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FEDELTA’ NELLA REPLICAZIONE

Frequenza di errore = 1 /108 TO 1010 bp replicate


• Livelli bilanciati di dNTP

• Reazione di polimerizzazione = meccanismo a due step


Il dNTP si appaia alla base complementare sullo stampo
Il sito attivo della polimerasi si chiude
In presenza di un corretto appaiamento avviene la reazione
Cambiamento conformazionale nella proteina

• Attività 3’ → 5’ esonucleasi
Correzzione di bozza (proofreading)

• Presenza di sistemi enzimatici addizionali

• Necessità di un primer per l’attività DNA polimerasica


Gli errori di cattivo appaiamento sono più frequenti quando
l’elica in sintesi è stabilizzata da pochi legami idrogeno

• Riparo degli errori durante e dopo la replicazione

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

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Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

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TIPI DI DANNO A CARICO DELLE BASI
Tutte le 4 basi del DNA (A, T, C, G) possono essere modificate
covalentemente in varie posizioni

• Ossidazione
• Deaminazione
• Alchilazione

• Reazione con radicali


dell’ossigeno
• Radiazioni UV
• Agenti chimici

DANNI SPONTANEI A CARICO DEL DNA

Perdita spontanea di basi


Migliaia di purine e centinaia di
pirimidine per genoma /giorno

Deaminazione spontanea
Centinaia di uracile per genoma /giorno

Adenina → ipoxantina
Gunanina → Xantina
5-metil-citosina → Timina

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Deaminazioni

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La deaminazione della citosina genera un G-U mismatch
La U è facile da riconoscere (non fa parte del DNA)

La deaminazione della metil-citosina genera un G-T mismatch


La T non è distinguibile dalla normale T del DNA)

AGENTI CHE DANNEGGIANO IL DNA


▪ Radiazioni in alcuni intervalli di
lunghezza d’onda
▪ Radiazioni ionizzanti come i raggi
gamma ed i raggi-X

▪ Radiazioni ultraviolette,
specialmente i raggi UV-C
(~260 nm) che sono fortemente
assorbiti dal DNA e le radiazioni a
lunghezza d’onda maggiore, i raggi
UV-B, che possono attraversare la
fascia di ozono atmosferico
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AGENTI CHE DANNEGGIANO IL DNA
▪ I radicali dell’ossigeno, specie chimiche
altamente reattive prodotte durante la
normale respirazione cellulare o altre vie
biochimiche

▪ Agenti chimici ambientali


▪ Molti idrocarburi, compresi quelli presenti
nel fumo di sigaretta
▪ Prodotti di microrganismi e piante, come
le aflatossine presenti in alimenti
ammuffiti

▪ Agenti chimici usati in chemioterapia,


in particolare nella lotta contro i tumori
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OSSIDAZIONE DELLE BASI

2,6-diamino-
8-hydroxyguanine 4-hydroxy-
5-formamidopyrimidine

Guanine modification by hydroxyl radicals. Addition of hydroxyl radical to C-8 of guanine


produces an adduct radical, which can be oxidized to 8-hydroxyguanine (8-oxoG) or reduced to
give the ring-opened product 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine (FAPγG).

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OSSIDAZIONE DELLE BASI

Modified bases resulting from the attack of reactive oxygen species.


Examples of the products that can be formed by hydroxyl radicals addition to
position 8 of the purine ring (A) and to positions 5 or 6 of the pyrimidine ring (B).

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MODIFICA CHIMICA DELLE BASI

Reactive nitrogen species

hypochlorous acid

alkylation

Modified bases resulting from the attack of chemical reactive species.


Reactive nitrogen species as N2O3 or HNO2 can promote deamination of DNA
bases (guanine to xanthine and adenine to hypoxanthine) and conversion of
guanine to oxanine, whereas 8-nitroguanine is formed by reaction of DNA with
ONOO- (A). Examples of modified bases formed by the reaction of hypochlorous
acid with DNA (B). Some of the modified bases resulting from alkylation (C).

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In the Liver

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Aflatossine
composti prodotti da alcune
specie di funghi.

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DANNI DA RADIAZIONE UV

7°-9° 44°
bending bending

Dimeri di pirimidina ciclobutano Fotoprodotti Pirimidina (6-4) pirimidone


CPDs (TT>TC,CT>CC) 6-4PPs

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MUTAZIONI A CARICO
DELLE BASI

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Mutazione per deaminazione

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Guanosina
Metil-
Guanosina

Mutagenesi da alchilazione

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Mutazioni da depurinazione

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Mutagenesi da dimeri di pirimidine

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MUTAZIONI PUNTIFORMI
• Appaiamenti sbagliati (mismatches) tra le basi a causa di errori
da parte della DNA-polimerasi durante la replicazione del DNA

• Un esempio è l’incorporazione di U (presente nell’RNA) al posto di T

• Transizioni / Trasversioni

• Inserzioni / delezioni (cambio del frameshift)

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EFFETTO DELLE MUTAZIONI

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25

Transizione

Transizione: sostituzionee di una base pirimidinica o purinica con un’altra

Trasversione: sostituzione di una base pirimidinica con una purinica

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MUTAZIONI
• Mutazioni che producono cambiamenti fenotipici:

– Loss of Function [se recessiva, meno evidente nell’eterozigote;


aploinsufficienza se l’oranismo non tollera neanche la mancanza del 50% della
funzione]

– Gain of Function

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TIPI DI DANNO A CARICO DEL DNA


• Rotture (breaks) nelle catene riboso-fosfato del DNA
• Possono essere limitate ad una delle due eliche (single-stranded
break o SSB) oppure
• Interessare entrambe le eliche (double-stranded break o DSB)
• Sono causate frequentemente dalle radiazioni ionizzanti, anche se
possono essere prodotte da alcuni agenti chimici

• Legami crociati (crosslinks) che si possono formare tra le


basi
• Sulla stessa elica del DNA ("intrastrand") oppure
• Su eliche opposte ("interstrand")
• Molti agenti chemioterapici usati nella lotta contro il cancro
provocano legami crociati nel DNA

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DANNI A CARICO DEL DNA

% of total daily
TYPE OF DAMAGE events/cell/day
damage
Single-strand break 120000 50.9
N7-MethylGuanine > 4000 35.6
Depurination > 10000 10.2
O6-MethylGuanine 3120 1.3
Oxidized DNA 2880 1.2
Depyrimidation 1320 0.5

