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DIVERSITA’

METABOLICA DEI MICRORGANISMI



Gli organismi viven= riescono a u=lizzare due forme di energia presen= nell’ambiente
trasformandole in energia u=le al funzionamento delle reazioni cellulari:

Ø  l’energia derivante dall’ossidazione di compos= chimici organici o inorganici

Ø  l’energia luminosa


In base alla fonte di energia che sono capaci di u=lizzare possiamo suddividere gli
organismi in:

Ø  CHEMIOTROFI (quelli che u=lizzano l’energia rilasciata da reazioni chimiche di
ossidoriduzione)

Ø  FOTOTROFI (quelli che u=lizzano energia luminosa).

A loro volta, i chemiotrofi possono essere suddivisi
in chemioeterotrofi (o chemiorganotrofi), quando il
donatore di elettroni nella reazione di
ossidoriduzione è un composto organico, e
chemiolitotrofi (o chemioinorganotrofi), se il
donatore di elettroni è un composto inorganico

presente
esclusivamente
nei procarioti.
BaNeri chemioeterotrofi aerobi, anaerobi obbliga=, anaerobi facolta=vi
GLICOLISI

Alterna=ve (o contemporanee) alla


GLICOLISI
Via di ENTNER DOUDOROFF
Via dell’esoso monofosfato
ENERGIA METABOLICA :
•  MOLECOLE AD ALTO CONTENUTO ENERGETICO (ATP, GTP;
PEP…)
Le molecole ad alto contenuto energetico possono essere prodotte sia per
fosforilazione a livello del substrato, in reazioni di fosforilazione di un composto
organico e successivo trasferimento del fosfato ad un ADP sia per fosforilazione
ossidativa.

•  POTERE RIDUCENTE sottoforma di cofattori ridotti (NADH+H+,


FADH2) si ottiene dalle reazioni di ossidoriduzione (quelle biologiche sono
idrogenazioni e deidrogenazioni, quindi passaggi di elettroni e protoni)
Fosforilazione ossida=va
Questo è un esempio di catena di trasporto degli ele/roni in aerobiosi di un
microrganismo chemioeterotrofo. E’ quello che si verifica nella respirazione aerobia
dove l’acceNore di eleNroni della catena respiratoria è l’ossigeno molecolare O2

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


Sintesi di ATP mediante ATPasi (ATP sintasi)‫‏‬

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


In assenza di ossigeno i batteri possono ancora utilizzare la
fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, ma deve essere
presente un opportuno accettore di elettroni della catena di trasporto.

Questo tipo di respirazione si chiama

RESPIRAZIONE ANAEROBIA.
accettori di elettroni della
CO2...?
catena respiratoria possono
essere …

solfati

nitrati

Fe ferrico
Altri accettori
Nitrati (NO3-) come acce1ori di ele1roni

Il processo è definito DENITRIFICAZIONE o riduzione dissimilativa del nitrato


A"enzione alla differenza
fra riduzione assimilativa
e dissimilativa.


I prodo1i della riduzione sono escreti in notevole quantità dalla cellula ba1erica

I prodo1i della riduzione assimilativa sono usati per le biosintesi all'interno della
cellula

Il potenziale redox è + 0.42 V (confrontato con + 0.82 V dell’ossigeno). Il processo


quindi produce meno energia.
Richiede una ossidasi terminale chiamata NITRATO REDUTTASI
La sintesi dell’enzima è repressa in presenza di ossigeno e indo1a in
. assenza. Molti ba1eri anaerobi facoltativi come Alcaligenes,
sua
Escherichia, Aeromonas, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia,
Spirillum, Staphylococcus e Vibrio sono solo in grado di ridurre il
nitrato a nitrito, che viene poi escreto nel mezzo di coltura

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


Ossido nitrico o
monossido di azoto

Donatori di elettroni: Ossido nitroso o


composti organici o protossido di azoto
inorganici ridotti

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


Acce1ore può essere anche il solfato (SO42-)
Il processo è definito solfato riduzione dissimilativa
(come per i nitrati a"enzione alla differenza!!!)

