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• Attività 3’ → 5’ esonucleasi
Correzzione di bozza (proofreading)
1
Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani - Biologia molecolare - 2018 (c) CEA
2
TIPI DI DANNO A CARICO DELLE BASI
Tutte le 4 basi del DNA (A, T, C, G) possono essere modificate
covalentemente in varie posizioni
• Ossidazione
• Deaminazione
• Alchilazione
Deaminazione spontanea
Centinaia di uracile per genoma /giorno
Adenina → ipoxantina
Gunanina → Xantina
5-metil-citosina → Timina
3
Deaminazioni
4
La deaminazione della citosina genera un G-U mismatch
La U è facile da riconoscere (non fa parte del DNA)
▪ Radiazioni ultraviolette,
specialmente i raggi UV-C
(~260 nm) che sono fortemente
assorbiti dal DNA e le radiazioni a
lunghezza d’onda maggiore, i raggi
UV-B, che possono attraversare la
fascia di ozono atmosferico
10
5
AGENTI CHE DANNEGGIANO IL DNA
▪ I radicali dell’ossigeno, specie chimiche
altamente reattive prodotte durante la
normale respirazione cellulare o altre vie
biochimiche
2,6-diamino-
8-hydroxyguanine 4-hydroxy-
5-formamidopyrimidine
12
6
OSSIDAZIONE DELLE BASI
13
hypochlorous acid
alkylation
14
7
In the Liver
15
Aflatossine
composti prodotti da alcune
specie di funghi.
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8
DANNI DA RADIAZIONE UV
7°-9° 44°
bending bending
17
MUTAZIONI A CARICO
DELLE BASI
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9
Mutazione per deaminazione
19
Guanosina
Metil-
Guanosina
Mutagenesi da alchilazione
20
10
Mutazioni da depurinazione
21
22
11
MUTAZIONI PUNTIFORMI
• Appaiamenti sbagliati (mismatches) tra le basi a causa di errori
da parte della DNA-polimerasi durante la replicazione del DNA
• Transizioni / Trasversioni
23
24
12
25
Transizione
26
13
MUTAZIONI
• Mutazioni che producono cambiamenti fenotipici:
– Gain of Function
27
28
14
DANNI A CARICO DEL DNA
% of total daily
TYPE OF DAMAGE events/cell/day
damage
Single-strand break 120000 50.9
N7-MethylGuanine > 4000 35.6
Depurination > 10000 10.2
O6-MethylGuanine 3120 1.3
Oxidized DNA 2880 1.2
Depyrimidation 1320 0.5
29
30
15
IMPORTANZA DEI MECCANISMI DI
RIPARO DEL DNA
31
32
16
33
34
17
Inversione del danno – riparazione diretta
35
FOTOLIASI
Cromoforo: FADH e MTHF (5,10-metenil-tetraidrofolato)
o 8-HDF (8-idrossi-5-deaza-riboflavina)
~385 nm
36
18
MGMT
O-6-methylguanine-DNA methyltransferase
La O6-methylguanine-DNA methyltransferase o
DNA-O6-methylguanine:protein-L-cysteine S-methyltransferase
(EC 2.1.1.63)
è un enzima di riparo unico presente in molti organismi e
codificato dal gene ada.
37
DIOSSIGENASI (ABH2)
Dealchilazione ossidativa di alcune basi attraverso l’azione
dell’enzima ABH2 (AlkB)
α-chetoglutarato / O2
1-metil-adenina adenina formaldeide,
3-metil-citosina citosina succinato e CO2
α-chetoglutarato / O2
1-etil-adenina adenina acetaldeide,
succinato e CO2
38
19
LIMITI DEI MECCANISMI DI
RIPRISTINO DIRETTO
La fotoriattivazione mediante radiazioni UV non rappresenta un
valido meccanismo naturale.
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40
20
BASE EXCISION REPAIR (BER)
Rappresenta uno dei sistemi di riparo più attivi
e 5 step di reazione
41
42
21
DNA N-GLICOSIDASI UMANE
43
44
22
DNA N-GLICOSIDASI BIFUNZIONALI
4-oxo-2-pentenale
45
DNA-glicosidasi monofunzionali
DNA-glicosidasi bifunzionali
46
23
MECCANISMO BER
47
48
24
Nature Reviews Molecular Cell Biology 13, 659-671 (October 2012)
49
50
25
NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER)
51
52
26
LESIONI RIMOSSE DAL SISTEMA DI
RIPARO NER
Il sistema di riparo NER è in grado di rimuovere anche:
• addotti chimici voluminosi a carico delle basi come quelli
prodotti dagli idrocarburi policiclici aromatici (fumo di sigaretta)
53
54
27
Prokaryotic NER pathways
Global genome repair (GG-NER),
•the genome is scanned by the heterotetrameric UvrA 2–UvrB2 complex → search
for damaged nucleotides causing large conformational changes.
