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EFFETTI A LIVELLO AUTOECOLOGICO

Risposta di un individuo ad una sostanza tossica

Stabilità delle
funzioni
determinata da
autoregolazione
Risposta di una popolazione ad una sostanza tossica
EFFETTI DELLE SOSTANZE TOSSICHE

GENETICO
LIVELLO BIOCHIMICO MOLECOLARE

LIVELLO CELLULARE
PRODUZIONE RISPOSTE
LIVELLO DI ORGANO

LIVELLO ORGANISMICO
DEFINIZIONE

BIOINDICATORI
STATO DI SALUTE VALUTAZIONE
BIOMARKERS
IMPORTANZA DEL LIVELLO BIOCHIMICO

Gli effetti ‘macroscopici’ delle sostanze tossiche, osservabili a livello di


individuo hanno origine dall’interazione tra molecole

Di solito la sequenza di meccanismi attraverso cui l’effetto a livello


biochimico si traduce in un effetto macroscopico non è conosciuta in
modo completo

Lo studio dei meccanismi biochimici non fa parte


dell’ecotossicologia in senso stretto ma:

-è importante per illustrare il legame tra diversi livelli di


organizzazione biologica

-fornisce strumenti utili per la valutazione della tossicità e della


qualità ambientale
EFFETTI: I COMPOSTI GENOTOSSICI
Alcuni IPA formano legami
covalenti con il DNA (addotti)

-devono prima essere ‘attivati’ dalle


monoossigenasi
-riparazione (vedi figura)

Se non vengono eliminati:


-introducono errori quando il DNA viene
duplicato
-mutageni, cancerogeni, teratogeni

Una nucleasi è un enzima capace di


idrolizzare i legami fosfodiestere
fra le subunità nucleotidiche degli
acidi nucleici (taglia-incolla)
EFFETTI A LIVELLO
MOLECOLARE
Due sono i principali meccanismi tramite cui le sostanze xenobiotiche
agiscono e alterano le interazioni molecolari e la normale attività
biochimica cellulare

Inibizione
Competizione

eccone degli esempi....


INIBIZIONE ENZIMATICA

Eggshell thinning in Falcus sparverius

per inibizione di Ca2+-ATPasi


in relazione alla esposizione
a DDT e DDE wild (Ithaca, NY)

captive exposed to DDT

da Lincer, 1975
Altro caso di studio....

Riduzione della AminoLevulinicAcidDehydrase activity


nel Germano reale (Anas platyrhincos) in relazione alla
concentrazione di Pb nel sangue
<

da Peakall, 1992
La biosintesi del gruppo eme, essenziale per la produzione di
emoglobina avviene nelle cellule del midollo. Il Pb interferisce con tre
enzimi coinvolti in questo processo: stimola l’enzima mitocondriale acido
L-aminolevulinico sintetasi (ALAS); inibisce l’enzima citoplasmatico
acido L-aminolevulinico deidratasi (ALAD), con conseguente accumulo di
acido L-aminolevulinico (ALA) nel sangue, nel plasma e nelle urine

il Pb induce anemia in parte dovuta a ridotta sintesi dell’eme ed


incorporazione del ferro nell’anello emato-porfirinico da inibizione degli
enzimi ALA-deidratasi ed eme-sintetasi, enzimi zinco dipendenti)

la terapia dell’intossicazione da piombo consiste nell’allontanamento


del metallo dall’organismo mediante chelanti(EDTA)
COMPETIZIONE
ENZIMATICA
Riduzione dell’attività
della AChE
in Zebra finch
dopo somministrazione
di fenitrothion

da Peakall, 1992
COMPETIZIONE:LE
NEUROTOSSINE
Le neurotossine rappresentano un esempio classico di competizione
enzimatica

Molti veleni hanno origine naturale:


- tetrodotossina (pesce palla)
- tossina del botulino (Clostridium botulinum)
- atropina (Atropa belladonna)
- nicotina (Nicotiana tabacum)
- piretrina (Chrysanthemum sp)

Sostanze di sintesi
- organoclorurati
- organofosforici
- carbamati
- piretroidi
Alcune sostanze possono competere con l’acetilcolina per il sito di legame
sul recettore della membrana post-sinaptica

Insetticidi organofosforici
-analogie strutturali con
acetilcolina
- competono per il sito
attivo della AChE
-il rilascio del prodotto è
più lento
L’analogia strutturale non è perfetta o riguarda solo alcune parti della
molecola [partial mimic]

Alcuni composti (tetrodotoxina) provocano la chiusura ritardata dei


canali del sodio nella membrana plasmatica dei neuroni

Altri composti si legano ai recettori per il GABA, impedendo il passaggio


dello ione cloruro

Il GABA
(acido Gamma-AminoButirico) è il principale neurotrasmettitore inibitore del SNC
EFFETTI: I VELENI
MITOCONDRIALI
Disaccoppiatori della fosforilazione ossidativa (2-4 dinitrofenolo):
permette il ritorno di H+ senza formazione di ATP

Rotenone, cianuro: non permettono l’instaurarsi del gradiente di H+


espletando una funzione antagonista
EFFETTI: ANTAGONISTI DELLA VITAMINA
K
La vitamina K ha un ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine per
la coagulazione del sangue

Serie ciclica di trasformazioni (ciclo della vitamina K). Durante il ciclo


le proteine della coagulazione vengono carbossilate ad opera della
vitamina K che nei passaggi successivi si riduce. La carbossilazione è
necessaria alla funzione della proteina

Rodenticidi anticoagulanti (Warfarina e simili)


- struttura molecolare simile alla vitamina K
- competono per il sito di legame
- impediscono la riduzione della vitamina k e quindi la carbossilazione
delle proteine della coagulazione

emorragia
ANTAGONISTI DELLA VITAMINA
K
Due forme di vitamina K

Warfarina
Il ciclo si ripete da 200 a
2000 volte al giorno negli
uomini

da acido glutammico ad acido


carbossiglutammico,
precursore della protrombina

Si blocca la riduzione!
EFFETTI: ESTROGENI E
ANDROGENI
Sostanze di sintesi immesse nell’ambiente con strutture molecolari simili
ad ormoni sessuali

In bacini di lagunaggio sono stati osservati pesci maschi con caratteri


femminili sia morfologici che biochimici (sintesi di vitellogenina).

L’effetto è stato attribuito al nonilfenolo

NB i pesci sono in qualche modo ‘predisposti’


-alcune specie hanno ermafroditismo proterandro
(prima maschio e poi femmina)
- spesso in gasteropodi marini in siti inquinati sono osservati imposex
(femmine con caratteri morfologici maschili come pene e vasi
deferenti)
EFFETTI: REAZIONI CON GRUPPI TIOLICI
DELLE PROTEINE

Mercurio e Cadmio sono tra i metalli più tossici

Si legano con i gruppi tiolici (-SH) delle proteine

I gruppi tiolici sono molto importanti nel determinare la struttura


terziaria delle proteine (ponti disolfuro)

La struttura terziaria delle proteine è fondamentale per la loro funzione


EFFETTI A LIVELLO CELLULARE

Porcellio scaber
Crostacea,
Isopoda

Dysdera crociata
Aracnida,Araneida
Nelle cellule dell’epatopancreas: tre diversi tipi di accumulo di metalli,
corrispondenti a tre diversi ‘percorsi’, cioè processi di immobilizzazione,
e detossificazione

percorso A: precipitazione di Ca e Mg (ma anche Zn e Pb) in forma di


fosfati;

percorso B: materiale ricco di zolfo, probabilmente prodotto del


catabolismo delle metallotioneine (Cu, Cd, Hg, Zn, Pb)

percorso C: transferrina ferritina emosiderina (Fe)

composto organico ferro-proteico che


rappresenta una delle forme di deposito del
ferro nei tessuti
Isopodi

percorso A nelle cellule di tipo S


e di tipo B

accumulo in corrispondenza di
membrane o attorno a granuli di
materiale di tipo B o C (granuli B/A e
C/A)

percorso B solo nelle cellule di


tipo S
granuli distinti; il materiale si
accumula senza essere mai eliminato

percorso C solo nelle cellule di


tipo B
granuli distinti; subiscono un
processo di lisi e liberano il loro
contenuto nel lume (eliminazione)
Ragni
Si formano granuli distinti per ciascun
tipo di percorso

-i tre tipi di granuli si formano tutti


all’interno di un solo tipo di cellule (cellule
digestive)

- le cellule digestive subiscono


periodicamente un processo di lisi e
liberano il loro contenuto nel lume
dell’epatopancreas

Gli isopodi possono accumulare elevate concentrazioni di metalli


(sequestratori)
I ragni che predano gli isopodi riescono a mantenere
concentrazioni molto più basse (regolatori)
EFFETTI A LIVELLO DI ORGANO
Alcune sostanze tossiche sono concentrate in specifici organi

- affinità fisico-chimica con tessuti


(ad es. xenobiotici idrofobi nei tessuti adiposi)

- meccanismi di immobilizzazione o detossificazione


(ad es. metalli nell’epatopancreas degli invertebrati Terrestri)

caratteristiche simili a sostanze coinvolte nella funzione di


specifici organi-tessuti (ad es. iodio radioattivo nella tiroide o lo
stronzio nelle ossa per il possedere caratteristiche simili al calcio)

Concentrazione critica nell’organo bersaglio


una sostanza si concentra in un organo

l’elevata concentrazione danneggia l’organo

effetti avversi anche se le concentrazione media a


livello di organismo è relativamente bassa

Epatopancreas isopodi terrestri

- meno del 10% del peso complessivo dell’animale


- più del 90% di Cd, Pb, Cu, Zn
su suoli contaminati nell’epatopancreas
sono state osservate [Zn] > 2% dw (weight dry)

- le cellule S vengono distrutte morte


- il Cd si accumula in fegato e reni dei
Mammiferi che provoca rottura delle cellule
del rene proteinuria
Il termine proteinuria indica la presenza di proteine
nell’urina.

