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Le cellule

Caratteristiche degli
organismi viventi
Complessi e organizzati
Capaci di estrarre/trasformare energia
Capaci di rispondere a cambiamenti
ambientali
Capaci di autoreplicarsi
Sono compartimentati
Seguono le leggi della Fisica e della
Chimica!

Sistemi biologici e biomolecole


Pochi elementi naturali, leggeri (fondamentalmente,
C, N, O, H)
Sistemi lontani dallequilibrio, spesso allo stato
stazionario
Reazioni chimiche catalizzate
Macromolecole costituite di unit semplici (struttura
gerarchica)
Proteine
Acidi nucleici
Polisaccaridi
Importanza delle strutture tridimensionali
Chimica acquosa

Elementi nel
corpo umano

PRINCIPALI
CLASSI DI
BIOMOLECOLE

Termodinamica e funzioni di stato


Funzioni di stato: dipendono solo dagli
stati iniziale e finale del sistema
Entalpia: quantit di energia che un
sistema pu scambiare con lambiente
H = U + P V
Nei sistemi biologici,
H q (calore a pressione costante)

Energia libera (di Gibbs)


Funzione di stato che consente di valutare
se un processo spontaneo
G = H TS
Dove:
H = entalpia
S = entropia

La variazione in energia libera


determina la direzione di un
processo
G = Gprodotti - Greagenti
G = H - T S
G < 0 reazione esoergonica,
spontanea
G > 0 reazione endoergonica;
richiede energia dallesterno
G = 0 reazione allequilibrio

Entropia
G = H - T S
Lentropia una misura del grado di disordine di un
sistema

Lentropia aumenta quando il sistema diventa pi


disordinato e diminuisce quando il sistema pi
strutturato

Molte reazioni biologiche tendono ad aumentare


lordine e a diminuire in entropia (
S < 0)

Reazioni esotermiche (
H < 0) che aumentano in

entropia (
S > 0) avvengono spontaneamente (
G
< 0)

Reazioni endotermiche (
H > 0) possono avvenire
spontaneamente se T S > H

Esempi di differenze di
entropia
BASSA ENTROPIA ALTA ENTROPIA
Acqua - ghiaccio

Acqua - vapore

Poesia

Serie casuale di lettere

Scrivania di un
bancario

Scrivania di uno
scienziato

Da: Lehninger

Un processo esoergonico: la
diffusione attraverso una
membrana

membrana

tempo

Effetto
idrofobico
Molecole dacqua ordinate

G e costante di equilibrio
La variazione di energia libera di una reazione dipende
dalle concentrazioni di reagenti e prodotti
G = G + RT ln [prodotti]/[reagenti]
dove: G = variazione di energia libera standard
Allequilibrio:
0 = G + RT ln [prodotti]/[reagenti]
da cui

G = - RT ln Keq

Costanti di equilibrio e variazioni di


energia libera standard
Keq
0,001
0,01
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0

G (kJ/mole)
17,1
11,4
5,7
0,0
5,7
-11,4
-17,1

Variazioni di
energia libera standard G

Pressione atmosferica; t = 25 C
Attivit chimica (concentrazione) = 1
In Biochimica, lo stato standard a pH = 7
Allacqua attribuito comunque un valore
pari ad 1

I legami fosfoanidridici dellATP

ATP

Sub-

Trasferimento di
un gruppo fosfato

Sub-

Trasferimento di un
gruppo adenilico

Una reazione energeticamente sfavorita


pu procedere se accoppiata ad una
favorita
Molte reazioni biochimiche sono energeticamente
sfavorite (G > 0) e non procedono spontaneamente
Le cellule possono condurre tali reazioni accoppiandole
ad una reazione (processo) con un G maggiormente
negativo
Reazioni energeticamente sfavorite sono spesso
accoppiate allidrolisi dellATP che ha un G = -7.3
kcal/mol
Lenergia utilizzabile in una molecola di
contenuta nei legami fosfoanidridici

ATP

Reazioni accoppiate

10

Importanza di intermedi fosforilati

Composti in genere stabili cineticamente

LATP usato per alimentare numerosi


processi
Luce (fotosintesi) o composti ad alta
potenziale (respirazione)
The ATPenergia
cycle

Sintesi di
macromolecole
(proteine,
DNA)

Sintesi di altri Movimenti


componenti cellulari
cellulari)

Generazione Calore
Trasporti di
di potenziali
molecole/ ioni
contro gradiente elettrici

11

GLI -AMMINOACIDI
Sono caratterizzati da un
gruppo carbossilico e da un
gruppo amminico legato al
carbonio adiacente ()
 Si differenziano per il
gruppo sostituente -R


Gli amminoacidi costituenti le


proteine:
 Sono venti (standard), -ammino-acidi, appartenenti alla serie L
 Sono anfoteri
 Caratterizzati da un punto isoelettrico (pI) dovuto
ai gruppi ionizzabili
 Esistono numerosi altri amminoacidi con ruoli
diversi
 La sequenza degli amminoacidi (struttura
primaria) determina la struttura spaziale
 La struttura determina la funzione

Stereoisomeria degli amminoacidi


Carbonio
asimmetrico

Tutti gli amminoacidi standard, tranne la glicina, possiedono


almeno un carbonio asimmetrico

La convenzione secondo Fischer per la


configurazione fa riferimento alla
gliceraldeide:

Importanza della stereoisomeria:


solamente un enantiomero possiede
attivit anti-infiammatoria

Propriet acido-base

Gli amminoacidi sono acidi poli-protici deboli


 pH basso: gruppo amminico e carbossilico protonati
 pH neutro: si dissocia il carbossile
 pH alto: si dissocia il gruppo ammonio
 A pH fisiologico (pH ~7.0) stabile la forma
zwitterionica: i gruppi amminici sono protonati, il
carbossile completamente dissociato.


Gruppo carbossilico :
Gruppo amminico :

pKa ~ 2
pKa ~ 9

Propriet acido-base



Punto isoelettrico (pI): valore di pH al quale


lamminoacido ha carica netta nulla.
Nel caso di un amminoacido con catena laterale neutra
dato da:

pI =

1
(pKa1( COOH) + pKa2 ( NH + ) )
3
2

pKa1

pKa2

gruppi R non polari, alifatici

Amminoacidi
con catene
laterali apolari

gruppi R aromatici

Amminoacidi con catene laterali


polari

La prolina un imminoacido
(contiene un gruppo amminico secondario)

gruppi R carichi positivamente (basici)

Amminoacidi
carichi
gruppi R carichi negativamente (acidi)

Alcune propriet degli amminoacidi


standard

Lehninger Introduzione alla Biochimica, ed. Zanichelli

La cisteina pu formare ponti


disolfuro (ossidazione)

Gli spettri UV di amminoacidi aromatici

Curva di
titolazione della
glicina

pI =

1
(pKa1( COOH) + pKa2 ( NH + ) )
3
2

Curva di
titolazione del
glutammato

Curva di
titolazione
dellistidina

Alcuni amminoacidi modificati (dopo


la traduzione)

Importanti molecole derivate


da amminoacidi

La selenocisteina (Sec), il
ventunesimo amminoacido
Analogo alla Cys, contiene Selenio al posto di
Zolfo
 Deriva da una modificazione della Serina;
inserita come tale nelle proteine. E codificata
in modo particolare
 Importante in numerosi enzimi ossido-riduttivi
 Negli Archaea esiste un 22 amminoacido, la
pirrolisina (Pyl).


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Il legame peptidico

Il legame peptidico si genera (formalmente) per eliminazione


di una molecola di acqua tra gruppo carbossilico ed amminico

11

Le proteine
polimeri lineari costituiti di
amminoacidi
 Contengono diversi gruppi funzionali
 Possono formare strutture complesse
 Possono essere rigide (strutturali) o
flessibili
 Sono

Alcuni ruoli delle proteine


 Enzimi

(biocatalizzatori)
 Proteine strutturali - collagene
 Proteine regolatrici - ormoni (ad esempio:
insulina, glucagone)
 Proteine di trasporto emoglobina (O2)
 Proteine di trasporto di membrana
 Recettori
 Proteine contrattili - actina, miosina
 Proteine di difesa anticorpi
 Proteine che decodificano linformazione

Le proteine sono polimeri lineari


costituiti da amminoacidi








Le proteine sono polimeri lineari, non ramificati, degli


amminoacidi
Il legame peptidico o carboammidico si genera (formalmente) per
eliminazione di una molecola di acqua tra gruppo carbossilico di
un amminoacido ed amminico dellamminoacido adiacente
Lequilibrio sarebbe spostato verso lidrolisi
I legami peptidici sono cineticamente stabili
Per convenzione il polimero viene letto partendo dallamminoacido N-terminale

Il legame peptidico
 ha un parziale carattere di doppio legame: non ruota
liberamente
 Si trova quasi sempre nella configurazione trans (C
da lati opposti) a minore ingombro sterico

Il legame peptidico un
sistema planare

Sei atomi giacciono sullo stesso piano

Il legame peptidico


A causa della distribuzione degli


elettroni il legame peptidico ha
specifiche propriet elettriche:
dipolare.

- 0.42

+ 0.42

C2

C1

- 0.20

+ 0.20

Il grafico di Ramachandran
Foglietti
O

C1

elica

C
CH32

La struttura delle proteine pu essere


suddivisa in quattro livelli


STRUTTURA PRIMARIA: sequenza degli amminoacidi uniti da


legami peptidici. Legami covalenti

STRUTTURA SECONDARIA:
organizzazioni regolari e
ricorrenti nello spazio dei residui amminoacidici adiacenti (come,
ad es. -elica e struttura ). Legami a idrogeno

STRUTTURA TERZIARIA: ripiegamento della catena


polipeptidica dovuto ad interazioni deboli. In tale ripiegamento
sono presenti diversi tipi di struttura secondaria. Proteine
globulari

STRUTTURA QUATERNARIA: interazioni esistenti fra varie


subunit, nel caso in cui le proteine siano costituite da pi catene
polipeptidiche.

Struttura primaria


Struttura primaria di un peptide o di una proteina:


sequenza degli amminoacidi uniti da legami peptidici
descritta per convenzione a partire dallAA amminoterminale (il primo) allAA carbossi-terminale (lultimo).
1

+
1

3HN-G-A-S-T-A-A-K-W-K-COO
2

3HN-Gly-Ala-Ser-Thr-Ala-Ala-Lys-Trp-Lys-COO

Livelli di organizzazione delle


proteine

Alcuni tipi di interazioni deboli

Importanza delle forze deboli


Legami covalenti singoli: 300-400 kJ/mol
van der Waals:

0.4 - 4 kJ/mol

legami a idrogeno:

12-30

legami ionici:

kJ/mol

20 kJ/mol

interazioni idrofobiche : < 40 kJ/mol

Struttura secondaria
Organizzazione spaziale regolare e ricorrente
locale (a breve distanza)
 Caratterizzata da interazioni deboli, soprattutto
legami a idrogeno


L-elica
(L. Pauling, 1951)

Legami a
idrogeno

Premio Nobel per la


Chimica, 1954

L-elica


stabilizzata da legami a idrogeno intra-catena

Lossigeno di un C=O lega lidrogeno di un NH di


un amminoacido 4 residui pi avanti

Lelica destrogira

Le catene laterali sporgono verso lesterno dellelica

Lelica un dipolo

L-elica un
dipolo

Che cosa destabilizza l-elica


prolina destabilizza lelica: un
anello piuttosto rigido e non pu
formare ponti ad idrogeno
 Residui -R ingombranti
 Residui R prossimi nello spazio e
dotati della stessa carica
 La

Struttura
foglietto pieghettato
Legami a idrogeno
tra catene
Gruppi R che
sporgono sopra e
sotto il piano

Foglietti paralleli ed antiparalleli

Ripiegamento (turn)
 Ripiegamento

a 180
 Quattro amminoacidi: legame a idrogeno
tra il 1 e il 4 amminoacido
 Spesso Pro, Gly
 Spesso alla superficie della proteina

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Frequenza relativa di amminoacidi


nella struttura secondaria

Quantit di -elica e
-foglietto in alcune proteine
Residui (%)
Proteina (residui)
elica
foglietto
Mioglobina (153)
78
0
Citocromo c (104)
39
0
Lisozima (129)
40
12
Ribonucleasi (124)
26
35
Chimotripsina (247)
14
45
Carbossipeptidasi (307) 38
17

11

Proteine fibrose
Gran parte della catena polipeptidica
organizzata parallelamente ad un singolo asse,
con una sola struttura secondaria (nella cheratina,
-elica)
 Nella fibroina della seta la struttura prevalente il
foglietto ; soffice perch le interazioni tra
foglietti sono deboli
 Le proteine fibrose:
hanno alta resistenza meccanica e scarsa
reattivit chimica
sono insolubili
hanno un ruolo strutturale


Le -cheratine dei mammiferi


Presenti in peli, unghie, corna
 Avvolgimenti avvolti
 Ricche in Cys (che possono formare ponti
conferendo rigidit)
 In uccelli e rettili si trovano -cheratine


18 % Cys

12

Ossidazione e riduzione della


cisteina

Ponte disolfuro
Tratto da: A.L. Lehninger Introduzione
alla Biochimica, ed. Zanichelli

Struttura delle -cheratine


Due catene
avvolte
insieme

Proto
fibrille

Tratto da: A.L. Lehninger Introduzione


alla Biochimica, ed. Zanichelli

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La Biochimica dal
parrucchiere: la permanente
- cheratina dei capelli