Solfato (SO42-) →→ → → Solfuro di idrogeno (H2S)


La riduzione del solfato a solfuro richiede 8 ele"roni

La compie biologicamente un piccolo gruppo di ba1eri (definiti BSR-Ba1eri Solfato
Ridu1ori), tu1i sono anaerobi obbligati e tu1i possiedono un citocromo molto
particolare ( c3) de1o “a basso potenziale” .

Spesso l’H2S prodo1o si combina con il ferro


dei sedimenti formando dei precipitati di
FeS

I sedimenti neri sono comuni negli estuari


Il genere più studiato fra i BSR è Desulfovibrio (appartenente alla classe δ dei
Proteobacteria).
I ba1eri del genere Desulfovibrio usano, come fonte di ele1roni, idrogeno
molecolare al quale so1raggono ele1roni per mezzo di idrogenasi e li usano per la
riduzione del solfato. L'idrogeno può essere esogeno (fermentazioni di altri
microrganismi) o derivare da substrati organici come acidi organici o alcoli o
altro metabolizzati dal ba1erio stesso
Lo ione solfato è molto stabile e ha un
potenziale redox piu1osto negativo (il
potenziale di ossidoriduzione della
coppia HS–/SO42– è di –0,217 V) ed è,
per questo, un “ca1ivo” acce1ore di
ele1roni; quindi, per essere rido1o,
deve essere prima a1ivato
ATP sulfurilasi catalizza l’a1acco dello
ione solfato al fosfato dell’ATP . Si
forma l’APS per il metabolismo
dissimilativo

Con l'aggiunta di un fosfato al ribosio
dell’APS si forma PAPS e il solfato,
così a1ivato, può essere rido1o a scopi
assimilativi
APS = Adenosina-fosfo-solfato PAPS = Fosfoadenosina-fosfo-solfato

Da donatori di
elettroni
attraverso la Fosfoadenosina-fosfato
catena di
trasporto degli
elettroni

8H+ Citocromo
4
8e- periplasmatico c3


8e-






Figura 5.27 RESPIRAZIONE ANAEROBIA DEL SOLFATO.

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


Alle idrogenasi periplasmatiche, che nei ba1eri solfato ridu1ori
possono essere di vario tipo, sono associati citocromi periplasmatici
come il citocromo c553 (con un unico gruppo eme) e il citocromo c3
(con qua1ro gruppi eme) che è un citocromo a basso potenziale di
ossidoriduzione che dona ele1roni ad un altro citocromo multieme
(16 gruppi eme) associato alla membrana de1o Hmc (high molecular
mass cytocrome c).

citocromo c3



Citocromo
periplasmatico c3





L' ossidazione dell'acido


la1ico serve ad una
idrogenasi
citoplasmatica per
generare idrogeno, che
diffonde nel periplasma
Poiché finora non è stata dimostrata l'esistenza di
idrogenasi citoplasmatiche , il meccanismo ipotizzato
non è ancora pienamente confermato

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


FERRO 3+ come acceNore di
eleNroni

Sono stati isolati numerosi ba1eri e archaea (che


includono ipertermofili, termofili, psicrofili,
alcalofili) capaci di operare la riduzione
dissimilativa del Fe3+
I ba1eri della famiglia delle Geobacteraceae,
appartenenti alla classe dei delta proteoba1eri,
sono fra i più noti, cara1erizzati e diffusi
microrganismi ferro riducenti insieme al gamma
proteoba1erio Shewanella e ad altri Proteoba1eri
della classe beta. Un ruolo nella riduzione degli
ossidi ferrici nell'ambiente sembra l'abbiano anche,
al di fuori dei Proteoba1eri, i ba1eri del philum
Acidobacteria come Geothrix fermentans che si
trovano frequentemente nei sedimenti anossici
ricchi di ferro.
3+
Questi ba1eri si affidano, per ricavare energia, solo alla riduzione del Fe .
I donatori, in questi ba1eri, possono essere composti organici (anche
idrocarburi aromatici come il toluene), oppure H2 o ammonio.



