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PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE

Separazione di 1 proteina da altre 10.000 - 20.000 proteine


diverse (in una cellula, tessuto)
Il grado di purezza che si vuole raggiungere dipende dagli scopi
finali.
Cosa si intende per proteina pura?
E praticamente impossibile raggiungere il 100%
Moderata (<95%) determinazione struttura primaria
produzione di anticorpi
studio della cinetica di un enzima
( importante che non ci siano attivit
competitive)
Elevata (95-99%) cristallografia a raggi X
caratterizzazioni chimico fisiche
Estremamente elevata (>99%) uso terapeutico
studi in vivo
Proteine non ricombinanti
Basso livello di espressione
Difficile reperibilit della fonte
Sicurezza (organismi patogeni)
Difficolt di purificazione
Microbial cells
or tissue
Break cells,
tissue, or organ
Blender,
homogenizer,
sonication,
osmotic pressure
Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins
Supernatant with
Soluble protein
Rottura della parete e della membrana cellulare
Cellule batteriche
Nelle cellule procariotiche oltre alla membrana cellulare
bisogna distruggere la parete cellulare costituita da
peptidoglicano, (eteropolimero con unit alternate di N-
acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico unite da
legami glicosidici 1->4).
Questi polimeri lineari sono disposti luno accanto allaltro e
sono uniti da piccoli peptidi, la cui struttura dipende dalla
specie batterica. Le propriet antigeniche dei batteri sono
spesso dovute ai costituenti della parete.
Il lisozima idrolizza il legame glicosidico del peptidoglicano
( presente nellalbume delluovo, nelle lacrime, come difesa
degli occhi contro le infezioni batteriche)
Rottura della parete e/o membrana cellulare
Per le cellule vegetali e i funghi, che possiedono una
parete cellulare pi resistente rispetto ai batteri,
necessario rompere la parete con
metodi fisici (cicli ripetuti di congelamento-
scongelamento, biglie di vetro, sonicazione, utilizzo di
mortaio e pestello ecc.)
oppure
metodi enzimatici capaci di digerire la parete cellulare.
OMOGENIZZATORE A ROTORE -STATIVO
FRENCH PRESS
OMOGENIZZATORE DI VETRO
SMERIGLIATO
PURIFICAZIONE di una PROTEINA
Prendere le necessarie precauzioni durante la purificazione
per minimizzare i danni (inattivazione irreversibile e
perdita della proteina)
temperatura
agenti stabilizzanti
eliminazione di proteasi
detergenti per proteine di membrana
Cercare di usare il minor numero possibile di passaggi di
purificazione
Non purificare pi del necessario allo scopo finale
TAMPONI FREQUENTEMENTE UTILIZZATI
INTERVALLO DI pH
GLICINA /HCl 2.2-3.6
Na
2
HPO
4
/acido citrico 2.6-7.6
acido citrico/citrato 3.0-6.2
acido acetico/sodio acetato 3.7-5.6
NaH
2
PO
4
/Na
2
HPO
4
5.8-8.0
trietanolammina idocloruro/NaOH 6.8-8.6
Tris/HCl 7.0-9.0
Dietanolammina/HCl 8.0-10.0
Sodio Borato/HCl 8.1-9.0
Glicina/NaOH 8.6-10.6
Sodio carbonato/sodio bicarbonato 9.0-10.7
GOOD BUFFERS
MES/NaOH 5.8-6.5
ADA/NaOH 6.2-7.2
PIPES/NaOH 6.4-7.2
MOPS/NaOH 6.5-7.9
HEPES/NaOH 7.0-8.0
Tricine/HCl 7.6-8.8
Bicine /HCl 7.8-8.8
CHES/NaOH 9.0-10.1
CAPS/NaOH 9.7-11.1
Il primo passo di qualunque tecnica di biologia molecolare
consiste nellisolare e purificare acidi nucleici.
I protocolli sperimentali variano a seconda
del materiale di partenza
del tipo di acido nucleico che si vuole separare
dal tipo di esperimento che si deve effettuare, ecc.
In tutti i casi dovremo :
1. Rompere la parete e/o la membrana cellulare
2. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari
3. Separare gli acidi nucleici tra loro (per es. DNA da RNA)
Isolamento e purificazione di DNA e RNA
Rottura della parete e della membrana cellulare
Cellule batteriche
La rottura della parete batterica effettuata mediante
trattamento con una miscela contenente
Il lisozima idrolizza il legame glicosidico del
peptidoglicano
lEDTA un agente chelante che sequestra i cationi
bivalenti necessari per la stabilizzazione delle membrane
(e per lattivit di molti enzimi tra cui la DNasi)
lSDS (detergente anionico) solubilizza i lipidi delle
membrane e lega le proteine alterandone la struttura
secondaria
Rottura della parete e/o membrana cellulare
Cellule eucariotiche
Le membrane delle cellule animali sono solubilizzate con
detergenti blandi quali SDS
Per un campione di tessuto necessaria uniniziale
omogenizzazione che realizzata mediante:
Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter).