Normalmente le proteine presenti nel sangue (globuline,


albumine ecc.), date le loro dimensioni, non riescono a
oltrepassare il filtro renale, ma in varie condizioni
patologiche che coinvolgono il rene ( conseguenti a reazioni
allergiche, a intossicazioni da farmaci o droghe ecc. o
glomerulopatie primitive) l’apparato di filtrazione del rene
stesso non è più in grado di trattenerle, consentendone la
perdita nelle urine.
DANNI
FUNZIONALI
Gli effetti dai livelli inferiori (es:biochimico) si ripercuotono spesso a livelli
funzionali maggiori, di organismo; ecco alcuni esempi

Inibizione e competizione enzimatica

DDT-DDE vs Ca2+-ATPasi (metabolismo Ca, egg thinning)


Pb vs ALAD (sintesi eme)
OPC vs AChEsterasi (funzionalità nervosa)
Budget energetico e riproduzione

costi di trasformazione, accumulo, escrezione


riduzione SFG (Scope for Growth)
riduzione successo riproduttivo
Fotosintesi
inibizione RuBPC e PEPC (Phosphoenolpyruvate carboxylases) da SO2
(inibizione dei processi di fosforilazione ossidativa nei cicli
fotosintetici)
inibizione funzionalità stomatica da Pb, Cd, Ni
inibizione trasporto elettronico da organofosfati
VARIAZIONE DEL BUDGET
ENERGETICO
Riduzione del SFG
in Arca zebra (Bivalvi)
in funzione della
distanza da un sito
di inquinamento
da metalli pesanti
e idrocarburi

Hamilton Harbour
(Bermuda)

Sito di inquinamento

da Widdows et alii, 1990


Riduzione della taglia dei figli in Gammarus sp (Crostacei) in funzione
dell’inquinamento da Zn

da Peakall, 1992
Ritardo riproduzione
in Bengalese finch (Uccelli)
in funzione dell’inquinamento
da DDT

da Peakall, 1992
INIBIZIONE FOTOSINTESI E
TRASPIRAZIONE NELLE
PIANTE

Effetto della somministrazione


di Pb nel mezzo di coltura
in piante di soia fotosintesi

traspirazione

da Bazzaz et alii, 1974, in Bullini


Effetto dell’esposizione a F
in piante di Pinus nigra
nei pressi di una fonderia

Assorbimento CO2 (mg h-1)

Clorofilla (mg g-1)


Clorofilla
CO2

da Keller, 1982, in Bullini

F (ppm)
DANNI FINALI INDOTTI DAGLI
INQUINANTI
Carcinogenesi: induzione tumorale

Mutagenesi: modificazioni ereditabili del DNA

Gli IPA del sedimento producono neoplasie epatiche e cutanee nei


pesci dei Grandi Laghi americani
La riduzione del 99% nell’uso di IPA (1981-87) ha ridotto del 75%
l’incidenza di questi tumori
Le neoplasie del fegato della sogliola (Parophrys vetulus) nel Pudget
Sound (UK) associate ad alti livelli di IPA e PCB

carcinogenesi e mutagenesi sono associate: su 175 sostanze


carcinogenetiche, il 90% sono anche mutagene

Esempi di composti xenobiotici carcinogenetici e mutageni:


IPA (benzo(a)pirene); composti alogenati alifatici (cloruro di vinile);
composti alchilanti (ciclofosfamide); metalli (Cd, Cr)
Teratogenesi: induzione di malformazioni

molti composti organoclorurati, organofosfati, PCB sono potenti


teratogeni negli Uccelli

l’erbicida trifluralin causa deformazioni vertebrali in molte specie


di Pesci
i PCB è causa di malformazioni scheletriche nei Rettili (tartarughe)

i PCB, esaclorobenzene e dieldrina causano malformazioni nell’


apparato riproduttore femminile (aborti) nei Mammiferi (Pinnipedi)

il TBT causa malformazioni nell’apparato genitale femminile dei


Gasteropodi
TIPI DI
RISPOSTA
a) Protettive

proteggono gli organismi dagli effetti avversi delle sostanze tossiche

es.: induzione delle monossigenasi microsomali


es.: induzione delle metallotioneine

b) Non protettive
non proteggono gli organismi dagli effetto avversi delle sostanze
tossiche; non necessariamente producono effetti avversi

es.: inibizione dell’acetilcolinesterasi


es.: formazione di addotti di DNA
RISPOSTE
PROTETTIVE
Diminuiscono l’intensità dell’interazione tra sostanza e siti d’azione

1) abbassano la quantità di sostanza presente all’interno dell’organismo


- metabolismo
- escrezione

2) segregando la sostanza tossica in modo che non possa interagire con i


siti di azione
-metallotioneine

3) riparano i danni delle sostanze tossiche


- enzimi per la riparazione del DNA
-proteine da stress

4) induzione di enzimi o altre proteine: attivazione gene aumento


della sintesi aumento della concentrazione intracellulare
aumento attività
5) induzione dovuta direttamente alla sostanza tossica
monossigenasi microsomiali (enzimi che metabolizzano le sostanze
tossiche)
- metallotioneine (proteine ricche di cisteina (-SH) che legano gli ioni
metallici (Cu2+, Cd2+, Hg2+)
- proteine che legano particolari composti organici

6) induzione in risposta ai danni provocati dalle sostanze


- enzimi per la riparazione del DNA
(attivate dalla formazione di addotti di DNA)
- proteine di stress
(gruppo eterogeneo, riparano danni cellulari)

Spesso chiamate heat shock proteins (hsp)


Sono state individuate per la prima volta come risposta a temperature
elevate
La loro sintesi viene indotta dai danni generati da diversi fattori di
stress, tra cui le sostanze tossiche.
Si tratta di un gruppo eterogeneo che comprende molte famiglie, in
genere indicate con una sigla che ne indica il peso molecolare
es: hsp60 (PM: 60 000), hsp70 (PM: 70 000), hsp90
Le hsp70 sono il gruppo di proteine da stress più conosciuto

Aiutano il corretto ripiegamento delle proteine, in particolare la


corretta struttura terziaria (forma tridimensionale), necessaria per la
specifica funzione proteica
Molte sostanze sono caratterizzate da proteotossicità, cioè capacità
di denaturare le proteine

Le hsp70 contrastano la denaturazione

Induzione delle hsp70


In presenza di proteine denaturate le hsp70 si legano alle catene
peptidiche non ripiegate

liberano la heat shock factor protein (hsf), cui normalmente sono


legate

l’hsf, liberato dalla hsp, va a legarsi a una regione del DNA detta heat
shock element

viene attivata la sintesi di mRNA per le hsp70


SPECIFICITÀ DELLA
RISPOSTA
Anche per quanto riguarda la diffusione tra diversi tipi organismi:
-risposte comuni a tutti o a molti organismi in quanto alcune molecole
o vie metaboliche sono comuni
- risposte esclusive di un gruppo più o meno ristretto di organismi

veleni mitocondriali eucarioti


organofosforici sistema nervoso animali
inibitori della fotosintesi vegetali
dimilin sintesi chitina artropodi

Risposte diffuse in ampi gruppi di organismi possono però variare di


molto la loro intensità
Ci possono essere differenze molto grandi tra ceppi diversi di una
stessa specie. Di solito differenze di questo tipo sono legate allo
sviluppo della resistenza alle sostanze tossiche (es popolazioni di insetti
resistenti agli insetticidi organofosforici)
L’acetilcolinesterasi dei ceppi resistenti può differire anche per un solo
aminoacido:
- sufficiente per modificare il sito attivo
- lega (e idrolizza) l’acetilcolina
- non lega gli organofosforici
EFFETTI DELLE SOSTANZE TOSSICHE

GENETICO
LIVELLO BIOCHIMICO MOLECOLARE

LIVELLO CELLULARE
PRODUZIONE RISPOSTE
LIVELLO DI ORGANO

LIVELLO ORGANISMICO
DEFINIZIONE

BIOINDICATORI
STATO DI SALUTE VALUTAZIONE
BIOMARKERS
Per biomonitoraggio si intende la rilevazione sistematica dello stato
dell’ambiente, in relazione a fenomeni di inquinamento, ottenuta
mediante la registrazione di variazioni a carico della componente biotica
del sistema