Gli ossidi ferrici che fungono da acce1ori di ele1roni sono insolubili e non
possono diffondere nella cellula, quindi la loro riduzione deve avvenire per
forza all'esterno, nel periplasma.
I due ba1eri usati come modello per gli studi della ferro riduzione sono
Shewanella spp. e Geobacter spp. che si comportano in modo abbastanza
diverso

Shewanella oneidensis strain MR-1 growing on the


surface of the iron oxide mineral hematite.
Courtesy: Pacific Northwest National Laboratory.
CymA citocromo tetraeme di tipo c MacA citocromo che si trova legato
Cytc3 e MtrAdue piccoli citocromi di tipo c alla membrana citoplasmatica
OmcB citocromo della membrana esterna PpcA citocromo periplasmico tri-
parzialmente esposto sulla superficie della eme di tipo c
cellula

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


E' particolare il modo in cui gli elettroni sono trasferiti dal batterio agli ossidi ferrici che,
in ambiente a pH neutro, si trovano allo stato solido. Appendici cellulari costituiscono
“nanowires” che sono dei nano-cavi conduttori di elettroni
FERMENTAZIONI

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


LITOAUTOTROFIA
OSSIGENICA
luce
CO2 + 2H2O è (CHOH) + O2+H2O

ANOSSIGENICA
luce
CO2 + 2H2A è (CHOH) + A2+H2O
H2A= H2S
Batteri fotosintetici:

Solfobatteri verdi

Fotosintesi anossigenica
Solfobatteri rossi,

Batteri verdi non sulfurei

Batteri rossi non sulfurei

Cianobatteri
Fotosintesi ossigenica
FOTOSINTESI
OSSIGENICA
Piante, alghe
eucariotiche e
cianobatteri (alghe
procariotiche) usano
atomi di idrogeno
dall’acqua per ridurre
la CO2 a carboidrati
ed evolvono
ossigeno molecolare

Figura 6.9 RAPPRESENTAZIONE TERMODINAMICA DEL FLUSSO DEGLI ELETTRONI NELLA FOTOSINTESI OSSIGENICA DEI
CIANOBATTERI E DEI CLOROPLASTI (SCHEMA “Z”).

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


Diverse modalità di
fotosintesi anossigenica

Figura 6.8 RAPPRESENTAZIONE TERMODINAMICA DEL FLUSSO DEGLI ELETTRONI NELLA FOTOSINTESI
ANOSSIGENICA DEI BATTERI PURPUREI (ES.

da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana


da Dehò-Galli- Biologia dei microrganismi 2014 CEA© Casa Editrice Ambrosiana
Archaea metanogeni

Acetobacterium woodii
METANOGENESI
ACETOGENESI

Una CO2 è ridotta a


gruppo metilico
dell’acetato

Una CO2 è ridotta a


gruppo carbonilico
dell’acetato
Enzima chiave la
CO(monossido di
carbonio) deidrogenasi

La via dell’acetil-
CoA non è ciclica
METANOTROFIA E METILOTROFIA
Ossidazione aerobia del metano

I batteri metofili usano composti C1 (ad es. metano,


metanolo), in aerobiosi, per ricavare energia. Li usano
anche come fonte di carbonio
Il passaggio iniziale di ossidazione del
metano coinvolge un enzima chiamato
METANO MONOOSSIGENASI
(MMO)

Esistono due tipi di batteri


metanotrofi, di Tipo I e di Tipo II che
assimilano i composti C1 in maniera
diversa
Quelli di tipo I utilizzano la
VIA DEL RIBULOSIO
MONOFOSFATO,
quelli di tipo II la
VIA DELLA SERINA

Da “Biologia dei microrganismi” Dehò & Galli CEA 2011


Ossidazione anaerobia del metano
Il metano può essere ossidato anche in anaerobiosi con
un meccanismo solfato dipendente che ha luogo nei
sedimenti anossici subsuperficiali.
(si tra1a di un processo molto rilevante in certi siti)


In molti ambienti marini rappresenta il processo dominante di
consumo del solfato sopra1u1o quando è disponibile metano
ad alte concentrazioni. Tu1avia la biochimica e la fisiologia dei
ba1eri che sembrano coinvolti in queste reazioni non è ancora
stata studiata dire1amente a causa dell’impossibilità di
coltivarli in condizioni di laboratorio.
Nel 1999 è stata o1enuta la prima sequenza di 16S rDNA
dei microorganismi probabilmente coinvolti nella AOM.
Si tra1a di un gruppo di Archaea (definito ANME1)
filogeneticamente non lontani dall'ordine dei
Methanomicrobiales .