55
Protein structures in
FIGURE 1
56
28
PROTEINE DEL SISTEMA DI RIPARO NER
EUCARIOTI
57
Successivamente il
complesso iniziale viene
sostituito dal TFIIH
contenente le due attività
elicasi XPB e XPD
58
29
STADI INIZIALI DEL TR-NER
Nel Transcription Coupled
NER (TR-NER) lo step
iniziale è lo stallo del
complesso della RNA-
polimerasi II associata
alle proteine CSA e CSB
59
Excissione
dell’elica
contenete il
danno
endonucleasi
XPG (sito 3’)
Sintesi di
riparo con
PCNA
RFC
DNA-pol δ/ε
RPA
DNA-ligasi
60
30
DIFETTI NEL SISTEMA DI RIPARO NER
• riconoscimento
iniziale
• DNA-binding
• Elicasi
• Elicasi
• endonucleasi 3’
• endonucleasi 5’
61
Eukaryotic Nucleotide
Excision Repair
https://www.youtube.com/watch?v
=o-qMG6ffxUU
62
31
MISMATCH REPAIR (MMR)
Meccanismo che riconosce danni a carico del DNA che causano
63
Tautomeria e
mutazioni mismatch
64
32
SISTEMA DI RIPARO MMR IN E.Coli
MutS riconosce i punti di mismatch
MutL stabilizza il complesso
MutH riconosce il DNA emimetilato
65
66
33
Mismatch repair in E. coli
https://www.youtube.com/watch?v
=p3MXIKWAi2w
67
68
34
International Journal of Biophysics - p-ISSN: 2168-4979 e-ISSN: 2168-4987
2013; 3(1A): 18-38 - doi:10.5923/s.biophysics.201311.03
69
70
35
Figura 7.8 Mismatch repair (MMR) negli eucarioti.
71
72
36
Correzione di scivolamenti nella replicazione di regioni con ripetizioni in tandem
(DNA microsatellite)
Tendenza della polimerasi a scivolare sullo stampo copiando più volte la stessa regione
(causa di polimorfismo e di patologie: distrofia muscolare, X fragile, malattia di Huntington
estensione della tripletta CAG che codifica per la glutamina)
73
RIPARO MMR
https://www.youtube.com/watc
h?v=HYS6EKnQcv0
74
37
DIFETTI NEL SISTEMA DI RIPARO MMR
Hereditary non-polyposis colon cancer (HNPCC)
• forma di cancro al colon caratterizzata dalla insorgenza in età precoce
e dalla ereditarietà autosomica dominante
• frequentemente associata con difetti nei geni codificanti MSH2 (35%
dei casi) e MLH1 (circa 60% dei casi)
• MSH2 e MLH1 sono essenziali per la formazione di eterodimeri
funzionali di MutS e MutL
• saltuariamente associata con difetti in altri geni del sistema di riparo
MMR (MSH6, PMS2 e PMS1), conseguenza della ridondanza di questi
ultimi geni che li rende singolarmente non essenziali per il MMR
La HNPCC è quasi sempre associata con difetti nella riparazione del DNA
evidenziate nella "instabilità del DNA microsatellite" (microsatellite
instability o MIN) rappresentata da variazioni nel numero delle unità di
sequenza ripetute [An, (GGC)n, (CA)n]
75
In condizioni di stress la lesione del DNA viene ignorata e copiata dalla Pol V
76
38
Sintesi translesione del DNA:
DND-Pol δ si stacca
77
TRANSLESIONAL SYNTHESIS
78
39
Figura 7.9 Meccanismi di tolleranza al danno (PRR, Post-Replication Repair) negli eucarioti.