Dati i fenomeni di propagazione degli effetti, il biomonitoraggio può


utilizzare osservabili a livello di
• organismo
• popolazione
• comunità

Gli organismi usati nel biomonitoraggio sono detti bioindicatori


Bioindicatore è un organismo passibile di fornire informazioni
sullo stato di inquinamento di un sistema ambientale

Biomarker qualunque risposta rilevabile sul bioindicatore per la


quale sia dimostrata una relazione con l’esposizione ad un fattore
inquinante

Requisiti di un buon bioindicatore:


- risposte subletali nel range di concentrazioni oggetto di studio
- relazione nota dose-risposta di uno o più biomarkers
- abitudini sedentarie o poco vagili
- facilmente reperibile e identificabile
- adeguate conoscenze su anatomia, fisiologia ed ecologia della specie
- ad ampia distribuzione spaziale
- sufficientemente grande da permettere la manipolazione
- uniformità genetica e ciclo vitale adeguato
BIOMARKER
S
più precisamente:
..qualunque variazione biochimica, cellulare, fisiologica o
comportamentale che può essere misurata, dando evidenza di
esposizione e/o effetto ad uno o più composti inquinanti

Il ruolo del biomarker non è quindi quello di dare informazioni


quantitative sui livelli di esposizione di un organismo, ma di fornire
indicazioni sul suo “stato di salute”
BIOMARKERS: VANTAGGI E
LIMITI
1) risposta integrata nel tempo e nello spazio all’esposizione
complessiva
2) risposta integrata dell’insieme delle interazioni tossicologiche e
farmacocinetiche della miscela di composti a cui è esposto l’organismo
3) risposta immediata all’esposizione al tossico (ore-giorni), utile per
previsioni anche a lungo termine

Alcune reazioni enzimatiche subiscono variazioni legate a fattori come


età, sesso, stato ormonale ecc...importante dunque saper interpretare
le variazioni emerse, e fondamentale la conoscenza della fisiologia
dell’organismo durante tutto il ciclo vitale
STRATEGIE D’IMPIEGO

Caso 1
Si ignorano i composti, l’origine e la fonte della contaminazione; la durata
dell’esposizione non “storicamente” definita

I biomarkers permettono di:


-valutare se l’ecosistema in oggetto è effettivamente esposto a stress
chimico (biomarkers generali)
-individuare le principali classi di inquinanti in azione (biomarkers
specifici)
-valutare il danno potenziale sulle popolazioni e comunità (biomarkers di
effetto)
Caso 2
E’ nota, anche solo parzialmente, la natura, fonte e origine della
contaminazione; la durata dell’esposizione allo stress chimico è
“storicamente” definita

I biomarkers permettono di:


-individuare l’effetto tossicologico come integrazione spazio-temporale
-valutare se le popolazioni risultano esposte o meno a livelli di
contaminazione che eccedono le normali capacità di compensazione e di
riparazione dell’organismo (biomarkers di effetto)
-valutare il danno potenziale sulle popolazioni e comunità
Caso 3
Individuazione di specie potenzialmente a rischio in ambiente in cui è nota
la natura della contaminazione sia qualitativamente che quantitativamente

I biomarkers permettono di:


-valutare se le popolazioni che occupano posizioni a rischio nell’ecosistema
(es. Consumatori terminali) risultino esposte a livelli di contaminazione che
superino le normali capacità di compensazione e riparo
-l’individuazione della o delle specie più a rischio in funzione della diversa
suscettibilità agli inquinanti
-valutare il danno potenziale sulle popolazioni e comunità
BIOMARKERS: SIGNIFICATO
INTERPRETATIVO
Attraverso i biomarkers non otteniamo la valutazione quantitativa dei
livelli di tossico a cui l’organismo è sottoposto, ma la determinazione
del “livello di salute” in cui si trova

Al posto della curva “dose-risposta”, fondamentale in tossicologia,


abbiamo la più qualitativa “curva della salute”
Risulta fondamentale per operare in modo corretto:

- conoscere i livelli “normali” di ciascun biomarker misurato nelle


diverse specie

-scelta di biomarker con riproducibilità e sensibilità adeguata


-per inferire a livello di popolazione, individuare marcatori con peso
ecologico maggiore (che comportino un cambiamento della fitness,
cioè alterazioni della crescita, comportamentali, successo
riproduttivo, utilizzazione energetica ecc.)

Un individuo si trova in condizioni di salute quando la sua risposta cade


entro l’intervallo fiduciale del 95% ricavato dalla distribuzione di
riferimento
BIOMARKERS

Si hanno tecniche di tipo invasivo e non invasivo

Vantaggi dell’uso di biomarkers non distruttivi:

1) Analisi di un numero più ampio di individui senza produrre drastiche


riduzioni della popolazione nell’area di studio
2) Analisi sequenziali sullo stesso individuo per un lungo arco di tempo
3) Analisi anche su popolazioni ecologicamente rilevanti caratterizzate
da pochi individui
BIOMARKERS
di esposizione
I biomarkers possono essere:
di effetto

I BIOMARKERS DI ESPOSIZIONE sono risposte attive per lo più basate


sui sistemi di detossificazione o metabolizzazione. Forniscono informazioni
sul tipo di inquinanti cui l’organismo è esposto e sulla loro biodisponibilità.
Indicano che l’organismo è stato esposto a particolari categorie di sostanze

Non misurano un danno biologico


Non indicano se effettivamente ci sia stato un danno
dovuto all’esposizione

Indicano che una certa categoria di sostanze è presente e biodisponibile


nell’ambiente ed è potenzialmente in grado di determinare un danno, senza
per questo dare indicazione su reali effetti tossicologici
Esempi
- ioni metallici bivalenti metallotioneine
- composti organici idrofobi a PM < 800 monoossigenasi microsomiale
(citocromo P450)
I BIOMARKERS DI EFFETTO sono risposte che denotano uno stato di
sofferenza funzionale. Non ci informano necessariamente sulla natura
chimica dell’inquinante ma tuttavia evidenziano il danno subito
dall’organismo. Sono importanti per il loro carattere predittivo (es. danni
al DNA)

Indicano la presenza di un danno biologico e permettono di quantificarlo

Alcuni sono estremamente specifici, permettendo di risalire alla causa


-inibizione di ALAD effetto dovuto unicamente al piombo

-inibizione AchE da parte di carbammati e organofosforici

Altri sono molto generici


-riduzione SFG, lesioni epatiche, disordini immunitari, certi danni al DNA

- proteine di stress, stabilità lisosomiale (effetto dovuto a molte


sostanze diverse, ma anche a situazioni di stress diverse come anossia e
shock termico)
BIOMARKERS

I biomarkers generali sia di esposizione che di effetto vengono


applicati quando l’area in oggetto è contaminata da sostanze di
origine ignota

La generalità permette di valutare in prima battuta l’esistenza di


un rischio chimico

Successivamente, l’utilizzo di biomarkers più specifici permette di


determinare la classe molecolare degli xenobiotici, definire i
possibili effetti tossicologici, stabilire le misure preventive
TIPOLOGIE DI
BIOMARKERS
Possono essere utilizzati come biomarcatori:

• livelli di bioaccumulazione corporea


• risposte biochimiche
• risposte cellulari
• risposte fisiologiche Biomarkers funzionali
• risposte comportamentali

Utilizzati soprattutto per monitoraggio ambientale in sito

- su organismi naturalmente presenti nel sito di studio


su organismi appositamente introdotti nell’ambiente di studio (di
solito organismi sessili o confinati in ‘enclosures’)

- secondariamente misura della tossicità in laboratorio


Livelli di bioaccumulazione

Tutti gli organismi sedentari e non regolatori sono utilizzabili come


bioindicatori da livello di accumulazione (es. bivalvi, balani)

Il dosaggio può essere a carico dell’inquinante primario o di un suo


metabolita

Il dosaggio può essere fatto sull’intero individuo o (meglio) su organi


bersaglio

Per confronti tra aree o tempi diversi, i test di bioaccumulazione


devono tener conto degli effetti di taglia, stato funzionale, stadio
ontogenetico del bioindicatore
I molluschi bivalvi (spec. Mitili) possiedono determinate
caratteristiche (abitudine filtratoria, sessilità, scarsamente
regolatori, ampia distribuzione, facilità di raccolta, ciclo vitale
noto, adattamento alle condizioni di laboratorio) che li rendono
particolarmente idonei come bioindicatori di contaminazione
costiera ed estuarina

La scelta dell’organismo bioindicatore dipenderà dal tipo di


informazioni che vogliamo ottenere (ad es. in base a particolari
esigenze di conservazione di una determinata area o specie)

Es. il bivalve Adamussium colbecki è stato


ampiamente studiato e caratterizzato nei
valori basali e nelle risposte di numerosi
biomarkers utilizzabili per monitorare il
possibile impatto delle sempre crescenti
Adamussium colbecki
attività antropiche in antartide
Il primo programma “su vasta scala” di biomonitoraggio risale alla

metà degli anni ’80 (US EPA) per il monitoraggio delle coste

statunitensi: “mussel watch”

Il protocollo prevedeva:

• trapianto di molluschi bivalvi (spec. Mitili) da aree indenni a siti


di indagine (generalmente per 12 settimane).