Il collagene: una tripla elica






Principale componente dei tessuti connettivi (ossa,


tendini, denti, cartilagini)
Tre catene avvolte tra loro (tropocollagene): elica
pi estesa dell-elica
Composizione amminoacidica particolare
Un residuo ogni tre Gly (Gly-X-Y)
Ricco in prolina
Amminoacidi insoliti (idrossilisina, idrossiprolina:
formano ponti a idrogeno) post-traduzionali;
lidrossilazione dipende dallacido ascorbico

Sono presenti anche legami covalenti inter-catena

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Dr. Jekyll and Mr. Hyde:


le malattie prioniche dipendono dalla
struttura
Il prione buono (PrPc). e quello cattivo (PrPsc)
resistente a tutto e contagioso

La conversione PrPc
PrPsc autocatalitica
S. Prusiner, Premio Nobel per la
Medicina 1997

Esempi di motivi
(struttura supersecondaria)

motivo -

barile

Motivi: raggruppamenti di elementi strutturali secondari

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Struttura terziaria
 Ripiegamenti

nello spazio dei diversi segmenti


 Eliche e nastri si impaccano assieme
 Le proteine si ripiegano per cercare la
struttura pi stabile
 Nelle proteine globulari sono importanti gli
effetti idrofobici
 Strutture in genere flessibili
 Stabilizzate da legami deboli
 Talvolta, ponti disolfuro

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Struttura di proteine globulari

Alcune proteine sono modulari


A volte un modulo pu essere ripetuto nella
stessa proteina
 Luso di moduli ha una base genetica
 Alcune proteine sono composte di due o pi
moduli (o dominii)
 Dominii: unit strutturalmente indipendenti
che possiedono caratteristiche di piccole
proteine globulari
 Ogni dominio si pu ritrovare in altre proteine


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Esempi di dominii:
lenzima gliceraldeide 3-fosfato
deidrogenasi
Dominio per il legame
con il substrato

Dominio per il legame


con il coenzima NAD

Un coenzima che partecipa ad


ossidoriduzioni: il NAD

Nicotinammide Adenina Dinucleotide

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Struttura quaternaria:
associazione di pi subunit
Costituite in modo modulare
 Minori informazioni geniche (minori errori)
 Possibilit di pi siti
 Possibilit di regolazione (interazione tra siti)
 Proteine diverse possono condividere le stesse
subunit
 Perdita di entropia dovuta alla associazione:
sfavorevole
 Guadagno di entropia dovuta al seppellimento di
residui idrofobici: molto favorevole


Oltre alla struttura quaternaria, esistono complessi


multi-enzimatici

La struttura quaternaria
della emoglobina

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Proteine complesse o
coniugate






Classe
Lipoproteine
Glicoproteine
Emoproteine
Flavoproteine
Metalloproteine






Gruppo prostetico - Esempio


Lipidi
1-lipoproteina
Glucidi
Proteine di membrana
Eme (ferroporfirina) Emoglobina
FAD
succinato deidrogenasi

Ferro
Calcio
Zinco
Manganese
Rame

Transferrina
Calmodulina
Superossido dismutasi
Catalasi
Ceruloplasmina; emocianina
Il gruppo prostetico pu essere legato alla proteina in diversi modi

Denaturazione delle proteine


Perdita della conformazione spaziale nativa
 Le proteine sonomarginalmente stabili; basta
la rottura di pochi legami deboli per innescare
la denaturazione
 Molte proteine si denaturano a 50-60C; alcune
sono stabili a temperature pi alte
 La denaturazione oltre che dalla temperatura
pu essere provocata da agenti chimici
(caotropici)
 In alcuni casi proteine possono rinaturarsi


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Proteine degli estremofili


Negli estremofili (Archaea) ci sono proteine
particolarmente stabili
 Tali proteine sono utili in campi applicativi
 Le loro caratteristiche sono legate alla struttura
(ripiegamento)

Folding e
denaturazione
delle proteine:
lesperimento di
Anfinsen
(Nobel per la Chimica
1972)
Denaturazione e refolding
della RNAasi (124 aa)

21

Ripiegamento delle proteine


In E. Coli, una proteina attiva di 100 amminoacidi
prodotta in circa 5 secondi a 37 C
 Un processo casuale per tentativi richiederebbe
venti miliardi di anni (paradosso di Levinthal)
 Probabilmente si formano nuclei di strutture
secondarie; il ripiegamento avviene in modo
gerarchico
 Ci pu essere un collasso idrofobico
 Alcune proteine si ripiegano spontaneamente

Ripiegamento delle proteine

22

Ripiegamento delle proteine

Alcune
proteine
(chaperone)
guidano
lavvolgimento (ad esempio, heat shock proteins hsp)
Chaperon: persona di et matura che un tempo accompagnava una
ragazza di buona famiglia per salvaguardarne la rispettabilit

Le hsp (come hsp70) ostacolano il ripiegamento


sbagliato (misfolding) o la denaturazione; sono
proteine molto conservate

Il corretto ripiegamento aiutato da


specifiche proteine (hsp e chaperonine);
il processo richiede energia

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Enzimi








Gli enzimi sono catalizzatori di natura proteica


(esistono ancora RNA catalitici o ribozimi)
influenzano la velocit, ma non lequilibrio
non si consumano: si trovano immutati alla fine
della reazione
consentono alle reazioni di procedere a velocit
compatibili con la vita, in condizioni blande
presenti in piccole quantit (importanza della
concentrazione)
formano complessi reversibili con il substrato
sono specifici

Enzimi


Alcuni enzimi richiedono cofattori (coenzimi)

Ogni enzima mostra condizioni ottimali (pH, T..)

In ogni cellula 2000-3000 enzimi diversi

Alcuni enzimi esistono in forme molecolari


diverse (isoenzimi)

Possono essere ingannati da inibitori (la


inibizione alla base dellazione di molti farmaci)

Spesso sono coinvolti in vie metaboliche a pi


passaggi

Talvolta soggetti a regolazione

Gli enzimi sono catalizzatori di natura


proteica: accelerano le reazioni
biologiche di diversi ordini di grandezza
Incrementi di velocit prodotti da
enzimi

Specificit
Gli enzimi:
1. catalizzano specifiche reazioni
2. Possono riconoscere selettivamente i

propri substrati (specificit geometrica)


3. Possono riconoscere la stereoisomeria


La specificit controllata dalla


struttura

Classificazione degli enzimi

La classificazione contiene 4 numeri: ad es., la


Lattato Deidrogenasi
Lattato:NAD ossidoreduttasi EC 1.1.1.27

Il sito attivo


una entit spaziale costituita da gruppi


anche lontani nella sequenza amminoacidica

Occupa una parte relativamente piccola della


molecola enzimatica

una cavit o fenditura (spesso inaccessibile


allacqua)

I substrati si legano di solito con interazioni


deboli

La specificit dipende dagli atomi/gruppi nel


sito attivo

Cofattori e Coenzimi




Cofattori che partecipano a reazioni enzimatiche


(ad esempio, nelle ossido-riduzioni)
Possono essere legati allenzima o fungere da cosubstrati (co-enzimi)
Alcuni derivano da vitamine idrosolubili

Vitamina PP
(pellagra-preventing)

Un coenzima che partecipa ad


ossidoriduzioni: il NAD

Nicotinammide Adenina Dinucleotide

Le reazioni enzimatiche:


Sono spesso in cascata (vie metaboliche)

Possono essere controllate

PUNTO DI
CONTROLLO

Velocit di reazione ed attivit


enzimatica


Velocit di reazione: quantit di substrato


trasformato nel tempo

v = - d [S] / dT = d [P] / dT
Attivit enzimatica: espressa in base alla
velocit della reazione promossa dallenzima:
 katal (SI):
quantit di enzima che converte
1 mol substrato in 1 sec
 Unit internaz. (IU) quantit di enzima che
converte 1 mol substrato in 1 min


Velocit di reazione ed equilibrio




Lequilibrio della
reazione dipende da
G

La velocit di reazione
dipende dalla barriera
energetica G

Ci sono reazioni
spontanee (G < 0) e
sfavorite dal punto di
vista cinetico

Secondo lequazione di
Arrhenius:

k = A e - G*/RT
dove:

= costante di velocit

G* = energia di attivazione
T
= temperatura assoluta

Il catalizzatore (enzima) abbassa


la energia di attivazione

Come funzionano gli enzimi


Il modello chiave-serratura (Fischer, 1894)

Sito
attivo

Emil Fischer, 1894

Il complesso ES non pu essere


troppo stabile

da: Garrett & Grisham

Il complesso
ES non pu
essere troppo
stabile

Come funzionano gli enzimi


Il modello delladattamento indotto
(induced-fit Koshland 1958)
Sito
attivo

Meccanismi della catalisi


 Catalisi

acido-base
 Catalisi covalente
 Metalloenzimi
 Prossimit

ed orientamento

10

Prossimit e
orientamento

substrati

enzima

Stato di
transizione

prodotto

Catalisi acido-base

11

Effetto del pH: la papaina

Catalisi covalente
Fosforil-enzima

Acil-enzima

Glucosil-enzima

Un centro nucleofilo
sullenzima attacca
un gruppo elettrofilo
del substrato

12

Catalisi favorita da ioni metallici




Metalloenzimi (un terzo


degli enzimi):

anidrasi carbonica

contengono metalli come


cofattori
enzimi attivati da metalli


I metalli possono:
legarsi al substrato per
orientarlo
partecipare a reazioni redox
stabilizzare cariche negative
rendere molecole dacqua
pi acide (Zn2+ e anidrasi
carbonica)

Meccanismi dazione:
le proteasi a serina









Tra di esse chimotripsina, tripsina, elastasi: sequenza,


struttura e dimensioni (PM = 25.000) simili (evolute da un
unico progenitore)
Stessa specificit di reazione, diversa specificit di
substrato
Partecipano diversi residui amminoacidici (la triade
catalitica Ser, His, Asp)
La serina forma intermedi covalenti (acil-enzima)
Listidina agisce come catalizzatore acido-base
Laspartato stabilizza e orienta listidina
Meccanismo comune ad altri enzimi (acetilcolinesterasi);
evoluzione convergente

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Sito di riconoscimento per il


substrato

Lys; Arg
Ala

Aa.
aromatici

La triade catalitica triade


catalitica Ser, His, Asp

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Fluorofosfati organici legano una


serina molto reattiva

DIFP

Asp102
His57

Listidina rende
lossigeno della serina
pi nucleofilo

O
H

Ser195
N
N
H

R2NH

H
O

R1

H N

O
Gly193

15

Meccanismi di azione:
la prima reazione della chimotripsina
Acil-enzima

triade catalitica

Da: Lehninger

16

Da: Lehninger

complesso
tetraedrico

La scissione del
complesso
tetraedrico
libera il lato
amminico della
proteina da
idrolizzare

Stabilizzazione dello
stato di transizione:
la cavit ossianionica

Lo stato di transizione
tetraedrico stabilizzato
da due legami a idrogeno

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Da: Lehninger

Lesistenza dellacil-enzima

fase esplosiva
(burst)

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La cinetica enzimatica:
Studia la velocit delle reazioni enzimatiche
 Pu fornire informazioni sul meccanismo di azione
di un enzima
 Fornisce informazioni sul ruolo di un enzima in
condizioni cellulari e sulle risposte a variazioni di
concentrazioni di metaboliti
 Fornisce informazioni su come un enzima regolato
E utile:
 nella caratterizzazione di enzimi ad impiego
industriale
 nel dosaggio di attivit enzimatiche
quali indici
diagnostici
 nel discriminare diverse forme enzimatiche sia
fisiologiche (isoenzimi) sia anomale


Velocit di reazione ed attivit


enzimatica


Velocit di reazione: quantit di substrato


trasformato nel tempo

v = - d [S] / dT = d [P] / dT
Attivit enzimatica: espressa in base alla
velocit della reazione promossa dallenzima:
 katal (SI):
quantit di enzima che converte
1 mol substrato in 1 sec
 Unit internaz. (IU)
quantit di enzima che
converte 1 mol substrato in 1 min


Velocit iniziale


La velocit dipende dal substrato, ma [S]


cambia nel tempo (si consuma)

Per semplicit, la cinetica viene studiata in


condizioni iniziali (tempo = 0)

In queste condizioni,


[S] >> [E]

[P] 0 (la reazione inversa da P a S


trascurabile)

Cinetica enzimatica
E+S

k1

ES

k2
Lenzima si combina con S formando il complesso ES in una
tappa veloce e reversibile.
k3
ES
E+P
Nella seconda tappa, spesso pi lenta, il complesso ES si
decompone per dare il prodotto pi lenzima libero.
La velocit della reazione dipende dalla concentrazione di ES (I
ordine):

v0 = k3 [ES]

Cinetica enzimatica

Michaelis e
Menten

Cinetica enzimatica:
assunzione dellequilibrio
 Il

complesso ES in rapido equilibrio con


lenzima libero E
se k3 << k2

Ks = k2/ k1

assunzione dello stato stazionario:


 d [ES]/dt = 0

Cinetica di Michaelis-Menten
Reazioni catalizzate da enzimi
Un grafico di velocit iniziale contro [S] mostra
tre zone:

Km ha le dimensioni di una concentrazione

Parametri cinetici


Km

kcat costante catalitica (numero di turn-over)