79
Replicazione trans-lesionale
(o “soggetta ad errori”)
https://www.youtube.com/watch?v=wnlQl-UCC3I
https://www.youtube.com/watch?v=PgzkXJO0WrQ
80
40
DNA polimerasi
81
82
41
STRAND-BREAK REPAIR
83
STRAND-BREAK REPAIR
Le rotture nella singola elica vengono riparate
attraverso un solo tipo di meccanismo
84
42
SINGLE-STRAND BREAKS REPAIR (SSBR)
Le rotture nella singola elica vengono riparate attraverso un meccanismo
comune al sistema di riparo BER (short-patch BER)
PARP riconosce
le interruzioni
XRCC1 ha le
funzioni di
proteina scaffold
La PNK
Polinucleotide
kinasi/3’-
fosfatasi prepara
le estremità
La DNA
polimerasi β
riempie
l’interruzione
La DNA ligasi 3
unisce le
estremità
85
FORMAZIONE DI DSBs
Formazione dei DNA double-strand breaks (DSBs). I DSBs doppi (two-ended) possono
formarsi quando il DNA duplex è rotto in due frammenti, ad esempio a causa di radiazioni. I two-
ended DBSs possono essere riparati attraverso la homologous recombination (HR) usando i
cromatidi fratelli intatti, oppure attraverso la non-homologous DNA end-joining (NHEJ) che però
può portare ad un riarrangiamento della sequenza.
I DSBs singoli (one-ended) si generano quando la forca di replicazione incontra un single-strand
DNA break che non è stato riparato. In questo caso la homologous recombination tra i cromatidi
fratelli affiancati nella forca di replicazione è il meccanismo di riparo preferito e più accurato.
86
43
NON-HOMOLOGS END JOINING (NHJE)
Le rotture nella doppia elica possono essere riparate attraverso un
meccanismo diretto che prevede l’unione dei due frammenti di DNA
La proteina Ku Se è necessaria una modifica
(eterodimero delle estremità,
Ku70/Ku80) si lega DNA-PK attiva Artemis che
alle estremità del agisce come endonucleasi
DNA e richiama la processando le estremità del
DNA-PKcs (DNA- DNA e generando dei
dependent protein filamenti a singola elica che
kinase catalitic possono appaiare
subunit) formando
l’enzima DNA-PK Possono
(MNR complex) intervenire
altre attività di
DNA-PK promuove processamento
la giustapposizione come la TdT e
delle estremità le Pol o Pol
delle due molecole
di DNA e, se non è
necessario un loro
processamento,
richiama i fattori
addizionale per la
ligazione.
87
NHJE
88
44
LINFOMA DI BURKITT
Il linfoma di Burkitt è un tumore dei linfociti B.
Nella parte maggior parte dei casi di linfoma di Burkitt (>90%) si
osserva una traslocazione del proto-oncogene c-myc
→dalla sua posizione normale sul cromosoma 8
→ad una posizione adiacente all’enhancer del gene della catena pesante
delle immunoglobuline G situato sul cromosoma 14
C-myc è un fattore
essenziale nella
regolazione della mitosi
cellulare e la sua
sovraespressione rende la
cellula tumorale
89
90
45
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA (CML)
Le leucemia sono proliferazioni incontrollate dei leucociti e la leucemia
mieloide cronica (CML) colpisce cellule staminali emopoietiche precursori
dei granulociti e dei macrofagi.
Molti casi di CML sono associati ad una traslocazione tra la regione
terminale del cromosoma 9 ed il cromosoma 22 con la formazione di un
cromosoma 22 piccolo detto cromosoma Philadephia
Il proto-oncogene c-abl si fonde con
il gene bcr.
Il prodotto BCR-ABL è una tirosina
kinasi costitutivamente attivata che
stimola risposte cellulari
normalmente sotto il controllo del
PDGF (platelet-derived growth
factor) provocando una mitosi
incontrollata ed una inibizione
dell’apoptosi
L’imatinib
mesilate
(Gleevec®) è
un inibitore
dell’attività
kinasi di ABL
91
92
46
LEUCEMIA DELLE CELLULE-B
Le cellule B hanno un tempo di vita limitato e vanno spontaneamente
incontro ad apoptosi dopo che è terminata la risposta immunitaria
La sovraespressione del
gene bcl-2 protegge la
cellula nei confronti
dell’apotosi prevenendo
l’azione delle caspasi e
rendondo la cellula
tumorale
93
94
47
Apoptosis signaling and BCL-2 pathways
95
96
48
HR
Strand resection:
Generazione di 3’ ssDNA tails
da parte del complesso MRN
(Mre11, Nbs1 e Rad50)
Coating:
RPA (ssDNA binding) copre il
tratto ssDNA
RAD loading:
Rad51 ed altre proteine
(Rad52, Rad54, BRCA-1 e
BRCA-2) formano un
complesso che promuove
l’invasione e l’appaiamento
con la sequenza omologa non
danneggiata
97
HR
non-crossover (NCO)
98
49
HR verso NHEJ
(G1)
(G2)
99
NHEJ verso HR
Modello di riparazione delle double-strand breaks (DSB): NHEJ verso HR
100
50
Non-homologous end joining
https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw
Non-homologous End Joining in Class Switch Recombination (IgG)
https://www.youtube.com/watch?v=ECeEyVxKFT8
101
102
51
Figura 7.11 La risposta cellulare a danni al DNA attiva il checkpoint.