Cytosine deamination 360 0.2

Double-strand breaks 9 0.01

Interstrand cross-links 8 0.01

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IMPORTANZA DEI MECCANISMI DI


RIPARO DEL DNA

Il DNA cellulare è soggetto a molte alterazioni di


natura chimica e fisica

Un fallimento nei sistemi di riparazione del DNA


produce mutazioni (cancerogenesi)

Più di 100 geni (anche nel più semplice organismo)


sono coinvolti meccanismi di riparazione del DNA

La recente pubblicazione del genoma umano ha


permesso di scoprire più di 130 geni coinvolti

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15
IMPORTANZA DEI MECCANISMI DI
RIPARO DEL DNA

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MECCANISMI DI RIPARO DELLE BASI


DANNEGGIATE
Le basi danneggiate o male appaiate possono essere riparate
attraverso diversi meccanismi:

• Ripristino diretto del danno

• Riparo per escissione (Excision Repair), nel


quale la base o le basi danneggiate vengono rimosse e
sostituite attraverso la nuova sintesi di DNA.
Esistono diversi meccanismi di riparo per escissione
ognuno dei quali utilizza una serie di enzimi
specializzati.
1. Base Excision Repair (BER)
2. Nucleotide Excision Repair
(NER: GG-NER et TR-NER)
3. Mismatch Repair (MMR)

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16
33

RIPRISTINO DIRETTO DEL DANNO


La causa più frequente di danno chimico a carico delle basi che
portano ad una mutazione negli esseri viventi sono

• la formazione di dimeri di pirimidina


• l'addizione spontanea di un gruppo metilico alla C, seguita
dalla deaminazione con formazione di T

Questo tipo di danno può essere riparato da enzimi che


agiscono senza il bisogno di rompere la catena riboso-fosfato
del DNA.

• I dimeri di pirimidina possono essere risolti chimicamente


attraverso una reazione di fotoriattivazione (Fotoliasi)
(eccetto mammiferi placentati)
• Alcuni dei gruppi metilici possono essere rimossi da una
proteina codificata
dal gene MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase)

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Inversione del danno – riparazione diretta

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FOTOLIASI
Cromoforo: FADH e MTHF (5,10-metenil-tetraidrofolato)
o 8-HDF (8-idrossi-5-deaza-riboflavina)

~385 nm

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MGMT
O-6-methylguanine-DNA methyltransferase
La O6-methylguanine-DNA methyltransferase o
DNA-O6-methylguanine:protein-L-cysteine S-methyltransferase
(EC 2.1.1.63)
è un enzima di riparo unico presente in molti organismi e
codificato dal gene ada.

La sua azione rimuove l’addotto mutageno e carcinogenico


O6-alchil-guanina presente nel DNA attraverso una reazione
chimica in cui il gruppo alchilico viene trasferito dalla guanina ad
un residuo di cisteina dell’enzima.
La proteina possiede una
cavità nella quale si inserisce
la base alchilata.
La metilazione rende inattiva
la proteina che quindi può
effettuare il riparo solamente
una volta.

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DIOSSIGENASI (ABH2)
Dealchilazione ossidativa di alcune basi attraverso l’azione
dell’enzima ABH2 (AlkB)

α-chetoglutarato / O2
1-metil-adenina adenina formaldeide,
3-metil-citosina citosina succinato e CO2

α-chetoglutarato / O2
1-etil-adenina adenina acetaldeide,
succinato e CO2

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LIMITI DEI MECCANISMI DI
RIPRISTINO DIRETTO
La fotoriattivazione mediante radiazioni UV non rappresenta un
valido meccanismo naturale.

La MGMT non è un vero enzima in quanto non agisce in maniera


catalitica.

Limiti dei meccanismi di ripristino diretto del danno:

• sono poco efficienti e dispendiosi

• Ogni tipi di alterazione chimica a carico delle basi ha


bisogno del suo specifico meccanismo di correzione.

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….....LIMITI DEI MECCANISMI DI


RIPRISTINO DIRETTO…....
.....PERTANTO.....

Gli organismi viventi hanno sviluppato:


✓meccanismi più generali,

✓capaci di correggere ogni sorta di danno chimico a carico delle


basi

✓attraverso un gruppo limitato di funzioni enzimatiche.

Questi sono rappresentati dai


meccanismi di riparazione mediante escissione.

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BASE EXCISION REPAIR (BER)
Rappresenta uno dei sistemi di riparo più attivi

Sono sufficienti 4 attività enzimatiche:


• DNA-Glicosidasi, endonucleasi, DNA-polimerasi e DNA-ligasi

e 5 step di reazione

1. Eliminazione base danneggiata (glicosidasi)

1. Scissione elica e rimozione residuo abasico


(endonucleasi)

1. Sintesi del DNA (DNA-polimerasi)

1. Riparo dell’interruzione sull’elica (DNA-ligasi)

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SPECIFICITA’ DELLE N-GLICOSIDASI

• uracile OGG1 →8oxoG


• idrossimetil-uracile UNG →uracile
• 5-metil-citosina TDG →Timina:G
• ipoxantina SMUG1 →uracile
• T:G timina mismatch NTH1 →glicol-timina
• A:C adenina mismatch MYH →A:8oxoG
• 3-metil-adenina NEIL1 →pirimidine ossidate
• 7-metil-guanina NEH2/NEIL2 →metil-guanina
• 3-metil-guanina MED1 →timina, uracile
• formamido-pirimidina AAG →metilpurine, ipoxantina, 8-
• glicol-timina 8oxoG, xantina, and oxanina

Basi modificate Varie attività N-glicosidasi

42

21
DNA N-GLICOSIDASI UMANE

La porzione C-terminale delle glicosidasi eucariotiche è omologa a quelle


procariotiche
Le glicosidasi eucariotiche contengono una porzione N-terminale che
controlla la localizzazione intracellulare e le interazioni con altre proteine

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DNA N-GLICOSIDASI MONOFUNZIONALI

Reazione schematica delle DNA-glicosidasi monofunzionali. La base


danneggiata è rimossa mediante l’idrolisi del legame N-glicosidico tra la base e il
deossiribosio, generando un sito abasico. Il prodotto risultante è ulteriormente
processato da una endonucleasi AP-specifica, generando una estremità 3’-OH ed
una estremità 5’ desossiriboso fosfato (dRP).