• determinazione analitica dell’accumulo tissutale di vari tipi di


inquinanti: Idrocarburi Totali, IPA, PCB's Metalli, Pesticidi,
tensioattivi, etc.
Livelli di bioaccumulazione: casi di studio

Concentrazione corporea di Cu e Zn in Nereis diversicolor (Policheti)

in relazione
alla concentrazione
dei due metalli
nel sedimento
in estuari del Devon
e Cornwall

Bryan, 1976
Concentrazione corporea di Pb in Scrobicularia plana (Bivalvi)
in relazione alla concentrazione del metallo nel sedimento in
ambiente di estuario (SW England)

Luoma & Brian, 1978 in Moriartry, 1983


Concentrazione corporea di Pb e Cd
in Porcellio scaber (Isopodi)

in relazione alla densità


di traffico automobilistico
in varie aree di Innsbruck

Dallinger et alii, 1992


Concentrazione foliare
di metalli nel leccio (Quercus ilex)

in relazione alla densità di traffico


automobilistico in varie aree di
Napoli

Alfani et alii, 1989


DIGESTIVE GLAND REMAINING TISSUES
15
20
10
FROM FOOD 15
(shrimp exp
10
18 ng/l sw) 5
5

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Bioaccumulo 30

dell’esaclorobifenile 150

ng g-1 lipids
FROM 20
(PCB) in Sepia SEAWATER 100
(18 ng/l)
officinalis da acqua, 10
50

sedimenti e cibo 0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

15 80

FROM 10
60

SEDIMENTS 40
(30 ng/g dry wt) 5
20

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Danis et al. (2005) Time (d)
Accumulo di cadmio nelle
branchie del bivalve di
acqua dolce Lamellidens
marginalis lungo un
gradiente di inquinamento
nel fiume Ichhapore, West
Bengala, India

Lamellidens marginalis

Das and Jana (2003)


Accumulo di cadmio,
rame e mercurio nel
bivalve Donax trunculus
(Haifa Bay, Israel) in
funzione della taglia

Donax trunculus

Fishelson et al. (1998)


TIPOLOGIE DI
BIOMARKERS
Possono essere utilizzati come biomarcatori:

• livelli di bioaccumulazione corporea


• risposte biochimiche
• risposte cellulari
• risposte fisiologiche Biomarkers funzionali
• risposte comportamentali
BIOMARKERS
FUNZIONALI
Qualunque risposta funzionale facilmente rilevabile e la cui relazione
con un inquinante sia nota e consistente può essere utilizzata come
biomarcatore

I biomarcatori possono essere

• altamente specifici
• generici

la scelta degli uni o degli altri dipende dall’obiettivo del programma di


biomonitoraggio

• esposizione a singoli inquinanti o categorie omogenee


• valutazione di stress generale da inquinamento
Biomarkers Fattore inquinante

Alta specificità

Inibizione ALAD Pb
Inibizione AChE OPs
Imposex TBT

Media specificità

Livello delle MFO IPA, Insetticidi, Erbicidi


Livello delle MT vari metalli pesanti,
stress naturale

Bassa specificità

Scope for Growth + stress ambientale non antropogenico


Classificazione gerarchica di importanza
dei biomarkers funzionali
- Alterazioni del DNA -addotti
-modificazioni secondarie
-eventi irreversibili
-mutazioni

2) Risposte a livello di proteine -induzione MFO


-induzione MT
-esterasi
-proteine da stress

- Prodotti metabolici -porfirine

6) Variazioni a carico del sistema immunitario e ormonale

8) Alterazioni istopatologiche

6) Biomarkers non specifici e fisiologici


BIOMARKERS GENETICI

GENOTOSSICITÀ: capacità di una molecola di produrre danni al DNA

Alcune classi di contaminanti (Es. IPA, composti organoclorurati)


possono indurre alterazioni genotossiche dovute a:

-interazione diretta della molecola

-interazione di un suo metabolita Es. benzo[a]pirene

- formazione di ROS (Reacting Oxygen Species, radicali attivi


dell’O2)
Una sostanza genotossica può essere cancerogena se si verificano
alcuni steps:

- danni al genoma
- riparazione del DNA manchevole o incompleta
- mutazione che altera l’equilibrio tra proliferazione e morte cellulare
- insorgenza di formazioni cancerogene

Una mutazione nella linea germinale può indurre mutagenesi:


mutazioni ereditabili del DNA

In alcune condizioni di particolare vulnerabilità (es. fase


embrionale) si può avere teratogenesi: insorgenza di
malformazioni.
BIOMARKERS GENETICI
Sostanze capaci non solo di causare danni al DNA, ma anche di scatenare
alterazioni a cascata.
Vediamoli in ordine di importanza
Addotti Benzo(a)pirene

Il benzopirene ad es., si lega stabilmente al


DNA formando degli addotti.
Epossid.
Metodologie per identificazione
+ H2O
-metodo immunochimico (ELISA Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay ) Metodo usato in diagnostica e per studiare
interazioni antigene-anticorpo. Rilevazione del complesso antigene-anticorpo
attraverso enzimi specifici che fungono da marcatori. Epossid.
Viene quindi utilizzato per rilevare la presenza di un dato antigene
caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne è
probabilmente affetto

-metodo radiochimico (32P- postlabeling) DNA


la separazione degli addotti tramite cromatografia su strato BDPE
sottile bidimensionale
(benzo-a-pirene-
Biomarkers che individuano risposte di 7,8-diol-9,10-
tipo precoce epossido)
L'antigene è una molecola che può
legarsi a una specifica
immunoglobulina (anticorpo)
E' definibile quindi come qualsiasi
sostanza capace di produrre una
risposta immunitaria

Gli antigeni sono solitamente


proteine, ma possono essere di
qualsiasi natura chimica.

Essi si basano sull’utilizzo di antisieri specifici contro addotti del DNA o, più
genericamente, campioni di DNA modificati a seguito del trattamento con
cancerogeni vari. La sensibilità dei saggi immunoenzimatici può arrivare a 1 addotto
per 108 nucleotidi Questi tests sono affidabili, poco costosi e consentono l’analisi
contemporanea di diversi campioni (fino a 20 al giorno). Gli svantaggi includono la
necessità di grosse quantità di DNA
Modificazioni Se la presenza di addotti non è riparata, si creano
secondarie rotture nel DNA, con modificazioni strutturali
Metodologie di identificazione
- n° di fratture nel DNA
-test Cometa
- metodo della Alkaline Unwinding, indagine
spettrofotofluorimetrica che individua il n° di rotture
Eventi La generazione di modificazioni secondarie, se eccede le
irreversibili capacità di riparo dell’organismo, può causare fenomeni
irreversibili, come aberrazioni cromosomiche.
Metodologie per identificazione
test citologici quali:
- determinazione dei micronuclei
-sister-chromatide exchanges (SCEs)

Biomarkers che individuano risposte di tipo ritardato

Mutazioni L’ultimo stadio di alterazione è rappresentato da mutazioni


capaci di alterare la funzionalità del gene
Metodologie per identificazione
-attivazione dell’oncogene

Biomarkers che individuano risposte di tipo ritardato


ADDOTTI STABILI DEL DNA
I metaboliti di molti inquinanti formano addotti stabili con la
molecola del DNA.

La formazione di questi addotti è considerata un evento critico


per quanto riguarda la carcinogenesi

Questi addotti sono marcati radioattivamente con 32


P e
visualizzati con tecniche autoradiografiche

HPLC-fluorimetry (Leclercq et al, 1997)


immunochemical (Den Engelse et al, 1990)

Il principale vantaggio (almeno per i vertebrati) è che i dati


ottenuti possono essere direttamente correlati con l’effetto
dannoso (insorgenza di fenomeni di teratogenesi, mutagenesi e
carcinogenesi). Per gli invertebrati resta più un biomarker di
esposizione
Su contadini esposti a vari tipi di pesticidi

Le Goff et al. (2005)


Le Goff et al. (2005)

Media
periodo

Simbolo pieno: fumatori Fumatore


Oltre alle incertezze per quanto riguarda gli invertebrati, si ricorda che
la formazione degli addotti può essere anche:
- di origine naturale
- specie-specifica
- regolata da fattori endogeni indipendenti dalla presenza di contaminanti
MODIFICAZIONI SECONDARIE

Numero di fratture lungo la doppia elica


La molecola di DNA viene denaturata, “srotolata” in condizioni
alcaline e fatta reagire con un colorante fluorescente

Il numero di rotture è direttamente proporzionale alla velocità di


srotolamento. L’intensità della fluorescenza è diversa per le
rotture a singolo o doppio filamento.
TEST COMETA (Östling & Johansson , 1984)

Determina i danni al DNA a livello di una singola cellula, non di filamento di


DNA come il metodo precedente.