Vibrazioni ultrasoniche
Congelamento/scongelamento
Separazione degli acidi nucleici da altri componenti
cellulari
Una centrifugazione permette di eliminare i detriti cellulari dal
contenuto cellulare rilasciato nel mezzo, che costituito da varie
componenti cellulari come DNA, RNA, lipidi, mono e polisaccaridi,
proteine e sali.
Una buona preparazione di DNA cromosomale permette di
ottenere frammenti di DNA lunghi al massimo di 25 kbp
- E importante deproteinizzare la soluzione e poi procedere alla
precipitazione dellacido nucleico con alcol.
La rimozione delle proteine dal lisato cellulare particolarmente
importante sia perch tra le proteine sono presenti enzimi capaci
di degradare gli acidi nucleici, sia per la presenza di proteine
capaci di legarsi agli acidi nucleici impedendone la funzione e/o la
purificazione.
Le proteine sono rimosse dalla preparazione mediante varie
tecniche da usare in combinazione, o luna in alternativa
allaltra.
1. Uso di enzimi proteolitici, tipo pronasi e proteinasi K.
- la Pronasi: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici di cui due
endopeptidasi (serina- e metallo-proteasi) e due esopeptidasi
(carbossi e ammino-peptidasi).
- la Proteinasi K, cos detta per il suo potere di idrolizzare la
cheratina, una endopeptidasi di origine fungina.
La rimozione degli ioni Ca
++
determina la perdita dell80% della sua attivit
enzimatica, ma lattivit residua comunque sufficiente a degradare le proteine
che contaminano gli acidi nucleici. Pertanto la digestione pu essere condotta in
presenza di EDTA, necessario per inattivare le DNasi.
Gli enzimi proteolitici andranno poi eliminati.
Rimozione delle proteine
Estrazione con fenolo
(miscela di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25:24:1)
E la tecnica comunemente utilizzata per rimuovere le
proteine dagli acidi nucleici, e consiste nel trattare la
soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici con una
miscela fenolo/cloroformio, immiscibile (quasi) in acqua.
Tale procedura pu essere usata da sola o dopo la
digestione con enzimi proteolitici, al fine di rimuoverli.
Per le preparazioni di DNA, per eliminare lRNA si usa la
ribonucleasi A (RNasi);
Per le preparazioni di RNA, per eliminare contaminazioni di
DNA invece utilizzata la desossiribonucleasi (DNasi).
Anche queste attivit enzimatiche vanno poi eliminate
C
6
H
5
OH
Fenolo
E un forte denaturante delle proteine che si
lega ad esse, alterandone la struttura.
Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobici
esposti, diventano solubili nella fase fenolica o
precipitano allinterfase fenolo-acqua.
Cloroformio
- completa la denaturazione delle proteine
- rimuove i lipidi
- grazie alla sua elevata densit facilita la separazione della
fase acquosa (contenente il DNA deproteinizzato) da
quella organica (fenolica) stabilizzando linterfaccia tra le
due fasi.
Alcol isoamilico: riduce la schiuma che si forma nel corso
dellestrazione.
Fase acquosa (DNA e RNA)
Interfase (proteine denaturate)
Fase fenolica (proteine solubili)
Dopo centrifugazione si
ottengono tre fasi:
1. superiore, che contiene la
soluzione di acidi nucleici;
2. interfase, proteine
denaturate;
3. inferiore, fase fenolica
contenente lipidi e proteine
ricche di aminoacidi
idrofobici.
Preparazione del fenolo
Il fenolo fortemente igroscopico e deve essere sempre
equilibrato con una soluzione tampone perch altrimenti
assorbirebbe la soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici.
Il fenolo tende ad ossidarsi facilmente assumendo un colore rossastro per la
presenza di chinoni. Si aggiunge la 8-idrossichinolina (antiossidante, parziale
inibitore delle RNasi e debole chelante di ioni metallici)
A unestrazione fenolica fa seguito unestrazione con
cloroformio/isoamilico (24:1)
e una
precipitazione con alcol per concentrare gli acidi nucleici
(le proteine sono insolubili in alcol e co-precipiterebbero in larga misura con gli
acidi nucleici se non fossero preventivamente rimosse)
La soluzione acquosa contenente lacido nucleico miscelata con 2
volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti (Na
+
,
K
+
, NH
4
+
) e viene lasciata precipitare a 80C.
Estrazione e analisi dellRNA
Una tipica cellula di mammifero contiene circa 20-30 picogrammi di RNA.
La popolazione di RNA cellulari molto eterogenea:
RNA totale :
RNA codificante (~4%)
Comprende le molecole di mRNA citoplasmatico e i
precursori nucleari (hnRNA: heterogeneous nuclear RNA)
RNA non codificante (~96%)
-RNA ribosomiali: 28S, 18S, 5,8S e 5S, con i relativi precursori, che
costituiscono fino all80% dellRNA totale
-tRNA e altri piccoli RNA
Estrazione dellRNA
Vincere la battaglia con le RNasi
Le DNasi richiedono ioni metallici per la loro attivit e sono termolabili,
per cui sono facilmente inattivate da agenti chelanti e dalla
sterilizzazione in autoclave
Le RNasi non hanno bisogno di cofattori, resistono a trattamenti
drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono
attive entro un ampio range di pH.