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DNA N-GLICOSIDASI BIFUNZIONALI

4-oxo-2-pentenale

Reazione schematica delle DNA-glicosidasi bifunzionali.


Questa classe di enzimi è in grado di rimuovere la base danneggiata e tagliare l’elica
del DNA al 3’ del sito abasico attraverso una attività liasica intrinseca. La reazione di
β-liasi genera una estremità 5’-fosfato ed una estremità 3’ con una aldeide 3’-
fosfato-α,β-insatura (4-hydroxypentenal phosphate). La reazione di β,δ-liasi genera
una estremità 3’-fosfato e una 5’-fosfato liberando 4-oxo-2-pentenale.

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DNA N-GLICOSIDASI UMANE

DNA-glicosidasi monofunzionali

DNA-glicosidasi bifunzionali

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MECCANISMO BER

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PROTEINE COINVOLTE NEL BER

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24
Nature Reviews Molecular Cell Biology 13, 659-671 (October 2012)
49

PROTEINE COINVOLTE NEL BER

DNA Repair : Base excision repair SHORT patch v 1.0 - Full HD


https://www.youtube.com/watch?v=72oT6N90iWc

DNA repair: Base excision repair LONG patch 1.0


https://www.youtube.com/watch?v=g4khROaOO6c

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NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER)

• Il sistema di riparo NER permette la rimozione di danni a


carico del DNA che causano

una distorsione nella doppia elica

• Il sistema di riparo consiste nella rimozione di un tratto di


singola elica del DNA di 12-25 nucleotidi e contenente
l’alterazione attraverso la scissione della catena riboso-
fosfato alle estremità e la sintesi di un nuovo filamento

• Il sistema di riparo NER è estremamente flessibile in


quanto è in grado di riparare una moltitudine di lesioni,
come la formazione di addotti delle basi, che in comune
generano una alterazione o distorsione della doppia elica

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LESIONI RIMOSSE DAL SISTEMA DI


RIPARO NER
Le lesioni più rilevanti rimosse dal sistema di riparo NER sono:
• i dimeri di cis-sin-ciclobutano (CPDs)
• i fotoprodotti pirimidina-(6-4)-pirimodone (6-4PPs)

Entrambi si formano tra residui adiacenti di pirimidine

e sono le due principali lesione indotte dalla radiazione solare UV.

Le lesioni 6-4PPs sebbene siano meno abbondanti distorcono


maggiormente l’elica e vengono riparate 5 volte più velocemente.

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LESIONI RIMOSSE DAL SISTEMA DI
RIPARO NER
Il sistema di riparo NER è in grado di rimuovere anche:
• addotti chimici voluminosi a carico delle basi come quelli
prodotti dagli idrocarburi policiclici aromatici (fumo di sigaretta)

• cross-linking tra eliche indotto da agenti chemioterapici come il


cis-platino o alcuni metaboliti cellulari

Il sistema di riparo NER può anche rimuovere danni minori a carico


delle basi come quelli indotti dagli agenti alchilanti ed ossidanti e che
non generano distorsioni nell’elica.
• NER come sistema di back-up del BER

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MECCANISMO DEL SISTEMA DI


RIPARO NER
Il sistema di riparo NER comprende 20-30 proteine e prevede:

• Il riconoscimento iniziale del danno che può avvenire


✓ in un punto qualsiasi del genoma (GG-NER)
✓ associato all’evento trascrizionale (TR-NER)

• Il legame di un complesso multiproteico

• Incisioni sui lati 5’ e 3’ dell’elica danneggiata ad una distanza


di diversi nucleotidi dal sito iniziale

• La rimozione dell’elica danneggiata

• La sintesi di nuovo DNA da parte della DNA-polimerasi

• L’unione dei frammenti di DNA da parte della DNA-ligasi

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Prokaryotic NER pathways
Global genome repair (GG-NER),
•the genome is scanned by the heterotetrameric UvrA 2–UvrB2 complex → search
for damaged nucleotides causing large conformational changes.

Transcription-coupled repair (TR-NER),


•the repair process is initiated by a stalled RNA polymerase during transcription
→interaction of the RNA polymerase with Mfd,
→Mfd recruits the UvrA dimer or a UvrA2–UvrB heterotrimer to the site of the
lesion.

Both mechanisms converge into the same pathway


•damage verification by UvrB
•followed by 3′ and 5′ incisions catalyzed through UvrC.
•helicase activity of UvrD is required for the removal of UvrC.
•incised strand is excised
•repair patch is synthesized by DNA polymerase I and DNA ligase seals the nick.

Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Mar; 5(3): a012591.


doi: 10.1101/cshperspect.a012591

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Protein structures in
FIGURE 1

DNA repair mechanism animation -


Nucleotide excision repair (NER)
https://www.youtube.com/watch?v=94ou07-qMSg

Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Mar; 5(3): a012591.


doi: 10.1101/cshperspect.a012591

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PROTEINE DEL SISTEMA DI RIPARO NER
EUCARIOTI

XPA: Ruolo chiave nell’organizzazione strutturale del compleso NER

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STADI INIZIALI DEL GG-NER


Nel Global Genome NER
(GG-NER) lo step iniziale
è il riconoscimento della
distorsione nell’elica del
DNA ad opera del
complesso XPC/HHR23B

Successivamente il
complesso iniziale viene
sostituito dal TFIIH
contenente le due attività
elicasi XPB e XPD

L’azione delle elicasi viene


coadiuvata dal complesso
XPA-RPA (ss-DNA binding
protein) e dalla
endonucleasi XPG (sito 3’)

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STADI INIZIALI DEL TR-NER
Nel Transcription Coupled
NER (TR-NER) lo step
iniziale è lo stallo del
complesso della RNA-
polimerasi II associata
alle proteine CSA e CSB

Anche in questo caso il


complesso iniziale viene
sostituito dal TFIIH
contenente le due attività
elicasi XPB e XPD

L’azione delle elicasi viene


coadiuvata dal complesso
XPA-RPA (ss-DNA binding
protein) e dalla
endonucleasi XPG (sito 3’)

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FASI FINALI DEL SISTEMA NER


Legame della
endonucleasi
XPF/ERCC1
(sito 5’)

Excissione
dell’elica
contenete il
danno
endonucleasi
XPG (sito 3’)

Sintesi di
riparo con

PCNA
RFC
DNA-pol δ/ε
RPA
DNA-ligasi

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DIFETTI NEL SISTEMA DI RIPARO NER

