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Inibizione enzimatica

Si definisce INIBITORE una qualunque sostanza che ha


leffetto di ridurre la velocit di reazione di un enzima.
Pu derivare da:
Formazione di complesso E-I
Interazione S-I.
Lo studio di inibitori utile:
1. Nella biochimica classica: per studiare la struttura del sito attivo di un enzima, il
meccanismo della reazione e la specificit di catalisi.

Utilizzo degli inibitori:


1. La maggior parte dei farmaci attualmente utilizzati sono inibitori altamente specifici
di reazioni enzimatiche (molto spesso sono inibitori irreversibili).
2 nella diagnostica e nella ricerca di laboratorio si utilizzano inibitori competitivi per
la progettazione di cromatografie di affinit
3. Per scopi industriali, la presenza di inibitori specifici va accuratamente controllata
ed evitata.

Inibizione

Reversibile

Irreversibile

Competitiva

Non competitiva
Acompetitiva
Mista
Da prodotto

In tutti i casi:
variano uno o entrambi i parametri cinetici

INIBIZIONE COMPETITIVA
8 molecole di substrato S
2 molecole di inibitore I

S
I

S
S

I
S
S

S
S
S

La probabilit che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dellenzima dell80%

INIBIZIONE COMPETITIVA
8 molecole di substrato S
2 molecole di inibitore I

S
I

S
S

I
S
S

S
S
S

La probabilit che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dellenzima dell80%
La probabilit che linibitore I

venga in contatto con il sito attivo dellenzima del 20%

INIBIZIONE COMPETITIVA
4 molecole di substrato S
4 molecole di inibitore I

I
S

I
S
I

La probabilit che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dellenzima del 50%

INIBIZIONE COMPETITIVA
4 molecole di substrato S
4 molecole di inibitore I

I
S

I
S
I

La probabilit che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dellenzima del 50%
La probabilit che linibitore I

venga in contatto con il sito attivo dellenzima del 50%

Inibizione competitiva
k1

k3

k2

KM aumenta
Vmax rimane inalterata

Inibizione competitiva
KM aumenta
Vmax rimane inalterata
v =

VMAX [S]

KM + [S]

= 1 +

[I]
KI

Come calcolare
KM, Vmax, KI??

KM

Inibizione competitiva

I1, mM

Km app,
microM

0,5

16

100

30

80

10

111

= 1 +

KM

Km app,
microM
app

60

[I]
KI

40

[I]

20

I, mM

0
-2

- KI
KM

app

= KM = KM + [I]

Vmax 47,587

KM
KI

KM

10

12

Inibizione competitiva
Doppi reciproci

Inibizione competitiva
Conclusione:
facile calcolare Vmax

KM calcolabile solo da una curva in assenza di inibitore

da curve con inibitore si ottiene una KMapp per ogni


concentrazione di inibitore, e il valore della Vmax

Due substrati in competizione


Leffetto dei due substrati quello di rallentare la reazione globale, ma fa
diminuire in maniera quasi esclusiva la velocit di catalisi del substrato meno
abbondante
Questo esempio non scelto a caso. Infatti, leffetto di inibizione
dovuto alla competizione tra due substrati per uno stesso enzima viene
utilizzato in medicina per curare soggetti che presentino i sintomi di un
avvelenamento da metanolo.
O
Formaldeide, tossica
HC-C
CH3OH +
H
ADH
O
CH3CH2OH +
CH3-C-C
Etanolo
H
Terapia dellavvelenamento: infusione intravenosa di etanolo, per un tempo
sufficiente ad eliminare il metanolo attraverso le urine senza danni (circa 3 ore).
Poich il metanolo tossico anche a basse concentrazioni, importante
ripetere pi volte linieziezione di etanolo, ed fondamentale il tempestivo inizio
della terapia.

Inibizione da prodotto
k1
E+S

k3
ES

k2

k4

E+P

Allaumentare di [P], la reazione rallenta, fino al raggiungimento allequilibrio

Inibizione da prodotto
P

P
EP

Inibizione acompetitiva

KM diminuisce
Vmax diminuisce

Inibizione acompetitiva

Conclusione:
non si ottiene nessun parametro dai grafici lineari primari

da curve con inibitore si ottiene una KMapp e una VMaxapp


per ogni concentrazione di inibitore

Inibizione non competitiva


KS

KS

KM non varia
Vmax diminuisce

Riepilogo

Nessun inibitore
Competitiva
Acompetitiva

Non competitiva

Irreversibile

KM

VMax
VMax

KMapp = KM
KMapp =
KM

KM

KM

VM

app

VM

app

VM

app

=
=

VM

VM

VM

Inibizione irreversibile

Sono anche detti inibitori suicidi

A differenza dellinibizione competitiva


questo equilibrio non reversibile

Se [I] < Etot


La VMax diminuisce (diminuisce la quantit di enzima attivo)
La KM resta invariata (lenzima che resta attivo non ha nessuna inibizione)

Come per linibizione non competitiva!!!

Inibizione irreversibile o non competitiva??


In entrambi i casi:
La VMax diminuisce

Fare 3-4 saggi con diverse quantit di


enzima e substrato saturante

La KM resta invariata

Nessuna
inibizione

non U/ml

Inibizione
irreversibile
Inibizione
reversibile