Vmax (dipende da [E0])

kcat/Km (costante di specificit o efficienza


catalitica)
Inibizione (Ki)

Significato della KM
una costante di dissociazione apparente:
misura il grado in cui lenzima legato al substrato
 Dipende dalle costanti cinetiche:
KM = (k2 + k3)/ k1
 Se ha valori bassi, lenzima si satura con poco
substrato (affinit elevata)
 Corrisponde alla concentrazione di S per la quale:
v0 = VM/2
 caratteristica di un enzima per un certo substrato


Significato della KM
Spesso la KM ha valori
simili alle concentrazioni
cellulari fisiologiche dei
substrati (in rosa)

Numero di turn-over o
costante catalitica (kcat)

VM = kcat [E0]
Massimo numero di molecole di substrato
convertite nella unit di tempo da una
molecola (sito) di enzima
 correlata alla velocit di decomposizione
del complesso ES


Grafico degli inversi

Consente di
linearizzare i dati

Significato di kcat/Km
(costante di efficienza o di specificit)


D una idea della efficienza relativa con cui


vengono trasformati substrati diversi (specificit)

D una idea dellefficienza catalitica dellenzima

Enzimi perfettamente evoluti hanno costanti


cinetiche che si approssimano alla diffusione

Enzimi per cui kcat/Km vicino alla velocit di


associazione controllata per diffusione
kcat (s-1)

Acetilcolin- Acetilcolina
esterasi

1,4. 104

9. 10-5

kcat /Km
(s-1M-1)
1,6. 108

Anidrasi
carbonica

CO2

1. 106

0,012

8,3. 107

Catalasi

H2O2

1. 107

2,5 . 10-2 4. 108

Fumarasi

Fumarato

800

5. 10-6

1,6. 108

2. 103

2. 10-5

1 . 108

Enzima

Substrato

-lattamasi Benzilpenicillina

Km (M)

Effetto della temperatura


denaturazione

Tratto da: Champe,


Harvey, Ferrier Le
basi della Biochimica,
Zanichelli

Relazione tra temperatura e


velocit (Arrhenius)
ln v = cost. - Eatt/RT

Inibizione enzimatica


Reversibile
competitiva
non competitiva e mista
(acompetitiva)

Irreversibile (inattivazione)

Inibizione
competitiva

Inibizione competitiva

Linibitore competitivo riduce la concentrazione di


enzima libero disponibile per legare il substrato

Inibizione competitiva

10

Il grado di inibizione dipende da [I] e


da KI (affinit dellinibitore)

E possibile ricavare KI

Inibizione non competitiva

(KI = KI)

11

Inibizione non competitiva

Inibizione non competitiva

12

Inibizione mista

(KI KI)

Inibitori irreversibili
Si legano allenzima con legami stabili (covalenti)
 Non possono essere rimossi con mezzi semplici
 Cinetica analoga allinibizione non competitiva
 Sono utilizzati


nello studio dei siti catalitici


come farmaci (anti-metaboliti)
come anti-parassitari

13

Un reattivo
per le
cisteine

Inibitori a serina
(acetilcolinesterasi)
DIFP, esteri fosforici (Parathion), gas nervini

Sarin

14

Inibitori come farmaci: i sulfamidici

Un inibitore competitivo del metabolismo


dei folati (diidrofolato reduttasi)

15

La parete batterica e il
peptidoglicano
Vasto polimero di
glucidi e piccoli peptidi
tenuti assieme da
legami crociati
 Struttura rigida
resistente alla lisi
osmotica


Azione della
penicillina

Inibisce la formazione
di legami crociati nel
peptidoglicano della
parete batterica
Non esiste analoga
reazione nel
metabolismo animale

16

Inibitori come farmaci:


le statine
Abbassano i livelli di
colesterolo inibendo lHMGCoA
reduttasi, enzimachiave nella sintesi endogena
del colesterolo

Inibitori come farmaci:


inibitori delle HIV proteasi
Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere
poliproteine
 Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro;
Tyr-Pro)
 occorrono inibitori ad alta specificit


17

Inibitori come farmaci:


gli inibitori suicidi
Di norma poco reattivi
 vengono riconosciuti dal sito catalitico
 reagiscono covalentemente col sito catalitico,
inattivandolo
 Ottimi candidati come farmaci per i minimi
effetti collaterali


18

Regolazione enzimatica

Quantit di enzima (sintesi /degradazione)

Cofattori

Modificazioni allosteriche
cooperativit (effetti omotropici)
effettori
(effetti eterotropici)

Modificazioni covalenti
reversibili: fosforilazione/defosforilazione
irreversibili: attivazioni proteolitiche

Possono coesistere pi meccanismi di regolazione

Un enzima regolato (allosterico):


ha cinetica sigmoide
 quasi sempre polimerico
 mostra cooperativit
 Esiste in due forme, T ed R, a diversa affinit
(T a bassa affinit)


T R


Pu essere descritto con gli stessi modelli


usati per lemoglobina

Cinetica di un enzima regolato

Un caso di cooperativit
estrema

Concentrazione
critica di
substrato

Effettori allosterici

Effettori allosterici

Inibizione retroattiva (a feed-back)

La reazione catalizzata dalla


aspartato transcarbamilasi (ATCasi)

una
pirimidina

Laspartato
carbamiltransferasi

Modificazioni covalenti
Modificazione
Fosforilazione

Donatore

Esempio

Funzione

ATP

Glicogeno Metabolismo
fosforilasi glucosio;
segnalazione
Acetilazione
Acetil CoA Istoni
Impaccamento
DNA
ADPNAD
RNA
Trascrizione
ribosilazione
polimerasi
-carbossilazione Bicarbonato Trombina Coagulazione

Regolazione covalente:
fosforilazione/defosforilazione
(Ser, Thr; Tyr)

Regolazione covalente:
fosforilazione/defosforilazione
La regolazione per fosforilazione un processo
comune
 30-50 % delle proteine negli eucarioti possono
essere fosforilate
 Nelluomo esistono pi di 500 chinasi
 Esistono numerose chinasi che riconoscono
sequenze consenso di amminoacidi
 Possono esserci fosforilazioni multiple


Amplificazione in
cascata
Quando enzimi attivano
altri enzimi, il numero di
molecole influenzate in
una cascata aumenta
geometricamente

Numerose
chinasi sono
coinvolte nella
trasduzione di
segnali

Attivazioni
proteolitiche:
gli enzimi digestivi

zimogeni

Vengono prodotti anche inibitori delle proteasi

Attivazioni proteolitiche:
la cascata della coagulazione

Trasporto dellossigeno
 Bassa solubilit di O2 in soluzioni acquose come il

sangue (1 x 10-4 M)
 In singole cellule o piccoli organismi sufficiente
la diffusione
 Esistono numerose proteine che legano ossigeno
Emoglobina (ferro)
 vertebrati
Emocianine (rame)
 molluschi
Clorocruorine (ferro)
 Anellidi

Mioglobina ed Emoglobina
Proteine globulari complesse (contengono un
gruppo prostetico)
Mioglobina

2 2

1
Emoglobina

Max Perutz, Premio Nobel per la Chimica 1962

Il gruppo prostetico detto eme


costituito da ferroprotoporfirina IX e Fe (II)
 Nellemoglobina funzionale il Ferro rimane Fe2+ e
non si ossida
 Esiste una emoglobina non funzionale contenente
Fe3+ (metaemoglobina)


pirrolo

gruppi
propionici

globina

Nelleme il Ferro (II) pu avere


sei legami di coordinazione:
Quattro con gli N degli anelli
pirrolici
 Uno con una ISTIDINA
(prossimale) della globina
 Uno disponibile per lossigeno
 Il ferro deve essere protetto
dalla ossidazione


His

sito per lossigeno

Vista di lato

proteina

Residuo di His
prossimale

Piano dellanello
porfirinico

Istidina prossimale e distale

Ruolo dellistidina distale


monossido di
carbonio

Localizzazione delleme
tasca idrofobica
His prossimale

His distale

La ferro-protoporfirina responsabile del


colore del sangue

Mioglobina ed Emoglobina


La struttura delle due proteine diversa:


Mioglobina: monomero con un gruppo prostetico (eme) che
complessa uno ione Fe2+.
Emoglobina: tetramero (nei mammiferi) fatto di subunit (22)
simili alla mioglobina; ognuna contiene un gruppo prostetico (eme)
che complessa uno ione Fe2+.

Le funzioni biologiche delle due proteine sono diverse:


Mioglobina: lega con lata affinit lO2 e lo rende disponibile
SOLO quando la pO2 molto bassa (muscolo, cetacei in
immersione).
Emoglobina: lega lO2 quando la pO2 alta (polmoni, branchie) e
lo rilascia quando la pO2 pi bassa (tessuti, cellule).

La Mioglobina:
una proteina monomerica globulare compatta
 Contiene otto segmenti (A, B, C...) ad -elica
(circa 75%)
 Possiede una cavit idrofobica che contiene
leme
 153 amminoacidi
 PM 17.000


Il legame con lossigeno




Nella mioglobina:
Mb + O2

KD =

MbO2

[Mb] [O2]
[MbO2]

Si definisce la saturazione frazionale (O2 ) la


frazione di siti che hanno ossigeno legato:
O2 =

[MbO2]

[Mb] + [O2]

O2 =

[O2]

KD + [O2]

La MIOGLOBINA mostra una caratteristica


curva di saturazione iperbolica
Y = [O2] /(K D + [O2])

= pO2 /(p50 + pO2)

Ruolo della mioglobina




Mb ha unalta affinit per


lossigeno: p50 bassa (2.8 Torr)

Riesce ad estrarre lossigeno


dai capillari

Quando le cellule sono


metabolicamente attive, Mb
rilascia lossigeno ai muscoli

Lemoglobina:
costituita da 4 subunit (tetramero 22)
 una proteina regolata (allosterica)
 mostra una curva di saturazione sigmoide
(cooperativit positiva)


Confronto tra Mb e Hb

Lemoglobina: una proteina


regolata
 Effetti

omotropici (dovuti al legando):

cooperativit positiva
 Effetti

eterotropici (dovuti ad altre molecole,


che si legano in un sito diverso da quello
attivo)
allosterismo

Come si spiega la regolazione ?


Lemoglobina esiste in due conformazioni (Perutz):
- Conformazione T (tesa), a bassa affinit per lO2 (forma
deossigenata)
- Conformazione R (rilassata), ad elevata affinit per lO2


T R


Il legame della prima molecola di O2 causa la rottura di


alcune interazioni tra le subunit, rendendo pi facile il
legame con le successive molecole di O2: cooperativit
positiva. Il cambiamento di affinit dovuto ad una
modificazione conformazionale.
Nella emoglobina, la forma T stabilizzata da ponti salini

Effetto del legame con O2

Cooperativit positiva
STATO R

STATO T

10

Modello concertato (MWC)


Stato T

La proteina un oligomero

Esiste in due stati


conformazionali, T ed R in
equilibrio

La forma non legata T, a


bassa affinit

Tutti i siti di legame sono


equivalenti

Stato R

Lemoglobina finemente modulata:


effetto del pH e della CO2


In acqua, la CO2 libera H+ (reazione favorita dalla


anidrasi carbonica)

CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3


gli ioni idrogeno stabilizzano la forma deossi:
H+Hb + O2 HbO2 + H+

11

Lemoglobina finemente modulata:


effetto del pH (effetto Bohr)
A pH pi bassi la
curva di saturazione si
sposta a destra:
minore affinit

Lemoglobina finemente
modulata: effetto della CO2


La CO2 si lega a gruppi amminici terminali con


formazione di carbammati:
R-NH2 + CO2 R-NH-COO- + H+

Anche questa reazione stabilizza la forma T


(deossi);
 inoltre consente il trasporto della anidride carbonica
(15-20%), che viene rilasciata quando in presenza di
alte concentrazioni di O2 la forma ossi prevale


12

Il sistema tamponante del sangue


 Il principale sistema tampone il bicarbonato:

CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3

La reazione catalizzata dallenzima anidrasi carbonica

da: Berg et al. Biochimica 6E - Zanichelli

Lemoglobina finemente
modulata: ruolo del BPG

13

Lemoglobina finemente
modulata: ruolo del BPG
BPG stabilizza la forma deossi legandosi ad
una cavit con gruppi positivi

Concentrazione alta nel sangue

Ruolo del BPG

14

Emoglobina
fetale Hb F

Emoglobina fetale: BPG si lega


debolmente
His 143 assente in HbF

15

Varianti dellemoglobina


Ci sono almeno 800 varianti della emoglobina:


circa 95% riguardano un solo amminoacido

Il 5 % della popolazione mondiale ha una


emoglobina diversa da quella normale
(HbA)

Numerose mutazioni sono silenti (non


patologiche) - mutazioni conservative

Consentono
di
struttura/attivit

studiare

relazioni

Anemia falciforme ed HbS




In Hb S, una Val sostituisce Glu in una posizione


superficiale;

Val pu dare legami idrofobici con unaltra Hb,


particolarmente nella forma deossi;

Le molecole Hb si aggregano in fasci e possono


precipitare (eritrociti falciformi)

Distribuzione geografica caratteristica

16

In Hb S, una Valina sostituisce un


Acido glutammico
Hb S meno acida di HbA

Distribuzione geografica

Il tratto falciforme (eterozigoti) conferisce protezione dalla malaria.