• riconoscimento
iniziale

• DNA-binding

• Elicasi

• Elicasi

• endonucleasi 3’
• endonucleasi 5’

Cockayne’s Syndrome Complementation Groups


• CS-A (protein with multiple WD-40 repeats) Inizio TC-NER
• CS-B (DNA-dependent ATPase of the SNF2 family) inizio TC-NER

61

Eukaryotic Nucleotide
Excision Repair
https://www.youtube.com/watch?v
=o-qMG6ffxUU

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MISMATCH REPAIR (MMR)
Meccanismo che riconosce danni a carico del DNA che causano

alterazione nella doppia elica del DNA


(mismatch tra basi e piccoli loop di ssDNA)

Per il riparo viene utilizzata l’elica parentale


(si assume che il danno sia avvenuto durante l’ultima replicazione)

Costituito da due sistemi enzimatici


• Sistema enzimatico che riconosce il mismatch
• Sistema che riconosce l’elica parentale e provoca una
incisione nell’elica neosintetizzata nelle vicinanze del sito
danneggiato

Il meccanismo viene completato dall’azione della DNA-polimerasi


che sintetizza il nuovo filamento di DNA su stampo del filamento
parentale

63

Khuu P, Ho PS. A rare nucleotide base tautomer in the structure of an


asymmetric DNA junction. Biochemistry. 2009 Aug 25;48(33):7824-32.
doi: 10.1021/bi900829b.

Tautomeria e
mutazioni mismatch

64

32
SISTEMA DI RIPARO MMR IN E.Coli
MutS riconosce i punti di mismatch
MutL stabilizza il complesso
MutH riconosce il DNA emimetilato

DNA metilato nei siti GATC


La metilazione avviene in ritardo
rispetto alla sintesi del DNA per cui
è possibile riconoscere l’elica di
nuova sintesi

MutS/MutL attiva MutH che taglia il DNA sull’elica non metilata


Una attività elicasi (UvrD o Helicase II) svolge l’elica dal sito di
taglio sino al punto di mismatch mentre una attività esonucleasi
(5’ o 3’ in base al punto di taglio) rimuove il singolo filamento
La DNA pol-III sintetizza il nuovo filamento e la DNA-ligasi unisce
l’interruzione

65

Come il sistema di riparo MMR riconosce l’elica parentale

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33
Mismatch repair in E. coli

https://www.youtube.com/watch?v
=p3MXIKWAi2w

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GENI COINVOLTI NEL SISTEMA MMR

cryptic endonuclease that is specifically activated by MutS/MutL.

MutU(uvrD) helicase modulated by the mismatch repair protein MutL

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34
International Journal of Biophysics - p-ISSN: 2168-4979 e-ISSN: 2168-4987
2013; 3(1A): 18-38 - doi:10.5923/s.biophysics.201311.03

69

MECCANISMO DI RIPARO MMR

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35
Figura 7.8 Mismatch repair (MMR) negli eucarioti.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

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Nicking by the endonuclease function


of PMS2 stimulated by ATP, PCNA,
and RFC and relevant protein–protein
interactions (indicated by green arrow)
may establish strand discrimination
targeting repair to the newly
synthesized strand.

DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing


(2008) Peggy Hsieh, Kazuhiko Yamane - DOI:10.1016/j.mad.2008.02.012

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Correzione di scivolamenti nella replicazione di regioni con ripetizioni in tandem
(DNA microsatellite)
Tendenza della polimerasi a scivolare sullo stampo copiando più volte la stessa regione
(causa di polimorfismo e di patologie: distrofia muscolare, X fragile, malattia di Huntington
estensione della tripletta CAG che codifica per la glutamina)

73

RIPARO MMR

https://www.youtube.com/watc
h?v=HYS6EKnQcv0

74

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DIFETTI NEL SISTEMA DI RIPARO MMR
Hereditary non-polyposis colon cancer (HNPCC)
• forma di cancro al colon caratterizzata dalla insorgenza in età precoce
e dalla ereditarietà autosomica dominante
• frequentemente associata con difetti nei geni codificanti MSH2 (35%
dei casi) e MLH1 (circa 60% dei casi)
• MSH2 e MLH1 sono essenziali per la formazione di eterodimeri
funzionali di MutS e MutL
• saltuariamente associata con difetti in altri geni del sistema di riparo
MMR (MSH6, PMS2 e PMS1), conseguenza della ridondanza di questi
ultimi geni che li rende singolarmente non essenziali per il MMR

La HNPCC è quasi sempre associata con difetti nella riparazione del DNA
evidenziate nella "instabilità del DNA microsatellite" (microsatellite
instability o MIN) rappresentata da variazioni nel numero delle unità di
sequenza ripetute [An, (GGC)n, (CA)n]

In molti casi di cancro al colon associati con MIN ma senza alterazioni a


carico dei geni del sistema MMR
→ è stata osservata una metilazione estesa del promotore di MLH1 che lo
silenzia
• probabilmente tutti i casi di cancro al colon associati a MIN sono
dovuti a difetti nel sistema di riparo MMR

75

Replicazione trans-lesionale (o “soggetta ad errori”)

In condizioni di stress la lesione del DNA viene ignorata e copiata dalla Pol V

76

38
Sintesi translesione del DNA:

DND-Pol δ si stacca

PCNA carica un’altra DNA-Pol


(in grado di superare la lesione)
a bassa processività

77

TRANSLESIONAL SYNTHESIS

Translesional o bypass synthesis:


DNA polimerasi alternative a bassa processività
Possono essere sia error free che error prone
Ad esempio Pol incorpora correttamente dA in presenza di CPD (dimeri timina)

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39
Figura 7.9 Meccanismi di tolleranza al danno (PRR, Post-Replication Repair) negli eucarioti.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

79

Replicazione trans-lesionale
(o “soggetta ad errori”)

https://www.youtube.com/watch?v=wnlQl-UCC3I

https://www.youtube.com/watch?v=PgzkXJO0WrQ

80

40
DNA polimerasi

10 DNA polimerasi eucariotiche coinvolte nella TLS


(Rev1, Pol, Pol, Pol, Pol, Pol, Pol, Pol, Pol e Pol)

81

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

82

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STRAND-BREAK REPAIR

Le radiazioni ionizzanti ed alcuni agenti chimici


possono produrre rotture che riguardano

• la singola elica (single-strand breaks o SSBs)