103
Figura 7.12 Reclutamento dei “sensori” del checkpoint da danno vicino alle lesioni.
104
52
Figura 7.13 Il checkpoint da danno al DNA è una cascata di trasduzione del segnale.
105
Protein fosfatasi
Figura 7.14 Il checkpoint da danno al DNA agisce su p53 e Cdc25 bloccando l’entrata in mitosi.
106
53
DNA DSB repair signaling pathways through the apical
(DNA damage–response) DDR kinases.
CHK2 serves to inhibit cyclin-dependent CHK1 is the best described substrate of ATR, and once
kinase (CDK) activity through the activated by ATR, CHK1 serves to inhibit cyclin-
phosphorylation of CDC25. is a critical dependent kinase (CDK) activity through the
regulator of the G1–S and intra-S phosphorylation of CDC25A. As such, CHK1 is a critical
regulator of the G2–M and intra-S cell-cycle checkpoints
Jessica S. Brown et al. Cancer Discov 2017;7:20-37
©2017 by American Association for Cancer Research
107
Figura 7.15 Mutazioni in un gene coinvolto nella riparazione del DNA aumentano l’instabilità dell’intero genoma.
108
54
Predominant DNA repair pathways
109
110
55
Predominant DNA repair pathways
111
Farmaci antivirali
112
56
Nucleosidi purinici modificati allo zucchero
(nucleosidi aciclici)
Aciclovir :
[9-(2'-idrossietossimetil)guanina], usato
come tale o sottoforma di sale sodico.
Agisce sulla DNA polimerasi virale.
Struttura zuccherina profondamente
modificata. L'aciclovir è un nucleoside ad
ampio spettro e a grande selettività.
113
HN C O (CH 2)4 CH 3
O
F
F N
O HN
O N
F O
HN N
HOH 2C O H3 C O
N
O H
HO OH OH
Fluorouracile Floxuridina Capecitabina
NH2 NH2
N N
O N O N
HOH 2C O HOH 2C O
HO F
HO HO F
Citarabina Gemcitabina
114
57
Nucleosidi derivati dall’ adenina
NH2
O
N
N N
HN
O
N
N N
HO N
HO P O
O O
H OH OH H OH
HO H HO H
NH2
I
N
O N
HO
O
H F
HO H
FIAC (5-iodo-1(2’-deossi-2’-fluoro-
D-arabinosofuranosil)citosina
116
58
Nucleosidi pirimidinici modificati allo zucchero
CH3
HN
O N
HO
O
H F
HO H
FMAU 1(2-deossi-2-fluoro-
D-arabinofuranosil)timina
Attivo contro HSV-1; HSV-2; citomegalovirus;
Inibisce DNA polimerasi
117
FARMACI
Antimetaboliti
• 5-fluorouracil
• 6-tioguanine
Alchilanti
• N-methyl-N-nitrosourea (MNU)
• N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)
• 1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourea (CCNU)
• Mitomycin C
Platino
• Cis-diamminedichloro-platinum
• Oxaliplatin
Inibitori topoisomerasi
• Camptotecin (CPT)
• Etoposide (ETP)
118
59
ANTIMETABOLITI
Analoghi di nucleosidi incorporati nel DNA - danno
Gemcitabine* Cytarabine
119
5-Fluorouracil
• Fluorouracil (5-FU or f5U)
(sold under the brand names
Adrucil, Carac, Efudix,
Efudex and Fluoroplex) is a
drug that is a pyrimidine
analog which is used in the
treatment of cancer.
120
60
Analoghi delle pirimidine (fluorouracile)
Il 5-Fluorouracil viene attivato a 5-F-dUMP attraverso la reazione di recupero delle
basi pirimidiniche e inibisce la timidilato sintasi (TS) che metila dUMP a dTMP
(formazione di un intermedio covalente TS-FdUMP-N5,10-MTHF.)
5-FdUTP può inoltre essere incorporato nel DNA al posto di dUTP.
5-Fluorouracil + deoxyribose-1-phosphate
pirimidina fosforilasi (T
5'-deoxy-5-fluorouridine (5'-DFUR)
uridina kinasi
fluoro-deoxy-uridine monofosfato (5-F-dUMP)
121
5-Fluorouracil metabolism
5-FUTP può agire da inibitore
Effetti su DNA
- TS inhibition da 5-FdUMP
- 5-FdUTP può essere incorporato nel DNA
al posto di dUTP.