Nella talassemia sono coinvolte intere catene.
da: Berg et al. Biochimica 6E - Zanichelli

17

Lipidi
Composti eterogenei, idrofobici (poco solubili
in acqua, solubili in solventi apolari)
 Funzioni principali:


riserve energetiche (grassi e olii)


costituenti delle membrane
in alcuni casi, messaggeri (ad esempio, ormoni)
agenti emulsionanti

Acidi grassi
Acidi carbossilici a lunga catena, spesso a numero
pari di carbonii (i pi comuni hanno 12-24 carbonii)
 Possono essere saturi o insaturi:


gli insaturi sono di solito cis


le insaturazioni spesso cominciano dal C-9 (9)
le insaturazioni sono ogni tre carbonii (non sono
coniugate)


I punti di fusione:
aumentano con la lunghezza
diminuiscono con il grado di insaturazione

La fluidit aumenta con il grado di insaturazione

Alcuni acidi grassi naturali

Acidi grassi saturi e insaturi

cis

Acido stearico 18:0

Acido oleico 18:1 (9)

Impaccamento degli acidi grassi

Triacilgliceroli (trigliceridi)





Esteri del glicerolo con acidi grassi


Riserva energetica depositata in forma anidra
Possono produrre acqua metabolica
Sono isolanti termici

glicerolo

Cere
Esteri di acidi grassi a lunga catena con
alcoli a lunga catena
 Funzioni energetiche e protettive
 Di largo impiego nellindustria farmaceutica
e cosmetica


Classi principali di lipidi


Lipidi di
deposito
(neutri)

Lipidi di membrana (polari)

fosfolipidi
Triacilgliceroli

glicerofosfolipidi

glicolipidi
sfingolipidi

sfingolipidi

Glicerofosfolipidi
Lipidi polari (anfipatici)
 Il glicerolo esterificato:


con due acidi grassi


con un gruppo fosfato


(code non polari)


(testa polare)

Il gruppo fosfato a sua volta pu essere


esterificato con un altro alcool

Glicerofosfolipidi

Glicerofosfolipidi e fosfolipasi
I fosfolipidi possono essere tagliati
da fosfolipasi specifiche
 La fosfolipasi C libera diacilglicerolo,
una molecola segnale


Sfingolipidi
Derivano dalla sfingosina, un amminoalcool insaturo a 18 carbonii: i
C-1, 2, 3 somigliano al glicerolo

Un esempio: la sfingomielina:
Ossidrile in posizione 1
esterificato con fosforilcolina
Legame ammidico con un
acido grasso (cerammidi)

Sfingolipidi


Cerammide: unit comune


Sfingomieline (testa polare di fosfocolina o
fosfoetanolammina)
Glicosfingolipidi



Cerebrosidi: singola unit saccaridica


Gangliosidi: teste polari con oligosaccaridi complessi
(abbondanti sulla superficie esterna delle cellule)

Gli zuccheri di glicosfingolipidi sono i determinanti dei


gruppi sanguigni umani

Sfingolipidi

Lehninger Introduzione alla Biochimica, ed. Zanichelli

Steroidi e colesterolo
Quattro anelli condensati
(ciclopentano-peridrofenantrene);
nucleo planare e rigido
 Precursore di ormoni steroidi, sali
biliari, vitamina D


Testa polare

I sali biliari emulsionano i lipidi

Fosfolipidi in
acqua

Ad esempio,
acidi grassi
lisofosfolipidi

Tratto da: A.L. Lehninger Introduzione alla Biochimica, ed. Zanichelli

Membrane
Strutture laminari che delimitano diversi compartimenti cellulari
 Costituite da lipidi anfipatici e proteine (contengono anche carboidrati)
 Proteine specifiche svolgono ruoli funzionali
 Semi-permeabili
 Asimmetriche
 Fluide
 Resistenti e flessibili: si auto-assemblano e si
sigillano


Schema di una membrana:


il mosaico fluido

esterno

interno
proteina
periferica

Mobilit dei lipidi e fluidit




Movimento delle catene aciliche


e diffusione laterale

La
fluidit
temperatura

La
fluidit
dipende
dalla
composizione
(presenza
di
insaturi, lunghezza delle catene)

Il colesterolo modula la fluidit

Il movimento trasversale (flipflop) lento; richiede enzimi


(flippasi e floppasi) e spesso ATP

dipende

dalla

10

Temperatura di transizione

(stato paracristallino fluido)

Composizione in acidi grassi di cellule di


E. coli coltivate a temperature diverse
Percentuale rispetto agli acidi
grassi totali
10 C 20 C 30 C 40 C
Acido miristico

(14:0)

Acido palmitico (16:0)

18

25

29

48

Acido palmitoleico (16:1)

26

24

23

Acido oleico

38

34

30

12

2.9

2.0

1.6

0.38

(18:1)

Rapporto insaturi/saturi

11

Movimento flip-flop
Le flippasi possono
richiedere energia
 In genere, determinano
asimmetria nella
membrana


Composizione e asimmetria

12

FRAP: una misura della mobilit

Proteine di membrana


Proteine integrali
strettamente legate alla membrana con interazioni
idrofobiche
si possono rimuovere solo disgregando la
membrana (con detergenti)
Possono contenere pi segmenti transmembrana

Proteine periferiche o estrinseche


legate blandamente ad una faccia della membrana
una volta rimosse sono solubili

Proteine ancorate covalentemente a lipidi (ad


esempio, GPI glicosil-fosfatidilinositolo)

13

Un esempio di proteina
integrale, la
batteriorodopsina (7-S)

Zattere o lipid rafts


spazio intracellulare

Raft

spazio extracellulare
1: porzione non raft della membrana
2: lipid raft (ricco di colesterolo e sfingolipidi)
3: proteina transmembrana associata a lipid raft
4: proteina nella porzione non raft della membrana
5: proteina glicosilata
6: proteina ancorata al GPI (glicosil-fosfatidilinositolo)
7: colesterolo
8: glicolipidi

14

Lipidi biologicamente attivi


Ormoni steroidei
 Fosfatidilinositolo e suoi derivati fosforilati:


segnalazione


Cerammide e suoi derivati


Segnalazione

Eicosanoidi (derivati dellacido arachidonico)


Prostaglandine
Trombossani
Leucotrieni

Eicosanoidi

FANS

Derivano principalmente dallacido arachidonico

Tratto da: A.L. Lehninger Introduzione alla Biochimica, ed. Zanichelli

15

Eicosanoidi
Esplicano il loro ruolo a livello locale: vita breve
 Prostaglandine
Numerosi tipi
Stimolano la contrazione uterina, regolano il flusso sanguigno,
sono legate allinfiammazione


Trombossani
Prodotti nelle piastrine, coinvolti nella coagulazione

Leucotrieni
segnali biologici: ad esempio, inducono la contrazione della
muscolatura liscia nei polmoni

La cicloossigenasi (COX) che partecipa alla sintesi di


prostaglandine e trombossani inibita da FANS

16

Sistemi di trasporto di
membrana
 Diffusione

semplice (processo spontaneo


non mediato)
 Trasportatori
Diffusione facilitata o trasporto passivo
Trasporto attivo
 primario
 secondario

 Canali

e pori

Diffusione semplice
Processo spontaneo non
mediato.
La velocit dipende dal
gradiente [C], dalla
superficie di contatto e
da un coefficiente di
diffusione (legge di Fick)

Il flusso segue il gradiente


di concentrazione

oppure un gradiente
elettrico (o entrambi)

Diffusione semplice


Non sono richieste proteine particolari

Le specie si muovono seguendo il gradiente di


concentrazione; da [C] pi alta a [C] minore

Spesso, bassi coefficienti di permeabilit: velocit


bassa

Poche specie diffondono efficacemente per questa via


(gas come lossigeno, molecole non polari come gli
steroidi...)

Trasportatori
di membrana
Soggetti a modificazioni
conformazionali
I trasportatori (come gli
enzimi) diminuiscono
lenergia di attivazione
del processo di trasporto

Trasporto passivo
(diffusione facilitata)


Come per le reazioni che richiedono enzimi, la


diffusione pu essere possibile dal punto di vista
termodinamico, poco probabile dal punto di vista
cinetico.

I soluti si muovono secondo gradiente (direzione


favorita termodinamicamente)

Proteine aumentano la velocit di trasporto


(confronta con gli enzimi)

Il trasporto mostra cinetiche di saturazione

Trasporti mediati e non mediati:


differenze
 Velocit
 Specificit
 Saturazione
 Competizione
 Inibizione/inatti-

vazione

Il trasporto passivo
del glucosio (Glut1;
glucosio permeasi)
Dodici eliche trans-membrana
 Due siti di legame (interno ed
esterno)
 Cambiamento conformazionale in seguito al legame con
il glucosio
 Glucosio nel plasma: ~ 5 mM
 Famiglia di trasportatori Glut:
Glut4 sotto il controllo
dellinsulina


pompa
del
sodio
Ad es., Glut

Trasporto attivo
I soluti si muovono contro gradiente (chimico,
elettrico o entrambi)
 Il processo sarebbe sfavorito termodinamicamente


Trasporti attivi primari: lenergia deriva direttamente


da ATP
Trasporti attivi secondari: lenergia deriva da un altro
processo accoppiato e favorevole (ad esempio,
gradienti ionici)

Un trasportatore attivo primario:


la Na+-K+ ATPasi
Escono 3 Na+
 Entrano 2 K+
 contro gradiente
chimico ed elettrico


Un trasportatore
attivo primario:
la Na+-K+ ATPasi
Dapprima ATP fosforila il
trasportatore e ne cambia la
specificit
Il cambiamento conformazionale

dovuto
alla
fosforilazione di un Asp
(ATPasi di tipo P)
La proteina fosforilata lega K+
Il fosfato si libera e K+ viene
rilasciato

La pompa del sodio inibita


dalla ouabaina e da glicosidi
cardioattivi come la digitossina

La concentrazione di calcio
intracellulare controllata
[Ca2+] in circa 0.1 M, circa 4 ordini di
grandezza pi bassa che allesterno
 Esistono almeno due Ca-ATPasi di tipo P, una
di membrana citoplasmatica che espelle il calcio
e una del reticolo endoplasmico/sarcoplasmico
(SERCA) che lo sequestra
 Nella contrazione muscolare, il calcio
rilasciato dal reticolo
 Esiste anche uno scambiatore Na+/Ca2+


Un trasportatore attivo secondario:


il trasportatore intestinale di glucosio


Il trasportatore porta allinterno (sinporto)


il glucosio contro gradiente (G positivo)
il sodio secondo gradiente (G negativo)

Lenergia (sotto forma di ATP) consumata


per espellere di nuovo il sodio (pompa del
sodio)

Trasportatori attivi primari e


secondari

La resistenza ai farmaci antitumorali (MDR)


Dipende da una
pompa proteica che
espelle sostanze
estranee (in genere
idrofobiche) come
alcuni farmaci

Glicoproteina P

Sistemi di trasporto in cellule di


mammifero


Glucosio











Amminoacidi
H+ (ATPasi di tipo F)
Na+, K+
Ca++ (SR)
Ca++, Na+
Lattosio, H+ (E. coli)








Passivo
Co-trasporto attivo con Na+
Co-trasporto attivo con Na+
Attivo (mitocondri)
Attivo primario (antiporto)
Attivo primario
Scambio attivo (secondario)
Attivo secondario (sinporto)

Canali


Buco acquoso nella


membrana

Velocit molto elevate


(anche 1000 volte superiori
ai trasportatori

Gating (possono essere


aperti o chiusi)




Non saturabili
Seguono il gradiente

10

La famiglia delle acquaporine


Nei mammiferi esistono almeno 11 proteinecanale integrali per lacqua
 Diversa localizzazione e ruolo
 Flusso molto veloce
 Peter Agre, Premio Nobel per la Chimica, 2003


Il canale per il sodio


dipendente dal voltaggio
bloccato dalla tetrodotossina

11

Il recettore dellacetilcolina

Il canale del recettore


dellacetilcolina
Residui idrofobici
ingombranti Leu
tengono chiuso il
canale

Il legame di due
acetilcoline provoca una
rotazione

Con i recettori occupati,


le
eliche
espongono
residui polari verso il
canale

12

Ionofori mobili e che formano canali




Molecole organiche (spesso di origine


batterica) che aumentano la permeabilit di
membrana
formanti canali
trasportatori mobili

Valinomicina
Struttura ciclica; contiene D- ed L-amminoacidi
Affinit per il potassio 1000 volte superiore rispetto al
sodio

Ionoforo specifico per K+

13

Gramicidina

14

Il metabolismo;
sistemi enzimatici coordinati per:
ottenere energia dallambiente (luce solare o sostanze
nutrienti)
convertire molecole nutrienti nelle molecole caratteristiche
della cellula
polimerizzare
precursori
(per
polisaccaridi, acidi nucleici)

produrre

proteine,

sintetizzare/degradare molecole specializzate


In E. coli, pi di 1000 reazioni chimiche
Alto livello di coordinazione

Relazioni metaboliche
OSSIDAZIONI

RIDUZIONI
Da: Lehninger

Le vie metaboliche
 Sono spesso irreversibili (G << 0)
 Molte tappe sono prossime allequilibrio (G 0) e





dipendono dalle concentrazioni di reagenti


Una (o pi di una) tappa iniziale di controllo
(irreversibile); qui spesso il reagente si accumula (diga)
Vie cataboliche e anaboliche sono spesso diverse
Le vie cataboliche sono convergenti; quelle anaboliche
divergenti
Negli eucarioti esiste compartimentazione: questo
consente di separare alcune vie e di mantenere
concentrazioni diverse di metaboliti ed enzimi