• la doppia elica (double-strand breaks o DSBs)

I meccanismi di riparo per gli strand-breaks sono


essenziali per la sopravvivenza della cellula

83

STRAND-BREAK REPAIR
Le rotture nella singola elica vengono riparate
attraverso un solo tipo di meccanismo

• Single-strand breaks repair (SSBR)

Le rotture nella doppia elica possono essere riparate


attraverso due tipi di meccanismo

• Double-strand breaks repair by non-homologous


end joining (NHEJ)

• Double-strand breaks repair by homologous


recombination (HR)

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42
SINGLE-STRAND BREAKS REPAIR (SSBR)
Le rotture nella singola elica vengono riparate attraverso un meccanismo
comune al sistema di riparo BER (short-patch BER)
PARP riconosce
le interruzioni

XRCC1 ha le
funzioni di
proteina scaffold

La PNK
Polinucleotide
kinasi/3’-
fosfatasi prepara
le estremità

La DNA
polimerasi β
riempie
l’interruzione

La DNA ligasi 3
unisce le
estremità

85

FORMAZIONE DI DSBs

Formazione dei DNA double-strand breaks (DSBs). I DSBs doppi (two-ended) possono
formarsi quando il DNA duplex è rotto in due frammenti, ad esempio a causa di radiazioni. I two-
ended DBSs possono essere riparati attraverso la homologous recombination (HR) usando i
cromatidi fratelli intatti, oppure attraverso la non-homologous DNA end-joining (NHEJ) che però
può portare ad un riarrangiamento della sequenza.
I DSBs singoli (one-ended) si generano quando la forca di replicazione incontra un single-strand
DNA break che non è stato riparato. In questo caso la homologous recombination tra i cromatidi
fratelli affiancati nella forca di replicazione è il meccanismo di riparo preferito e più accurato.

86

43
NON-HOMOLOGS END JOINING (NHJE)
Le rotture nella doppia elica possono essere riparate attraverso un
meccanismo diretto che prevede l’unione dei due frammenti di DNA
La proteina Ku Se è necessaria una modifica
(eterodimero delle estremità,
Ku70/Ku80) si lega DNA-PK attiva Artemis che
alle estremità del agisce come endonucleasi
DNA e richiama la processando le estremità del
DNA-PKcs (DNA- DNA e generando dei
dependent protein filamenti a singola elica che
kinase catalitic possono appaiare
subunit) formando
l’enzima DNA-PK Possono
(MNR complex) intervenire
altre attività di
DNA-PK promuove processamento
la giustapposizione come la TdT e
delle estremità le Pol o Pol
delle due molecole
di DNA e, se non è
necessario un loro
processamento,
richiama i fattori
addizionale per la
ligazione.

La proteina Ku richiama il complesso XRCC4/DNA-ligasi IV che riunisce le estremità. XLF agisce


come fattore ausiliario.
Nel caso di processamento delle estremità (reclutamento MNR complex) è possibile la perdita di
alcuni nucleotidi nel punto di riparo [DNA polymerase called terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)]

87

NHJE

88

44
LINFOMA DI BURKITT
Il linfoma di Burkitt è un tumore dei linfociti B.
Nella parte maggior parte dei casi di linfoma di Burkitt (>90%) si
osserva una traslocazione del proto-oncogene c-myc
→dalla sua posizione normale sul cromosoma 8
→ad una posizione adiacente all’enhancer del gene della catena pesante
delle immunoglobuline G situato sul cromosoma 14

C-myc è un fattore
essenziale nella
regolazione della mitosi
cellulare e la sua
sovraespressione rende la
cellula tumorale

Il rischio di traslocazioni che riguardano le regioni codificanti i geni degli


anticorpi è elevato in quanto durante la maturazione e la sintesi delle
catene degli anticorpi avvengono riarrangiamenti a carico della sequenza
del DNA. Cromosoma 14 (catene pesanti), cromosoma 2 (catene leggere
kappa) e cromosoma 22 (catene leggere lambda).

89

c-Myc as a key signaling node

Attacking c-Myc: Targeted and Combined


Therapies for Cancer
Current pharmaceutical design
20(42):6543-54 · March 2014

90

45
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA (CML)
Le leucemia sono proliferazioni incontrollate dei leucociti e la leucemia
mieloide cronica (CML) colpisce cellule staminali emopoietiche precursori
dei granulociti e dei macrofagi.
Molti casi di CML sono associati ad una traslocazione tra la regione
terminale del cromosoma 9 ed il cromosoma 22 con la formazione di un
cromosoma 22 piccolo detto cromosoma Philadephia
Il proto-oncogene c-abl si fonde con
il gene bcr.
Il prodotto BCR-ABL è una tirosina
kinasi costitutivamente attivata che
stimola risposte cellulari
normalmente sotto il controllo del
PDGF (platelet-derived growth
factor) provocando una mitosi
incontrollata ed una inibizione
dell’apoptosi
L’imatinib
mesilate
(Gleevec®) è
un inibitore
dell’attività
kinasi di ABL

91

Molecular Pathways: BCR-ABL

Hsp90 Inhibitors for the Treatment of


Chronic Myeloid Leukemia
Leukemia Research and Treatment
Volume 2015, Article ID 757694, 16 pages
http://dx.doi.org/10.1155/2015/757694

92

46
LEUCEMIA DELLE CELLULE-B
Le cellule B hanno un tempo di vita limitato e vanno spontaneamente
incontro ad apoptosi dopo che è terminata la risposta immunitaria

Una traslocazione tra il cromosoma 18 ed il cromosoma 14 porta il gene


bcl-2 adiacente all’enhancer del gene della catena pesante delle
immunoglobuline presente sul cromosoma 14

BCL-2 è una proteina ad


attività anti-apoptotica.

