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Seconda Universit degli Studi di Napoli

DiSTABiF

Corso di Laurea in Scienze Biologiche

Insegnamento di

CHIMICA BIOLOGICA

Antimo DiParente
Prof. Augusto Maro

Anno Accademico 2015-16


Lezione 4
Il folding delle proteine

Come si arriva al corretto


ripiegamento di una proteina?

Folding = ripiegamento, avvolgimento

si parte da una semplice successioni di amminoacidi


pi o meno lineare, in ogni modo casuale!
Il problema del folding

Che cosa determina la struttura tridimensionale delle


proteine?

Una sequenza amminoacidica contiene linformazione completa


per il raggiungimento della struttura funzionale ?

Se si provoca mediante agenti chimico-fisici la perdita della


struttura di una proteina (unfolding) si ottiene una struttura
disordinata detta random coil. . possiamo verificare se si
pu tornare al punto di partenza (sistema sperimentale).

In alcuni casi il recupero della struttura nativa possibile


semplicemente ripristinando le condizioni sperimentali originali.

Cominciamo con definire una proteina


denaturata
la temperatura un denaturante

Attivit biologica Assorbanza a 280 nm

Assorbimento a 280 nm 100 %

Attivit enzimatica
0 %
DENATURAZIONE DELLE PROTEINE
- Le forze che stabilizzano le strutture delle proteine:
interazioni idrofobiche, Legami ionici, legami idrogeno,
forze di van der Waals.

DENATURANTI

Agenti chimici: urea, cloridrato di guanidina, solventi organici,


sodio dodecil solfato (SDS).

Agenti riducenti: Mercaptoetanolo (2-Me) e ditiotreitolo (DTT).

Agenti fisici: temperatura, pH


+
2
Urea Guanidina

C12H25SO4Na
SDS

2-Me

DTT
Comunque qual la corretta struttura di una
proteina o enzima quale ?

Quella con la sua caratteristica


attiva biologica!
Lesperimento di Christian B. Anfinsen - 1961
Lipotesi termodinamica
(almeno) per piccole proteine la struttura nativa
determinata esclusivamente dalla struttura primaria.

Premio Nobel per la


Chimica nel 1972
March 26, 1916 May 14, 1995

La struttura nativa quella termodinamicamente pi stabile (a


minore energia- diminuzione di entalpia ed entropia) tra quelle
cineticamente accessibili.
Ribonucleasi seminale bovina
Ribonucleasi
pancreatica
bovina

a pH 8,0

Esperimento
di Anfinsen

allaria
Intrappolata in
conformeri non
nativi
La dialisi per rimuovere sali o per campi di tamponi
Dopo aver stabilito che la struttura primaria
contiene le informazioni per il folding (almeno per
quanto riguarda lesperimento di Anfinsen)
Come possiamo studiare il fenomeno:

1 Termodinamicamente (avviene o non avviene?)

2 Cineticamente (in quanto tempo avviene?)


La termodinamica...

Non ottengo informazioni sulla velocit di un


processo, ma se pu o non avvenire
Il ripiegamento proteico trasforma una
miscela disordinata in una ordinata
Le implicazioni energetiche presenti nel
processo Termodinamico

I legami che si formano stabilizzano il


sistema (H negativo) ma questo non
giustifica lordine del sistema che si
ottiene

si genera ordine contro la seconda legge


della termodinamica

G=H-TS
Legami coinvolti
Legami covalenti <209 kjoule mol-1
Legami elettrostatici 8- 13 kjoule mol-1
Legami ad idrogeno 4,18 17,8 kjoule mol-1
Legami Van der Waals 2 4,18 kjoule mol-1
Per la termodinamica si occupa
dellUniverso cio del sistema e
dellambiente in cui trova il sistema.
Con tale nuova visione le cose cambiano
.

Leffetto idrofobico .
Leffetto idrofobico dovuto al
solvente..(acqua)

Universo: ambiente + sistema

Soluti apolari
Un ordine enorme per le molecole dacqua

Il processo dipende dal


sistema e dallambiente in cui
si trova

Gradi di libert maggiori per le molecole dacqua.