I flussi sono controllati


dalle reazioni
irreversibili

Reazione limitata
dallenzima (lontano
dallequilibrio)
Reazioni limitate
dal substrato
(prossime
allequilibrio)

Controllo del metabolismo


Attivit enzimatica (regolazione allosterica e covalente)
Quantit di enzimi (induzione e repressione)
Disponibilit di substrati
Stato energetico
Carica energetica =

ATP + 1 / 2 ADP
ATP + ADP + AMP

Le vie cataboliche sono convergenti

Da: Champe

Esempi di reazioni biochimiche


Trasferimenti di gruppo (sostituzione nucleofila)
Ossido-riduzioni
Eliminazioni, isomerizzazioni, riarrangiamenti
Reazioni che formano/rompono legami C-C

Composti ad alta energia

La completa ossidazione di combustibili


libererebbe notevoli quantit di energia:

Glucosio: 2850 kJ/mole


Palmitato 9780 kJ/mole

Il metabolismo procede a tappe: lenergia


immagazzinata a pacchetti in intermedi
ad alta energia

ATP, un composto con elevata


energia di idrolisi
Adenina

ATP, un composto con elevata


energia di idrolisi

ATP

Sub-

Trasferimento di
un gruppo fosfato

Sub-

Trasferimento di un
gruppo adenilico

Importanza di intermedi fosforilati

Composti in genere stabili cineticamente

LATP usato per alimentare numerosi


processi
Luce (fotosintesi) o composti ad alta
potenziale (respirazione)
The ATPenergia
cycle

Sintesi di
macromolecole
(proteine,
DNA)

Sintesi di altri Movimenti


componenti
cellulari e
cellulari
lavoro
meccanico

Trasporti di
Generazione Calore
molecole/ ioni di potenziali
contro gradiente elettrici

Nelluomo ci sono circa 100 g di ATP: a riposo si consumano


circa 40 kg ATP/giorno

Reazioni accoppiate

Coenzimi ossido-riduttivi

NAD+

FAD

Coenzimi ossido-riduttivi
Piridinici (NAD e NADP)
Derivano dalla niacina (Vitamina PP o B3)
Cosubstrati di pi di 200 enzimi
Ruoli metabolici specializzati
Accettano due elettroni (ione idruro H:-)
NADPH coinvolto nelle biosintesi riduttive

Flavinici (FMN e FAD)


Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)
Possono trasferire un elettrone alla volta
In genere, legati saldamente agli enzimi (flavoproteine)

Un coenzima che partecipa ad


ossidoriduzioni: il NAD(P)

Nicotinammide Adenina Dinucleotide

Ossidoriduzioni ed energia

Lossidazione di coenzimi ridotti un processo


esoergonico
Lenergia liberata pu essere utilizzata per la
sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa)
ATP pu essere generato anche dallaccoppiamento con processi pi esoergonici
(fosforilazione a livello del substrato)

I coenzimi flavinici e piridinici sono


accettori di elettroni che provengono dalle
ossidazioni
FAD

FADH2

- CH2- CH2-

- CH = CH -

Il substrato si ossidato (ha perso elettroni), il FAD si


ridotto a FADH2 (ha acquistato elettroni)
OH
- CH - CH2-

NAD+

NADH

O
- C - CH2-

Il substrato si ossidato (ha perso elettroni), il NAD+


si ridotto a NADH (ha acquistato elettroni)

OSSIDANTI

RIDUCENTI

Gli elettroni possono trasferirsi da prodotti ridotti a reagenti


ossidati di una reazione sovrastante
Da: Lehninger

10

Il glucosio svolge un ruolo centrale


Glicogeno, amido,
saccarosio...

deposito

glicolisi
(10 reazioni)

Acidi grassi

Alcuni aspetti della glicolisi


Via antica e conservata
Formazione di ATP nella glicolisi
Destino del piruvato
Energia rimasta nel piruvato
Ruolo degli intermedi fosforilati
Altri zuccheri come fruttosio e galattosio sono

trasformati in intermedi della glicolisi


Il NAD+ come reattivo limitante
Fermentazioni: reazioni anaerobiche che
rigenerano NAD+

Glicolisi: fase preparatoria


Fosforilazione del glucosio e
formazione della
gliceraldeide-3-P

Glicolisi: fase di recupero


conversione della gliceraldeide-3-P
Formazione di ATP

Glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 piruvato + 2 NADH +


2 ATP + 2 H2O + 4 H+

Il glucosio
trasportato
allinterno
della cellula

1. Attivazione del glucosio:


la prima tappa irreversibile e regolata

G =

- 33.9 kJ/mol

Reazioni accoppiate

Isoenzimi della esochinasi:


ruolo metabolico
inibita da G-6-P

Vmax/2
epatica (non inibita da G-6-P)

Il glucosio trattenuto nella


cellula dalla fosforilazione a G6P

La fosforilazione
sposta lequilibrio a
destra

2. Isomerizzazione a fruttosio

pi facile fosforilare un -OH primario

3. La seconda fosforilazione catalizzata


dalla fosfofruttochinasi (PFK-1)

La fosfofruttochinasi un enzima
regolato

4. Laldolasi catalizza una


condensazione aldolica

G = - 0.23 kJ/mol

5. I prodotti dellaldolasi possono


interconvertire per isomerizzazione

La glicolisi prosegue dalla GA3P


TPI un enzima perfetto

6. Lossidazione dellaldeide guida la


formazione dellacilfosfato, composto
ad alta energia

Meccanismo dazione della


gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi

tioemiacetale

tioestere

7. La fosfoglicerato chinasi forma ATP


(fosforilazione a livello del substrato)

Le reazioni 6) e 7) sono energeticamente accoppiate:


G = 6.3 18.5 = - 12.2 kJ/mol

Importanza di intermedi fosforilati

6, 7 - riassumendo:
Unaldeide (gliceraldeide-3-P) ossidata a
1,3 bis-fosfoglicerato (che poi si trasforma
in 3-P-glicerato)
Il NAD+ si riduce a NADH
Si forma ATP, a spese dellenergia di
ossidazione del carbonio
La reazione 7) spinge in avanti la
reazione 6) con cui accoppiata

10

Una deviazione nella glicolisi


Nei globuli rossi, da 1,3 BPG per azione di
una mutasi si forma 2,3 BPG, effettore
negativo dellemoglobina

8. La fosfoglicerato mutasi riposiziona il


fosfato per la reazione successiva

11

9. La deidratazione catalizzata da enolasi


forma un composto ad alta energia

10. Lenergia del PEP usata per formare un


secondo ATP (piruvato chinasi)

Reazione fortemente
esoergonica

12

Bilancio energetico
della glicolisi

Le reazioni della
glicolisi sono
utilizzate in parte
nella via sintetica
(gluconeogenesi)

13

Destino del piruvato e del NADH

In condizione aerobiche,

il piruvato ossidato completamente a CO2 e


acqua (ciclo dellacido citrico)
Il NADH partecipa al trasferimento di elettroni
fino allaccettore finale ossigeno: in questo
processo si rigenera NAD+

In condizioni anaerobiche,

Il piruvato trasformato per rigenerare NAD+


(fermentazioni)

Fermentazione lattica
Serve per rigenerare NAD +
Il lattato trasportato dal
sangue al fegato dove si pu
riformare glucosio (ciclo di
Cori)

14

Fermentazione
alcolica (lieviti)
necessario un cofattore, la
tiamina pirofosfato

La tiamina pirofosfato
Deriva dalla tiamina, vitamina B1, anti beri-beri
Partecipa a reazioni di decarbossilazione,
trasportando unaldeide attiva
Forma un carbanione sullanello tiazolico (che
contiene un H acido)

15

H acido

Si forma un carbanione

Vitamina B1

Meccanismo
dazione della
TPP

Da: Lehninger

16

La gluconeogenesi
Alcuni tessuti (globuli rossi, cervello..)
dipendono dal glucosio
Sintesi di glucosio da precursori non
glucidici:

Lattato, piruvato, ossalacetato, glicerolo


Amminoacidi (scheletro carbonioso)

Usa le reazioni glicolitiche in direzione


inversa tranne quelle esoergoniche:

piruvato chinasi
fosfofruttochinasi
esochinasi

Principalmente nel fegato


Glicolisi e gluconeogenesi strettamente
coordinate

La piruvato carbossilasi produce


ossalacetato
La reazione richiede ATP, HCO3- e biotina (un coenzima

che trasporta CO2 )


La biotina legata covalentemente a una lisina dellenzima
Regolazione: quando ATP o acetil-CoA sono alti, il
piruvato entra nella gluconeogenesi
Esiste un "problema di conversione " nei mitocondri
(passaggio di metaboliti tra citosol e mitocondri)

La biotina
*

Biotina

Carbossi-biotinilenzima

Vitamina (H) sintetizzata da batteri intestinali


Trasporta CO2
Legata covalentemente a enzimi (braccio mobile)
La carbossilazione richiede ATP

Lossalacetato
un intermedio del
ciclo di Krebs
(mitocondri)

La piruvato carbossilasi
attivata da acetil-CoA

Acidi grassi

Prima
deviazione

piruvato
chinasi

Il trasporto del
malato produce
NADH citosolici

PEPCK
citosolica

MDH
citosolica

La piruvato carbossilasi nel


mitocondrio

Meccanismo di
azione della piruvato
carbossilasi

La fosfoenolpiruvato
carbossichinasi
Lossalacetato un
piruvato attivato
Occorre molta energia
proveniente:
dalla decarbossilazione
dal GTP

Le altre
due
deviazioni

Terza
deviazione

Seconda
deviazione

Nella sintesi di un glucosio si


consumano 6 ATP
Dato che nella glicolisi si
formano 2 ATP, un ciclo
futile costerebbe 4 ATP

Glicolisi e gluconeogenesi
 La glicolisi e la gluconeogenesi sono vie metaboliche



spontanee (esoergoniche)
Se fossero attive simultaneamente si avrebbe un ciclo
futile con consumo di energia: necessaria una regolazione
reciproca
Glicolisi:
 glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi  2 piruvato + 2 NADH
+ 2 ATP

 Gluconeogenesi:

 2 piruvato + 2 NADH + 4 ATP + 2 GTP  glucosio + 2 NAD+


+ 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi

 Glicolisi + gluconeogenesi:
 2 ATP + 2 GTP  2 ADP + 2 GDP + 4 Pi

Il fruttosio 2,6bisfosfato un potente


modulatore
La glicolisi attivata

La gluconeogenesi rallentata

Enzima tandem
Il fruttosio 2,6-bisfosfato sintetizzato e scisso
da due attivit sullo stesso enzima (PFK-2 e
Fruttosio BisFosfatasi -2, (FBP-2))
Lenzima sotto controllo allosterico, covalente,
ormonale

Ruolo del fruttosio 2,6-bisfosfato


PFK-2

Via del pentosio fosfato


(shunt dellesosio monofosfato)
 Alternativa ossidativa alla glicolisi
Tessuto adiposo
fegato (30% del glucosio ossidato)

 Ha origine dal glucosio 6-fosfato


Esochinasi, Glicogeno

 Serve a produrre (fase ossidativa)


Pentosio fosfato (ribosio)
NADPH

NADPH
NADPH: potere riducente per
le biosintesi (come quella degli
acidi grassi)
Distinto da NADH
[NAD+]/[NADH] 1000
[NADP+]/[NADPH] 0.01

1. Glucosio 6-fosfato deidrogenasi

Si forma un -lattone (estere


ciclico intramolecolare)
2. La lattonasi (esterasi)
accelera lapertura dellanello

3. Fosfogluconato deidrogenasi
La fosfogluconato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato:
il NADP+ serve da ossidante

Un chetosio:
ribulosio-5-P

4. Formazione del ribosio 5-fosfato


 Si forma il chetone ribulosio-5fosfato che una isomerasi
converte in ribosio-5-fosfato
 Nella fase ossidativa si formano
un Ribosio-1-P e due NADPH
 NADPH serve per le vie
sintetiche e previene danni
ossidativi

10

Isomerizzazione del ribulosio 5-P

Via del pentosio fosfato:


fase non ossidativa
Ricicla pentosi in composti a diverso numero di
carbonii
Da tre pentosi (C5) si pu arrivare a due molecole di
fruttosio-6-P (C6) e una gliceraldeide-3-P (C3)
Pu essere percorsa in entrambe le direzioni
(reazioni facilmente reversibili)
Consente di arrivare a pentosi senza la fase
ossidativa
Transchetolasi: trasferisce un frammento a due C da
un chetosio donatore a un aldosio accettore
Transaldolasi: trasferisce un frammento a tre C