La sovraespressione del
gene bcl-2 protegge la
cellula nei confronti
dell’apotosi prevenendo
l’azione delle caspasi e
rendondo la cellula
tumorale

93

Apoptosis by the BCL-2 protein family

Control of apoptosis by the BCL-2


protein family: implications for
physiology and therapy

Nature Reviews Molecular Cell Biology


volume 15, pages 49–63 (2014)

94

47
Apoptosis signaling and BCL-2 pathways

Blood Reviews (2018)


Volume 32, Issue 1, January 2018, Pages 8-28 - https://doi.org/10.1016/j.blre.2017.08.004

95

HOMOLOGOUS RICOMBINATION (HR)


Nella ricombinazione omologa
le interruzioni su di una doppia
elica vengono riparate
utilizzando
→il cromosoma fratello
(presente in fase G2 dopo la
replicazione del DNA)
O
→il cromosoma omologo
(presente in fase G1)

Il meccanismo della HR prevede


passaggi che sono in comune
con il sistema di ricombinazione
del DNA che opera durante la
meiosi
Due proteine utilizzate nel
meccanismo HR sono codificate
dai geni BRCA-1 e BRCA-2.
Mutazioni in questi geni sono
associate a forme di cancro

96

48
HR
Strand resection:
Generazione di 3’ ssDNA tails
da parte del complesso MRN
(Mre11, Nbs1 e Rad50)

Coating:
RPA (ssDNA binding) copre il
tratto ssDNA

RAD loading:
Rad51 ed altre proteine
(Rad52, Rad54, BRCA-1 e
BRCA-2) formano un
complesso che promuove
l’invasione e l’appaiamento
con la sequenza omologa non
danneggiata

Stand invasion and repair:


Una volta che l’elica interrotta
appaia con la sequenza
omologa la DNA polimerasi
ripara l’interruzione

97

HR

non-crossover (NCO)

98

49
HR verso NHEJ

(G1)

(G2)

99

NHEJ verso HR
Modello di riparazione delle double-strand breaks (DSB): NHEJ verso HR

a) La formazione di una DSB richiama le componenti di controllo iniziali:


il complesso MRN (MRX nel lievito), Tel1 e Sae2. La fosforilazione
dell’istone H2a (γ-H2Ax) si estende intorno al sito di rottura
[ATM is the principal kinase responsible for the phosphorylation of histone H2AX on serine
139 (known as γH2AX)]

b) Il sistema di riparo NHEJ, che agisce tramite Ku70 o Ku80, è la via di


riparazione preferita quando l'attività delle CDK è bassa (fase G1)

c) Quando l'attività delle CDK è alta (fase G2), vengono generate le


estremità 3’ ssDNA ed il complesso MRN/MRX, Tel1 e Sae2
cominciano a dissociare

d) RPA lega le ssDNA e recluta Ddc2-Mec1 mentre i complessi Rad24-


Rfc2-5 e Ddc1-Mec3-Rad17 (9-9-1 complesso) si associano al sito
della rottura

e) Rad52 e Rad51 sono reclutati nel sito di rottura, spostano RPA, e


avviano l'invasione e l’appaiamento con la sequenza di DNA omologa

100

50
Non-homologous end joining
https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw
Non-homologous End Joining in Class Switch Recombination (IgG)
https://www.youtube.com/watch?v=ECeEyVxKFT8

Homology-dependent double strand break repair


https://www.youtube.com/watch?v=86JCMM5k
b2A

101

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

102

51
Figura 7.11 La risposta cellulare a danni al DNA attiva il checkpoint.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

103

Figura 7.12 Reclutamento dei “sensori” del checkpoint da danno vicino alle lesioni.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

104

52
Figura 7.13 Il checkpoint da danno al DNA è una cascata di trasduzione del segnale.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

105

Protein fosfatasi

Figura 7.14 Il checkpoint da danno al DNA agisce su p53 e Cdc25 bloccando l’entrata in mitosi.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

106

53
DNA DSB repair signaling pathways through the apical
(DNA damage–response) DDR kinases.

CHK2 serves to inhibit cyclin-dependent CHK1 is the best described substrate of ATR, and once
kinase (CDK) activity through the activated by ATR, CHK1 serves to inhibit cyclin-
phosphorylation of CDC25. is a critical dependent kinase (CDK) activity through the
regulator of the G1–S and intra-S phosphorylation of CDC25A. As such, CHK1 is a critical
regulator of the G2–M and intra-S cell-cycle checkpoints
Jessica S. Brown et al. Cancer Discov 2017;7:20-37
©2017 by American Association for Cancer Research

107

Figura 7.15 Mutazioni in un gene coinvolto nella riparazione del DNA aumentano l’instabilità dell’intero genoma.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA

108

54
Predominant DNA repair pathways

Targeting DNA Repair in Cancer : Beyond PARP Inhibitors


(2016); DOI: 10.1158/2159-8290.CD-16-0860

109

Predominant DNA repair pathways

Targeting DNA Repair in Cancer : Beyond PARP Inhibitors


(2016); DOI: 10.1158/2159-8290.CD-16-0860

110

55
Predominant DNA repair pathways

Targeting DNA Repair in Cancer : Beyond PARP Inhibitors


(2016); DOI: 10.1158/2159-8290.CD-16-0860

111

Farmaci antivirali

Molti antivirali interferiscono con gli enzimi coinvolti nel processo


virale

Gli Inibitori della DNA polimerasi virale sono anche composti ad


attività antitumorale.

l'Ara-A o vidarabina è prevalentemente un antivirale, il suo analogo


Ara-C o citarabina è principalmente un farmaco antineoplastico;

Anche la Timidilato Sintasi è bersaglio antivirale: questa può legare gli


antimetaboliti, al posto dei metaboliti veri, incorporarli nel DNA e
RNA virale con l'intervento di un apposito enzima provocando la sua
distruzione, quindi eliminando l'infezione.

112

56
Nucleosidi purinici modificati allo zucchero
(nucleosidi aciclici)

I nucleosidi aciclici nascono dall’esigenza di trovare inibitori della


adenosina deaminasi da somministrare assieme a Ara-A, per migliorarne
l’effetto. Il composto 9-(2-idrossietossimetil)adenina si rivelò essere un
substrato per l’adenosina deaminasi. Il fatto che questo spezzone
zuccherino potesse essere riconosciuto da un enzima fece ipotizzare che
potesse essere riconosciuto anche da altri enzimi. Nacquero così gli
aciclonucleosidi, il più importante dei quali è l’aciclovir.

Aciclovir :
[9-(2'-idrossietossimetil)guanina], usato
come tale o sottoforma di sale sodico.
Agisce sulla DNA polimerasi virale.
Struttura zuccherina profondamente
modificata. L'aciclovir è un nucleoside ad
ampio spettro e a grande selettività.