Non si deve estrarre il DNA

I nuclei cellulari vengono isolati e posti in un campo elettroforetico. Se il


nucleo è intatto esso migra compatto all’interno del campo altrimenti si ha
una migrazione differenziale che ci permette di osservare una scia, detta
“coda”.

La coda è tanto più lunga quanto più consistenti sono i danni al DNA
Metodologia
Una sospensione cellulare viene immobilizzata in un gel di agarosio.
Le membrane vengono lise e il nucleo isolato. Il preparato viene
fatto migrare in un campo elettroforetico.
Se il nucleo è intatto migra compatto all’interno del campo, se ci
sono danni ho una migrazione differenziale

A B Cellule di ratto
A: controllo
B: bassa dose micro-onde (2h) 

MOMENT TAIL= (|CGTail . CGHead|) × %DNATail 

Centro gravità Centro gravità


coda testa
Buona correlazione con la presenza di mutageni ambientali, ma si
riscontra anche una notevole variabilità intraindividuale

Recentemente si è evidenziato nei mitili come esistano livelli basali di


frammentazione del DNA, la cui presenza è influenzata da fattori
quali l’età, la stagione, la disponibilità alimentare...
TEST COMET-FISH

FISH: Fluorescence In Situ Hybridization

Nella sonda (probe) sono incorporate direttamente molecole


fluorescenti oppure sono presenti antigeni che possono essere
riconosciuti con anticorpi fluorescenti
La FISH è una tecnica mediante la quale una sonda colorata specifica
per un dato segmento di DNA viene ibridata con i cromosomi
metafasici, profasici o interfasici, e quindi visualizzata con un
microscopio a fluorescenza

La FISH si basa sulla proprietà del


DNA di fondersi in modo
reversibile e prevede il legame tra
una sonda molecolare (frammento
di DNA specifico per la regione di
interesse marcato con composti
fluorescenti) e la sequenza di DNA
complementare: la regione
cromosomica di interesse risulta
così facilmente individuabile ad un
microscopio a fluorescenza.
La FISH consente l’identificazione di piccole delezioni (perdita di
materiale genetico), traslocazioni e altri riarrangiamenti
cromosomici troppo piccoli per essere visti con le consuete
tecniche di bandeggio e colorazione dei cromosomi.
Il test comet-fish combina le due tecniche

Cromosoma non Cromosoma


danneggiato  danneggiato 

Permette di misurare il tasso di danneggiamento di una regione


specifica di DNA
ALKALINE UNWINDING TEST

Le membrane vengono lise in presenza di detergenti e alte


concentrazioni saline

La molecola di DNA viene “denaturata” (unwinding) in condizioni


alcaline.

Il DNA viene poi frammentato tramite applicazioni di ultrasuoni,


stabilizzato e separato per via cromatografica

Il numero di rotture è direttamente proporzionale alla velocità di


srotolamento.

In genere si valuta la frazione di dDNA rispetto al totale


(dDNA+sDNA).
Sul mitilo Perna viridis in relazione all’esposizione a benzo[a]pyrene

F=(auDNA-sDNA)/(dDNA-sDNA)

Perna viridis

Ching et al. (2001)


EVENTI IRREVERSIBILI

Frequenza di micronuclei (MN)

I MN rappresentano frammenti acentrici di cromosomi, o cromosomi


interi esclusi dal nucleo principale per errori avvenuti durante
l’anafase.

Nelle cellule in interfase appaiono come corpuscoli citoplasmatici di


forma rotondeggiante e chiaramente distinti dal nucleo principale.

Sono biomarkers di aberrazioni cromosomiche strutturali, e utilizzati


come test di screening aspecifici. 

Tecnica semplice che non richiede particolare abilità


Un micromucleo (MN) si forma in una cellula danneggiata durante
la transizione tra metafase e anafase.

Può derivare da un frammento cromosomico che contiene il


centromero (evento ANEUGENICO) oppure da un frammento
acentrico (evento CLASTOGENICO)
Integrando il test con la tecnica FISH si può distinguere tra
aneugenesi e clastogenesi
Vantaggi
- molto sensibile per riconoscere i danni al DNA
- rapido e di facile utilizzo
- sono sufficienti poche cellule
- è applicabile alla maggior parte delle cellule eucariote
- discriminazione tra eventi aneugenici e clastogenici (se integrato con
FISH)
- con esperimenti “in vitro” si può avere un’idea della capacità di
riparazione cellulare

Svantaggi
- non è sensibile a tutti i tipi di aberrazioni cromosomiche
- è necessaria la divisione cellulare
- può essere difficile risalire al tipo di mutazione
VALUTAZIONE DELLE ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Aberrazioni strutturali
Sono rotture del DNA osservabili con il microscopio ottico durante la
metafase.

Due classi principali:


a) chromosome-type aberrations: coinvolgono entrambi i cromatidi di
un cromosoma (radiazioni ionizzanti)
Es: cromosomi dicentrici, cromosomi ad anello
b) chromatid-type aberrations: coinvolgono solo uno dei due cromatidi
(> parte mutageni chimici)
Es: fratture, delezioni

Aberrazioni numeriche
Poliploidi (4n) ; Ipodiploidi(<n) ; Iperdiploidi (>n)
CROMOSOMA DICENTRICO

CROMOSOMA AD ANELLO
Vantaggi

- Sono sufficienti poche cellule

- Riconoscimento dei diversi tipi di mutazioni

Svantaggi

- Richiede coltivazione in vitro

- Richiede apparecchiature e competenze specifiche


SCEs (Sister Chromatid Exchanges)

Consiste in uno scambio di frammenti tra cromatidi fratelli


durante la fase S dell’interfase

I cromatidi vengono
differentemente colorati
ed evidenziati con
tecniche fluorimetriche

Si valuta la presenza di
“cromosomi arlecchino”
CASI DI STUDIO
TEST COMETA E FREQUENZA DEI MN

Test cometa e frequenza dei


MN sul mitilo Perna viridis in
relazione all’esposizione a
benzo[a]pyrene (B[a]P)

Olive Tail Moment= lunghezza


della coda × % di DNA migrato
nella coda rispetto a quello della
testa

Perna viridis 
Siu et al. (2004)
ADDOTTI DEL DNA e ALKALINE UNWINDING TEST
Sul mitilo Perna viridis in relazione all’esposizione a benzo[a]pyrene
(B[a]P)
Perna viridis

Addotti del DNA

Ching et al. (2001)


SCEs and Chromosome aberrations

-Ciclide Etroplus suratensis in relazione all’esposizione a

insetticidi organofosforici
SCE
-MP: Methyl Parathion

-PM: Phosphamidon Etroplus suratensis

Das and John (1999)


Chromosome aberrations

Das and John (1999)

FRAMMENTO

DELEZIONE
Classificazione gerarchica di importanza
dei biomarkers funzionali
- Alterazioni del DNA -addotti
-modificazioni secondarie
-eventi irreversibili
-mutazioni

2) Risposte a livello di proteine -induzione MFO


-induzione MT
-esterasi
-proteine da stress

- Prodotti metabolici -porfirine

6) Variazioni a carico del sistema immunitario e ormonale

8) Alterazioni istopatologiche

6) Biomarkers non specifici e fisiologici


BIOMARKERS A LIVELLO
PROTEICO
- INDUZIONE DELLE METALLOTIONEINE
(esposizione)
Si tratta di proteine citoplasmatiche a basso peso
molecolare, monomeriche e dimeriche, termostabili,
caratterizzate da un alto contenuto di cisteina, e
quindi ricche di gruppi –SH.