11

La fase non ossidativa ricicla i


pentosi a glucosio-6-fosfato

FASE
OSSIDATIVA

C3

FASE NON
OSSIDATIVA

C7

C5

C5
C4
C6

Da: Voet et al. Fondamenti di Biochimica - Zanichelli

12

Reazioni
reversibili:
la fase non
ossidativa
pu essere
percorsa al
contrario

Versatilit della via dei pentosi


1. Richiesta di potere riducente e ribosio
(ad esempio, duplicazione cellulare)
Fase ossidativa

2. Elevata richiesta di NADPH


La via prosegue con le reazioni transchetolasiche
e transaldolasiche

3. Bassa richiesta di NADPH


La fase non ossidativa percorsa a ritroso
partendo da fruttosio-6-fosfato

13

Carenza di G6PDH e favismo


 NADPH contribuisce a mantenere lambiente
riducente nei globuli rossi
 La carenza dellenzima porta a crisi emolitiche
 Numerosi farmaci e sostanze ossidanti possono
scatenare crisi emolitiche
 Distribuzione geografica simile a quella della
malaria

14

Glicogeno
Il glicogeno (come lamido) un polimero del D-glucosio
I monomeri sono legati con legami glicosidici 1
4
nelle catene principali e 1 6 nelle ramificazioni.
un sistema di accumulo del glucosio sotto forma di
granuli (soprattutto nel fegato): struttura molto ramificata
CH2OH

CH2OH

O
OH

CH2OH

CH2OH

OH

OH

CH2OH
O

OH

6 CH2

OH

HO

OH

OH

OH

OH

O
OH

1mm

OH

HO

CH2OH

CH2OH

OH

OH

OH

O
OH

CH2OH

OH

O
OH

OH
OH

Demolizione del glicogeno (glicogenolisi)


Alimenta il glucosio del sangue (~ 5mM) dal
fegato e la glicolisi nel muscolo
Riserva di breve durata
Richiede tre enzimi

La glicogeno fosforilasi
Stacca un glucosio -1-fosfato (G1P) da una estremit
non riducente (C-4 libero) (reazione di fosforolisi)

Glicogeno
La struttura dei granuli di glicogeno permette una
rapida mobilizzazione (scissione) del glucosio 1-P
poich vi sono molte estremit diverse attaccabili

CH2OH

CH2OH

O
OH

CH2OH

O
n

OH

CH2OH
O

OH

6 CH
2

CH2OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O
OH

HO

OH

HO

CH2OH

CH2OH

OH

OH

OH

O
OH

CH2OH

OH

O
OH

OH
OH

2, 3 Glicogenolisi
Date le dimensioni del sito, la

fosforilasi riesce a tagliare il


legame 1 4 fino a quattro
residui dalla ramificazione
2. Un enzima deramificante
sposta tre unit di glucosio
(transferasi) e taglia lultimo
glucosio (attivit glucosidasi)
formando glucosio libero
3. La fosfoglucomutasi (una
isomerasi) converte G1P in G6P
Nel fegato, il G6P produce
glucosio (G6P fosfatasi)

Nel fegato
presente la G6P
fosfatasi

La glicogeno fosforilasi un enzima


polimerico controllato

Regolazione covalente: esiste una forma fosforilata in Serina (fosforilasi a) pi attiva e una
defosforilata (fosforilasi b) meno attiva
Regolazione allosterica: conformazione attiva R
e meno attiva T. Un effettore positivo come
AMP sposta lequilibrio verso R.

Sintesi del glicogeno

Sintesi e demolizione devono seguire vie diverse


Occorrono tre enzimi
La sintesi coordinata con la demolizione
La sintesi ha inizio con una reazione esoergonica
(di attivazione)
Si utilizza UTP come trasportatore di glucidi

1. La UDP-glucosio pirofosforilasi
G1P trasferito su UTP
Lidrolisi del pirofosfato PPi
rende la reazione esoergonica
(strategia comune)

2. La glicogeno sintasi
Il glucosio trasferito dallUDPG sul C-4 di un
estremit non riducente di glicogeno (
1
4 )

La glicogeno sintasi un enzima


controllato
La glicogeno sintasi un tetramero in cui la forma
fosforilata (su Ser) meno attiva (al contrario della
fosforilasi)
La forma fosforilata regolata allostericamente
Il controllo glicogeno fosforilasi/sintasi ormonale

3. Lenzima ramificante
La sintasi allunga catene con legami 1
4 (come
nellamilosio)
Le ramificazioni sono dovute ad un enzima che
trasferisce segmenti di residui di glucosio su di un C6
Dato che la sintasi pu solo allungare segmenti preesistenti, la sintesi comincia da una proteina
glicogenina su cui si forma un innesco (su di un
residuo di Tyr)

Fasi della demolizione aerobica


del glucosio


Produzione di acetil-CoA (complesso della


piruvato deidrogenasi)

Ossidazione dellacetil-CoA (ciclo di Krebs)

Trasferimento di elettroni e fosforilazione


ossidativa

Gli acetil-CoA possono provenire anche dalla


demolizione (ossidazione) degli acidi grassi

Il Ciclo dellacido citrico


(di Krebs; 1937)
cristae

(acetilCoA)

Il Ciclo dellacido citrico: una


panoramica
Via circolare (ciclo) con otto reazioni
 Le reazioni avvengono nella matrice
mitocondriale (un enzima nella membrana
mitocondriale interna)
 Nei mitocondri vi sono anche gli enzimi per
lossidazione degli acidi grassi e la fosforilazione
ossidativa


Il Ciclo dellacido citrico: una panoramica


Reazione netta totale:
 Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi
CoA + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2 CO2
 Lenergia di ossidazione conservata nei
coenzimi ridotti e nel GTP
 Il ciclo agisce come un catalizzatore che ossida
gruppi acetilici
 Gli intermedi della via possono essere precursori
di altri composti (funzione anfibolica)


Una tappa di collegamento:


la piruvato deidrogenasi
Trasforma il piruvato in acetil-CoA
 un complesso (in E. coli, 60 subunit!) formato
da tre enzimi:


piruvato deidrogenasi
diidrolipoiltransacetilasi
diidrolipoildeidrogenasi


Utilizza cinque coenzimi:

CoA-SH
tiamina pirofosfato (TPP)
Lipoato
NAD+
FAD

Il complesso piruvato deidrogenasi


consente lingresso del piruvato nel
ciclo di Krebs

Il coenzima A (CoA-SH)

-mercaptoetilammina

Acido pantotenico

I tioesteri sono composti ad alta energia


Lacido pantotenico una vitamina del
gruppo B

La tiamina pirofosfato
(TPP)

La Tiamina una vitamina (B1) anti beri-beri

Coenzimi ossido-riduttivi
NAD+

FAD

FMN

Il lipoato (fattore vitaminico)


un braccio mobile legato
covalentemente allenzima E2

Catena polipeptidica di E2
(diidrolipoiltransacetilasi)

Decarbossilazione
ossidativa del
piruvato

Coenzimi ossido-riduttivi
Piridinici (NAD e NADP)
Derivano dalla niacina (Vitamina PP o B3)
Cosubstrati di pi di 200 enzimi
Ruoli metabolici specializzati
Accettano due elettroni (ione idruro H:-)
NADPH coinvolto nelle biosintesi riduttive

Flavinici (FMN e FAD)


Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)
Possono trasferire un elettrone alla volta
In genere, legati saldamente agli enzimi (flavoproteine)

Controllo della piruvato deidrogenasi




Inibizione retroattiva da prodotto


NADH
Acetil CoA

Regolazione covalente
la fosforilazione tramite una chinasi rende il
complesso meno attivo
Linsulina attiva la piruvato deidrogenasi tramite una
fosfatasi

Regolazione allosterica
ATP inibisce
AMP attiva

1. La citrato sintasi: lacetil-CoA


condensa con lossalacetato

legame tioestere

2. Laconitasi: il citrato isomerizza

La reazione sarebbe spostata a sx, ma si consuma isocitrato


Lisocitrato si ossida pi facilmente

3. Prima decarbossilazione
ossidativa: lisocitrato deidrogenasi

Si forma il primo NADH

4. Seconda decarbossilazione ossidativa:


l-chetoglutarato deidrogenasi

Il meccanismo analogo alla piruvato deidrogenasi:


il prodotto un tioestere ad alta energia

5. Parte dellenergia recuperata in


una fosforilazione a livello del substrato

6. Ossidazione del succinato

SDH: nella membrana interna

7. Idratazione del fumarato

10

8. Lossalacetato viene recuperato:


la malato deidrogenasi

La reazione sarebbe endoergonica, ma la


citrato sintasi rimuove lossalacetato

I prodotti del
ciclo di Krebs

11

Bilancio del ciclo





Nella glicolisi dal glucosio si formano 2 ATP e due


NADH
Nel ciclo di Krebs da due molecole di piruvato si
ottengono:
8 NADH (di cui due 2 dalla piruvato deidrogenasi)
2 FADH2
2 GTP
Dalla ossidazione dei coenzimi nella fosforilazione
ossidativa si ottengono:
Dal NADH: 2.5 - 3 ATP
Dal FADH2: 1.5 - 2 ATP
Dalla ossidazione completa del glucosio si ottengono 3238 ATP, con una resa attorno al 65%

Controllo del ciclo di


Krebs


Tre fattori:
Acidi grassi
Disponibilit di substato
Inibizione da prodotto
Inibizione allosterica retroattiva
(da ATP)

Il ciclo regolato a livello


delle tre tappe esoergoniche:
Citrato sintasi
Isocitrato deidrogenasi
-chetoglutarato deidrogenasi

12

Reazioni cataplerotiche/anaplerotiche
Ossalacetato per la gluconeogenesi
 Acetil-CoA per la sintesi degli acidi grassi (via
citrato)
 Ossalacetato/chetoglutarato verso il metabolismo
degli amminoacidi
 Ossalacetato dalla piruvato carbossilasi
(gluconeogenesi); un aumento di acetil-CoA
attiva lenzima
 Ossalacetato/ chetoglutarato dal metabolismo
degli amminoacidi


13

Trasporto di elettroni e fosforilazione


ossidativa

Le ossidazioni di nutrienti producono coenzimi ridotti


(NADH, FADH2)

Nel processo di riossidazione dei coenzimi ridotti


coinvolto un flusso di elettroni attraverso intermedi redox

Lenergia resa disponibile dal flusso esoergonico di


elettroni accoppiata al trasporto endoergonico di protoni
attraverso la membrana mitocondriale

il flusso di protoni in senso inverso (gradiente protonico)


fornisce lenergia libera per la sintesi di ATP

Trasporto di elettroni e
fosforilazione ossidativa: schema

STRUTTURA DEL MITOCONDRIO


Membrana esterna
Membrana interna
Spazio intermembrana

Matrice
Creste
Probabilmente antichi batteri aerobici; possiedono un loro DNA

Sistemi navetta: i coenzimi ridotti devono


essere trasportati nei mitocondri

La navetta
malato-aspartato

Da: J. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer Biochimica, Zanichelli

La navetta del
glicerofosfato

Potenziali redox nella catena respiratoria

I valori positivi indicano una maggiore tendenza ad acquistare elettroni


(ridursi).
Il flusso di elettroni va da specie con potenziale pi negativo a specie con
potenziale pi positivo

I potenziali redox consentono di


valutare la variazione di energia libera
E = E +RT/n . ln [accettore e-]/ [donatore di e-]
E = Eaccettore - E donatore
G = - n E
Ad esempio,
NAD+ + H+ + 2e- NADH
E = - 0.315 V
1/2 O2 + 2H+ + 2e- H2O
E = 0.815 V
Lossigeno ha maggior tendenza a ridursi:
1/2 O2 + NADH + H+ H2O + NAD+
E = 1.130 V
G = - 218 kJ/mole

Alla catena respiratoria partecipano:

Coenzimi (NADH, FADH2, FMN)


Proteine integrali di membrana come
citocromi (contenenti gruppi eme)
proteine ferro-zolfo

Ubichinone o Coenzima Q, molecola idrofobica

diffusibile nel doppio strato


Citocromo c, una piccola proteina periferica
(solubile )

Schema del trasferimento elettronico


Spazio intermembrana

matrice
Complesso I
NADH
DEIDROGENASI
trasferisce
elettroni dal
NADH al Q

Complesso II
SUCCINATO
DEIDROGENASI
trasferisce
elettroni dal
FADH2 al Q

Complesso III
UBICHINONECITOCROMO C
REDUTTASI
trasferisce
elettroni dal Q
al citocromo c

Complesso IV
CITOCROMO
OSSIDASI
trasferisce
elettroni dal
citocromo c
allO2

Allinterno di ogni complesso, gli elettroni passano sequenzialmente


attraverso una serie di trasportatori di elettroni.