La sommatoria del processo (dovuta


allentropia che aumenta) giustifica lordine
del sistema (la proteina), che poi
stabilizzata anche dai legami in precedenza
detti (entalpia)
Leffetto idrofobico importante
I residui idrofobici si concentrano nella
parte centrale del globulo proteico

Inoltre, il formarsi della struttura secondaria fa in


modo che gli atomi carichi del legame peptidico,
lossigeno del carbossile e lidrogeno del gruppo
amminico, formano legami ad idrogeno e si ha
stabilizzazione
Poi i legami elettrostatici, i ponti disolfuro ecc si
formano dopo poich si avvicinano gli atomi coinvolti.
I contributi termodinamici per la stabilit della
proteica in acqua.

nel vuoto o nei solventi organici leffetto idrofobico no. quindi


ma di
poco!
Legami covalenti <209 kjoule mol-1
Legami elettrostatici 8- 13 kjoule mol-1
Legami ad idrogeno 4,18 17,8 kjoule mol-1
Legami Van der Waals 2 4,18 kjoule mol-1
ricapitoliamo: TERMODINAMICA
Legami Effetto Idrofobico

LEGAMI A IDROGENO
INTERAZIONI IDROFOBICHE
FORZE DI WAN DER WAALS
LEGAMI IONICI Interazioni Idrofobiche, molecole dacqua
Legami covalenti libere (disordine)

CONTRIBUTO CONTRIBUTO
ENTALPICO ENTROPICO

G = H - T S
Lo stabilirsi di legami di una serie di contatti e di legami che impegnano i gruppi
peptidici e i gruppi R della catena proteica, mentre fornisce un contributo decisivo
alla diminuzione dellenergia libera del sistema costituito dalla proteina, limita in
misura significativa la libert dei gruppi interagenti. Ci in termini termodinamici in
una diminuzione della sua entropia in contraddizione col Secondo Principio della
termodinamica ma
TERMODINAMICA DELLA STRUTTURA TERZIARIA:
IL SISTEMA PROTEINA-SOLVENTE
..Lanalisi della struttura terziaria di una proteina va allargato al sistema
proteina-solvente, costituito oltre che dalla catena polipeptidica, anche dallacqua
con cui essa interagisce.

La struttura di una proteina stabilizzata dallequilibrio tra la forza entalpica


dellenergia di legame, alla quale contribuiscono i legami a idrogeno, quelli ionici
e i contatti di Van der Waals, e la forza entropica del sistema proteina-solvente,
su cui si basano le interazioni idrofobiche tra i gruppi apolari della proteina.

La rimozione dei residui apolari


dalla superficie del globulo proteico
determina una diminuzione
dordine e cio un aumento di
entropia a causa del minor numero
di molecole dacqua interagenti
con la proteina.
Soluti apolari

Effetto idrofobico
Visto il meccanismo alla base del
ripiegamento, ai denaturanti detti
in precedenza: urea, guanidina,
SDS e riducenti, possiamo
aggiungere anche i solventi organici
(ambiente non acquoso) ?
Ad oggi dopo 40 anni, ancora vero
il principio dellesperimento di
Anfinsen con la ribonucleasi?
Cio la struttura primaria contiene
gi tutte le informazioni per un
corretto folding (forma nativa)?.

ma le proteine di membrana?
La termodinamica e gli esperimenti di Anfinsen
dicono che un determinato tipo di processo, il
folding , per ottenere lo stato nativo avviene
perch favorito,

ma in quanto tempo??

Problema cinetico, e suo paradosso

Il paradosso di Levinthal
Il folding non pu avvenire attraverso una
esplorazione di tutte le possibili conformazioni
verso la ricerca della conformazione pi stabile.
Non c abbastanza tempo. Se infatti
consideriamo che per ogni legame peptidico ci
siano almeno 9 conformazioni possibili, una
ipotetica proteina con 100 amminoacidi pu, in
linea teorica, assumere 9100 possibili
conformazioni. Il tempo impiegato per passare
da una conformazione allaltra circa 10-13 s e
quindi il tempo necessario per analizzare tutte le
conformazioni sarebbe dellordine di 1072 anni.
Molten globule,
intermedio stabile spesso
isolabile, si forma
velocemente ma di cui ad
oggi non si sanno principi
della sua formazione
(processo troppo veloce)
Intermedi
Visione dinsieme
B
A
Esempio semplice di folding

In alcuni casi ci sono degli intermedi


che sono metastabili; bisogna quindi
evitare questi fallimenti, che
possono essere anche tossici per la
cellulare
Chaperonine consumano energia
GroEL (cilindro) e GroES (cappuccio)
Le chaperonine sono una classe di proteine che
funziona in vivo riconoscendo e stabilizzando
intermedi parzialmente riavvolti durante il
folding della catena polipeptidica.
Gli chaperonine molecolari
La malattia di Alzheimer colpisce le cellule nervose
(neuroni) in diverse regioni del cervello.
Structure of Amyloid -
Peptide (1-40) (human)
Morbo della Mucca pazza, Prione (PrP)

Nativa Tossica