ANaerobic MEtanotrophs

Strettamente associati con con questi Archaea sono stati
trovati batteri solfato riduttori molto vicini al genere
Desulfosarcina e Desulfococcus

FISIOLOGIA DEI CONSORZI


Contemporaneo consumo di metano e produzione di solfuri in
quantità stechiometriche indicano che il metabolismo dei
microrganismi del consorzio è coordinato.

Ipotesi sul trasferimento extracellulare di ele"roni
nell'ossidazione anaerobica del metano (AOM)


Si suppone che si tra1i di
una associazione
sintrofica dove i metano
ossidanti (ANME)
cedono ele1roni ai
ba1eri solfato ridu1ori
(SRB).

Nanowires
“nano conduttori di elettroni”
BIODEGRADAZIONE LEGATA ALLA CRESCITA

I processi di biorimediazione si basano soprattutto sulle attività di batteri e funghi che


usano i contaminanti per la crescita.
Affinchè un contaminante serva da fonte di carbonio ed energia per la crescita dei
microrganismi deve essere trasformato in molecole che riescano ad essere
incanalate nel metabolismo centrale.
Solo così il carbonio di questo contaminante, può essere trasformato in biomassa e,
in parte, mineralizzato con un ricavo di energia metabolica.
Metabolismo
centrale
Microrganismi con queste capacità sono presen=
nell'ambiente e sono a`vi nelle loro condizioni o`mali di
crescita.

Per isolarli si alles=scono
COLTURE DI ARRICCHIMENTO

La tecnica delle colture di arricchimento è alla base dell'isolamento di


colture pure di batteri e funghi capaci di usare un gran numero di
molecole organiche (anche inquinanti) come fonte di Carbonio ed energia
Si parte da una coltura in un chemostato dove la concentrazione del
composto xenobiotico è bassa mentre sono alte le concentrazioni di
sostanze correlate, ma utilizzabili. Durante la procedura di arricchimento
(che può durare anche alcuni mesi), la concentrazione del substrato
utilizzabile viene diminuita gradualmente mentre la concentrazione del
composto xenobiotico viene aumentata.
In questo modo vengono selezionati batteri e anche mutanti spontanei
con un’aumentata capacità di utilizzare lo xenobiotico.
Dopo 1 mese dopo 1 mese dopo 1 mese

Inoculo:
suolo contaminato

Terreno di coltura:
BH (terreno minerale
minimo)
Fonte di carbonio:
il contaminante e una
molecola correlata e
utilizzabile in
concentrazioni variabili
(all’inizio meno
contaminante e più
molecole utilizzabili e
poi, via via, l’inverso)
BH o Bushnell-Haas Broth o Bushnell Haas Agar

Solo nel terreno solido


•  Colture liquide: terreno BH (minimo) con eicosano o
nabalene come sole fon= di carbonio
•  Piastramento su terreno LB o PCA (massimo) o su
terreno BH (minimo) con eicosano o nabalene
DischeNo di carta assorbente impregnato di contaminante
Alone di crescita intorno al
discheNo

DischeNo di carta assorbente impregnato di contaminante


La tecnica di arricchimento SCAS
Semi Con9nuous Ac9vated Sludge
CASO di STUDIO

La colonna in vetro, dal volume


di 1.5L, contiene un fango di
depuratore contaminato da 1,2-
DCA, che viene nutrito in
semicontinuo con un terreno a
base di peptone e riceve
continuamente 1,2-DCA
attraverso il sistema di
aerazione.