Complesso I : NADH DEIDROGENASI


(NADH-ubichinone ossidoreduttasi)
Trasferimento di elettroni da NADH al Coenzima Q
(CoQ ) NADH + H+ + CoQ NAD+ + CoQH2
Quattro H+ transportati fuori per 2 e-

Forma a L

Complesso I : NADH DEIDROGENASI


(NADH-ubichinone ossidoreduttasi)
Complesso di grandi dimensioni: pi di 40
subunit proteiche tra cui
Una FMN-flavoproteina
Almeno sei centri FeS

Lubichinolo (Coenzima Q ridotto - QH2)


diffonde nella membrana verso il Complesso III
Inibito da amital (un barbiturico) e rotenone

Coenzimi ossido-riduttivi
NAD+

FAD

FMN

COMPLESSI I E II
Per il loro trasporto interno di elettroni le proteine che
fanno parte del I e II complesso utilizzano:
 molecole di FMN e FAD
 centri Fe-S, nei quali il Fe passa dallo stato di
ossidazione +2 a +3 e viceversa, trasportando elettroni

Tratto da: A.L. Lehninger Introduzione alla Biochimica, ed. Zanichelli

Lubichinone o
coenzima Q
liberamente diffusibile
nella membrana

Ubichinone (Q)
ossidato

Radicale
semichinone (QH )

Benzochinone, con una catena


laterale isoprenoide
(comunemente 10 unit: Q10)
Ubichinolo (QH2)
ridotto

Complesso II
SUCCINATO DEIDROGENASI
(succinato-CoQ reduttasi)
E lo stesso enzima che
partecipa al ciclo di Krebs
Trasferisce elettroni
direttamente al CoQ
NON trasporta H+ nello
spazio intermembrana
Altri substrati
trasferiscono elettroni dal
FADH2 direttamente al
CoQ
da: Lehninger

Complesso III (complesso bc1)


UBICHINONE-CITOCROMO C REDUTTASI
CoQ passa elettroni al citocromo c (e pompa 4 H+)
Le principali proteine trans-membrana nel complesso III
sono citocromi b e c1
I citocromi sono agenti che trasferiscono un elettrone
UQH2 un trasportatore di elettroni liposolubile
Il citocromo c un trasportatore di elettroni idrosolubile
( una piccola proteina periferica di membrana)

I citocromi contengono gruppi


prostetici a Ferro

Per il loro trasporto interno di elettroni, i complessi III e IV


utilizzano proteine dette citocromi, contenenti gruppi porfirinici
(eme) a cui legato il Fe, che pu passare dallo stato + 2 a quello + 3
e viceversa

I citocromi hanno spettri UV-vis


caratteristici

Complesso IV
CITOCROMO OSSIDASI
 Grandi dimensioni: 13 subunit
 Trasferisce elettroni dal citocromo c allO2; si ha una
riduzione a 4 elettroni dellO2 per produrre 2 H2O
 Lossigeno dunque laccettore terminale di elettroni
nella catena di trasporto
 La citocromo c ossidasi utilizza 2 gruppi eme di tipo a e
2 siti a rame
 Il complesso IV trasporta anche 2 H+ nello spazio
intermembrana

Potenziali
nel trasporto
di elettroni

10

Fosforilazione ossidativa e teoria


chemiosmotica
La sintesi dellATP catalizzata dalla ATP sintasi
lenergia liberata dal trasporto di elettroni serve per
pompare H+ nello spazio intermembrana creando un
gradiente elettrochimico (pH e carica) (forza motrice
protonica);
Il potenziale del gradiente sfruttato per la sintesi di
ATP, grazie al rientro guidato di protoni nella matrice

La sintesi di ATP guidata dal gradiente


protonico

11

Il gradiente di
H+ contribuisce
al trasporto di
ATP e Pi

Inibitori della
fosforilazione ossidativa
Il rotenone inibisce il complesso I
Il cianuro e CO inibiscono il complesso IV,
legandosi al ferro delleme
Loligomicina inibisce lATP sintasi

12

Inibitori selettivi

Da: Garrett & Grisham - Biochemistry

Disaccoppianti
Laccoppiamento dipende dallintegrit della
membrana: composti che dissipano il gradiente
protonico (disaccoppianti) impediscono la sintesi
di ATP (ma non la respirazione)
Il grasso bruno contiene un disaccoppiante
proteico naturale (termogenina o UCP-1):
lenergia del gradiente dissipata come calore

13

Studi su mitocondri:
inibitori e disaccoppianti

ADP + Pi
succinato

da: Lehninger

La struttura dellATP sintasi


Composta da due dominii funzionali: Fo e F1
Fo: (oligomicina-sensibile) proteina integrale di
membrana; crea un canale per gli H+;
F1 : proteina periferica che protrude nella matrice ed
il sito di sintesi dellATP; 9 subunit (3 3 )

Il meccanismo di funzionamento dellATP


sintasi sfrutta il gradiente protonico per
sintetizzare ATP; la catalisi assicurata a turno
dalle subunit , grazie ad una rotazione
accompagnata da modificazioni conformazionali.
La proteina pu funzionare come pompa per gli
H+, consumando ATP

14

La struttura dellATP sintasi

F1

matrice

Fo

Spazio intermembrana

Le specie reattive dellossigeno (ROS)


Durante il trasferimento elettronico, si
possono formare radicali liberi molto reattivi:
O2 + eO2-. ione superossido

ANIONE SUPEROSSIDO
PEROSSIDO DI IDROGENO

RADICALE IDROSSILE

15

Le specie reattive dellossigeno (ROS)


Vita breve
Alcune sono radicaliche (elettroni spaiati);
H2O2 reattiva, ma non un radicale
A basse concentrazioni: segnalazione
A concentrazioni medio-alte: danni
a proteine, lipidi, acidi nucleici

Linvecchiamento e numerose patologie


degenerative sono correlati alle ROS

Meccanismi antiossidanti
Composti a basso peso molecolare
Acido ascorbico (vitamina C), tocoferolo
(vitamina E), glutatione

Enzimi
Superossido dismutasi
Catalasi, glutatione perossidasi (rimuovono
lacqua ossigenata)

Stress ossidativo

16

Demolizione dei triacilgliceroli


Dalla dieta: lipasi digestive (la principale
pancreatica)
 Dalle riserve: lipasi sotto controllo ormonale
Si formano mono- e diacilgliceroli, acidi grassi e
glicerolo
 I lipidi sono trasportati da lipoproteine (i
trigliceridi principalmente da chilomicroni)


Gli acidi biliari emulsionano i lipidi

Mobilizzazione dei lipidi


di deposito
I triacilgliceroli sono idrolizzati
da lipasi sotto controllo
ormonale
 Gli acidi grassi sono trasportati
legati allalbumina


Da: Lehninger - Zanichelli

Lipoproteine plasmatiche: densit e


composizione
chilomicroni VLDL
Densit
< 0.94
0.94(g/ml)
1.006
Lipidi %
99
91
Trigliceridi 85
55
Esteri col. 3
18
Colesterolo 2
7
Fosfolipidi 8
20

LDL
1.0061.063
80
10
50
11
29

HDL
1.0631.210
44
6
40
7
46

Catabolismo dei
lipidi: utilizzazione
del glicerolo

verso la glicolisi

Attivazione
degli acidi grassi
acil CoA
sintetasi

acil-adenilato
legato allenzima
acil CoA
sintetasi

acil CoA

Gli acili sono trasferiti nel


mitocondrio dalla carnitina

Lesperimento di Knoop
(1904)
Acidi grassi con numero di
carbonii pari
e dispari

Dimostra che la degradazione procede


staccando unit bicarboniose

La chimica del catabolismo degli


acidi grassi

La -ossidazione degli acidi grassi


Il legame C-C si rompe con difficolt
 Il carbonio ossidato (tre reazioni analoghe a
quelle da succinato ad ossalacetato nel ciclo di
Krebs)
 il -chetoacil-CoA scisso da una tiolasi
(reazione inversa rispetto ad una condensazione)
 Lacil-CoA accorciato di due atomi di carbonio
ripete il ciclo


Quattro
reazioni
ripetute

1. Acil CoA deidrogenasi


(flavoproteine)

Analogo alla succinato deidrogenasi

Lacil CoA deidrogenasi un enzima


della membrana mitocondriale:
gli elettroni del FADH2 sono trasferiti
allubichinone

2. Enoil-CoA idratasi (crotonasi)


Addiziona acqua al doppio legame: analogo alla
fumarasi
 La reazione trasforma il trans enoil- CoA in L-idrossiacil-CoA


3. Idrossiacil-CoA deidrogenasi
Ossida il gruppo alcolico secondario in
 assolutamente specifico per gli isomeri L


4. -chetotiolasi
Un gruppo Cys-SH
dellenzima attacca il
-carbonile

Il gruppo -SH di un nuovo CoA


attacca lacile accorciato, formando
un nuovo acil-CoA

G < 0

Il ciclo si ripete


Per lacido palmitico (C16),


il ciclo si ripete sette volte,
formando
8 acetil-CoA
7 NADH e FADH2

Destino dei prodotti


della -ossidazione
Acetil-CoA: ciclo di
Krebs
 Coenzimi ridotti: catena
respiratoria


Acidi grassi dispari






La -ossidazione porta a propionil-CoA


Tre ulteriori reazioni lo convertono in succinil-CoA
Gli acidi grassi dispari sono precursori per la
gluconeogenesi

Acidi grassi insaturi





Opportuni enzimi (isomerasi) convertono doppi legami da


3-cis a 2-trans
Nei poliinsaturi, tali legami vanno spostati in modo da
trovarsi in posizione trans 2: intervengono una isomerasi
e una reduttasi

Demolizione dellacido oleico


(monoinsaturo)

Corpi chetonici







Lacetoacetato si forma per


condensazione di acetil-CoA
Acetoacetato e idrossibutirrato interconvertono grazie ad una deidrogenasi
Lacetone prodotto per decarbossilazione
I CORPI CHETONICI sono normali
composti usati da tessuti extra-epatici
Lacetoacetato convertito ad acetoacetil-CoA grazie al succinil-CoA
Un eccesso di corpi chetonici (chetosi)
si osserva nel digiuno prolungato e nel
diabete; pu portare ad acidosi

10

Formazione dei
corpi chetonici

11

Biosintesi degli acidi grassi


Sintesi e catabolismo usano vie differenti
la biosintesi avviene nel citosol
Nella sintesi gli intermedi sono legati a

-SH di una
proteina trasportatrice di acili (ACP) invece che a CoASH
Nella sintesi c un solo complesso enzimatico
La biosintesi utilizza come coenzima NADPH (che
proviene principalmente dalla via dei pentosi)

Lacetil-CoA esportato dai mitocondri sotto

forma di citrato (sistema citrato-malato-piruvato)


Oltre a equivalenti riducenti, richiesto ATP

Le fonti di Acetil-CoA
matrice
mitocondriale

membrana
mitocondriale

citosol
Acidi
grassi

Acidi
grassi

Le fonti di Acetil-CoA
In condizioni di ATP elevato, il citrato si accumula

ed trasportato fuori dal mitocondrio


La reazione catalizzata da citrato liasi formalmente
linverso della sintesi: la formazione dellintermedio
citril-CoA richiede energia:
citrato + ATP + CoA ossalacetato + acetil-CoA + ADP
+ Pi

Lossalacetato si trasforma in malato (MDH)


Il malato pu:
rientrare nel mitocondrio (grazie ad un trasportatore)
formare piruvato e NADPH (enzima malico)

Le sorgenti di NADPH:
Lenzima malico

La via del pentosio-fosfato

In abbondanza di
ATP, il citrato pu
uscire dal
mitocondrio

Ciclo di Krebs

Biosintesi degli acidi grassi


La sintesi impiega unit bicarboniose: acetil-CoA
La condensazione di due acetil-CoA sarebbe
endoergonica (la reazione catalizzata dalla tiolasi
esoergonica)

Un acetil-CoA viene allungato a malonil-CoA


per carbossilazione

La proteina
trasportatrice di acili
(ACP)

serina

gruppi malonile
sono esterificati
al -SH

Lacetil CoA carbossilasi


La carbossilazione dellacetil-CoA per formare

malonil-CoA una tappa irreversibile e regolata


ACC usa bicarbonato, ATP e biotina

NAD e NADP non sono


intercambiabili

NAD+/NADH 1000
NADP+/NADPH 0.01

Lacido grasso sintasi


In E. Coli un complesso multienzimatico
costituito da ACP e sei enzimi

Negli animali, costituita da due subunit


ciascuna multifunzione

1,2 e 3. I gruppi acetile e malonile,


trasferiti sul complesso, condensano
ACP

Acido grasso
sintasi

-chetoacil-ACP
sintasi (KS)

condensazione di
Claisen

La decarbossilazione
rende il processo
esoergonico

4. Riduzione del carbonile

-chetoacil-ACP
reduttasi (KR)
si forma un D- idrossiacil-ACP

5. Deidratazione

-idrossiacilACP deidratasi
(HD)
si forma un trans2-butenoil (enoil)ACP

6. Riduzione del
doppio legame

enoil-ACP
reduttasi (ER)

si forma il butirril-ACP o un acido


grasso saturo allungato di 2 carbonii

Sintesi degli acidi grassi: il seguito


Il butirrile trasferito sull-SH del primo enzima
LACP resta libero per accogliere un malonile
Si ha una condensazione e le reazioni su ripetono
allungando di due carbonii lacido grasso
Di solito, si arriva al massimo a palmitato C16 ; una
attivit idrolitica del complesso lo libera dallACP
7 acetil CoA + 7 CO2 + 7 ATP 7 malonil-CoA + 7 ADP + 7 Pi
acetil CoA + 7 malonil CoA + 14 NADPH + 14 H+ palmitato +
14 NADP + + 8 CoA + 7 CO2 + 6 H2O
8 acetil CoA + 7 ATP + 14 NADPH + 14 H+ palmitato + 7 ADP
+ 7 Pi + 14 NADP +

Regolazione della biosintesi degli


acidi grassi
Lacetil-CoA carbossilasi (ACC)
attivata allostericamente dal citrato
inibita retroattivamente dal palmitato
inibita covalentemente per fosforilazione
(controllata da glucagone/adrenalina)

La citrato liasi sotto il controllo dellinsulina

Regolazione
ormonale

defosfo-ACC attiva
a basso [citrato]

fosfo-ACC attiva solo


ad alto [citrato]