113

Formule di struttura di analoghi pirimidinici

HN C O (CH 2)4 CH 3
O
F
F N
O HN
O N
F O
HN N
HOH 2C O H3 C O

N
O H
HO OH OH
Fluorouracile Floxuridina Capecitabina

NH2 NH2

N N

O N O N
HOH 2C O HOH 2C O
HO F

HO HO F

Citarabina Gemcitabina

114

57
Nucleosidi derivati dall’ adenina
NH2
O

N
N N
HN

O
N
N N
HO N
HO P O
O O
H OH OH H OH

HO H HO H

VIDARABINA (AraA) Ara-Hx-MP


Utilizzati contro Herpes simplex e varicella zoster
Ara A agisce con diversi meccanismi d’azione diminuisce
resistenza ma aumenta tossicità.
1) Come trifosfato inibisce DNA polimerasi
2) Incorporata nel DNA (virus e ospite)
3) Inibisce reazioni transmetilazione (metil transferasi)
4) Inibisce dideossiadenosindifosfato da ADP ( ATP)
115

Nucleosidi pirimidinici modificati allo zucchero e alla base

NH2

I
N

O N
HO
O
H F

HO H

FIAC (5-iodo-1(2’-deossi-2’-fluoro-
D-arabinosofuranosil)citosina

Attivo contro HSV-1; HSV-2; citomegalovirus; Epstein Barr virus.


Inibisce DNA polimerasi

116

58
Nucleosidi pirimidinici modificati allo zucchero

CH3
HN

O N
HO
O
H F

HO H

FMAU 1(2-deossi-2-fluoro-
D-arabinofuranosil)timina
Attivo contro HSV-1; HSV-2; citomegalovirus;
Inibisce DNA polimerasi

117

FARMACI
Antimetaboliti
• 5-fluorouracil
• 6-tioguanine
Alchilanti
• N-methyl-N-nitrosourea (MNU)
• N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)
• 1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourea (CCNU)
• Mitomycin C
Platino
• Cis-diamminedichloro-platinum
• Oxaliplatin
Inibitori topoisomerasi
• Camptotecin (CPT)
• Etoposide (ETP)

118

59
ANTIMETABOLITI
Analoghi di nucleosidi incorporati nel DNA - danno

Gemcitabine* Cytarabine

Analoghi delle purine (tiopurine)


Inibizione sintesi nucleotidi
Analoghi delle pirimidine (fluorouracile)

119

5-Fluorouracil
• Fluorouracil (5-FU or f5U)
(sold under the brand names
Adrucil, Carac, Efudix,
Efudex and Fluoroplex) is a
drug that is a pyrimidine
analog which is used in the
treatment of cancer.

• It is a suicide inhibitor and


works through irreversible
inhibition of thymidylate
synthase.

• It belongs to the family of


drugs called antimetabolites.

120

60
Analoghi delle pirimidine (fluorouracile)
Il 5-Fluorouracil viene attivato a 5-F-dUMP attraverso la reazione di recupero delle
basi pirimidiniche e inibisce la timidilato sintasi (TS) che metila dUMP a dTMP
(formazione di un intermedio covalente TS-FdUMP-N5,10-MTHF.)
5-FdUTP può inoltre essere incorporato nel DNA al posto di dUTP.

5-Fluorouracil + deoxyribose-1-phosphate
pirimidina fosforilasi (T
5'-deoxy-5-fluorouridine (5'-DFUR)
uridina kinasi
fluoro-deoxy-uridine monofosfato (5-F-dUMP)

121

5-Fluorouracil metabolism
5-FUTP può agire da inibitore

Effetti su DNA
- TS inhibition da 5-FdUMP
- 5-FdUTP può essere incorporato nel DNA
al posto di dUTP.

Effetti su RNA
- 5-FUTP Incorporato nel RNA al posto di
UTP.

Diidrifluorouracile (DHFU) – inattivo


Diidropirimidina deidrogenasi (DPD)
orotato-fosforibosiltransferasi (OPRT)
timidilato fosforilasi (TP)
timidilato Kinasi (TK)
timidilato sintasi (TS)

122

61
Mechanism of thymidylate synthase
inhibition by 5-fluorouracil
TS

inibisce la timidilato sintasi (TS) che metila dUMP a dTMP


(formazione di un intermedio covalente TS-FdUMP-N5,10-MTHF.)

123

Analoghi delle pirimidine (fluorouracile)


La Capecitabine è un proframaco che viene convertito in 5-FU attraverso
3 tappe enzimatiche.

Capecitabine
esterasi
5'-deoxy-5-fluorocytidine (5'-DFCR)
citidina deaminasi
5'-deoxy-5-fluorouridine (5'-DFUR)
timina fosforilasi
5-fluorouracil

Machado MGM, Yamasaki PR, dos Santos JL, Chin CM (2016)


Targeted Prodrug Design for the Treatment of Malignant Melanoma.
J Dermatol Res Ther 2:019. 10.23937/2469-5750/1510019

124

62
Modulation of 5-fluorouracil activity
diidropirimidina deidrogenasi (DPD): Capecitabine
• enzima chiave coinvolto nel catabolismo del esterasi
5-fluorouracile (5-FU)
5'-deoxy-5-fluorocytidine (5'-DFCR)
• responsabile della degradazione di questo analogo citidina deaminasi
pirimidinico al suo metabolita inattivo diidrofluorouracile
(DHFU)
5'-deoxy-5-fluorouridine (5'-DFUR)
timina fosforilasi (TP)
5-fluorouracil

5-formyltetrahydrofolate (folinic acid, leucovorin)

Diidrifluorouracile (DHFU) – inattivo


Diidropirimidina deidrogenasi (DPD)
orotato-fosforibosiltransferasi (OPRT)
timidilato fosforilasi (TP)
timidilato sintasi (TS)

125

Activation of p53 by 5-fluorouracil

126

63
ANTIMETABOLITI

Integrazione del metabolismo di purine e pirimidine.


Il metotrexato (antifolato) inibisce la DHF reduttasi riducendo il quantitativo di THF
necessario per la sintesi delle purine.
Il metilen-THF, derivante dal THF, è anche necessario per la sintesi delle purine nella
reazione catalizzata dalla timidilato sintasi (TS), a sua volta inibita dal fluro-uracile.