Effetti su RNA
- 5-FUTP Incorporato nel RNA al posto di
UTP.
122
61
Mechanism of thymidylate synthase
inhibition by 5-fluorouracil
TS
123
Capecitabine
esterasi
5'-deoxy-5-fluorocytidine (5'-DFCR)
citidina deaminasi
5'-deoxy-5-fluorouridine (5'-DFUR)
timina fosforilasi
5-fluorouracil
124
62
Modulation of 5-fluorouracil activity
diidropirimidina deidrogenasi (DPD): Capecitabine
• enzima chiave coinvolto nel catabolismo del esterasi
5-fluorouracile (5-FU)
5'-deoxy-5-fluorocytidine (5'-DFCR)
• responsabile della degradazione di questo analogo citidina deaminasi
pirimidinico al suo metabolita inattivo diidrofluorouracile
(DHFU)
5'-deoxy-5-fluorouridine (5'-DFUR)
timina fosforilasi (TP)
5-fluorouracil
125
126
63
ANTIMETABOLITI
127
6-MP viene
convertito in
ribonucleotide e
inibisce la reazione
che converte
inosina in adenina
128
64
Cytidine Analogs
Mechanism of action
Cell cycle phase specific
undergoes phosphorylation to form
arabinosylcytosine triphosphate (ara-CTP), which competes with the
normal substrate deoxycytidine 5’-triphosphate (dCTP), in the inhibition of
DNA polymerase
129
ANTIMETABOLITI
Idrossiurea [Onco Carbide®]
Utile in chemioterapia
130
65
ALCHILANTI
NITROSOUREE
Temozolomide Procarbazine
Cyclophosphamide
131
ALCHILANTI
132
66
ALCHILANTI
Main effect is on DNA synthesis with most
cytotoxicity to rapidly proliferating cells
133
Ciclofosfamide
Alchilante bifunzionale
134
67
Meccanismo d’azione di alchilanti bifunzionali
Gli agenti alchilanti agiscono trasferendo un gruppo alchilico all’N7 dei residui di
guanina del DNA attraverso la formazione di un carbanione o lo ione etileneimmonio.
135
ALCHILANTI
• Mechanism of action
– act as bifunctional alkylating agents following metabolic
activation and formation of mustards
– mustards react with the N7 atom of purine bases
(guanine)
– these DNA adducts go on to form cross-links through
reaction of the second arm of the mustard
– prevent cell division by cross-linking DNA strands
– intra- and interstrand cross-links
– cell continues to synthesize other cell constituents, such
as RNA and protein, and an imbalance occurs and the cell
dies
– if these modifications in the nucleic acid structure are
compatible with cell life (after DNA repair), mutagenesis
and carcinogenesis result
136
68
PLATINO
Mechanism of Cisplatin
https://www.youtube.com/watch?v=UpfPiccg3Do
The Mechanism of Cisplatin (New -HD)
https://www.youtube.com/watch?v=Wq_up2uQRDo
How anticancer drugs work - Molecular mechanism of action of cisplatin
https://www.youtube.com/watch?v=5Jhva54oMJ8
137
OXALIPLATIN
138
69
Methotrexate
• Mechanism of action
– Folic acid analog
– Cell cycle specific (S-phase)
– Inhibits dihydrofolate reductase, depleting
intracellular pools of tetrahydrofolate
which is essential for purine and
thymidylate synthesis (DNA synthesis)
139
140
70
Anthracyclines are drugs extracted
from Streptomyces spp
The explanations of cytostatic and cytotoxic actions of anthracyclines point to
by many different mechanisms including free radical formation, lipid
peroxidation, direct membrane effects, and enzyme interactions.
The following elucidates some of these theories:
•Enzyme interaction
The most widely accepted explanation for the action of anthracyclines is their
interaction with topoisomerase-II. The ternary complex thus formed
prevents the re-ligation of the ds DNS breaks. Subsequently, it promotes
growth arrest and apoptotic cell death.
•DNA intercalation
Anthracyclines have a chromophore moiety that has an intercalating function
and inserts between adjacent base pairs of DNA when localized to the nucleus
of the cell; this inhibits DNA and RNA synthesis especially in highly replicating
cells blocking cell division.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK538187/
141
142
71
Illustration of various approaches to target replication
stress for cancer treatment
Targeting DNA Replication Stress for Cancer Therapy - Genes 2016, 7, 51; doi:10.3390/genes7080051
143
Targeted therapy
144
72
Therapeutic targeting of PARP1 and DNA-PK for the treatment
of homologous recombination–defective cancer cells.
145
146
73