Questo le rende ottimi agenti chelanti


Struttura aminoacidica molto conservata, con similitudini maggiori tra
specie evolutivamente più vicine; presenti comunque in modo diffuso, sia
tra vertebrati che invertebrati

Inquinante: metalli pesanti


In particolare chelano metalli come Ag, Cd, Cu, Hg, Zn, che sono legati
all’interno di clusters con chiralità opposta

Ruolo fisiologico legato alla regolazione


intracellulare di metalli essenziali (Zn, Cu)
Sono inducibili, quindi la loro concentrazione è in rapporto con la quantità
di metallo

I vari tipi di metallotioneine sono specifici per i singoli metalli

Biomarker di esposizione, permette di inferire sulla presenza di metalli


nell’ecosistema e la loro biodisponibilità, non necessariamente sull’effetto
tossico di questa esposizione per l’organismo

Varie metodologie analitiche di quantificazione


- cromatografia a scambio ionico
- cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
- spettrofotometria UV-visibile a livello di
proteine
- ELISA
- saggi radioimmunologici
- polarografia
- titolazione dell’RNA messaggero a livello di espressione genica
Strumento che in questi anni si è rivelato utile e versatile, quindi
molto utilizzato

Porre comunque attenzione al fatto che:


-la presenza delle metallotioneine presenta fluttuazioni stagionali
dovute al ciclo riproduttivo

-presenza e induzione influenzata da glucocorticoidi (ormoni da stress,


prodotti dal surrene), condizioni di stress, ipossia, basse temperature
- PROTEINE DA STRESS
Proteine citosoliche, aumentano in presenza di stress di varia natura,
chimici, fisici, fisiologici

Si tratta di biomarkers generali di effetto, utili per valutare se


l’organismo è esposto o meno a situazioni di stress
Misurate con tecniche immunochimiche o elettroforetiche
- INIBIZIONE DELL’AChE (effetto)
Le esterasi sono una famiglia di proteine suddivisibile in due classi

Esterasi A Esterasi B
Attivate da insetticidi Inibite in presenza di insetticidi
organofosforici e organofosforici e carbammati
carbammati, sono responsabili
della loro detossificazione Tra queste abbiamo le esterasi
ematiche (Butyrylcholinesterase,
(esterasi A-tissutale; CbE) e le esterasi cerebrali (AChE)
carbossilesterasi)

Biomarker specifico di tipo inibitorio

Si può valutare in modo indiretto misurando l’aumento della


concentrazione di ACh a livello sinaptico

La AchE infatti è l’enzima responsabile dell’idrolisi dell’ Ach in colina e


acido acetico. L’inibizione di questa attività enzimatica porta ad un
incremento di ACh.
La risposta degli invertebrati marini sembra molto meno evidente e
caratterizzata rispetto ai vertebrati (pesci, uccelli)

L’enzima estratto dagli invertebrati marini mostra un’alta somiglianza


con quello dei vertebrati, ma grazie alla sostituzione di pochi residui
aminoacidi nella molecola, l’attività colinesterasica diventa insensibile
all’azione degli organofosforici e carbammati
- PROLIFERAZIONE DEI PEROSSISOMI
Inquinante: varie classi di inquinanti

Sono organuli cellulari contenenti enzimi (spec. catalasi) che


catalizzano la demolizione delle specie reattive dell’ossigeno

Sono in grado di autoreplicarsi e sono inducibili.

Sono delimitati da una membrana


singola e hanno un cuore cristallino
- INDUZIONE DELLE MFO (esposizione/effetto)
Inquinante: xenobiotici idrofobi

L’organismo può biotrasformare le molecole tossiche in modo da


renderle più idrosolubili e quindi più facilmente espellibili. 

Nella trasformazione degli xenobiotici idrofobi intervengono gli


enzimi MFO (mixed function oxidase) che appartengono alla
famiglia multienzimatica del citocromo P450.

Questi enzimi presentano, nella forma ridotta e complessata con


CO, un picco di assorbimento a 450 nm, da cui il nome

450 nm

400 450 500 nm


Sono inducibili e la risposta di induzione è abbastanza specifica
Es: gli IPA inducono la famiglia del citocromo P-450 1A; gli insetticidi
organoclorurati inducono la famiglia del citocromo P-450 2B

La loro attività è poco evidente negli invertebrati che utilizzano


sistemi enzimatici differenti
Attività dell’enzima 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) in esemplari
di Platycephalus bassensis provenienti da zone di Port Phillip Bay
(Australia) a maggiore (nord) e minore (sud) grado di inquinamento da PCB.

Platycephalus bassensis

MALE
Gagnon & Holdway (2002)
FEMALE
- MISURE DI FLUORESCENZA DEL CONTENUTO BILIARE DI PESCI

Inquinante: IPA

Dopo la trasformazione degli IPA da parte degli enzimi MFO i metaboliti


prodotti nel fegato vengono accumulati nella bile fino al momento
dell’escrezione

Gli IPA sono una classe di composti con forti proprietà di fluorescenza

Ciascun composto è caratterizzato da specifici picchi, in base dimensione,


alla struttura e alla presenza di sostituenti

Osservando la presenza-assenza e l’intensità di determinati picchi si


risale alla tipologia e alla concentrazione di esposizione

E’ un’analisi molto usata perché breve e poco costosa


Analisi fluorometrica della bile di pesci:
• Esposto a naftalene, pirene e benzo[a]pirene
• Proveniente da un ambiente inquinato da benzo[a]pirene
• Proveniente da un ambiente di controllo

90 Intensità Benzo[a]pirene
80
70
Pirene
60
50
Naftalene (b)
40
30 (a)
20
10
(c)
0
250 300 350 400 450 500

Lunghezza d’onda (emissione) (nm)

Aas et al. (2000)


Come metodo di screening, l’analisi fluorimetrica della bile presenta alcuni
vantaggi:
-elevata sensibilità
-possibilità di distinguere le principali classi di IPA (ad esempio se a 2 o 5
anelli aromatici)
-tecnica semplice, rapida, economica

svantaggi:
difficoltà di standardizzazione quantitativa del metodo poichè la bile può
per sua natura essere diversamente concentrata o ciclicamente escreta
anche in funzione del regime alimentare dell’organismo
- EFFICIENZA DEL SISTEMA ANTIOSSIDANTE

Il metabolismo aerobio degli organismi ha come conseguenza


inevitabile la formazione di molecole ossidanti molto reattive, in
grado di produrre gravi danni molecolari
Tra queste i ROS (specie reattive dell’ossigeno): O2-, H2O2, OH•, NO•

Gli organismi hanno evoluto un sistema antiossidante endogeno per


contrastare la loro azione

In caso di stress l’equilibrio può essere alterato per:


- aumento delle forze ossidanti (Es: contam. organici, metalli)
- riduzione delle difese

Si innescano un ciclo di reazioni a feed-back positivo


L’esposizione a diverse classi di inquinanti provoca un aumento nella
produzione di ROS:
Es:
contaminanti organici  O2-
metalli pesanti  OH•

In presenza di stress ossidativo si può avere induzione o inibizione dei


singoli componenti del sistema antiossidante

L’efficienza del sistema antiossidante si studia osservando:

1) livelli dei singoli componenti (enzimi scavenger, enzimi specifici e


vitamine liposolubili)
2) la capacità antiossidante totale (TOSCA)
LIVELLI DEI SINGOLI COMPONENTI DEL SISTEMA ANTIOSSIDANTE

-Enzimi scavenger

Si tratta di molecole a basso peso molecolare che reagiscono direttamente


con i radicali ossidandosi (coniugazione)
Si trovano nel citosol o legati alle membrane
I principali: superossido-dismutasi (SOD), glutatione perossidasi (GPX),
catalasi (CAT)

Le SOD sono metallo-enzimi, classificate a seconda del cofattore


metallico: ferro (Fe-SOD), manganese (Mn-SOD) e rame-zinco (Cu/Zn-
SOD). Esistono quindi molte forme diverse distinguibili per il cofattore
utile per la catalizzazione delle reazioni
Catalizzano quindi la dismutazione del superossido in ossigeno e
perossido di idrogeno. Si tratta quindi di un importante
antiossidante in quasi tutte le cellule esposte all'ossigeno

SOD 2O2- + 2H+  H2O2 + O2


CAT 2H2O2  2H2O + O2
GPX riducono perossidi organici e inorganici

Nell'uomo, sono presenti tre forme di superossido dismutasi. La


SOD1 si trova nel citoplasma, la SOD2 nei mitocondri mentre la
SOD3 è extracellulare. La SOD1 e la SOD3 contengono rame e
zinco, mentre la SOD2 ha manganese nel suo centro di reazione.
Il superossido è uno dei maggiori agenti ossidanti nella cellula e di
conseguenza, la SOD ha un ruolo antiossidante chiave. L'importanza
fisiologica delle SOD è visualizzabile dalle gravi patologie evidenti nei
topi modificati geneticamente per mancare di questi enzimi.
I topi mancanti della SOD2 muoiono pochi giorni dopo la nascita, a causa
del forte stress ossidativo.
Quelli cui manca la SOD1 sviluppano una gran varietà di patologie, tra cui
il carcinoma epatocellulare, un'accelerazione della perdita di massa
muscolare legata all'età, un'incidenza precoce della cataratta ed una
speranza di vita minore.
Quelli che mancano della SOD3 non mostrano nessun difetto evidente ed
hanno una normale aspettativa di vita.