L’alternanza di una fase selettiva (solo DCA) e di una fase di


moltiplicazione batterica (nutrimento completo), hanno permesso un
notevole arricchimento in microorganismi degradatori.
FENOMENI NATURALI DI ARRICCHIMENTO
Alcanivorax borkumensis, (un γ -proteobatterio marino)
utilizza come substrato di crescita un ampio spettro di
costituenti del petrolio preferenzialmente alcani, alcani
ramificati, alchil-cicloesani, alchil-benzeni e persino il
pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) che è prodotto da
zooplancton marino e rappresenta un importante substrato
naturale per A. borkumensis.
Il batterio, che è normalmente presente in basse
concentrazioni in ambienti non contaminati, in ambienti
marini contaminati raggiunge il 90% di tutti i batteri
idrocarburo degradanti
Punti delicati delle procedure di arricchimento:

l  Troppo poco contaminante per essere una fonte di carbonio


sufficiente

l  Troppo contaminante che può essere tossico per le cellule

l  Possono mancare, nel terreno minimo di crescita, importanti fattori di


crescita di cui i microrganismi hanno necessità

l  I microrganismi non usano il composto come fonte di carbonio e di


energia e lo trasformano soltanto con reazioni enzimatiche non
specifiche
Se i microrganismi
usano il composto
contaminante come
fonte di carbonio ed
energia, la biomassa
microbica deve
aumentare e la
concentrazione del
contaminante deve
diminuire

Crescita di Pseudomonas stutzeri ZP2con fenantrene

Può verificarsi, in qualche caso, che la mineralizzazione sia


legata ad una popolazione non in crescita e quindi non si
osservi questo andamento del grafico
Di norma, anche quando la mineralizzazione di un composto organico è
legata alla crescita, questo non è del tutto mineralizzato, perchè una
parte del carbonio è usato dal microrganismo per la sintesi di biomassa
e solo il restante è trasformato in CO2 e alcuni altri prodotti di scarto con
un'efficienza che varia da specie a specie e anche da un tipo di
composto ad un altro
Cassimilato= Csubstrato _ Cmineralizzato

Nell'ambiente il carbonio trasformato in biomassa (Cassimilato) può


essere mineralizzato successivamente, quando il microrganismo
che ha utilizzato per la crescita un certo composto organico,
diviene a sua volta fonte di carbonio per predatori o saprofiti.
Cassimilato= Csubstrato _ Cmineralizzato

Quando si effettua questo calcolo su colture


pure in cui si mettono solo le cellule e i substrati Questi indici misurano in pratica
per la crescita si può esprimere il cosiddetto l'efficienza del metabolismo
growth yield che è il peso della biomassa microbico quando utilizza un
ottenuta diviso il peso del substrato usato substrato e variano moltissimo
Che si può anche esprimere come molar yield in aerobiosi e anaerobiosi , da
cioè il peso della biomassa ottenuta diviso le composto a composto e fra un
moli di substrato metabolizzato microrganismo e un altro

Microrganismi substrato % di carbonio


conver=ta in biomassa

Bacillus acidocaldarius glucosio 15-47

Candida u9lis acetato 56

Arthrobacter sp glucosio 21-28

Acqua di lago 4-nitrofenolo <10


Si è visto che, in acque dolci e in
acque di scarico, in certe
condizioni, quasi tutto (93-98%) il
carbonio di composti come acido
benzoico, benzilammina, anilina,
2,4D e fenolo, aggiunti ad una
concentrazione inferiore ai 300µg/l
è mineralizzato e pochissimo entra
nella biomassa cellulare
Come si diceva, un buon “growth yield” dipende da molti fattori:
condizioni ambientali, specie microbica, tipo di composto fonte di
carbonio

Si possono osservare situazioni diametralmente opposte

-molto del carbonio derivante dal contaminante “entra” nella


biomassa quando questo è presente ad alte concentrazioni

ma può verificarsi anche il viceversa:

-alte concentrazioni di contaminante sono sfavorevoli.

Si può osservare come, a volte, il growth yield non è legato dalla


concentrazione del substrato, ma alla sua struttura chimica.