Fonti di RNasi in laboratorio
Tamponi e soluzioni di uso comune che se utilizzati senza opportune
precauzioni, possono ospitare batteri o altri microrganismi che rilasciano
i loro enzimi; autoclavarli non inattiva le RNasi, anzi pu introdurle nei
reagenti, per es. liberandole dai batteri contaminanti.
lavorare senza guanti pu introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche e
cellulari
batteri veicolati dallaria possono sedimentare sulla superficie delle
soluzioni, portando con s RNasi
Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno gi dispensato
soluzioni di RNasi
E importante quindi :
Dividere le soluzioni in piccole aliquote
Utilizzare plastica garantita RNasi-free
Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200C
Indossare sempre guanti e cambiarli spesso
Mantenere unarea di lavoro separata, dedicata allRNA, con dotazione di
pipette, puntali, provette, reagenti e tamponi esclusivi. Ci importante
particolarmente, se nello stesso laboratorio si usa RNasiA per estrazione
di DNA.
Come proteggere lRNA dalla degradazione da parte delle RNasi
Potenti agenti denaturanti:
Sali di guanidinio (guanidinio cloruro, guanidinio tiocianato)
Il guanidinio cloruro un elettrolita forte; le proteine si
dissolvono in soluzioni concentrate (4M) perdendo la loro
struttura secondaria e attivit biologica.
2-mercaptoetanolo un agente riducente in grado di rompere i ponti
disolfurici delle proteine
Temperatura lavorare mantenendo le provette in ghiaccio un modo di
inibire le ribonucleasi
Sostanze deproteineizzanti: fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K
Come proteggere lRNA dalla degradazione da parte delle RNasi
RNase inhibitor: proteine di origine umana (placenta) o non umana (E. coli
ricombinante), che si legano in modo non covalente alle RNasi e ne
inibiscono cos pi del 90% dellattivit. Il legame per reversibile e
linibitore deve essere mantenuto attivo, evitando soluzioni contenenti agenti
fortemente denaturanti, come SDS o urea, mantenendo un ambiente
riducente (presenza di DTT) e la temperatura < 65C.
DEPC (dietilpirocarbonato): un agente alchilante molto reattivo che reagisce
con le proteine attaccando lazoto imidazolico dei residui istidinici,
determinando la perdita dellattivit enzimatica.
Si usa alla concentrazione finale dello 0,1% per inattivare le RNasi
contaminanti presenti nelle soluzioni.
Al termine del trattamento deve essere inattivato in autoclave ( idrolizzato
ad etanolo e CO
2
).
Composti contenenti gruppi amminici primari, come il Tris reagiscono con il
DEPC; di conseguenza, le soluzioni devono essere preparate sciogliendo il
Tris in acqua gi trattata con DEPC ed autoclavata.
Estrazione dellRNA totale
Metodo della guanidina tiocianato in gradiente di cloruro di cesio
Colture cellulari o tessuti molli si lisano direttamente.
Gli altri tessuti si polverizzano in azoto liquido.
(Le RNasi endogene si attivano quando si rompono le cellule!)
Lisi cellulare e denaturazione delle
proteine (RNasi) sono immediate
nella soluzione di guanidina
tiocianato.
Aggiungendo detergenti (SDS) e
agenti riducenti (DTT) si dissociano
i complessi proteine-acidi nucleici.
LRNA pi denso (> 1,8 g/ml)
degli altri componenti cellulari e
quindi attraversa il cuscino di
cloruro di cesio.
Si perdono i piccoli RNA cellulari:
tRNA e rRNA 5S.
Si recupera lRNA dal fondo e si
trasferisce in provetta.
Si precipita lRNA in etanolo e sali,
poi si sospende il pellet di RNA in una
soluzione tampone.
Si analizza la qualit dellRNA
estratto.
Isolamento dellmRNA
La maggior parte degli mRNA eucariotici presentano la coda di poliA
allestremit 3.
LmRNA poliadenilato pu quindi ibridare con sequenze sintetiche di
oligo(dT) (corti polimeri di desossitimidina), mentre le altre specie di RNA
che non ibridano con loligo(dT) possono essere eliminate.
Questo metodo non adatto per gli mRNA batterici, perch solo una
piccola percentuale degli mRNA poliadenilato con code di poliA piuttosto
corte.
Isolamento dellmRNA
La preparazione di RNA totale
fatta passare attraverso una colonna
costituita da un polimero ricoperto
con oligo(dT).
Solo lmRNA polidenilato ibrider
con loligo(dT), mentre le altre
specie verranno eliminate mediante
lavaggi con tamponi a bassa
concentrazione salina.
Leluato finale sar costituito dalla
miscela di tutte le specie di mRNA
presenti nella cellula al momento
dellestrazione.