Mutazioni nel primo enzima SOD (SOD1) sono state collegate alla Sclerosi
laterale amiotrofica familiare (ALS, una forma di malattia dei
motoneuroni).
- Enzimi specifici
Neutralizzano molecole specifiche

Es: le gliossalasi (I e II) sono metalloenzimi a base di zinco che


catalizzano l’inattivazione glutatione-dipendente del metilgliossale

O
HEMITHIOACETAL
CH3
H
O SD-
Metilgliossale
LACTOYLGLUTATHIONE

Il metilgliossale è una molecola glucosio-derivata che è prodotta in


eccesso nelle cellule danneggiate a causa della iperglicemia

Implicata nel processo patologico delle due maggiori complicanze del


diabete: retinopatia e insufficienza renale. E’ inoltre prodotta dal
- Vitamine
Sono le vitamine: A (retinolo), C (acido ascorbico), E (alfa-tocoferolo),
Cedono ai radicali l’elettrone mancante trasformandosi a loro volta in
radicali poco attivi facilmente neutralizzabili dagli enzimi cellulari
I risultati che otteniamo dall’analisi della quantità dei singoli
componenti del sistema antiossidante sono difficilmente
interpretabili 

Es:
- La quantità di glutatione perossidasi diminuisce in condizioni di stress
ossidativo
- Le catalasi si trovano ad uguale concentrazione in organismi della
stessa specie provenienti da siti a diverso grado di inquinamento.
-Le gliossalasi sono inducibili ma ad alte concentrazioni risultano
tossiche
CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE TOTALE TOSCA
[Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay]
Parametro quantitativo di efficienza complessiva dell’intero sistema
ossidante
E’ un biomarker molto utilizzato. Non presenta ambiguità.
Per determinare la TOSCA: si generano artificialmente diverse forme
di radicali liberi e si mettono in contatto con un substrato dalla cui
ossidazione si forma un prodotto noto (etilene). Inseriamo nel sistema
gli antiossidanti provenienti da un estratto citosolico, i quali reagiranno
con i radicali. Gli antiossidanti cellulari reagiscono piú efficacemente
del substrato con i radicali, e la produzione di etilene risulta
quantitativamente inibita.
La capacità antiossidante totale sarà rilevata in base alla diminuzione
del prodotto di ossidazione
In genere si osserva che gli organismi provenienti da un ambiente
inquinato hanno una TOSCA più bassa rispetto a quelli che derivano da
un sito “pulito”
Sono molto utili osservazioni integrate dei vari biomarkers
- DESTABILIZZAZIONE DEL SISTEMA LISOSOMIALE

I lisosomi sono organuli cellulari circondati da membrana. Contengono


enzimi (idrolasi), immagazzinati in forma inattiva, con funzione
digestiva e detossificante; regolano infatti l’omeostasi cellulare e
sono implicati nella difesa immunitaria e nella digestione
intracellulare.

Per svolgere la loro funzione l’integrità della membrana è


fondamentale. 

Molte sostanze tossiche sono in grado di danneggiare le membrane dei


lisosomi secondo un meccanismo che non è ben chiaro

Misura della stabilità lisosomiale


A questo proposito possono essere studiati diversi tipi di biomarkers
• Tempo di labilizzazione acida della membrana
• Grado di ritenzione del rosso neutro
• Grado di fusione lisosomiale
• Accumulo di lipofuscine

Metodi semplici, economici, rapidi


Le principali alterazioni lisosomiali sono accettati come biomarkers a
livello internazionale, e le metodologie di valutazione raccomandate da
i più importanti organi di controllo mondiale (WHO-FAO, UNEP,
OSPARCOM)

Questo perchè la destabilizzazione del sistema lisosomiale è un grave


tipo di alterazione, non recuperabile nel breve-medio periodo. Visto
l’importanza dei lisosomi a livello immunitario, una perdita di
funzionalità può determinare una compromissione generale dello stato
di salute dell’organismo e quindi una diminuzione tangibile della fitness
(successo riproduttivo, salute ecc.)
•Tempo di labilizzazione acida della membrana

Metodologia che si applica su cellule morte. Campioni fissati con


azoto liquido.

La membrana viene trattata con un acido per labilizzarla


artificialmente e renderla permeabile al substrato usato, posto
esternamente. Questo, entrando nel lisosoma, reagisce con gli
enzimi dando luogo ad un prodotto colorato.

Il grado di labializzazione è proporzionale al tempo di esposizione


all’acido, fino ad un livello massimo (max grado di colorazione)
oltre il quale la membrana si rompe.

Il tempo dopo il quale viene raggiunta la massima colorazione viene


detto tempo di labilizzazione.

Questo tempo è dipendente dallo stato di danneggiamento iniziale


del lisosoma.
•Tempo di ritenzione del rosso neutro (Neutral Red
Retention NRR)

Principio del metodo: capacità dei lisosomi di assorbire e trattenere il


rosso neutro (colorante cationico)

-cellule sane (citosol incolore)

-cellule danneggiate (citosol colorato)

I lisosomi (cellule vive) vengono incubati con un colorante lipofilico.


Si osserva il tempo di rilascio nel citosol. L’efficienza di ritenzione è
infatti è inversamente proporzionale al grado di danneggiamento della
membrana.
Rosso Neutro (esempio sui Lombrichi)

Tecnica invasiva

• con una siringa si prelevano i celomociti

• vengono immersi in una soluzione contenente il rosso neutro

• incubati su un vetrino

• osservati al microscopio

• a intervalli di tempo regolari si conta il numero di cellule con il


citoplasma colorato

ENDPOINT: tempo al quale il 50% delle cellule è colorato


Tempo di ritenzione del rosso neutro
•Morfologia dei lisosomi

L’aumento nelle dimensioni è stato osservato soprattutto nelle


cellule digestive dei bivalvi. La presenza dei cosiddetti “lisosomi
giganti” riflette uno scompenso a carico dei normali processi di
fusione dei componenti del sistema lisosomiale, indotta da
contaminanti sia chimici che metallici. I processi di fusione
sarebbero proporzionali al grado di danneggiamento della
membrana.
Anche l’incremento nel numero assume lo stesso significato.
•Accumulo di lipofuscine 
Le lipofuscine sono uno dei prodotti terminali della perossidazione
lipidica. Si tratta quindi di residui dell'ossidazione di lipidi e proteine.

Si tratta infatti di un accumulo granulare di molecole polimeriche non


degradabili dalle idrolasi lisosomiali nè eliminabili per esocitosi. Tali
granuli assumono solitamente una colorazione marrone e sono
prevalentemente composti di lipidi.

A livello lisosomiale, una eccessiva presenza di questo pigmento


(rilevabile con colorazione istochimica) è indice di aumentati processi
autofagici e di un danneggiamento della membrana legato
all’instaurarsi di condizioni di stress ossidativo
Attenzione: anche i parametri di funzionalità lisosomica sono sensibili a
fattori diversi dall’inquinamento chimico quali
-incremento della temperatura
-variazioni stagionali
-fase riproduttiva (durante la fase di emissione dei gameti, ad es. nei
mitili, si ha la degenerazione degli epiteli digestivi e una
destabilizzazione del sistema lisosomiale)

La presenza di lipofuscine è da sempre correlata all‘invecchiamento


NEUTRAL RED RETENTION

Tempo di ritenzione del rosso


neutro nei lisosomi degli emociti di
Perna viridis in funzione
dell’esposizione a Cu

Perna viridis 

Nicholson et al. (2003)


Classificazione gerarchica di importanza
dei biomarkers funzionali
- Alterazioni del DNA -addotti
-modificazioni secondarie
-eventi irreversibili
-mutazioni

2) Risposte a livello di proteine -induzione MFO


-induzione MT
-esterasi
-proteine da stress

- Prodotti metabolici -porfirine

6) Variazioni a carico del sistema immunitario e ormonale

8) Alterazioni istopatologiche

6) Biomarkers non specifici e fisiologici


BIOMARKERS DA PRODOTTI
METABOLICI
Gli inquinanti possono alterare il normale metabolismo di composti
endogeni, provocandone un accumulo anormale.

Il nome "porfiria" deriva dal fatto che queste malattie provocano


l'accumulo di sostanze chimiche dette porfirine

Tutte le forme di porfiria sono dovute a dei difetti enzimatici nella


sintesi dell'eme, per cui il processo di sintesi si arresta ad un certo
livello, portando all'accumulo di un precursore dell'eme. Questo
accumulo può verificarsi nel fegato o nella pelle che diventa così
sensibile alla luce inducendo alterazioni. La porfiria è una malattia
geneticamente trasmessa

Forme più o meno gravi di anemie, fotosensibilità, sensibilità a


farmaci che possono scatenare crisi anche gravi (coma, paralisi,
atrofie)
Le porfirine hanno un ruolo nel corpo umano perché entrano nella
sintesi della emoglobina che trasporta l'ossigeno e dei pigmenti
respiratori delle cellule.

- PORFIRINE (effetto)

Alterazione del metabolismo delle porfirine

Produzione anomala di prodotti intermedi (protoporfirine,


uroporfirine, coproporfirine)

Accumulo sopratutto nel fegato

Produzione di un danno epatico

Responsabili: PCBs, esaclorobenzene (HCB), alcuni metalli pesanti (Pb)


Biomarker specifico; le uroporfirine sono ad es. dovute a HCB, le
protoporfirine a Pb ecc.
BIOMARKERS: SISTEMA
IMMUNITARIO E ORMONALE

Il sistema immunitario, essendo deputato alla difesa dell’organismo,


rappresenta nel suo funzionamento, un ottimo indicatore dello stato di
salute dell’organismo
I biomarkers immunologici maggiormente utilizzati sono:
-l’attività di fagocitosi dei macrofagi
-la chemioluminescenza e l’attività citotossica dei leucociti

Si tratta di biomarkers a risposta ritardata

Anche il sistema ormonale risente in modo sensibile della presenza di


inquinanti, fornendo possibilità di valutazione dello stato di
contaminazione dell’organismo
- DEGENERAZIONI ORMONALI (effetto)

Possono essere causate da un vasto pool di sostanze che


interferiscono con il sistema endocrino (EDC, Endocrine Disruptor
Chemicals). Es: Bisfenolo A, Ftalati, Parabeni, PCBs, TBT, etc.

