alla reazione con sodio bisolfito, un composto chimico
in grado di deaminare le citosine non metilate trasformandole in uracili, i quali sono successivamente
convertiti in timine. Al contrario, le citosine metilate non vengono convertite, risultando alla fine della
reazione sempre citosine.

In seguito, con una multiplex-PCR, vengono amplificate le regioni genomiche il cui grado di metilazione è
stato precedentemente associato all’età di una persona e queste regioni vengono, infine, sequenziate.

Leggendo la sequenza nucleotidica di queste isole CpG selezionate è possibile determinare l’esatta
posizione genomica delle citosine metilate confrontando la sequenza del campione trattato con sodio
bisolfito con quella dello stesso campione non trattato e, quindi, determinare il loro grado di metilazione. È
così possibile ricavare una stima dell’età dell’individuo a cui la traccia in analisi è riferibile.