Modificazioni degli acidi grassi


Allungamento da palmitato (reazioni non
citosoliche: reticolo endoplasmico, mitocondri)
Introduzione di doppi legami (desaturazione)
Nei mammiferi alcuni poli-insaturi devono
essere assunti con la dieta (essenziali)

Destino degli acidi grassi


In gran parte sono incorporati
nei triacilgliceroli (di deposito)
nei glicerofosfolipidi (delle membrane)

Intermedio della sintesi il glicerolo-3-fosfato

Il fosfatidato, un
intermedio comune

Al glicerolo-3-fosfato
si esterificano due acili

10

TRIACILGLICEROLI

FOSFOLIPIDI

11

DEGRADAZIONE DEGLI
AMMINOACIDI


Gli amminoacidi derivano:


dalla demolizione enzimatica delle proteine
della dieta (digestione)
dal turn-over fisiologico delle proteine cellulari
(attraverso sistemi complessi - proteasoma)
In caso di digiuno, proteine cellulari sono usate
come combustibile

non vengono immagazzinati


 nella degradazione:


lo scheletro carbonioso viene recuperato


il gruppo amminico



pu essere recuperato per altre sintesi


viene eliminato

proteine intracellulari

proteine della dieta

glucosio

urea (prodotto di
eliminazione dellazoto)

Destino dellammoniaca nei vertebrati

Animali ammoniotelici:
vertebrati acquatici

Animali ureotelici:
molti vertebrati
terrestri; squali

Animali uricotelici:
rettili, uccelli.
Lacido urico il
catabolita delle purine

Negli animali terrestri, forma non tossica e che


limiti il dispendio di acqua

proteine della dieta

Reazioni di transaminazione

Il gruppo amminico viene trasferito da un amminoacido ad


un chetoacido (di solito l-chetoglutarato)
Ad esempio,
chetoglutarato + alanina

glutammato + piruvato

Il meccanismo di reazione a ping-pong coinvolge come


coenzima il piridossal-fosfato

Vitamina B6 (piridossina) e
piridossal-fosfato (aldeide)
Partecipa a numerosi tipi di reazioni
 Di solito, legato covalentemente a un gruppo NH2 di una lisina dellenzima tramite una base
di Schiff
 Va incontro a trasformazioni reversibili


Lanello del PLP, una


trappola per elettroni

PLP normalmente
legato
allenzima
tramite -NH2 di una
lisina

Il meccanismo della transamminazione

La glutammato deidrogenasi
rilascia ammoniaca nel fegato

Enzima mitocondriale
Basso livello energetico (ADP): vengono
demoliti amminoacidi

Lammoniaca trasportata nel


sangue come glutammina...

glutammato + NH3 + ATP

glutammina + ADP + Pi

La reazione catalizzata da una glutammina sintetasi


(richiede ATP) mentre la reazione inversa, che restituisce
la ammoniaca, catalizzata dalla glutamminasi
La glutammina utilizzata per la sintesi di composti azotati
quali i nucleotidi purinici
La glutammina presente nel sangue a concentrazioni elevate
(rispetto ad altri amminoacidi)

Ciclo dellalanina


Nel muscolo, gruppi amminici sono trasferiti


prima al glutammato e poi
per
transamminazione al piruvato (dalla glicolisi)
che si trasforma in alanina

lalanina trasportata al fegato

per transamminazione si riforma piruvato


(che nella gluconeogenesi ritorna a glucosio)
e glutammato

Il destino dellammoniaca

Il ciclo dellurea
Avviene nel fegato
 Cinque reazione enzimatiche (1 + 4 nel ciclo)


le prime due nei mitocondri, le altre nel citosol

Si consuma ATP
 Un gruppo amminico deriva dal glutammato
mediante GDH
 Il secondo gruppo amminico deriva da un aspartato
 Stretto collegamento tra i cicli dellurea e di Krebs


Il ciclo regolato

0. Attivazione
dellammoniaca
(reazione preliminare)
carbossi-fosfato

carbamil-fosfato
sintetasi I
Esiste una carbamil-fosfato
sintetasi II citosolica coinvolta
nella sintesi dei nucleotidi
pirimidinici

Il ciclo dellurea (Krebs, 1932)

1. Ornitina transcarbamilasi
(mitocondriale)

Lornitina funge da accettore di un gruppo carbammilico


La citrullina formata nei mitocondri passa nel citosol

2. Argininosuccinato sintetasi
Il secondo gruppo amminico portato dallaspartato, il cui
gruppo amminico condensa con il carbonile della citrullina

citrullil-AMP

3. Argininasuccinato liasi

La via pu essere utilizzata per la sintesi di arginina

4. Arginasi

Lultima reazione rigenera lornitina.


Larginina tramite la NO sintasi il precursore dellossido nitrico
NO, un importante mediatore che agisce sul messaggero GMP ciclico

Collegamenti tra ciclo dellurea e ciclo di


Krebs

10

La sintesi dellurea
regolata dall Nacetil-glutammato
A lungo termine, viene
regolata anche la sintesi
degli enzimi coinvolti
La sintesi dellurea
aumenta in caso di dieta
iper-proteica o di
digiuno prolungato

Gli amminoacidi sono


degradati, attraverso reazioni
dedicate, a intermedi metabolici comuni

11

Biosegnalazione
Nei sistemi multicellulari, segnali chimici inducono/
coordinano risposte fisiologiche interagendo con
recettori

Specificit: complementariet tra segnale e recettore


Affinit
Sensibilit
Integrazione: pi segnali coordinati
Amplificazione in cascata
SEGNALE

Segnalazione e recettori di membrana


Rilascio del segnale (primo messaggero: ad
esempio, un ormone)
Interazione con il recettore specifico
Trasferimento del messaggio (trasduzione)
tramite secondo messaggero
Attivazione di effettori come risposta (spesso
enzimi intracellulari)
Spegnimento/desensibilizzazione

Desensibilizzazione
Lattivazione del recettore pu
scatenare un meccanismo
retroattivo che spegne il
recettore o lo rimuove dalla
superficie cellulare

SEGNALE

RISPOSTA

Ladrenalina (epinefrina)

Deriva dalla tirosina


Sintetizzata nelle ghiandole surrenali

Recettori a proteina G e Adrenalina

Da: Stryer

Recettori a proteina G (GPCR)


 Recettore con 7 eliche trans-membrana
 Linterazione recettore attivato-proteina G (trimero
) provoca il legame del GTP
 La subunit si stacca da e stimola la
produzione di AMP 3-5ciclico da parte della
adenilato ciclasi rivolta verso linterno;
 Lo stimolo limitato nel tempo: GS idrolizza GTP
(attivit GTPasica) e si riassocia con
 AMPc ha vita breve ( idrolizzato da fosfodiesterasi
dei nucleotidi ciclici)

Adrenalina e recettori a proteina G


1. Adrenalina si
lega al suo
recettore

2. Il recettore occupato
provoca lo scambio tra
GTP e GDP, attivando Gs

3. Gs si sposta verso
ladenilato ciclasi
attivandola

4. Adenilato ciclasi
catalizza la formazione di
AMPc

5. PKA
attivata da
AMPc
6. La fosforilazione
di proteine cellulari
da parte di PKA
causa la risposta

7. AMPc degradato,
invertendo lattivazione
di PKA

Ladenilato ciclasi

AMP ciclico attiva la proteina chinasi A (PKA)


PKA inattiva:
Le subunit
regolatrici hanno i siti
per AMPc vuoti

PKA regola numerosi enzimi a valle


Le subunit catalitiche
(sequenze consenso)
hanno i siti di legame
bloccati dalle subunit
I numerosi passaggi amplificano il regolatrici
segnale
Leffetto contrastato da fosfoproteine
Le subunit
fosfatasi
regolatrici
legano AMPc
Molte molecole regolatrici variano i
livelli di AMPc
PKA attiva:
subunit
In alcuni casi lazione di PKA arriva al Le
catalitiche hanno
i siti di legame
nucleo (effetti sulla trascrizione)
liberi

La via del fosfatidilinositolo

Recettori accoppiati alla fosfolipasi C:


la via del fosfatidilinositolo

La via del fosfatidilinositolo


La fosfolipasi C attivata dal complesso ormonerecettore tramite una proteina G;
Agisce sul fosfatidilinositolo 4,5 bis-fosfato (PIP2)
liberando due secondi messaggeri:
diacilglicerolo (DAG)
(in membrana)
Inositolo 1,4,5 trisfosfato (IP3) (nel citosol)

IP3 favorisce il rilascio di calcio da depositi intracellulari


Il diacilglicerolo attiva proteine chinasi (PKC)
Anche il calcio funziona da secondo messaggero

Recettori con attivit tirosina chinasica


(RTK): il recettore dellinsulina
Recettore (INS-R)
Due subunit recettoriali,
verso lesterno
Due subunit transmembrana
con attivit Tyr proteina
chinasica

In seguito al segnale le
subunit si autofosforilano e
si attivano, fosforilando altre
proteine bersaglio e attivando
una cascata.

Ormoni e regolazione metabolica


Derivati da un amminoacido
Peptidici
Steroidi (recettori nucleari)

Regolazione ormonale del


metabolismo energetico
Controllo della glicemia: azione coordinata di
insulina, glucagone, adrenalina
Adrenalina: derivata da un amminoacido
Glucagone: piccolo peptide
Insulina: piccolo peptide

Controllo della lipolisi

Fight or run

Glicogenolisi: cascata di segnali

forma b meno
attiva e dipendente
da fattori allosterici

forma a attiva
ed indipendente da
effettori allosterici

Insulina
Ormone peptidico (PM = 5800 Da, due catene) rilasciato
dal pancreas
Aumenta la velocit di trasporto del glucosio
Abbassa [AMPc]
Attiva fosfoproteina fosfatasi-1 (defosforilazioni)
si attiva la glicogeno sintasi
si inattiva la glicogeno fosforilasi

Attiva la fosfofruttochinasi-1 (PFK-1) (glicolisi)


Attiva la sintesi di acidi grassi (favorisce la
defosforilazione di ACC)
Favorisce la sintesi dei triacilgliceroli

Iperglicemia: secrezione di insulina


Ingresso di
glucosio nelle
cellule per
aumentato numero
di trasportatori
sulla membrana
Attivazione della
GLICOGENO
SINTASI

DIMINUZIONE
DELLA GLICEMIA

Aumento della
sintesi degli acidi
grassi e dei
trigliceridi

Regolazione
della
glicemia:
glucagone

Bassa [glucosio] nel sangue


Glucagone
[AMPc]

Proteina chinasi A, fosforilazioni di enzimi


Aumento glicogenolisi
Attivazione di FBPasi-2, disattivazione di PFK-2
[F2,6P]
Attivazione di FBPasi, disattivazione di PFK-1
Aumento della gluconeogenesi

Il fruttosio 2,6bisfosfato un potente


modulatore
La glicolisi attivata

La gluconeogenesi rallentata

10

Ruolo del fruttosio 2,6-bisfosfato


PFK-2

Enzima tandem e regolazione


Il fruttosio 2,6-bisfosfato sintetizzato e scisso da
due attivit sullo stesso enzima: PFK-2 e Fruttosio
BisFosfatasi-2, (FBP-2)
Lenzima sotto controllo covalente e ormonale:
la fosforilazione PKA-dipendente inattiva PFK-2 e
attiva la fosfatasi FBPasi-2

11

Regolazione
ormonale della
lipolisi

adrenalina

Glucagone/adrenalina
stimolano la lipolisi
attraverso la
fosforilazione AMPcdipendente della lipasi.
Linsulina si oppone
alla attivit
delladrenalina,
inattivando la lipasi.

Regolazione
ormonale
della sintesi di
acidi grassi
defosfo-ACC attiva
a basso [citrato]

fosfo-ACC inattiva
(attiva solo ad alto
[citrato])

12

Come si ricava lequazione di Michaelis-Menten


k1

E + S
k2

k3

ES E + P

Essendo in condizioni di v0 , la reazione inversa da P verso ES si pu trascurare.


Lo stadio lento la dissociazione del complesso (reazione di I ordine):
V0 = k3 [ES]
Assunzione dello stato stazionario:
d [ES]/dt = 0
In questo caso, le velocit di formazione e dissociazione del complesso sono uguali:
k1 [E][S] = (k2 + k3) [ES]
Esprimiamo [E] (enzima libero) rispetto allenzima totale [Et] (libero e complessato):
[E] = [Et] - [ES]
Sostituendo:
k1 {[Et] [ES] }[S] = (k2 +k3) [ES]
Sviluppando:
[Et] [S] [ES] [S] = (k2 + k3) [ES]
k1
Definiamo:
Km = (k2 + k3)
k1
[Et] [S] [ES] [S] = Km [ES]
Raccogliamo e ricaviamo [ES]:
[ES] {Km + [S] } = [Et] [S]
[ES] = [Et] [S]
Km + [S]

Dato che abbiamo definito la velocit iniziale:


V0 = k3 [ES]
Sostituendo il valore ricavato per [ES]:
V0 =

k3 [Et] [S]
Km + [S]

Dal grafico si osserva che la velocit massima si ottiene quando lenzima saturo,
cio tutto in forma di complesso: [ES] = [Et]:
per [S] grande,
VM = k3 [Et]

Da cui, sostituendo:

V0 =

VM [S]
Km + [S]

Si pu definire Km come la [S] alla quale la velocit pari a met di quella massima:
V0 = VM/2

(confronta con la p50 per la mioglobina)