Il disturbo ormonale si ripercuote su crescita, comportamento,


riproduzione e funzione immunitaria

Le forme più note di disturbo sono:


-sostanze che mimano l’azione di ormoni
-sostanze che bloccano l’azione di ormoni

Questo avviene in particolare per ormoni steroidei, a livello dei recettori


Si conoscono sostanze capaci di alterare la sintesi, il metabolismo, il
trasporto o l’escrezione di ormoni, e altre capaci di interferire con
meccanismi di feedback tra ipotalamo e la ghiandola pituitaria, fino a
composti capaci di un danneggiamento diretto di organi endocrini

In alcuni casi dal tipo di degenerazione si può risalire all’inquinante


che l’ha provocata, in questo caso il biomarker ha caratteristiche
intermedie tra “esposizione” ed “effetto” ed è molto informativo.

Es:
- Ermafroditismo orsi polari  PCBs
- Imposex gasteropodi  TBT
Vernici antifouling (TBT)
Nei gasteropodi marini induce il fenomeno conosciuto come
IMPOSEX: insorgenza di caratteristiche maschili nelle femmine

Normal female

Hydrobia ulvae

Female with imposex

Schulte-Oehlmann et al. (1997)


BIOMARKERS
ISTOPATOLOGICI
- LESIONI EPATICHE (effetto)
Sono dovute ad agenti inquinanti ad azione cancerogena
Lo sversamento di
PCBs nel Fox River
(Wisconsin) induce
lesioni epatiche nel
pesce Stizostedium Stizostedium vitreum

vitreum

FCA= Foci of Cellular


Alteration
HT= Hepatic Tumors

Barron et al. (2000)


Biomarkers fisiologici: un caso di
studio
Patellidi
Medio-litorale superiore P. rustica

Mediterranee

Patella caerulea P. caerulea

Medio-litorale inferiore

Frangia sublitorale P. aspera

Tropicali

Cellana Cellana
grata tourema
Acanthopleura japonica

Shek O
Procambarus clarkii

Procambarus clarkii

Fucecchio
Strumentazione  per  la  rilevazione  dell’attività 
cardiaca e ventilatoria
Computer
per acquisizione automatica

Oscilloscopio
programmabile

Scheda di alimentazione
amplificazione e filtraggio
fototransistor

fotodiodo IR
La modulazione dell’attività cardiaca può essere:

I TIVA
S
PO

NE
GA
T IVA

In frequenza: CRONOTROPA
La modulazione dell’attività cardiaca può essere:

I TIVA
S
PO

NE
GA
T IVA

In frequenza: CRONOTROPA

In ampiezza:  INOTROPA
Effetto del rame sull’attività cardiaca di Patella caerulea

3 h n=27 6 h
1.6 1.6

1.4 1.4
Heart Rate Variation (HRV)

Heart Rate Variation (HRV)


1.2 1.2
9 9 9 9 8 6
1 1

0.8 0.8

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2
0 0.25 0.5 0 0.25 0.5
-1 -1
Copper (mg l ) Copper (mg l )

-  L’esposizione acuta a rame induce una risposta bradicardica
tempo e concentrazione dipendente 

-  Alte  concentrazioni  di  metallo  e  tempi  di  esposizione 


prolungati possono provocare risposte acardiche reversibili
Effetto del rame sull’attività cardiaca di Patella caerulea

Cu 
0.5 mg l-1 
t

0 3 h 6 h

2 V

10 sec
Attività cardiaca e respiratoria in Procambarus clarkii

Alla fine del periodo di acclimatazione (n=72):


• Heart rate (mean ± SD) 1.50 ± 0.52 beats s-1
• Scaphognatite rate (mean ± SD) 1.44 ± 0.59 beats s-1
Struttura delle seconde mascelle atto a convogliare il flusso d’acqua verso la camera branchiale

3.5
Pearson product-
moment correlation
3
)

coefficient r=0.349,
-1
Scaphognatite rate (beats sec

2.5
P<0.01 
2

1.5

0.5

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
-1
Heart rate (beats sec )
Effetto del rame sull’attività cardiaca di Procambarus
clarkii

Heart Rate Variation (HRV)


(a) 1.5 3h 6h 96 h

0.5

0
0 0.5 1 10 0 0.5 1 10 0 0.5 1 10
Scaphognatites Rate Variation (SRV)

-1
Copper (mg l )

(b)
1.5 3h 6h 96 h

0.5

0
0 0.5 1 10 0 0.5 1 10 0 0.5 1 10
Copper (mg l ) -1 n=72
Effetto del rame sull’attività cardiaca di Acanthopleura
japonica

2
Heart Rate Variation (HRV)

1.5

0.5

0
0 0.25 0.33 0.50
-1
Copper concentration (mg l )

T=3 h; n=28
Somministrazione combinata di rame e (TTX)

2 = Cu 0
Patella
caerulea
Heart Rate Variation (HRV)

= Cu 0.25 mg l-1
1.5

0.5

0
0 0 0.5 1 0.5 1 T=3
Tetrodotoxin (µM) h
n=54

Acanthopleura
2 = Cu 0
Heart Rate Variation (HRV)

= Cu 0 ppm
japonica
= Cu 0.33
1.5 ppm
= Cu 0.33 mg l-1

0.5

0
0 0 1 1
T=3 h
Tetrodotoxin (µM) n=28
Somministrazione combinata di carbacolo e (TTX)

With TTX (1 µM)


2
Without TTX
1.8
Heart rate variation (HRV)

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0 10 100 10 100

Carbachol concentration (µM)

Patella T=10 min; n=54


caerulea
P.caerulea: atropina, benzochinone, d-tubocurarina
d-Tubocurarina T=3 h; n=24 Atropina T=3 h; n=48

Benzochinone
T=3 h; n=48
Acanthopleura japonica: atropina e benzochinone

2 = Cu 0 ppm
Heart Rate Variation (HRV)

= Cu 0.33
Atropina
1.5

0.5

0
0 0 20 20
Atropine (µM)
T=3 h; n=28

2 = Cu 0 ppm
Benzochinone
Heart Rate Variation (HRV)

= Cu 0.33
1.5

0.5

0
0 0 5 5
Benzoquinonium (µM)
T=3 h; n=28
Registrazioni cuore-arteria in A. japonica

Heart Dorsal artery

Dorsal
Artery
Controllo

Pericardium
Heart Dorsal artery

Heart

Cu 0.5 ppm (20 min)


Risposta al rame in popolazioni di P.caerulea
provenienti da siti a diverso grado di inquinamento
Effetto del rame sull’attività cardiaca

Pollution Unpolluted Polluted

Marina Porto di
Site Quercianella Castiglioncello
di Pisa Livorno

Treatment 
0 0.25 0.5 0 0.25 0.5 0 0.25 0.5 0 0.25 0.5
(ppm Cu)

9 repliche per ciascun livello di trattamento


Risposta al rame in popolazioni di P.caerulea
provenienti da siti a diverso grado di inquinamento

2 UNPOLLUTED POLLUTED
1.8
Heart Rate Variation (HRV)

1.6 Quercianella Castiglioncello Marina di Pisa Porto di Livorno


1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.25 0.5 0 0.25 0.5 0 0.25 0.5 0 0.25 0.5
-1
Copper (mg l )

T=3 h; n=108

•  L’effetto  bradicardico  indotto  dall’esposizione  a  rame  è 


dipendente dal grado di inquinamento del sito
•  In  particolare  esso  è  più  consistente  nei  siti  “unpolluted” 
rispetto a quelli “polluted”
Risposta al rame in popolazioni di P.caerulea
provenienti da siti a diverso grado di inquinamento
LC50

Quercianella
0 (controlli), 0.05, 0.1, 0.5 ppm Cu
Porto di Livorno n= 20 per concentrazione

Probit Analysis

95% Confidence
Limits
Time (h) Site LC50 Lower Upper
Quercianella 0.099 0.067 0.148
72
Porto di Livorno 0.205 0.134 0.368
Quercianella 0.053 0.037 0.063
96
Porto di Livorno 0.085 0.062 0.125
Risposta al rame in popolazioni di Cellana provenienti
da siti a diverso grado di inquinamento
POLLUTED UNPOLLUTED

T=2 h
Cu=0.5 ppm
Effetto della pre-esposizione a rame in Procambarus
clarkii
(a)
1.5

Heart Rate Variation (HRV) 1

0.5

0
0 0.1 1
Pre-exposure concentration (mg Cu l-1)
(b)
Scaphognatites Rate Variation (SRV)

1.5

0.5

Cu=10 mg l-1; T=3 h;


0
0 0.1 1
Pre-exposure concentration (mg Cu l-1) n=30