127

Analoghi delle purine (tiopurine)

Mercaptopurine (6-MP) e thioguanine (6-TG) inibiscono la sintesi dei nucleotidi purinici

6-MP viene
convertito in
ribonucleotide e
inibisce la reazione
che converte
inosina in adenina

128

64
Cytidine Analogs

Mechanism of action
Cell cycle phase specific
undergoes phosphorylation to form
arabinosylcytosine triphosphate (ara-CTP), which competes with the
normal substrate deoxycytidine 5’-triphosphate (dCTP), in the inhibition of
DNA polymerase 

129

ANTIMETABOLITI
Idrossiurea [Onco Carbide®]

L’idrossiurea è un inibitore della


ribonucleotide reduttasi (RR)
The mechanism of action remains speculative, but is usually attributed to
inhibition of ribonucleotide reductase.
[Side Effects of Drugs Annual, Volume 39 - 1st Edition- A Worldwide Yearly Survey of New Data in Adverse Drug Reactions, 2017]

Agisce anche come free radical


scavenger

Utile in chemioterapia

130

65
ALCHILANTI

NITROSOUREE

Temozolomide Procarbazine

Cyclophosphamide

131

ALCHILANTI

132

66
ALCHILANTI
Main effect is on DNA synthesis with most
cytotoxicity to rapidly proliferating cells

133

Ciclofosfamide

Alchilante bifunzionale

134

67
Meccanismo d’azione di alchilanti bifunzionali

Gli agenti alchilanti agiscono trasferendo un gruppo alchilico all’N7 dei residui di
guanina del DNA attraverso la formazione di un carbanione o lo ione etileneimmonio.

135

ALCHILANTI
• Mechanism of action
– act as bifunctional alkylating agents following metabolic
activation and formation of mustards
– mustards react with the N7 atom of purine bases
(guanine)
– these DNA adducts go on to form cross-links through
reaction of the second arm of the mustard
– prevent cell division by cross-linking DNA strands
– intra- and interstrand cross-links
– cell continues to synthesize other cell constituents, such
as RNA and protein, and an imbalance occurs and the cell
dies
– if these modifications in the nucleic acid structure are
compatible with cell life (after DNA repair), mutagenesis
and carcinogenesis result

136

68
PLATINO

Lesioni più frequenti:


Intrastrand e interstrand dipurinyl crosslinks
intrastrand tra N7 di purine adiacenti (65% GpG, 25% ApG)
DNA-protein crosslinks - Purine monoadducts
Riparo principalmente attraverso il sistema NER (anche MMR è coinvolto)
Oxaliplatin: alta efficienza terapeutica specie se in associazione con 5-FU

Mechanism of Cisplatin
https://www.youtube.com/watch?v=UpfPiccg3Do
The Mechanism of Cisplatin (New -HD)
https://www.youtube.com/watch?v=Wq_up2uQRDo
How anticancer drugs work - Molecular mechanism of action of cisplatin
https://www.youtube.com/watch?v=5Jhva54oMJ8

137

OXALIPLATIN

L’oxaliplatin viene attivato, attraverso una


serie di reazioni, alla specie di-idrata che
reagisce con residui adiacenti di guanina
presenti sullo stesso filamento o su filamenti
opposti.

In questo ultimo caso si forma un ponte tra i


due filamenti (inter-strand crosslink) che
impedisce la loro separazione, bloccando così
la forca di replicazione.

Il residuo diamino-cicloesano presente


nell’addotto riduce la capacità dei sistemi di
riparo (in particolare MMR), rendendo la
terapia con oxaliplatin utile anche in cellule
MMR-proficient.

138

69
Methotrexate
• Mechanism of action
– Folic acid analog
– Cell cycle specific (S-phase)
– Inhibits dihydrofolate reductase, depleting
intracellular pools of tetrahydrofolate
which is essential for purine and
thymidylate synthesis (DNA synthesis)

139

Anthracyclines are drugs extracted


from Streptomyces spp
Used in the treatment of various types of cancers. The different types
available:
•Daunorubicin
•Doxorubicin
•Epirubicin
•Idarubicin
•Mitoxantrone
•Valrubicin
(cancers: Acute lymphocytic leukemia; Acute myelogenous leukemia;
Hodgkin's lymphoma; Non-Hodgkin's lymphoma; Bladder cancer; Breast
cancer; Other metastatic cancers)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK538187/

How anticancer drugs work – Molecular mechanism of action of doxorubicin or adriamycin


https://www.youtube.com/watch?v=AX2mRRxVbNo

140

70
Anthracyclines are drugs extracted
from Streptomyces spp
The explanations of cytostatic and cytotoxic actions of anthracyclines point to
by many different mechanisms including free radical formation, lipid
peroxidation, direct membrane effects, and enzyme interactions.
The following elucidates some of these theories:
•Enzyme interaction
The most widely accepted explanation for the action of anthracyclines is their
interaction with topoisomerase-II. The ternary complex thus formed
prevents the re-ligation of the ds DNS breaks. Subsequently, it promotes
growth arrest and apoptotic cell death.
•DNA intercalation
Anthracyclines have a chromophore moiety that has an intercalating function
and inserts between adjacent base pairs of DNA when localized to the nucleus
of the cell; this inhibits DNA and RNA synthesis especially in highly replicating
cells blocking cell division.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK538187/

How anticancer drugs work – Molecular mechanism of action of doxorubicin or adriamycin


https://www.youtube.com/watch?v=AX2mRRxVbNo

141

Predominant DNA repair pathways

Targeting DNA Repair in Cancer : Beyond PARP Inhibitors


(2016); DOI: 10.1158/2159-8290.CD-16-0860

142

71
Illustration of various approaches to target replication
stress for cancer treatment

Targeting DNA Replication Stress for Cancer Therapy - Genes 2016, 7, 51; doi:10.3390/genes7080051

143

Targeted therapy

Principles of DNA inhibitor


monotherapy.

Tumor cells have disrupted one


DNA repair pathway resulting in
genomic instability.

The repair defect is partially


compensated for through the
activity of a second pathway.

The tumor is hyperdependent


on this second pathway, and a
specific inhibitor kills the
malignant cells but has little
affect on the normal cells.

144

72
Therapeutic targeting of PARP1 and DNA-PK for the treatment
of homologous recombination–defective cancer cells.

Clin Cancer Res; 20(23) December 1, 2014 - doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1165

145

Immunological effects of anticancer therapy.


the rationale for combining these agents with immunotherapy to achieve superior therapeutic effects.

Lorenzo Galluzzi et al. Cancer Immunol Res 2016;4:895-902


©2016 by American Association for Cancer Research

146

73